ai/knowledge_base/agriculture/content/鱼类分子育种原理与方法.txt

前言
1 分子育种的原理
1.1 分子育种的定义和特点
分子育种（molecule breeding）是借助分子生物学手段，是分子水平的育种，是在分子水平上改良植物的遗传物质。分子育种目前可分为基因工程育种（genetic engineering breeding）和分子标记辅助育种（molecule marker assisted breeding）。其中，基因组育种是在比较基因组研究和基因组分析的基础上，通过DNA标记技术来对畜禽数量性状座位进行直接选择，或通过标记辅助导入有利基因，通过标记辅助淘汰（marker assisted culling，MAC）清除不利基因等，以达到更有效地改良畜禽的目的。转基因育种则是通过基因转移技术将外源基因导入某种动物的基因组上，育成转基因畜禽新品种（系），从而达到改良重要生产性状（如生长率、遗传抗性等）或非常规性育种性状（如生产人类药用蛋白、工业用酶等）的目标。
由于动物分子育种是直接在DNA水平上对性状的基因型或基因进行选择，因此其选种的准确性大大提高，克服了传统动物育种方法的缺陷。按照常规育种方法要提高家畜的生产性能，如瘦肉率、产奶量、增重速度、饲料利用率等，人们往往需要进行多代杂交，选优交配，最后培育出高产、优质的品种。然而，这种传统的方法存在着品种育成时间长、育成后再想引入新的遗传性状困难大等许多弊端，使带有新性状的品种可能同时也携带有害基因，杂交后有可能会降低原有性状。而分子育种能够克服传统杂交选择法的各种缺陷，具有高效、快速育种的特点。目前已显示出了越来越强大的生命力，必将成为动物遗传育种学科发展的方向和21世纪动物育种的主流。
1.2 鱼类育种技术及其发展
1.2.1 鱼类育种的传统方法
1.2.1.1 选择育种
选择育种又称系统育种，是育种工作的一个最基本的手段（张兴忠等，1988；张士璀等，2001）。是对一个原始材料或品种群体实行有目的、有计划地反复选择淘汰，而分离出一些经济性状表现显著优良而稳定、符合人们需要的品种的技术过程。改变育种对象遗传性质的常规方法有两种：一是挑选作为亲本用的个体，这就是选择。另一个是控制亲本的交配方式，这就是遗传操作。将生物表现型作为育种指标，按照优中选优的原则，在群体中选择一定数量符合指标要求的优良个体，持续进行多代系统定向繁育，积累、加强与扩大生物体优良性状的变异遗传，或增加群体内具有育种价值的基因频率（Gene frequency），降低无育种价值的基因频率，最终达到育成新品系、新品种和对退化品种或类群提纯复壮等多种目的。
选择（选种）育种多以一些经济性状和质量性状，如生长率、成活率、抗病力、抗逆力、捕捞率、外形特征等为指标，在鱼类生长发育的各个阶段，有目的地选择具有优良性状的个体，淘汰品质不良的个体，这种方法可以避免由于鱼类人工繁殖所产生的近亲交配而随之引起的退化现象。目前，系统选育的方法通常有4种：①混合选种（又称集团选种），即从生产效果最好的池塘中选出鱼群，这种方法在鱼类的各个发育阶段都可进行。②家系选种（又称窝选），即从一雌一雄选亲配合建立家系开始，在其后代中一代一代进行高度的近亲交配，以累代实行严格的全同胞交配为基础，依据个体表型值，兼顾家系平均值，进行选择留种。③亲本选种，又称后裔鉴定选种，即根据后代质量而对亲本作出评价的个体选择方法，根据后裔鉴定结果决定对亲本的取舍。④综合选种，即综合上述几种选种方法进行的选择育种。
回顾世界渔业的发展史，对水产养殖生产影响最大的是鲤科、鲑科鱼类以及罗非鱼等种类的开发和选育。鲤是世界性养殖鱼类。20世纪60年代，苏联经选择育种育成了抗寒力强、生长快的全鳞型鲤新品种——罗普莎鲤，和对赤斑病有较强抵抗力的克拉斯诺达尔鲤（Kirpichnikov et al.，1993）。1949年后，中国应用选择育种的方法选育出荷包红鲤、兴国红鲤、鳞鲤、镜鲤等多个优良品种（程汉良等，2001），兴国红鲤的选育第6代与未选育的1冬龄鱼种相比较，选育鱼当年可达商品规格，生长优势率为19.65%，且套养选育后的兴国红鲤对主养鱼无不良影响，成活率在95%左右。
鲑鳟鱼类是欧美国家重要的养殖品种。早在1925年，Embody和Hyford就对溪红点鲑（Salvelinus fontinalis ）进行了抗地方疮疖病的选择育种，通过3代连续选育，使其成活率从2%上升到69%（Embody et al.，1925）。美国的Donaldson和Olson从1932年起，对野生虹鳟（Salmo gairdneri ）进行了23年的选择育种，育成了生长快、早产、怀卵量大的“超级虹鳟”（Donaldson et al.，1955）；又经过30多年的培育，目前已得到包括美国在内的世界各地虹鳟养殖者的认可，使世界虹鳟养殖产量增长了2倍，达到年产50万t以上。
20世纪70年代后，科研工作者对多种鱼类进行了系统的选择育种工作，如斑点叉尾（Ictalurus punctatus ）（Dunham et al.，1999），虹鳟（Gjerde，1986），大西洋鲑（Myers et al.，2001），银大马哈鱼（Oncorhynchus kisutch ）（Fleming et al.，1993），尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus ）（Eknath et al.，1993；Longalong et al.，1999；Ponzoni et al.，2005；颉晓勇等，2007），奥利亚罗非鱼（O.aureus ）（桂建芳，2007），橙色莫桑比克罗非鱼（O.mossambicus orange ）和荷那龙罗非鱼（O.hornorum ）（朱华平等，2008）等，都取得了较好的选育结果，平均选育1代有10%～20%的遗传获得。值得一提的是，国际水生生物资源管理中心（ICLARM）会同有关科研机构，成功培育出吉富品系尼罗罗非鱼（GIFT），其生长速度比菲律宾一般的商品性品系快60%，成活率高50%。1994年中国引进了该品系并经过多年选育，育成了“新吉富尼罗罗非鱼”品系，具有较好的养殖性能（颉晓勇等，2007）。
1.2.1.2 引种驯化
引种驯化是目前各地普遍重视和采用的方法，可以较快地产生养殖新品种，但必须通过较广泛的天然鱼类资源的调查，然后根据养殖鱼类的要求进行品种试养，确定是否有养殖的价值。我国重视鱼类资源的发掘和利用，在引种上做了大量工作。将团头鲂由野生变为家养并推广至全国养殖，形成新的世代种群，是我国在引种驯化方面的突出代表。鲴属鱼类、东北银鲫、长吻、鲥、鳇鱼、中华倒刺鲃、东方真鳊、长鳍鲤、大口鲶、鳜鱼、乌鳢、月鳢、黄颡鱼、鲻鱼、梭鱼、史氏鲟等引种移植也取得程度不同的效果。与此同时，我国还从国外引进了一些品质优良的种类，大大丰富我国养殖基本群体。迄今为止，我国引进的鱼类品种有30多种，如莫桑比克罗非鱼、散鳞镜鲤、白鲫、尼罗罗非鱼、蟾胡子鲶、露斯塔野鲮、革胡子鲶、麦瑞加拉、开特拉、道氏鳟（即超鳟鱼）、红色罗非鱼、奥利亚罗非龟、蓝鳃太阳鱼、加洲鲈、尖吻鲈、高白鲑、褐塘鳢、短盖巨脂鲤、银鲃等养殖鱼类，扩大了养殖对象，丰富了育种资源。其中，罗非鱼、沟鲶、淡水鲳、革胡子鲶等已成为我国重要的养殖品种（余来宁，1995）。
1.2.1.3 杂交育种
1.种内杂交
种内杂交一般以提高生长速度为主要目的，目前只有少数几个种类在生长性能方面表现出不同程度的杂种优势。其中，鲤的种内杂交主要是采用不同地理品系间和家养系与野生种间的杂交（Bakos et al.，1995；Hulata，1995）。苏联从20世纪40年代起开展了鲤抗寒品种的选育，他们用黑龙江野鲤和欧洲镜鲤杂交，杂种再与黑龙江野鲤回交，回交种再系统选育到F6、F7，育成了抗寒力强、生长快的全鳞型鲤新品种——罗普莎鲤（Kirpichnikov et al.，1993）。匈牙利是欧洲的养鲤国家之一，其80%的鲤产量都来自于杂交育种的苗种，其中得到推广的3个品种的生长速度比亲本以及其他品系快20%以上（Hulata，1995）。另外还有以色列的Dor-70品系（张兴忠等，1978），日本的大和镜鲤（马仲波，1980）等都是通过杂交育种获得的新品种。
中国从20世纪70年代开始就把鲤的种内杂交优势用于生产实践，并取得了巨大经济效益，推动了养鲤业的发展。现已推广应用的鲤杂交种有丰鲤［兴国红鲤（♀）×散鳞镜鲤（♂）］、芙蓉鲤［散鳞镜鲤（♀）×兴国红鲤（♂）］、荷元鲤［荷包红鲤（♀）×元江鲤（♂）］等，都表现出明显的杂种优势，一般可增产10%～30%。另外，建鲤是通过杂交［荷包红鲤（♀）×元江鲤（♂）］、定向选育、雌核发育等综合育种技术育成的遗传性状稳定的优良新品种。与其他杂交鲤比较，其生长更快，平均增重高2.7倍以上，产量可提高89.2%～126.8%，养殖周期短，当年养成食用鱼（楼允东，1999）。
除鲤外，虹鳟、斑点叉尾等也有种内杂交育种的报道。20世纪70年代，美国曾对来自3个不同孵化场的银大马哈鱼进行品系间杂交试验。结果发现，品系间异种配偶存在差异，由地理隔离造成的不同品系间杂交，杂种表现出杂交优势，如Green河品系与Skykomis品系间的杂种，产量可提高30%（Hershberger，1990）。
2.远缘杂交
早在16世纪中叶，就有关于鱼类远缘杂交的记载。目前，远缘杂交已在水产养殖中得到广泛的应用，并成功地获得了许多优良的养殖种类（张兴忠等，1978；Chevassus，1983；Refstie，1983；Issa，1986；Harrell，1998；刘少军等，1999）。它们的杂交后代一般都在生长速度、成活率、抗病力和性别比例等经济性状方面具有杂种优势。有时杂交后代并不表现出任何经济性状方面的杂种优势，但遗传整合了双亲的优良性状，也具有一定的经济价值。自20世纪50年代末开始，中国也进行了大量的鱼类远缘杂交试验，主要涉及3个目（鲤形目、鲈形目、鲇形目）、7个科（鲤科、鳍科、鲡科、鲷科、鲇科、胡子鲇科、鲿科），40多种鱼类，100多个杂交组合，其中大多数是鲤科不同亚科之间以及属间和属内种间的杂交。
从20世纪50年代起至今，中国、苏联和日本已进行了约30种鲤科鱼类，40余个杂交组合。如鲢（Hypophthalmichthys molitrix）和鳙（Aristichys nobilis ）杂交种的成活率和产量比双亲都高，而且比较温顺，20世纪70～80年代在以色列广泛养殖（Beck et al.，1980）。匈牙利在20世纪70年代进行的草鱼（Ctenopharyngodon idella ）和鳙杂交组合，其杂交种为三倍体（Shireman et al.，1983），由于其不可育而被美国鱼类生物学家用于有效控制水生植物（Shelton，1986）。正是这种杂种三倍体的出现，而使不育三倍体草鱼诱导技术得到了迅猛发展（长江水产研究所，1972）。中国进行的鲤科鱼类的杂交组合较多，如亚科间杂交组合有草鱼（♀）×团头鲂（Megalobrama amblycephala ）（♂）、鳙（♀）×团头鲂（♂）及其反交等（刘思阳，1987a；刘思阳，1987b；叶玉珍等，1989；桂建芳等，1993）。鲤科鱼类属间杂交组合如方正银鲫（Carassius auratus gibelio ）（♀）×兴国红鲤（♂）（蒋一珪等，1983）、红鲫（♀）×湘江野鲤（♂）（刘筠，1993）等，其中方正银鲫×兴国红鲤杂交诱导雌核发育产生的异育银鲫和红鲫×湘江野鲤杂交产生的异源四倍体鲫鲤已在养殖生产中得到应用。属内种间杂交组合元江鲤（♀）和柏氏鲤（♂）的杂种发育正常，起捕率比一般鲤高，接近父本（张建森等，1979）。鲫（♀）×白鲫（♂）的杂交子代生长速度比母本快1～2倍，比父本快20%～30%（楼允东等，1992）。
罗非鱼属内同时存在雄性异配（XX♀—XY♂）型与雌性异配（ZW♀—ZZ♂）型两种性别决定机制，进行种间杂交可产生全雄性后代。由于雄鱼生长速度要比雌鱼快30%，此种杂交组合极具生产应用价值。已在生产上得到广泛应用的福寿鱼［莫桑比克罗非鱼（♀）×尼罗罗非鱼（♂）］的生长速度比母本快100%，比父本快50%，比反交种快36.5%（万松良等，1987）。尼罗罗非鱼和奥利亚罗非鱼的杂交种奥尼罗非鱼雄性率为90%以上，其抗寒能力比尼罗罗非鱼强，而且有较好的耐盐性（杨弘等，2005）。橙色莫桑比克罗非鱼（♀）×荷那龙罗非鱼（♂）杂交子一代的生长速度比奥尼罗非鱼快25%～30%，雄性率为98%以上，而且生长快，规格整齐，起捕率高（杨淞等，2006）。但罗非鱼杂交目前依然存在杂交子代雄性率达不到100%且不稳定等问题，可能是罗非鱼种质不纯造成的（Wohlfarth et al.，1983；卢迈新等，2005）。另外，以期获得耐盐和生长性能兼优的罗非鱼新品种的杂交试验正在进行之中（颜标等，2007）。鲑鳟类的杂交一般没有表现出生长优势（Chevassus，1983），如果把它们诱导成三倍体，则能提高它们的孵化率和成活率（Donaldson et al.，1955）。不过，有学者认为三倍体应用会阻碍鲑鳟类遗传改良计划的进程（Blanc et al.，1999）。
3.鱼类杂交育种存在的问题
第一，鱼类种间杂交的许多组合虽然会产生某些方面的杂种优势，甚至子代可育，但是在另一些方面呈现劣势，如受精率和幼体成活率均低于双亲。如尼罗罗非鱼♀×奥尼亚罗非鱼♂的F1，虽然有生长优势，但出苗率不及母体类型的1/3；黑鲷与灰鳍鲷之间的正反交F1，其受精率、孵化率及仔、稚、幼鱼的成活率均低于双亲。
第二，并不是所有具有某种优势的杂交组合都能作为经济杂交加以利用。如草鱼♀×团头鲂♂的F1，虽生长速度快于团头鲂，抗病力强于草鱼，但其不育且成活率低。
第三，由于对杂种优势的遗传机理缺乏完善的理论解释，导致在杂交组合选择上的盲目性。
第四，目前我国进行的鱼类杂交多是利用F1代的杂种优势，没能进一步定向选育出具有真实遗传性的新品种，且显示杂种优势的F1大多是可育的或部分可育的，不易控制其本身的自交，杂种优势的分离和退化无法避免。
1.2.1.4 航天育种
20世纪中期，由于航天技术的发展，利用返回式卫星搭载动植物进行航天育种（或太空育种），开辟了一条育种新途径。其原理是由于太空处于一种微重力和高真空状态，中离子、真空射线以及太空中存在的交变磁场对卵子或种子产生辐射和诱变等效应，可使染色体或基因组发生一系列突变。
目前，业已开展航天育种的国家有中国、日本、美国、俄罗斯等国。2000年日本曾在美国航天飞机上搭载青鱼卵，并研究这批青鱼卵在地面的发育状况。我国从1987年开始，先后利用卫星搭载种子8次，有50大类，400多个作物品种，培育出一些优质、高产、抗病新品种。2002年我国“神州4号”搭载的花卉种子目前已经有3个品种陆续开花。但尚未开展在鱼类航天育种方面的研究。
1.2.2 现代生物技术的诞生
19世纪末20世纪初，发生了物理学革命，在整个自然科学领域引起了科学思想的深刻变革。物理学的新观念、新理论、新方法，被广泛地用于自然科学的各个部门。生物学因此在已有的基础上取得了革命性的进展。特别是在20世纪50年代以来，生物学领域中取得了一个又一个的创新成果。
1953年，沃森（J.Wastson，1928—）和克里克（F.Crick，1916—）发现了遗传物质DNA（脱氧核糖核酸）的双螺旋结构，在分子水平上解释了遗传信息的传递机制，更加深入地揭示了生命的本质和规律性，奠定了分子生物学的基础。同年，英国生化学家桑格（F.Sanger，1918—）发现了51个氨基酸的牛胰岛素结构。1961年，雅各布（F.Jacob，1920—）、雷沃夫（A.M.Lwoff，1902—）和莫诺（J.Monod，1910—1976）提出“乳糖操纵子学说”，首次在基因水平上阐明了原核生物体生物化学反应过程中调控原理。1964年，64种遗传密码全部破译。随后，发现了遗传学中的“中心法则”。1965年，我国科技工作者在世界上首次人工合成结晶牛胰岛素。1970年，发现逆转录酶，对“中心法则”作重大修正。同时发现而且分离到限制性核酸内切酶。
生物学领域的创新成果意味着人类在微观水平上改造生命体已经成为可能。1973年，美国科学家科恩（S.Cohen）等创建了体外重组DNA技术（the technology of recombient DNA），简称rDNA技术。他们将大肠杆菌体内的两个不同质粒（染色体以外的闭环DNA分子，能自我复制）切割开来，在体外连接为杂合质粒，再次引入至大肠杆菌体内，复制出的质粒表达了双亲质粒的遗传信息。这表明在分子水平上通过改变遗传信息从而影响生物体性状的设想已经变为现实。1975年，英国学者米尔斯坦（T.Milstein，1927—）等人发明了单克隆技术（clone，无性繁殖的意思），并产生了单克隆抗体（monoclonal antibody）。他们的做法是：把能产生抗体的B淋巴细胞和小白鼠能持续生长的癌细胞融合（细胞杂交），得到的杂交瘤细胞，具备两种细胞的功能，能够几乎无限制地分泌大量匀质的抗体。人们常把这两个科学事件作为现代生物技术诞生的标志。现代生物技术与以往技术的最大不同之处在于人类可以在分子或细胞水平上定向利用和操纵生命体。
1.3 现代生物技术发展及其技术特点
1.作用对象
现代生物技术是以生命体（动物、植物、微生物）或其组成成分作用对象，对生命体从细胞或分子水平进行定向设计、控制、改造或者模拟其功能，然后加以利用的一类技术。根据技术的作用对象，由现代生物技术形成的产业必然是生物资源性产业。
2.科学基础
从现代生物技术的产生和发展看，它是对生命运动规律的自觉应用。任何违背生命运动规律的技术都是不可能实现的。现代生物技术的自然属性决定了其内在构成的基本要素必然是生命科学知识。现代生物技术的产生和发展涉及许多学科，有分子生物学、细胞生物学、生物化学、遗传学、动物学、植物学、微生物学、电子学、数学和计算机科学等学科。所以，现代生物技术具有综合性、跨学科性。现代生物技术要进一步走向成熟，有赖于上述众多学科的深入发展和有效地整合。为此，一方面要加强相关学科基础研究；另一方面，根据现代生物技术的群体科学性，配置好从事研究与开发的科学群体。
3.技术特点
我国著名遗传学家谈家桢教授说：“生物工程的发展把生命科学推到一个神话般的境地，使人们从认识、利用生物的时代进入到改造生物、创造生物的新时代。”诚如所言，现代生物技术可以使人们在细胞和分子水平上定向控制生物的生长发育和代谢，使之朝向人们需要的目标发展；可以在微观层次上对生物结构进行拆合、重构，将不同生物的优良性状集中在一起，创造出新物种（工程菌、转基因动物、转基因植物）；可以利用蛋白质空间结构和生物活性之间的关系，借助计算机辅助设计和基因定位诱变与改造技术，构建出新的具有特殊功能的蛋白质或多肽产物。
4.技术目的
广义“生物技术”是利用生物学知识而开发利用和改造生物资源为人类生活服务的有力手段。现代生物技术的应用涉及社会经济的许多部门，有农业、医药、食品、化工、环保、能源、采矿、冶金、饲料等。根据应用领域或技术目的的不同，现代生物技术大体上可分为农业生物技术、医药生物技术、工业生物技术、环境生物技术、海洋生物技术等。
1.4 与鱼类育种有关的现代生物技术
1.4.1 细胞核移植
这是一种将细胞核移植到另一细胞的细胞质中的生物技术，是20世纪50年代初由美国学者Briggs和King首创的（Briggs et al.，1952）。他们以豹蛙为材料，将囊胚期的动物极细胞核移入另一去核的卵子中，获得正常发育的胚胎，引起了国际上的重视。而后这一技术广泛地应用于细胞分化、核质关系和发育机理等重大生物学问题的研究。鱼类细胞核移植即是将一个细胞的核移植到另一个细胞的去核的细胞质中，这样得到的鱼称为核质杂交鱼。这项工作的目的是：①研究细胞核质间的相互关系；②弄清鱼类遗传、发育和细胞分化的基础理论；③细胞核移植也是鱼类育种研究的一项新的技术和手段。
1961年童第周率先在金鱼和鳑鲏鱼中进行同种鱼的细胞核移植（童第周等，1963a，1963b），证明细胞核移植也可以在鱼类中进行。之后，童第周等（1973）在这两种鱼间进行亚科之间的细胞核移植，获得多种核质杂种鱼，严绍颐等（1991）将鲤鱼胚细胞核移植到鲫鱼去核卵中，获得的核质杂交鱼具有较高的养殖价值。谢忠明等（1992）以鲤鲫移核鱼二代为父本，黑龙江散鳞镜鲤为母本，经常规有性杂交获得第1代杂交种——颖鲤，已在20个省、自治区、直辖市推广养殖。
细胞核移植已在水产生物的遗传育种中发挥重要作用，但仅局限于鱼类和两栖类，对于虾、蟹、贝、藻类还一无所知。另外，并非所有核质杂交种都可以培育成新品种，也不是所有的核质杂交种都有受体物种的性状，如鲫鱼细胞核和鲤鱼细胞质配合的杂种鱼基本上相似于供体鱼（鲫鱼）的性状（严绍颐等，1984），更不是所有的种间杂交屏障都可以借助细胞核移植技术来突破，因此，该技术应用于水产生物的育种还有大量工作需要完成。
1.4.2 鱼类雌核发育研究
雌核发育即是通过被紫外线灭活的精子刺激正常鱼卵，再采用温度休克或水压处理，使染色体二倍化。人工诱导雌核发育在水产中占有重要地位，因为它可在很短的时间内产生单性鱼，从而培育纯系。雌核发育可大大缩短育种时间，提高育种的效率。例如，通过两代雌核发育获得草鱼纯系（大约需10年），相当于采用传统育种技术进行八至十代的选育效果（40～50年）。中国在人工诱导鱼类雌核发育方面的研究开始于20世纪70年代，成功获得了鲤鱼、鲫鱼、草鱼、白鲢等的雌核发育鱼。
中国科学院水生生物研究所蒋一硅先生采用天然三倍体方正银鲫作母本，兴国红鲤作父本，通过人工授精获得三倍体银鲫后代。这种通过异精效应发育的方正银鲫后代称为异育银鲫，这是一种独特的育种模式。进一步研究表明，兴国红鲤精子在受精过程中没有形成雄原核与雌原核融合。由于异育银鲫获得了双亲的优良性状，因而表现出超速生长的特性。这揭示了精子不仅仅是对方正银鲫鱼卵起刺激作用，而且对雌核发育后代的遗传性状也具有一定作用。异育银鲫后代没有性状分离，异育银鲫比一般鲫鱼生长快，与其母本方正银鲫相比，生长快34.7%。目前，异育银鲫已在中国20多个省市广泛养殖。这是鱼类雌核发育应用于生产实践的典范。
1.4.3 鱼类多倍体研究
人工诱导鱼类多倍体可产生不育的三倍体鱼，这可控制鱼类的过度繁殖，提高生长速度，延长鱼类寿命。人工诱导多倍体的研究在中国开始于70年代中期，至今已成功培育了三倍体鲢鱼、草鱼、鲤鱼、鲫鱼。虽然诱导鱼类多倍体研究已开展了20多年，并获得了一些三倍体鱼，但都没有应用于生产。这是由于化学或物理方法诱导三倍体成活率低，子代不稳定，不育的三倍体鱼不能自己繁殖后代，因而需年年制种，难于形成规模化生产。因此，鱼类多倍体研究应集中于怎样培育出四倍体鱼，形成可自繁的四倍体群体，通过它与二倍体群体的交配，大规模地生产不育的三倍体鱼。
湖南师范大学的刘绮院士采用湘江野鲤与红鲫杂交，在其F2代个体中发现了二倍体精子和卵子。这些二倍体精子和卵子交配，可产生两性可育的异源四倍体。通过几代繁殖，获得了遗传性状稳定的异源四倍体群体。异源四倍体与二倍体白鲫（或红鲤）杂交，可获得生长快、抗病力强、不育的三倍体工程鲫（或工程鲤）。三倍体工程鲫比日本白鲫生长快21.7%，已在全国20多个省份推广养殖，产生了巨大的经济、社会和生态效益。两性都能育的异源四倍体是世界首例，这为研究鱼类四倍体形成的遗传学机制提供了一个极好的材料。
1.4.4 鱼类性别控制
鱼类雌雄间生长速度差异很大，如罗非鱼雄鱼比雌鱼生长快，而鲤科鱼类雌鱼比雄鱼生长快，因此鱼类性别控制在水产养殖上意义重大。
罗非鱼是世界性养殖鱼类，养殖范围已遍及85个国家和地区。世界养殖产量达100万t，在国际贸易中成为继大马哈鱼和对虾之后的第三大水产品。西方国家罗非鱼市场极为看好，因为养殖罗非鱼比养殖一般水产品种具有更高的利润，并且罗非鱼肉质鲜美、价格适中，适合于不同层次的消费者，市场前景较好。我国罗非鱼养殖发展迅速，2002年产量达69万t，占世界总产量的一半以上。我国真正开始大规模养殖罗非鱼是从1978年引进尼罗罗非鱼开始，特别是1983年淡水渔业研究中心从美国引进了奥利亚罗非鱼后。由于奥利亚罗非鱼（雄鱼）与尼罗罗非鱼（雌鱼）杂交可产生高雄性率的奥尼杂交鱼，而罗非鱼雄鱼比雌鱼生长快40%～50%，杂交鱼又比双亲生长快20%～30%，因此单性养殖奥尼杂交鱼可大大提高罗非鱼产量，它是目前最适于我国养殖的罗非鱼品种。研究表明杂交鱼雄性率高低与亲本纯度相关，因而培育纯种罗非鱼是发展罗非鱼养殖的基础。
通过常规育种与生物技术相结合，即通过群体选择、基因型选择和染色体倍性化，结合回交得到较大规模雌雄群体，培育出高纯度的奥利亚罗非鱼，它与尼罗罗非鱼杂交雄险率达95%以上，已向全国30多个省份作了大面积推广，产生了极为显著的经济效益，推动了我国罗非鱼养殖产业化的发展。特别在罗非鱼主要产区的广东、广西地区，罗非鱼养殖已成为水产养殖的支柱产业，也是出口创汇的主要养殖品种。
淡水鱼业研究中心试验室目前正在研究罗非鱼性别决定的分子遗传学机制。利用人类及哺乳类动物的SRY和SOX基因（性别相关基因），从奥利亚罗非鱼和尼罗罗非鱼基因组中扩增SRY和SOX基因的相关序列，探讨性别基因与杂交子代雄性率的关系，研究利用分子生物学手段提高罗非鱼雄性化率的途径。
1.4.5 转基因技术
在基因工程方面，转基因技术为鱼类育种开辟了一条新途径。该项技术可以根据人们的需要，把有用的外源目的基因，如生长激素基因、抗冻基因、抗病基因等及其调控序列一起，导入受体的胚胎或受精卵中并使之表达，从而达到遗传改良的目的。采取的一般步骤为：①分离、克隆和重组外源基因。②将外源基因导入受精卵的细胞核中。③将转基因受精卵送入子宫，完成胚胎发育。④部分后代细胞携带有转入外源基因，利用这些动物培育新的品系。在这个技术中涉及基因工程技术、胚胎工程技术和分子诊断等技术。其关键是目的基因的选择和提高外源基因导入的成功率。
目前在转入基因的选择上主要有4类：①编码蛋白基因，这类基因参与机体组织生长发育的调节，如生长激素基因等。②抗性基因。③经济性状的主效基因。④治疗人类疾病所需的蛋白质基因。导入外源基因的方法有多种，如：DNA微注射法；逆转录病毒感染法；胚胎干细胞（ES）介导法；精子载体法；染色体片段注入法；电转移法等。在鱼类中DNA微注射法比较常用。
由于鱼类基因工程本身所具有的潜在经济价值和作为转基因研究所具有的有利条件，其研究进展迅速。与其他动物相比，鱼类具有怀卵量大、体外受精、体外孵化、易于遗传操作等特点，是研究基因表达、调控等分子生物学问题的理想动物模型，也是进行转基因研究的极好材料。
转基因鱼的研究工作在中国、美国、加拿大、日本、法国等已经展开，并取得了很大的成就（周进等，2003）。1985年，中国科学院水生生物研究所朱作言先生在世界上首次进行了转基因鱼研究，获得多种转基因鱼。他们进而在全鱼基因克隆，转基因鱼的代谢，转基因鱼食用安全，不育三倍体转基因鱼培育，及建立有效、适用的转基因鱼模型方面开展了大量研究工作。特别是进行了外源基因定点整合研究，并取得了进展（朱作言等，1989）。
淡水鱼业研究中心试验室将人生长激素（hGH）基因导入团头鲂和鲤鱼受精卵中，发现外源基因能整合到受体鱼基因组中，能转录、表达，并具促生长效应，还能通过性细胞遗传给子代，同样也能促进子代的生长。
转基因技术的应用，为克服动植物种间杂交不育以及远缘杂交困难的问题，显示出极大的优势。目前，“全鱼”元件组成的转生长激素基因鱼的构建已在鲤鱼获得成功，并已繁殖至第四代，牙鲆、真鲷等也构建成功。养殖结果表明，转基因鲤鱼在生长速度和抗病能力上已显示出优势。从理论上说，利用转基因可以改变水生生物的遗传物质，使改进的优良性状得以遗传，进而从根本上长久的提高水产养殖的产量和改善产品的品质，所以其在水产养殖中的应用将随时间的推移而更加深入的推进水产养殖育种工作的研究。
虽然转基因鱼研究取得了很大进展，但在应用前仍需解决一些问题：①外源基因的随机整合影响了其表达的有效性，也导致遗传的不稳定性，因此，外源基因的定点整合成为鱼类转基因技术的关键。②随着转基因研究的快速发展，其负面效应也逐渐显露出来，关键是要解决转基因鱼的食用安全性及对生态环境影响等问题。
1.4.6 分子标记技术
分子遗传标记是指利用分子生物学方法来区分不同的个体或群体能够稳定遗传的物质或性状，是生物个体或群体间遗传差异的客观表征。目前限制性片段长度多态性（Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP），简单序列长度多样性（SSLP），随机扩增多态性DNA（Random Amplified Polymorphic DNA，RAPD），单核苷酸的多态性（SNP）是最流行的分子标记技术。
分子标记技术的应用，大大促进了鱼类分子育种工作的开展。主要应用于以下方面：①构建分子遗传图谱，基因定位。分子标记一个重要的应用就是来构建遗传图谱。遗传图谱的建立为基因定位，特别是一些重要经济性状和数量性状位点的定位，并为最终克隆这些基因提供了基础，同时还可以推动生物的分子标记辅助选育和遗传改良。②基因的监测、分离和克隆。主要经济性状主基因和一些有害基因的监测、分离和克隆。③亲缘关系鉴定。DNA分子标记所检测的动物基因组DNA上的差异稳定、真实、客观。可用于品种资源的调查、鉴定与保存，研究动物起源进化，杂交亲本的选择和杂种优势的预测等。④DNA标记辅助选种。分子辅助育种已成为有效的育种工具，它是根据与某一性状或基因紧密连锁的标记的出现来推断该基因或性状的有无，从而进行选育的方法，可以增加选择的准确性，大大缩短育种的周期。进而大幅度提高中国养殖生产中优质原良种的普及率，达到增产增效的目的（邱黎明等，1993；Herbinger et al.，1999；Harris et al.，1991）。Gomez-Raya等（1999）认为在进行的选择育种工作中如果采用了分子辅助育种技术，那么育种速度将提高大约11%。⑤性别诊断与控制。一些DNA标记与性别有密切关系，有些DNA标记只在一个性别中存在。利用这一特点可以制备性别探针，进行性别诊断；分离性基因，作转基因之用。
1.4.7 核酸诱导技术
核酸诱导技术是以核酸（DNA和RNA）为介导的基因转移技术，需要提取DNA或RNA，并通过微量吸管注入法或受体细胞的吞饮作用把纯化的核酸导入细胞以转化受体细胞，进而诱导受体生物产生可遗传的变异。
DNA诱导遗传性状变异是1944年以来一直引起人们兴趣的问题。童第周和牛满江（1973）率先从事鱼类性状的转化试验，从鲫鱼肝脏中提取DNA注入金鱼受精卵内，共处理92粒。孵化后，得到的小鱼中有35.8%表现出鲫鱼的单尾鳍，而对照组的169尾中，只有4.2%表现为单尾鳍。这说明DNA在鱼类也具有转变遗传性状的功能。之后，又使这些注射肝脏DNA所转化的单尾鳍金鱼互相交配，子代出现17.3%的单尾鳍、21.0%的变异单尾鳍。两者相加，单尾鳍占38.3%。可见，由注射外源DNA引起的尾鳍变异可以遗传。这些结果表明，外源核酸诱导技术可以冲破生物的种间生殖隔离，使生物获得不同纲生物的性状，从而为水产动物的遗传改良提供了一条颇具希望的新途径。
1.4.8 细胞与组织培养技术
这是把生物的细胞或组织在适当培养基里培养、传代、再生或快速繁殖生物的技术。水产动物细胞培养的研究，起始于鱼类，已有30多年历史，截至1969年，已有61个鱼类细胞株相继建成。它们来自硬骨鱼类17个科36个种的各种组织，其中大多来自淡水鱼类或溯河洄游鱼类，仅8种海水鱼。我国鱼类细胞培养研究始于20世纪70年代，至今已获得草鱼吻端组织细胞株ZC—7901（张念慈等，1981）、草鱼尾鳍组织四倍体细胞株（陆仁后等，1982）、鲫鱼异倍体细胞系CAB—80（陈敏容等，1982）、草鱼肾组织细胞系CIK（左文功等，1986）、草鱼尾鳍组织二倍体细胞系GCCF—2C、硬头鳟巨噬细胞株、南方鲶鱼上皮型细胞系（洪锡钧，1997）。
鱼类细胞培养与细胞核移植结合使用，在良种培养中起着重要作用。陈宏溪等（1986）把鲫鱼胚胎的继代培养细胞核转移到鲫鱼的未受精去核卵中，培养出世界上第一尾无性繁殖鱼。他们还用类似技术，由短期培养的性成熟鲫鱼的肾细胞，获得1尾发育到性成熟的体细胞工程鱼，使鱼类细胞水平上的遗传育种成为可能。余来宁等（1996）采用电融合结合继代移核法，将对草鱼出血病病毒（FRV）有抗性的草鱼肝细胞株（GLA）的细胞核，移植到草鱼未受精卵内，获得了一批不同发育期的胚胎和存活的仔鱼。可见，用细胞工程育种的方法，培育抗病草鱼是大有前途的，也为鱼类体细胞育种提供了依据。
1.4.9 细胞融合技术
这是将两个不同遗传性状的细胞合并为1个杂种细胞的技术，是在细胞与组织培养基础上发展起来的细胞杂交技术。在水产生物方面，该技术具有难以估量的前景。易詠兰等（1988）已把大鳞副泥鳅（雌）×鳗尾泥鳅（雄）杂交囊胚细胞与大鳞副泥鳅卵融合，培育了16.7%的融合鱼，其外形兼有双亲的特征，类似于杂交卵发育的个体。同时他们还将鲤鱼囊胚细胞与红鲫鱼卵融合，培育了3.5%的融合鱼苗。这些融合鱼各具两对触须，形态类似鲤鱼。易詠兰的工作还表明鱼类囊胚细胞与未受精卵的电融合可以简化细胞核移植的操作过程，1次可以处理的卵数相当于1次核移植卵数的2～3倍。可见，利用细胞融合技术可获得通常难以杂交或不可能杂交的不同物种间的杂交后代，培养更多更好的新品种。
相对于世界发达国家，中国在生物技术应用于鱼类育种研究方面开展得较晚。然而，在鱼类细胞核移植、转基因鱼、人工诱导多倍体和雌核发育、鱼类性别控制、同工酶、杂交优势预测等研究领域发展较快。基于已取得的进展和中国的国情，今后的研究重点将放在以下几个方面：在转基因鱼中，外源基因的定点整合和可控表达研究；改进人工诱导多倍体和雌核发育的技术，建立实用化的大规模繁殖群体；加强鱼类性别调控的分子遗传学研究；加强鱼类遗传连锁图谱的研究。相信随着现代生物技术的飞速发展，它在水产育种研究和开发中的应用必将越来越广泛，这也将彻底改变该学科领域的发展现状，为水产养殖业的可持续发展提供更多优良品种。
1.5 现代生物技术在鱼类育种中的应用
1.5.1 转基因技术的应用
转基因技术是20世纪70年代初兴起的新兴遗传育种技术，朱作言于20世纪80年代在世界上率先开展鱼类转基因工程育种的研究，并建立了转基因鱼模式（朱作言等，1989）。之后，世界各地至少已开展了包括鲑鱼、牙鲆、真鲷等海洋鱼类在内的15种鱼的转基因研究。鱼类基因转移的方法主要有显微注射法、电脉冲法、精子携带法、卵母细胞的基因转移、基因枪注射法、脂质体融合法等，其中以显微注射法应用最为广泛。目前开展的鱼类转基因工作主要集中在生长激素基因、抗冻蛋白基因、抗病蛋白基因（温茹淑等，2002；舒琥，1997；陈松林，2004）。如法国Chourout（1986）成功地将外源生长基因导入虹鳟受精卵；英国的Maclean等（1987）在虹鳟转基因研究上取得成功；加拿大Hew等（1992）将一种冬鲽（Winter flounder）的抗冻蛋白基因导入大西洋鲑，使鲑鱼在进入盐水之前对低温有了一定的抗冻能力；Du等（1992）最先使用“全鱼基因”向大西洋鲑受精卵转移生长激素基因，获得的转基因鱼个体重量比对照组大3.8倍，转基因鱼子一代个体重量比对照组大5.2倍，当前“全鱼转基因鱼”已是鱼类转基因育种的主要方向。
在海水鱼类功能基因的鉴定和克隆方面，目前已经分离和克隆了虹鳟、大西洋鲑、大马哈鱼、银大马哈鱼、大鳞大马哈鱼、红大马哈鱼、马苏大马哈鱼、真鲷、金头鲷、黄鳍鲷、金枪鱼、鳗鱼、牙鲆等多种海水经济鱼类的生长激素基因。除此之外还有大麻哈鱼的催乳素基因、美洲拟鲽的抗冻蛋白基因、大西洋鲑雌激素受体和甲状腺素受体基因、大西洋鳗抗体基因、大西洋鲑抗体基因、虹鳟Vasa基因、条纹鲈GTH（促性腺激素）受体cDNA、大马哈鱼IGH基因及其启动子等。但转基因技术作为一种育种方法仍有许多不尽如人意的地方，目前应加强研究的工作有外源基因的分离、定点整合、表达、导入、检测以及安全性评价等（Chen et al.，1996；Zhang et al.，2004）。
1.5.2 多倍体技术
鱼类多倍体育种是现代鱼类育种的重要方法之一，20世纪七八十年代以来得到了迅猛发展，20世纪80年代后期到90年代初期更是在其应用研究上取得较大成绩（Arai，2001；陈光荣等，2004；楼允东，1994；朱传忠等，2004；尤锋，1997；Thorgaard，1986）。多倍体技术中，三倍体技术是最为常用的技术，主要原理是利用三倍体不育的特点。三倍体鱼往往表现出成活率高、生长快、肉质好、抗病力强等特点，具有广阔的养殖前途。如Scheerer等用热休克诱导褐鳟和溪红点鲑的三倍体杂种在开口摄食时成活率为78.8%，而二倍体杂种的成活率仅为23.7%，在幼鱼期和成熟期，三倍体普遍比二倍体生长快；日本长崎培育的三倍体牙鲆明显比二倍体大，二龄鱼二倍体平均重为670g，而三倍体平均重为900g，三倍体是二倍体的1.4倍，成活率也更高。
鱼类人工诱导多倍体的方法，概括起来有物理学方法（主要是冷、热休克和静水压处理等）、化学方法（即药物诱变，如用秋水仙碱、细胞松弛素B、聚乙烯乙二醇及某些麻醉剂等作诱导剂）、生物学方法（主要是远缘杂交）。目前海产鱼类多倍体研究成功的已有10余种，鲽、川鲽、大菱鲽、牙鲆、黑鲷、真鲷、大西洋鲑、虹鳟、大马哈鱼等。其中比较成功的是鲑科鱼类，如虹鳟已培育出可育四倍体，并由四倍体与二倍体杂交获得快速生长的三倍体商品鱼苗种。尤其是异源多倍体，在日本，采用性逆转四倍体雄性虹鳟与其他鱼的二倍体雌性鱼杂交定向生产全雌异源三倍体虹鳟，因具有明显的生长优势已得到了商品化应用。
鱼类多倍体技术同雄核发育、雌核发育技术相结合可以快速建立纯系，培养所需的更高倍数的多倍体品种、如Chourrout通过性成熟的四倍体虹鳟进行倍性操作分别得到了虹鳟的三倍体、雌核发育二倍体、四倍体和六倍体；Arai（2001）用四倍体比目鱼为材料，利用雌核发育技术诱导出五倍体、六倍体、七倍体和八倍体验鱼，并对它们的生物学特性进行了研究。四倍体的诱导将是培养鱼类新品种的有效途径，已显示出广阔而诱人的发展前景。
1.5.3 雌核发育技术
雌核发育是指卵子经精子激发而产生只具有母系遗传物质的个体的有性生殖方式。鱼类雌核发育对当前鱼类育种工作具有很重要的应用价值，利用这种技术，可以快速建立纯系、稳定杂种优势及提高选择效率。雌核发育的诱导方法可分物理方法（如温度休克、静水压）、化学方法、生物杂交（如远缘杂交）3种。目前已在真鲷、大马哈鱼和虹鳟等获得了雌核发育鱼，近年来又对鲈鱼、牙鲆等开展了雌核发育的研究，并应用于生产（Purdom，1969；Eiichi Yamamoto，1999；Felip et al.，2001；Peruzzi，2003；Luckenbach et al.，2004）。如Eiichi Yamamoto（1999）应用性别控制技术，生产全雌牙鲆；Peruzzi（2003）、Felip等（2001）对鲈鱼、鲆等的雌核发育二倍体、四倍体进行研究。
1.5.4 雄核发育技术
雄核发育是鱼类育种的先进技术之一，主要包括雌核染色体灭活和雄核二倍化诱导技术。它在快速建立纯系、判别性别决定、利用单性种群、保护濒危鱼类等方面具有重要作用（赵振山等，2000）。目前已人工诱导雄核发育的海水鱼类有川鲽（Platichthys flesus）、马苏大马哈鱼（O.masou ）（Arai et al.，1979）、虹鳟（O.mykiss ）（Araki，1995；Babiak et al.，2002）、溪红点鲑（S.ontinalis ）（郑汗式等，2003）等。
1.5.5 细胞工程
细胞工程技术主要包括细胞培养、细胞核移植技术、核酸诱导技术、细胞融合等。鱼类的组织细胞培养起于20世纪60年代初，由Clem等研究海水鱼类的组织细胞培养开始。现在鱼类细胞系被广泛应用于病害学、免疫学、毒理学、遗传育种等方面（楼允东，1999）。从1962年Wolf等首次建立虹鳟细胞系RTG（the rainbow trout growth cell line）至1994年至少已建立了157个鱼细胞系（据Fryer等统计），但大多数来自淡水性鱼类和溯河性鱼类，只有几个种来自海水鱼类。在国内，目前已建立了牙鲆鱼鳃组织细胞系FG（the flounder gill cell line）、鲈鱼脾组织细胞系SPS（the sea perch spleen cell line）、鲈鱼心组织细胞系SPH（the sea perch heart cell line）和真鲷鳍组织细胞系RSBF（the red sea bream fin cell line）等。
在细胞核移植技术、核酸诱导技术、细胞融合技术应用于鱼类育种的研究方面，我国走在世界的前列，但应用于海水鱼类的研究尚未见报道。这些技术可以冲破生物的种间生殖隔离，改变传统的育种方式，在遗传育种、培育新品种等方面具有广阔的应用前景，应在海水鱼类中开展这方面的研究。
1.5.6 分子标记技术
随着PCR技术的发展，目前已形成Isozyme、RAPD、AFLP、DFP、SSR、SSCP、RFLP等多种分子标记技术，并被广泛应用于种质资源评价与管理、遗传多样性分析、品种或品系的鉴定、基因的鉴定与克隆、构建遗传图谱、分析亲缘关系、预测杂交优势和分子辅助育种等领域（Postlethwait et al.，1994；Smith，1996；Bielewski et al.，1997；Elo et al.，1997；Young et al.，1998；Sakamoto，1999；Spruell et al.，1999；Kim，2002；Castro et al.，2003；Maria et al.，2003）。鱼类的遗传育种刚刚起步，目前主要在群体遗传结构及多样性、品种鉴定、分子标记的筛选、遗传图谱的构建方面开展初步的工作。Maureen等用3种微卫星位点对加拿大不列颠哥伦比亚省的一种鲑鱼（Coho salmon ）的34个地理群体的遗传杂合度做了比较分析；Bieleweki等（1997）用RAPD技术研究大西洋海岸鲈鱼4个洄游种群的遗传变异，揭示了4种群之间的基因交流；Sakamoto等（1999）用54个微卫星标记研究了与虹鳟产卵时间连锁的数量性状位点，在7个连锁群中确定了13个数量性状位点。此外，研究者们对真鲷（Pagrus major）、大西洋鲑鱼（Salmo salar ）的不同种群（或种类）都进行了遗传结构方面的比较研究。Smith等（1996）应用同工酶和RAPD技术对新西兰热带水域的金长鳍鱼（King tarakihi）和长鳍鱼（Tarakihi ）进行了种类鉴定；Elo等（1997）研究了大西洋鲑和虹鳟的种内与种间的RAPD标记，结果表明共有20个杂交种；Garciade Leon等将微卫星标记应用于鲈鱼的遗传育种计划；Spruell等（1999）分别利用微卫星等分子标记技术检测雌核发育的鲑鱼和大菱鲆；还有学者用AFLP方法分析了母性遗传物质在雌核发育条纹鲈基因组中的贡献；Kim等（2002）应用AFLP分子标记技术对雄核发育虹鳟的核DNA和mtDNA进行多态分析，以检验育种过程中射线对鱼苗遗传变异的影响。在遗传图谱的构建方面，Postlethwait（1994）首先构建了斑马鱼的遗传图谱；Young等（1998）用加倍的单倍体构建了虹鳟遗传连锁图谱；日本学者Maria等（2003）应用微卫星、AFLP等技术构建了第一个牙鲆遗传连锁图谱；这些为海水鱼类育种提供了丰富的理论依据。
1.5.7 存在问题与建议
1.5.7.1 养殖优良品种缺乏
现代生物技术打破了传统育种的束缚，开拓了育种的新领域，加快了育种的进程应当充分利用现代生物技术的优点，借鉴淡水鱼类育种的成功经验，瞄准海水经济鱼类，大力开展选育、培育优良新品种的研究工作，争取在较短时间内克服海水优良种苗短缺的局面。
1.5.7.2 育种技术有待改进与完善
近年来，各种现代生物技术不断发展完善，但许多技术仍然不尽如人意。如转基因技术存在定点整合难、表达率低、产品安全性等不足。因此，还应继续加强育种新方法和新手段的研究，提高育种的效率和安全性。
1.5.7.3 加快功能基因研究
目前对许多经济鱼类的功能基因了解很少，特别是与经济性状密切相关的功能基因了解不多。还应继续加强经济鱼类功能基因的研究，鉴定和克隆更多的与经济性状紧密联系的功能基因，为转基因育种等打好基础。
1.5.7.4 建立具有优良性状的鱼类家系、品系、纯系
目前，许多经济鱼类已成功进行了人工繁殖；还有一些利用现代生物技术改良的品种陆续出现，但还没有形成稳定的家系、品系、纯系。应利用各种有利手段与方法，快速建立各种经济鱼类的家系、品系和纯系，为鱼类育种的进一步工作提供便利条件。
1.5.7.5 继续构建经济鱼类遗传图谱
在经济鱼类中除虹鳟、牙鲆等少数种类已初步构建遗传图谱外，至今还没有一个种类构建了完整的遗传图谱。构建鱼类遗传图谱是现代育种的重要依据。应利用分子标记技术，建立各种遗传图谱，为鱼类育种提供材料。
1.5.7.6 开发利用与资源保护兼顾
环境问题是当今人类面临的共同问题，在开发利用鱼类资源的同时，应注意保护好海洋资源和海洋环境，应积极开展海洋资源调查，了解海洋生物的相互关系，保护海洋生物多样性。在开展育种过程中，应提高环保意识，科学评估转基因生物的地位与作用，尤其是对环境的影响和安全性不容忽略。
1.6 鱼类分子育种理论基础
1.6.1 鱼类分子育种技术理论
对优势基因或标记的富集，结合传统育种技术和物种生物学特性，再结合分子标记检测的个体与群体的遗传组成，将上述遗传与表型数据经现代生物统计方法进行处理可以建立选择强度大、效果好的鱼类育种技术，即以基因和标记为核心的鱼类综合育种技术。此技术理论的核心要素有4个：
1.表型选择仍是获得好的经济性状关键步骤，基因型选择结合表型选择是建立优良基础群体和选择优良亲本的核心技术。
2.性状的优势基因型的富集是获得优良性状的遗传基础，依据群体或家系QTL等分析结果，可以通过标记检测和选择达到富集家系或群体内的优势基因型的目的。
3.避免近亲繁殖是建立优良品种和进一步保护品种优良性状的关键环节，利用共显性分子标记可以准确检测群体或家系的基因型频率，从而将群体内或家系内的近交系数降到最低。
4.基因与综合性状的指数评估是将基因和标记融入育种技术的关键，优势基因和标记要通过群体并形成品种来体现其优势，将基因和标记及其他性状都利用指数来评估是建立优良种群所必须，包括基因和标记对性状的贡献值的综合指数的BLUP分析或其他统计分析可以实现这个目标。
鱼类分子育种技术定义为，在群体、家系或个体选择中使用了基因或标记并最终能形成品种的育种技术称为分子育种技术。
1.6.2 鱼类分子育种的不同发展阶段
分子育种技术的研究内容要与研究对象的分子遗传研究水平相适应，即有不同阶段。育种工作要根据个体、群体或家系的分子遗传组成来选择亲本，根据优势性状基因或标记的基因型聚合情况来选择亲本等选择手段是以特定物种的分子遗传学研究深度为基础的，只要能在育种的某个环节有所改进，并能提高选育强度和选育效率就可以获得好的育种结果。
鱼类分子育种的3个阶段：
第一阶段，是用标记分析群体间、家系间或个体间的遗传关系，根据雌雄亲本的遗传相似性和遗传距离确定亲本的取舍，建立优良的群体，从而得到家系和群体在性状上优良的新品种，通过避免近亲交配来保持品种的优良特征。目前，大多数物种都可以应用这种育种技术。由于这个技术可以在亲本和子代的遗传背景分析、雌雄配组技术等方面与传统育种技术结合起来，并使之在选择的准确性有提高，克服了鱼类初生小无法标记的困难等，且操作简单也不需要太多基因组研究基础，因此，在鱼类育种研究中大有广阔的应用前景。
第二阶段，即利用性状与基因或标记的简单连锁关系来进行经济性状的聚合育种，中国大多数养殖鱼类的QTL还处在基础研究阶段。目前，国内能用此技术培育品种的水产养殖动物仅有鲤、罗非鱼、牙鲆等少数几个养殖种。
第三阶段，即是利用多种经济性状与基因的连锁关系、依据性状的基因网络调控与环境相互作用的研究结果、依据性状的全基因组分析结果通过计算机软件来设计育种方案的技术，对大多数养殖鱼类来说，这类基础研究还没有开展，设计育种还很遥远，但Robinson等依据大西洋鲑在攻毒试验后的死亡鱼与存活鱼之间的基因表达谱的比较结果，设计了亲本的计算机选择模型，经6～7代选择抗病能力提高一倍以上。
1.6.3 养殖鱼类分子育种技术的生物学特殊性
养殖鱼类的生殖特点大多数为体外受精、体外孵化且产卵量大；生活在水中，不易分辨、难于标记，且出生时个体非常小，这些特点决定应该建立不同于陆生生物的分子育种技术。
1.6.4 养殖鱼类分子育种技术的多样性
养殖鱼类（包括其他水产生物）物种繁多、生殖多样性高，再与不同的养殖方式结合（如中国养殖鱼类价值低，养殖成本低），以及不同的遗传操作技术的组合会形成多种多样的有效率的分子育种技术。
有关水产动物分子育种研究的讨论已有15年以上的时间，这期间，中国从事水产生物技术和遗传育种研究的科学家们在经费少、设备差的条件下，经过长期的艰苦努力，终于将此项技术实用化。无论采用何种技术育成的品种，具有能够区分本品种与其他类群（如其他品种、野生种群、衰退种群等等）的分子标记是基本的技术要求。
参考文献
岑玉古.1989.淡水鱼类育种概述［J］.淡水渔业（6）：35-39.
长江水产研究所.1972.草鱼与武昌鱼的人工杂交［J］.动物利用与防治（2）：22-23.
陈光荣，肖克宇，翁波，等.2004.鱼类细胞工程遗传育种研究进展［J］.水利渔业，24（1）：4-6.
陈宏溪，易詠兰，陈敏容，等.1986.鱼类培养细胞发育潜能的研究［J］.水生生物学报，10（1）：1-7.
陈敏容，陈宏溪，易詠兰.1985.鲫鱼异倍体细胞系的建立及生物学特性［J］.水产学报，9（2）：121-130.
陈松林.2004.海水养殖鱼类抗病分子育种研究进展及前景展望［J］.科技导报（9）：10-13.
程汉良，潘黔生，马国文，等.2001.鲤鱼育种研究［J］.内蒙古民族大学学报，16（1）：46-48.
桂建芳，梁绍昌，朱蓝菲，等.1993.鱼类远缘杂交正反交杂种胚胎发育差异的细胞遗传学分析［J］.动物学研究，14（2）：171-177.
桂建芳.2007.鱼类性别和生殖的遗传基础及其人工控制［M］.北京：科学出版社，166-167.
洪锡钧.1997.南方鲶胚胎细胞培养及其细胞周期特性检测［J］.水产学报，21（3）：240-244.
蒋一珪，梁绍昌，陈本德，等.1983.异源精子在银鲫雌核发育子代中的生物学效应［J］.水生生物学集刊，8（1）：1-16.
颉晓勇，李思发，蔡完其，2007.吉富品系尼罗罗非鱼选育过程中遗传变异的微卫星分析［J］.水产学报，31（3）：385-390.
刘筠.1993.中国养殖鱼类繁殖生理学［M］.北京：农业出版社，117.
刘少军，冯浩，刘筠，等.1999.四倍体湘鲫F3、F4、三倍体湘云鲫、湘云鲤及有关二倍体的DNA含量［J］.湖南师范大学：自然科学学报，22（4）：61-68.
刘思阳.1987a.三倍体草鲂杂种及其双亲的细胞遗传学研究［J］.水生生物学报，11（1）：52-58.
刘思阳.1987b.草鱼卵子和三角鲂精子杂交的受精细胞学研究［J］.水产学报，11（3）：225-232.
楼允东，张克俭，徐庆登，等.1992.高邮杂交鲫及其亲本遗传性状的比较研究［J］.遗传，14（4）：18-20.
楼允东.1994.国外对鱼类多倍体育种的研究［J］.水产学报，6（4）：95-98.
楼允东.1999.我国鱼类育种研究五十年回顾［J］.淡水渔业，29（9）：1-3.
楼允东.1999.鱼类育种学［M］.北京：中国农业出版社.
卢迈新，黄樟翰.2005.罗非鱼遗传育种研究［J］.上海水产大学学报，14（2）：186-191.
陆仁后，李燕鹃，易詠兰，等.1982.四倍化草鱼细胞株的获得和核移植实验的初步探讨［J］.遗传学报，9（5）：381-388.
马仲波.1980.大和镜鲤的经济性状［J］.淡水渔业，（6）：39-39.
邱黎明，董国生，张凌霄，等.1993.鱼类基因转移的研究战略［J］.中国生物工程杂志，14（3）：35-41.
舒琥.1997.转基因鱼基因转移的基本方法及其研究进展［J］.吉首大学学报：自然科学版，18（1）：77-80.
童第周，牛满江.1973.核酸诱导金鱼性状的变异［J］.中国科学（3）：389-394.
童第周，牛满江.1975.由核酸诱导所产生的单尾鳍变异的作用［J］.中国科学，2：149-150.
童第周.1973.鱼类不同亚科间的细胞移植［J］.动物学报，19（2）：201-212.
童第周.吴尚勤，叶毓芬，等，1963a.鱼类细胞核的移植［J］.科学通报（7）：60-61.
童第周.叶毓芬，1963b.细胞核移植［J］.动物学报，15（1）：151-161.
万松良，黄二春，齐彩霞，等.1987.莫尼杂种全雄鱼与尼罗罗非鱼生产性能的比较试验［J］.淡水渔业（2）：15-16.
温茹淑，崔淼.2002.转基因鱼的研究进展［J］.嘉应学院学报：自然科学版，20（6）：40-45.
谢忠明.1992.“八五”国家重点推广养殖对象：颖鲤［J］.淡水渔业（2）：48.
严绍颐，陆德裕，杜淼，等.1984.硬骨鱼类的细胞核移植——鲫鱼细胞核和鲤鱼细胞质配合的杂种鱼［J］.中国科学（8）：729-732.
严绍颐.1991.鱼类细胞核转植（基因组转移）和育种［C］.海洋生物技术研讨会论文集，79-83.
颜标，李思发，蔡完其.2007.尼罗罗非鱼与萨罗罗非鱼及其正反杂交后代的微卫星分析［J］.水产学报，31（3）：411-415.
杨弘，吴婷婷，夏德全.2005.三种奥尼杂交罗非鱼养殖效果比较［J］.科学养鱼，3：18.
杨淞，卢迈新，黄樟翰，等.2006.5种杂交F1罗非鱼生长性能比较研究［J］.淡水渔业，36（4）：41-44.
叶玉珍，吴清江，陈荣德.1989.草鱼与鲤杂交的胚胎学研究-鱼类远缘杂交核质不同步现象［J］.水生生物学报，13（3）：234-239.
易詠兰.1988.鱼类囊胚细胞和卵的电融合［J］.水生生物学报，12（2）：189-192.
尤锋.1997.海产鱼类多倍体育种的研究［J］.海洋科学（1）：33-37.
余来宁，左文功，方耀林，等.1996.用电融合结合继代移核方法构建草鱼抗病体细胞工程鱼［J］.水产学报，20（4）：314-318.
余来宁.1995.我国鱼类遗传育种研究的现状和展望［A］.中美农业科技与发展研讨会论文集［C］.22-25.
张建森，马仲波，王楚松.1979.元江鲤（♂）与柏氏鲤（♀）杂交一代（柏元鲤）的研究和利用［J］.淡水渔业（2）：14-18.
张念慈，杨广智.1981.草鱼吻端组织细胞株ZC—7901及其亚株ZC—7901S的建立和特性观察［J］.水产学报，5（2）：111-120.
张士璀，李荔，郭华荣，等.2001.鱼类品种培育新技术［J］.遗传，21（3）：76-78.
张兴忠，岑玉吉.1978.苏联鱼类选育种概况［J］.淡水渔业，2：47-50.
张兴忠，仇潜如，陈曾龙，等.1988.鱼类遗传与育种［M］.北京：农业出版社.
赵振山，吴清江，高贵琴.2000.鱼类雄核发育的研究进展［J］.遗传，22（2）：109-113.
郑汗式，刘良国，易祖盛.2003.RAPD分子标记与鱼类种质资源和遗传育种研究［J］.广州大学学报：自然科学版，2（6）：518-524.
周进，黄捷，宋晓玲.2003.海洋生物技术在水产养殖中的应用［J］.北京水产（5）：11-15.
朱传忠，邹桂伟.2004.鱼类多倍体育种技术及其在水产养殖中的应用［J］.淡水渔业，34（3）：53-56.
朱华平，卢迈新，黄樟翰，等.2008.橙色莫桑比克罗非鱼（Oreochromismossambicus ）和荷那龙罗非鱼（O.hornorum ）的选育效果评价［J］.南方水产，4（3）：1-6.
朱作言，何玲，谢岳峰，等.1990.鲤鱼和草鱼基因库的构建及其生长激素基因和肌动蛋白基因的筛选［J］.水生生物学报，14（2）：176-178.
朱作言，许克圣，李国华，等.1986.人生长激素基因在泥鳅受精卵显微注射后的生物学效应［J］.科学通报，31（5）：387-389.
朱作言，许克圣，谢岳峰，等.1989.转基因鱼模型的建立［J］.中国科学（2）：147-155.
左文功，钱华鑫，许映芳，等.1986.草鱼肾组织的细胞系CIK的建立及其生物学特性［J］.水产学报，7（2）：153-157.
Arai K，Onozato H，Yamazaki F.1979.Artificial androgenesis induced with gamma irradiation in masou salmon （Oncorhynchus masou ） ［J］.Bull Fac Fish Hokkaido Univ，30（3）：181-186.
Arai K.2001.Genetic improvement of aquaculture finfish species by chromosome manipulation techniques in Japan［J］.Aquaculture，（197）：205-228.
Araki K.1995.Androgenetic diploids of rainbow trout （Oncorhynchus mykiss ）produced by fused sperm［J］.Can J Fish Aquat Sci，52（5）：892-896.
Babiak I，Dobosz S，GoryczkoK，et al.2002.Androgenesis in rainbow troutusing cryopreserved spermatozoa：the effect of processing and biological factors［J］.Theriogenology，57（4）：29-49.
Bakos J，Gorda S.1995.Genetic improvement of common carp strains using intraspecific hybridization［J］.Aquaculture，129：183-186.
Beck M L，Biggers C J，Dupree H K.1980.Karyological analysis of Hypophthalmichthys molitrix，Aristichthys nobilis and their F1 hybrid［J］. Trans Am Fish Soc，109：433-438.
Bielewski J P，Pumo D E.1997.Random amplified polymorphic DNA（RAPD） analysis of Atlantic coaststriped bass［J］.Heredity，78（1）：32-40.
Blanc J M，Vallée F.1999.Genetic variability of farming performances in some salmonid species and hybrids modified by triploidization［J］.Cybium，23（Suppl.1）：77-88.
Briggs R，T.J.King.1952.Transplantation of living nucle from blastula cells into encleated frogs eggs，Proc.Natl.Acad，Sci.U.S.A.，38：455-463.
Castro J，Bouza C，Sanchez L，et al.2003.Gynogenesis assessment using microsatellite geneticmarkers in turbot （Scophthalmus maximus ） ［J］.Mar Biotechno，J，5（6）：584-592.
Chen T T，Vrolijk N H，Lu J K，et al.1996.Transgenic fish and its application in basic and applied research［ J］.Biotechnol Annu Rev（2）：205-236.
Chevassus B.1983.Hybridization in fish［J］.Aquaculture，33：245-262.
Chourrout D，Guyomard R，Houdebine L.1986.High efficiency gene transfer in rainbow trout（Salmon gairdneri ） bymicroinjection into egg cytoplasm ［J］.Aquaculture（51）：143-150.
Donaldson L R，Olson PR.1955.Development of rainbow trout broodstock by selective breeding［J］.Trans Am Fish Soc，85：93-101.
Du S J，Gong Z Y，Fletcher G L，et al.1992.Growth enhancement in transgenic salmon by the use of an“all fish” chimeric grouth hormone gene construct［J］.Biotechnology，10（2）：176-181.
Dunham R A，Brummett R E.1999.Response of two generations of selection to increased body weight in channel catfish，Ictalurus punctatus ，compared to hybridization with blue catfish，I.furcatus ，males［J］.J Appl Aquac，9：37-45.
Eiichi Yamamoto.1999.Study on sex-manipulation and production of cloned populations in hirame，Paralichthys olivaceus ［J］.Aquaculture（174）：235-246.
Eknath A E，Tayamen M M，Palada-de Vera M S，et al.1993.Genetic improvement of farmed tilapias：the growth erformance of eight strains of Oreochromis niloticus tested in rent farm environments［J］.Aquaculture，111：171-188.
Elo K，Ivanoff S，Vuoriner J A，et al.1997.Inheritance of RAPD markers and detection of interspecific hybridization with brown trout and Atlantic salmon［ J］.Aquaculture，152（1）：55-65.
Embody G C，Hayford C O.1925.The advantage of rearing brook trout fing erlings from selected breeders［J］.Trans Am Fish Soc，55：135-142.
Feli PA，Zanuy S，CarrilloM，et al.2001.Induction of triploidy and gynogenesis in teleost fish with emphasis on marine species［ J］.Genetica，111 （1-3）：175-195.
Fleming I A，Gross M R.1993.Breeding success of hatchery and wild coho salmon （Oncorhynchus kisutch ） in competition［J］.Ecol Appl，3（2）：230-245.
Gjerde B.1986.Growth and reproduction in fish and shellfish［J］.Aquaculture，57：37-55.
Gomez-Raya L，Klemetsdal G.1999.Two Stage Selection Strategies utilizing Marker-quantitative trait Locus Information and Individual Performance［J］.Journal of Animal Science，77：2008-2018.
Harrell R M.1998.Genetics of stripped bass and other Morone［J］.J World Aquac Soc，29：56-59.
Harris A S，Bieger S，Doyle R W，et al.1991.DNA fingerprinting of tilapia Oreochromis niioticus ，and its application to aquaculture genetics ［J］.Aquaculture，92：157-163.
Herbinger R W，Doyle E R，Pitman D，et al.1999.Early Growth performance of atlantic salmon full-sib families reared in single family tanks versus in mixed family tanks［J］.Aquaculture，173（1-4）：105-116.
Hershberger W K，Meyers J M，McAuley W C，et al.1990.Genetic changes in growth of coho salmon（Oncorhynchus kisutch ） in marine netpens，produced by 10 years of selection［J］.Aquaculture，85：187-197.
Hew C ，Davies P L，Fletcher G.1992.Antifreeze protein gene transfer in Atlantic salmon［J］.Mol Mar Biol Biotechno，11（4-5）：309-317.
Hulata G.1995.A review of genetic improvement of the common carp（Cyprinus carpio L.）and other hybrids by crossbreeding，hybridization and selection［J］.Aquaculture，129：143-155.
Issa M A，Horvath L，Kosba M A，et al.1986.Anoteonthesurvival，growth，feed conversion and somemorphological characters of the reciprocal hybrids of silver carp（Hypophthalmichthysmolitrix Val.） and bighead carp（Aristichthys nobilis Rich.） raised in polyculture［J］.Aquac Hungarica，5：7-14.
Kim H Brown.2002.Mitochondrial and nuclear inheritance in androgenetic line of rainbow trout （Oncorhynchus mykiss ）［J］.Aquaculture（204）：323-335.
Kirpichnikov V S，Ilyasov J I，Shart L A，et al.1993.Selection of krasnodar common carp（Cyprinus carpio L.） for resistance to dropsy：principal results and prospects［J］.Aquaculture，111：7-20.
Longalong F M，Eknath A A，Bentsen H B.1999.Response to bidirectional selection for frequency of early maturing females in Nile tilapia （Oreochromis niloticus ）［J］.Aquaculture，178：13-25.
Luckenbach J A，John G，Harry V，et al.2004.Induction of diploid gynogenesis in southern flounder （Paralichthys lethostigma ） with homologous and heterologous sperm ［J］.Aquaculture（237）：499-516.
Maria R M，Coimbra K K，Sinrokuro K，et al.2003.A genetic linkage map of the Japanese flounder （Paralichthy olivaceus ）［J］.Aquaculture（220）：203-218.
Meclean N，Penman D，Zhu Z.1987.Introduction of novel genes into fish［J］.Biotechnology（5）：257-261.
Myers J M，Heggelund PO，Hudson G，et al.2001.Genetics and broodstock management of coho salmon［J］.Aquaculture，197：43-62.
Peruzzi S，Chatain B.2003.Induction of tetraploid gynogenesis in the European sea bass （Dicentrarchus labrax L.）［J］.Genetica，119（2）：225-228
Ponzoni R W，Hamzah A，Tan S，et al.2005.Genetic parameters and response to selection for five weight in the GIFT strain of Nile tilapia （Oreochromis niloticus ）［J］.Aquaculture，247：203-210.
Postlethwait J H，Johnson S L，Midson C N.1994.A genetic linkage map for the zebra fish［J］.Science（264）：699-703.
Purdom C E.1969.Radiation induced gynogenesis and androgenesis in fish［J］.Heredity（24）：431-444.
Refstie T.1983.Hybrids between salmonids species.Growth and survival in seawater［J］.Aquaculture，33：281-285.
Sakamoto T.1999.Linkage analysis of quantitative trait loci associated with spawning time in rainbow trout（Oncorhynchus mykiss ）［J］.Aquaculture（173）：33-43.
Shelton W L.1986.Broodstock development for monosex production of grass carp［J］.Aquaculture，57：311-319.
Shireman J V，Smith C R.1983.Synopsis of biological data on the grass carp，Ctenopharyngodon idella （Cuvier and Valenciennes，1844）［J］.FAO Fish Synops，135：86.
Smith P J.1996.Genetic evidence of two species of tarakihi in New Zealand waters［J］.New Zealand Journal of Marine and Freshwater Research，30（2）：209-220.
Spruell P，Pilgrim K L，Greene B A，et al.1999.Inheritance of nuclear DNA markers in gynogenetic haploid pink salmon［J］.Mar，90（2）：289-296.
Thorgaard G H.1986.Ploidy manipulation and performance［J］.Aquaculture（57）：57-64.
Wohlfarth G W，Hulata G.1983.Applied genetic of tilapias［J］.ICLARM Stud Rev，6：26.
Young W P，Wheeler PA，Coryell V H，et al.1998.A detailed linkage map of rainbow trout produced using doubled haploids ［J］.Genetic（6）：839-850.
Zhang X，Yang X，Sheng W，Jiu Y.2004.Safety evaluation of food from transgenic fish and the molecular biological mechanism ［J］.Mar，33（2）：233-238.
2 分子育种主要技术方法
2.1 候选基因法（candidate gene approach）
2.1.1 候选基因法原理
分子遗传学及测定技术的飞速发展，对生物基因组特别是人类和动物基因组分析的深入研究起到了有力地推动作用。通过基因组分析，可以从核酸水平上来识别遗传物质，鉴定基因组功能单元和了解其作用机理，确定影响表型性状的基因或与该基因紧密连锁的遗传标记，从而可以据此进行人类疾病预测治疗和指导动物选种，并且不受性别、时间和环境等因素的影响。基因组分析有多种方法，候选基因法和连锁分析法是鉴定基因位点的两种基本方法，它们分别用候选基因或遗传标记与表型性状的连锁分析来鉴定或定位多基因性状位点（王晓通等，2004）。连锁分析法成功率虽高，但由于需建立参考家系（人类基因组分析中不可能），耗时耗资巨大，目前在我国难以开展研究。而候选基因法具有统计功效强、应用广、费用低和操作简单等优点，适合在我国开展研究。使得该方法的研究较基因组扫描法活跃得多，成为目前在动植物育种中检测重要数量性状基因座（QTL）的有效方法（Rothschild and Soller，1997）。
候选基因，是指一些已知其生物学功能和序列的基因，它们参与性状的发育过程。这些基因可能是结构基因、调节基因或是在生化代谢途径中影响性状表达的基因（徐华等，2004）。候选基因法是根据动物生理生化理论和对复杂数量性状的剖析，以及在其他物种（如人类、小鼠等）中发现的控制某些性状的基因。选定一些候选基因，利用分子生物学技术研究这些基因和相关的DNA标记对某种数量性状的遗传效应，筛选出对该数量性状有影响的主基因和DNA标记，并估计出他们对数量性状的效应值。最后在分子生物学水平证实基因的变异能否带来真实的表型变异。
2.1.2 候选基因法的优缺点
2.1.2.1 优点
1.多态位点选择简单
研究者可通过对所研究性状生物学过程的了解，使用已有的知识判断选择新的候选基因，这是候选基因法的最主要优点。
2.统计检验效率高
因为群体内候选基因分析是以整个群体的连锁研究为基础，其统计功效相当于对两个近交系杂交再自交后所产生的F2群体的统计功效，而不受重组的影响。相反，在远交系产生的群体中进行QTL定位必须依赖于家系设计（半同胞、全同胞或同胞对），这些设计比F2设计的统计功效有一定程度的减小。因为，这时候选基因法的研究是在多家系群体中进行的，而具有同样候选基因等位基因的个体将具有同样多基因背景的趋势。
3.应用范围广
候选基因法是单个世代数据资料的分析，适用于任何可以取得表型数据的群体，不需要建立2个或3个世代的参考群体。因而具有相当的灵活性，几个系和几个品种能同时分析，费时少且不需建立费用昂贵的参考家系。再者，候选基因法可对每个品系或品种中的公畜群进行研究，其结果在遗传背景相类似的群体中同样有效。
4.总费用低，易于实施
候选基因研究法通常认为比以微卫星为基础的全基因组分析法的费用高，主要费用是用于引物设计及在候选基因内寻找多态位点，但一经批量测定其总的费用却比全基因组连锁分析法低。假定已经有一系列候选基因可供利用，且一周可测定500个基因型数据，那么对1000头动物，每头25个基因的测定工作可在1年内完成。再者，采用选择测定基因型，对单个性状进行分析，一年可完成对100个基因的测定，如用选择池DNA法可在1个月内完成。
5.操作简便
候选基因法的研究单位是单个基因而不是整个染色体组（QTL连锁分析的基因组扫描法）。所以，候选基因分析法适用于在较小的研究试验室及进行个体研究的试验室中操作或进行特殊基因鉴定和表达的研究。
6.结果便于应用
候选基因法的最大优点是能够在商品育种群中进行。可以避免在家系内确定特定遗传标记与QTL连锁关系的巨大困难，这是在远近交群体中进行有效的MAS所必需的。再者，由于候选基因与数量性状的连锁关系不受重组的影响，所以候选基因的效应是世代不变的，不需要在每一世代重新测定。这样，候选基因的效应一经确定和验证，就能在测定群体中立即用于MAS。此外，在可能遗传背景的效应一经证实后，其结果很容易地进行标记辅助渗入，使优良基因尽快导入另一群体中。
2.1.2.2 缺点
1.难以区分候选基因与基因标记
鉴定出的候选基因也许是主基因本身，如氟烷敏感基因L1直接对数量性状起作用，也许是与实际的QTL处在紧密的连锁不平衡状态中，间接对数量性状起作用。
2.易受非候选基因的影响
由于非性状基因通过一因多效而影响表型性状，所以表型性状总是保持着这一变异比例。寻找出引起这部分变异的基因是困难的，即使当一个效应基因被定位，大多数情况下它将处在较大的区域内（15～25 cM），该区域包含着450～750个基因。从这几百个非性状基因中找出实际起作用的基因是一项繁重的工作，除精细定位法外没有有效的解决办法，也许，这部分遗传变异不能由候选基因法来鉴定。如果这部分遗传变异较大，就会使候选基因法的作用大大削弱（顾志良等，2000）。
3.不能检出所有的QTL
受已知生物学知识的限制，目前只知道少量的性状基因，部分遗传变异不知是由何候选基因引起或不知该基因序列。随着人类和鼠类基因组研究的不断深入，对已知基因和基因功能数量的增加，可通过比较位置克隆在参考群体中QTL的连锁分析来发现新的性状基因，但这毕竟是一个长期的过程。
2.1.3 候选基因分析的基本方法
2.1.3.1 候选基因的选择
候选基因的选择主要根据所掌握的生物学及生理生化知识，还可以利用位置比较候选基因分析法，从其他物种的基因图谱中找出同源序列，再从该区段的保守连锁群中寻找相应的基因。此外，也可把其他物种具有较大效应的突变基因作为候选基因。
2.1.3.2 引物设计及基因相应片段的扩增
引物设计是候选基因分析法中最重要的一步，两侧引物只要有一侧位置不对，就会出现假阳性或假阴性。
通常我们都可以通过GeneBank知道候选基因的序列。在某些情况下基因序列包含着内含子和外显子，且内含子和外显子的界限明确，而在另一些情况下这些界限不明确，但可以从人或小鼠的基因序列信息中推断得到。当仅有cDNA序列可供利用时，外显子的界限通常能从其他品种中得到，或采用跨越内含子扩增的方法。反向PCR可用来测定5′至3′的非翻译调节区域。
当即无研究品种的基因序列又无cDNA序列可供利用时，可根据其他一个或多个品种的序列信息推断出一个一致的序列，作为设计引物。当然，如果某个基因暂时只在一个物种上获得，那么第2个物种上同源基因的适当引物获得就具有一定的运气因素。
如果品种间不存在相似序列，可设计出退化的引物。利用退化的引物扩增出候选基因的产物，然后测定序列，根据所测序列来设计引物。当然，这种方法需较低的退火温度，错配率较高。
2.1.3.3 候选基因多态性的寻找
在候选基因分析时，候选基因以及他的调节、扩展区域内的任何多态位点都可利用。确定候选基因内单元型的多态位点可不包含功能部位。候选基因多态性的寻找有多种方法。如蛋白质电泳和抗原抗体反应等，目前常采用PCR-RFLP法和SSCP分析法。为提高发现PCR-RFLP法多态性的可能性，根据候选基因的结构和大小，在引物设计时，使一对引物应跨越包括一些中等大小内含子的几个外显子区域，扩增片段的长度应在800～2500个核苷酸对的范围内，这样长度的核苷酸片段有利于发现PCR-RFLP的多态性，SSCP分析的片段长度通常在300个核苷酸对以内。
用5～10个样本的池DNA扩增片段的PCR-RFLP分析法也是快速扫描多态性的一个方法。具体做法是，将池DNA的扩增产物分别用一系列内切酶消化，这些内切酶是根据扩增序列来确定的，它们能识别及切割扩增产物中的相应酶切位点。消化产物电泳后表现出不同强度的多重条带类型，这就有可能存在多态性。组成池DNA的每头动物的DNA样品可随后作单独测定。这种池DNA也可用于寻找序列的差异，这时，对从4～5个样本的池DNA得到的核酸序列要仔细分析，如在某些位置序列信息表示有2个碱基时，那么对这些样本就要单独测定序列，证明可能的序列多态性。
2.1.3.4 候选基因与表型性状间的连锁分析
候选基因法鉴定QTL，适用于任何可取得基因型和表型数据的群体，是在动物商品种群中鉴定QTL的理想方法。根据候选基因的一个多态位点还是根据候选基因的单倍型来进行连锁分析，是连锁分析中首先要作出的决定。用候选基因单倍型进行分析将增加测定基因型的费用，但可提供较强的特异性及统计的可靠性。在整个群体中候选基因的效应，应使用混合线性模型来分析，其中候选基因的等位基因和基因型效应作为固定效应来处理。当在某群体中分析多个候选基因对某一性状的作用时，可采用多重回归方法。
候选基因与表型性状间的连锁分析也可通过比较具有不同性状值品种群的等位基因频率差异来进行，即可采用测定不同选择系之间的等位基因频率的差异来进行分析。
2.1.3.5 连锁关系的验证
1.是否具有种群及世代特异性
候选基因与数量性状的连锁关系通常在某一群体的特定世代中发现。所以，该效应可能是仅仅存在于该群体中，甚至于在该世代中。例如，在某群体中所研究的候选基因与影响某性状的QTL可能处在暂时的连锁不平衡状态，而该QTL与它相隔一定距离或甚至在另一条染色体上，这仅仅可由机遇产生；如某公畜携带着候选基因的某个等位基因，使得该等位基因在研究世代中出现的比例不平衡，并恰巧与研究性状育种值的高低相对应。
2.是否存在候选基因与特定遗传背景的相互作用
如果研究群体具有特殊的遗传背景，比如存在只对某个或某几个等位基因具有显性上位或超显性作用的基因座位，那么，等位基因与表型性状之间关系的确立将变得复杂。
3.基因型间的遗传差异是否由于候选基因本身引起
也许试验人员所选的候选基因只是与真正的QTL紧密连锁，这样对于该性状基因应用于转基因动物有致命影响。
所以，在某一群体中得到的候选基因效应，需要在该群体中经过一个或多个后续世代的验证，或在同品种不同群体以及不同品种中进行验证。
2.1.4 候选基因分析中的几个问题
1.不能找出所有的QTL
因为我们只能对生物学已知的基因作为候选基因，所以就不可能用候选基因分析中找出那些生物学功能未知的QTL。
2.难于确定候选基因就是QTL
除非候选基因的效应非常大，如主效基因。否则很难断定候选基因就是QTL，在候选基因的效应得到明确的证实以前不能下结论，很有可能我们所发现的候选基因的效应实际上是它与一个或几个相邻的QTL之间的连锁平衡所造成的。
2.2 基因组扫描法（Genome Scanning Approach）
2.2.1 标记图谱的构建
1.分子遗传标记
建立一个标记连锁图要有合适的标记，目前广泛应用的主要是一些分子遗传标记，包括RFLP、RAPD、AFLP、SSR、DNA指纹等。早期开发定位的分子标记大多数为RFLP及RAPD，后来发现SSR标记在连锁图构建中比较理想，因为其分布广泛而且均匀，为QTL的检测和定位创造了条件。
2.标记遗传图谱
高密度、高分辨的畜禽基因组连锁图谱是分析控制经济性状的QTL在基因组中的数量、位置及它们对相应表现型的影响，继而应用标记辅助选择（MAS）技术来进行畜禽育种的重要依据和必要条件。进行基因组扫描要求的图谱标记密度为10cM以下。到目前为止一些主要畜禽的连锁图构建的情况如下：图谱中存在一些问题就是密度不均匀，有的部位太密，有些部位标记区间太宽，影响QTL定位精度。
2.2.2 标记与QTL连锁分析的试验设计
用于标记与QTL连锁分析的试验设计大体上可分为两大类，一类是基于近交系或品系杂交的试验设计，另一类是基于分离群体的试验设计。从猪和鸡上进行基因扫描的个体来看，基于近交系（鸡）或品系（鸡和猪）杂交的试验设计。这类设计要求所考察的数量性状上有较大差异（最好是处于两个极端的近交系或品系或品种杂交）。常用的试验设计有回交设计即用杂交所得的F1个体与两个亲本中的一个回交，利用回交后代的标记基因型信息和数量性状表型信息进行标记与QTL的连锁分析。另一种是F2设计，是将F1个体或将产生F2代个体的标记基因型信息和数量性状表型信息进行标记与QTL连锁分析，往往若干全同胞家系的后代作为资源群体。基于分离群体的试验设计是直接用远交群体作为资源群体，最常用的是半同胞家系设计，将若干父系半同胞家系作为资源群体，利用父亲和其半同胞后代的信息和后代的数量性状的表型信息来进行标记与QTL的连锁分析。这主要用于肉牛和奶牛等单胎动物，奶牛中最常见的是女儿设计和孙女设计。
女儿设计是利用公牛的半同胞女儿的标记和表性信息进行分析。孙女设计则是利用公牛和半同胞儿子的标记信息和儿子的女儿（公牛的孙女）的表型信息来进行分析。另外的分离群体设计有全同胞家系设计和混合家系设计等。
2.2.3 标记与QTL的连锁分析方法
1.点估计或称单标记分析
这是利用单个标记，每次只利用一个与QTL连锁的标记位点进行分析，点估计方法是用于检测一个QTL是否与某一位点连锁是有效的。通常用方差分析或回归分析进行。这种方法直观而简便，其统计基础也是稳健（Robust）。优点是：①在未建立连锁图之前就可以进行连锁分析。②方法简便。缺点是：①不能估计出QTL的位置和效应值，即不能精确定位QTL。②往往低估QTL的遗传效应。③容易发生假阳性，即没有QTL，却误认为有QTL。④检测出的连锁分析不能确定标记同一个还是多个QTL连锁。⑤需要较多的试验个体，检测效率低，成本大（莫惠栋，1996）。
2.侧翼标记分析（Flanking marker analysis）
这是正态混合分布的极大似然函数和简单回归模型分析任何两个相邻标记及其间任一点是否存在被研究的QTL，是相邻标记作为分析单元的方法，也称为区间定位法（internal mapping），同时利用两个侧翼标记的信息，通常用似然函数来分析标记间任何一点具有QTL的概率，这大大增加了QTL的检测效率并能较准确得到QTL的位置及效应值的估计，即可在基因组的任何一点将发现QTL和估计其有关参数综合在一个分析体系中，曾被认为是QTL标记连锁分析的标准方法。而在实践中则发现这种方法定位的QTL区间往往太阔，在染色体上有两个以上QTL是则常常会把QTL的真实位置标错，产生幻影（ghosting）QTL。
3.复合标记分析（复合区间分析）
针对上述方法的缺点，Zeng（1993）提出了将多元回归和区间分析的方法结合起来的方法，这样利用基因组中的多个遗传标记位点信息。这种方法对性状存在两个或多个连锁QTL时，提高了发现和定位QTL的灵敏性和精确性。
2.3 全基因组选择
2.3.1 全基因组选择的概念和原理
全基因组选择，简单来讲就是全基因组范围的标记辅助选择，主要是通过全基因组中大量的标记资讯估计出不同染色体片段的育种值，然后估计出个体全基因组范围的育种值并进行选择。全基因组选择理论主要利用的是连锁不平衡信息，即假设标记与其相邻的QTL处于连锁不平衡状态因而由相同标记估计的不同群体的染色体片段效应是相同的，这就要求标记密度足够高以使所有的QTL与标记处于连锁不平衡（LD）状态。而目前随着鸡、牛、猪、羊等农业动物基因组序列图谱及SNP图谱的完成或即将完成，提供了大量的SNP标记用于进行基因组研究，而随着SNP芯片等大规模高通量SNP检测技术的完善和成本的降低，使得全基因组选择方法的应用成为了可能，成为继20世纪四五十年代的杂交育种技术和90年代的BLUP技术之后的新的育种技术。
全基因组选择在实施过程中主要分为两个步骤：
1.通过参与群体估计出不同染色体片段的效应。
2.预测群体的基因组估计育种值（genomic EBVs，GEBVs），该步骤可以直接预测无表型记录但是有基因型资料动物个体的GEBVs。步骤①中的困难主要是通过少量的表型记录估计大量染色体片段的单倍型效应。
2.3.2 全基因组选择的实施方法
全基因组选择可以通过单标记、单倍型或者同源一致性（IBD）途径实施，区别主要在于每个染色体片段所需要估计的效应数目不同，单标记分析时每个片段对应一个效应，而单倍型分析时每个片段对应多个效应。
通过单标记或单倍型进行全基因组选择主要有4种方法：最小二乘法（Least squares，LS）（Meuwissen et al.，2001）、BLUP法（BLUP）（Whittaker et al.，2000）、贝叶斯A法（Bayes A）和贝叶斯B法（Bayes B）（Meuwissen et al.，2001）。分析染色体片段效应时最简单的假设是全基因组所有染色体片段的单倍型效应方法差是相同的，然而目前的研究表明染色体片段中效应的分布是不同的，部分片段中含有较大效应的QTL，部分片段含有较小效应的QTL，而部分片段不含有QTL，以上4种方法分别予以考虑。最小二乘法不考虑染色体片段效应的分布，该方法的主要问题是显著性水准的选择和选择哪些染色体片段效应进行育种值估计，因此在进行多重比较时通常将片段效应估计过高BLUP法引入了岭回归，从而避免了效应估计过高的缺点，但是对于较大染色体片段效应的方差易估计过高而降低了选择的准确性。贝叶斯法能够在估计单标记或者单倍型效应时利用已知的某些片段含有较大效应的QTL、较小效应的QTL及无QTL等信息，其中贝叶斯A法考虑到较大效应QTL和较小效应QTL等资讯，贝叶斯B法在其基础上加入了无QTL的资讯，因而更加准确。
Meuwissen等（2001）比较了不同方法的准确性（表2-1）。其中所有基因组为1000cM的区间，标记间距为1 cM，有效群体大小为100，染色体效应的预测群体为2000头家畜，且该家系动物个体的育种值仅由所携带的标记预测得到。
表2-1 无表型记录个体估计育种值和真实育种值比较
其中rTBV：EBV为估计育种值和真实育种值间的相关系数（相当于选择的准确性），bTBV：EBV为真实育种值对估计育种的回归系数。Bayes A法考虑到大量片段效应接近于0，Bayes B法将其考虑为0，因而提高了其他片段效应估计的准确性。
除以上方法外，还可通过IBD方法实施全基因组选择。上述方法均认为每个单倍型携带1个特异的QTL等位基因，但实际情况中不同的单倍型可能携带相同的QTL等位基因。通过不同单倍型间的协方差得到其为同源相同而携带相同QTL等位基因的概率，我们可以在全基因组范围多位位置同时进行计算便可将其应用到全基因组选择中，这就是IBD方法。
2.3.3 全基因组选择的影响因素
1.标记数目
对于全基因组选择来讲，单标记或者单倍型必须与QTL处于足够的连锁不平衡状态才能对QTL的效应进行预测。Meuwissen等（2001）通过类比计算得到相邻相记之间r2≥0.2才能用于基因组选择。Calus等（2008）研究了相邻标记间r2对于选择准确性的影响，发现准确性随着相邻标记间r2的增加而显著增加，r2为0.1时准确性为0.68，r2为0.2时准确性为0.82。在奶牛群体中，标记间平衡间隔100kb即可满足r2为0.2，因此对于3000Mb的牛基因组而言，30000个标记就可满足全基因组选择。
2.单倍型或者单标记的实施方法
在全基因组选择中单倍型相对于单标记的优劣主要取决于通过单倍型判断IBD片段的准确性高于通过单标记判断IBD片段的准确性。Calus等（2008）比较了不同方法预测无表型资讯个体GEBV的准确性，发现在低密度标记（相邻标记间r2值较小）时，单倍型具有较大优势，而在r2≥0.2时，单倍型优势较小。
3.表型记录数目
基因组选择的准确性取决于染色体片段效应数目和表型记录数目。表型记录数目较多时，每个单倍型所观察到的效应也较多，估计的准确性较高。Meuwissen等（2001）通过模拟计算发现，对于遗传力为0.3的性状，达到2000个以上的表型记录时估计的准确性较高。对于高遗传力性状，估计的准确性更高，需要较少的个体可以满足要求。
不同方法中，LS法最低，BLUP法次之，Bayes法准确性最高。
4.非加性效应
估计染色体片段效应和预测育种值时，考虑显性效应和上位效应等能够提高选择的准确性。估计单标记的显性效应比较简单，估计上位效应比较困难，因为不同位点间存在的互作数目庞大计算较为困难。Xu等（2003，2007）引入一些参数并提出了近似方法进行简化计算，并将其应用于大麦回交的真实试验。Gianola等（2006）也提出了半参数方法等研究大量标记之间的互作效应。
5.不同群体及品种间的全基因组选择
在实际的全基因组选择中通常用于进行效应估计的参考群体和应用群体是不同的，而全基因组选择依赖于标记和QTL之间的LD程度，这在标记和QTL之间距离较大时尤为明显，而且有时QTL效应在不同群体中也存在区别，解决办法之一就是利用多品种参考群体，获得所有的遗传方差。对于相同品种的两个不同群体的情况下，遗传和环境之间的互作也可能会降低GEBV估计的准确性（Spelman et al.，2002；Dunner et al，2003）。
6.重新估计染色体片段效应
如果进行全基因组选择的标记恰好是引起QTL效应改善的突变（QTN），则估计的片段效应可以较好地用于应用于其他群体的选择。但是更多的情况是标记与QTN之间的r2为中低水准，经过几个世代后，标记和QTL之间发生重组会降低原始参考群体估计的GEBV的准确性。Meuwissen等（2001）研究发现rTEB∶EBV会逐渐降低，经过5个世代后，准确性下降较为明显，在其研究群体中经过3个世代就需要重新估计片段效应。DeRoos等利用荷兰和澳大利亚荷斯坦牛20000个标记的真实资料研究发现，两代之间准确性下降较小，估计的效应还可用。
2.3.4 全基因组选择的有效成本
主要取决于所用的基因型检测手段，检测30000个SNP约为500美元，而检测50个SNP约为20美元，因此如果用于全基因组选择的标记数目可以降低，可以很大程度地降低实施成本。
主要有两种方法可用于降低全基因组选择的成本。一种就是首先估计不同片段效应，而大量的片段效应接近于0，因此在应用时只检测效应不为0的位点即可。实施这种方案时可能遇到的问题是选择多个性状，假如选择30个性状，每个性状包括50个SNP，则共检测约1500个SNP，而对于大多数检测平台而言，检测1500个SNP和检测30000个SNP的成本是相近的。
全基因组选择无须已知QTL位点及其效应，但是随着目前QTL定位研究的迅速发展及大量成果的积累，可以有效地将QTL结果补充到全基因组选择的片段效应分析和标记选择中，提高其准确性，降低其成本。
2.3.5 全基因组选择的优势
1.全基因组选择能够对所有的遗传变异和遗传效应进行准确的检测和估计
标记辅助选择等仅能对部分遗传变异进行检测，且容易将其遗传效应估计过高。目前实施标记辅助选择的分子标记多为微卫星标记，基于其多态性及检测技术所限，其基因型在不同地方检测的结果重复性较差。而全基因组选择的标记为SNP标记，具有2种等位元基因，结果重复性较好，这在实际育种中可以更准确地估计个体育种值并进行选择。
2.在个体早期进行基因型检测而估计育种值，在不降低育种值估计准确性的前提下，缩短世代间隔，降低性能测定的成本，并提高遗传进展
Schaeffer（2006）设计了一个非常好的奶牛育种实施方案，每年选择少量性能突出的母牛留种用，这些母牛与特定的种公牛交配，后代公牛1岁时与大批母牛交配得到100个女儿并用于估计EBV。大约43个月后其女儿得到批一个泌乳期的产奶性状值，其EBV的准确性约为75%。此时实施全基因组选择，而不进行后续的性能测定，GEBV的准确性约为0.75，而世代间隔可以缩短一半，相对于传统育种方法成本可以降低92%而遗传进展增加1倍。Schaeffer认为实施全基因组选择后奶牛育种体系有可能转变为与猪、鸡等类似的体系，仅育种群需维持少量的优秀种畜即可，极大地降低成本。猪、鸡、羊等畜禽因为生产模式不同等略有差别，但与标记辅助选择相比成本降低均较为明显。
3.对于较难实施选择的性状具有重大影响
全基因组选择对于奶牛受精率、乳房炎，猪肉质，猪、鸡抗病性状等测定成本较高的性状，遗传力较低的性状以及限制性性状等具有巨大的应用前景，通过全基因组选择可以有效地降低表型测定成本，提高估计的准确性，缩短时代间隔，提高遗传进展。而这些性状的选择已经严重制约了动物育种和生产的发展，传统育种方法和标记辅助选择对其遗传改良较为缓慢，只有通过全基因组选择方法才能突破现有的瓶颈。
4.实施全基因组选择的有效成本较低
标记辅助选择等很难针对大量的性状同时进行有效的选择，且不同性状的标记往往不同，也增加了检测成本。而且基因组选择可以在参考群体中对大量性状进行表型检测和效应估计，之后在育种群体中利用相同的SNP标记对所有的性状进行分析，SNP芯片等技术的发现极大降低了大规模SNP标记的检测成本，使之适合进行检测。
5.全基因组选择还可以更有效地平衡不同性状的遗传进展
例如目前奶牛中，产量性状遗传进展较大，而繁殖性状由于育种值估计的准确性较低所获得的遗传进展较小。如果参考群体有足够的性状记录可以用于估计染色体片段效应，全基因组选择可以有效地提高繁殖性状育种值估计的准确性，进而提高其对综合育种值的贡献，有效的对不同性状进行平衡育种。
参考文献
顾志良，杜兰芳，李辉.2000.畜禽QTL及其检测方法和策略.常熟高专学报，14（4）：62-67.
王晓通，王晓娜，娄义洲.2004.候选基因法在动物育种中的应用.畜牧与饲料科学，4：36-39.
徐华，孙少华.2004.畜禽主基因的研究现状与检测方法［J］.当代畜牧，2：46-49.
Calus M P，Hayes B J，Spelman R J，et al.2008.Linkage disequilibrium and persistence of phase in Holstein-Friesian，Jersey and Angus cattle［J］.Genetics，179（3）：1503-1512.
Dunner S，Miranda M E，Amiguse Y，et al.2003.Haplotype diversity of the myostatin gene among beef cattle breeds［J］.Genet Sel Evol，35（1）：103-118.
Gianola D，Fernando R L，Stella A.2006.Genomic-assisted prediction of genetic valus with semiparametric procedures［J］.Genetics，173：1761-1776.
Meuwissen T H，Hayes B J，Goddard M E.2001.Prediction of total genetic value using genome-wide dense marker maps［J］.Genetics，157：1819-1829.
Schaeffer L R.2006.Strategy for applying genome-wide selection in dairy cattle［J］.J Anim Breed Genet，123：218-223.
Spelman R J，Ford C A，McElhinney P，et al.2002.Characterization of the DGATl gene in the New Zealand dairy population［J］.J Dairy Sci，85（12）：3514-3517.
Whittaker J G，Thompson R，Denham M C.2000.Marker-assisted selection using ridge regression［J］.Genet Res，75：249-252.
Xu S，Jia Z.2007.Genome wide analysis of epistatic effects for quantitative traits in barley［J］.Genetics，175：1955-1963.
Xu S.2003.Estimating polygenic effects using markers of the entire genome［J］.Genetics，163：789-801.
3 分子标记技术
3.1 以分子杂交技术为基础的检测方法
3.1.1 限制性片段长度多态性
1.RFLP基本技术原理
由于基因内个别碱基的突变，以及序列的缺失、插入、重排，会造成DNA核苷酸序列上的变化，从而导致限制性酶切位点的不同。用限制性内切酶消化基因组DNA后，将产生长短、种类、数目不同的限制性片段，这些片段经电泳分离后，在聚丙烯酰胺凝胶上呈现不同的带状分布，通过与克隆的DNA探针进行Southern杂交和放射自显影后，即可产生和获得反映生物个体或群体特异性的RFLP图谱。
2.RFLP基本操作步骤
①DNA提取；②限制性内切酶酶切；③电泳分离酶切片段；④转膜；⑤探针标记；⑥杂交；⑦放射自显影。
3.RFLP标记技术的优点
①普遍存在于各种生物的各类DNA中，不受组织、环境、发育阶段和器官特异性的影响，具有特异性。②等位基因之间呈共显性遗传，可以区分杂合子和纯合子，不受杂交方式的影响。③在非等位基因间无上位效应，互不干扰。④源于基因组DNA自身的变异，在数量上几乎不受限制。⑤结果稳定可靠，重复性好，分析的DNA片段相对较大，操作简便。
但它也有自身的局限性：分析程序复杂，技术难度高，工作量大，成本高；多态点数目有限，多态信息含量低；对样品DNA中靶序列拷贝数的纯度要求高，需要DNA量较大；检测中需要放射性同位素，使其应用受到一定限制。
RFLP标记位点数量不受限制，通常可检测到的基因座位数为1～4个。RFLP在构建基因组连锁图谱上有重要应用作用。目前较为完善的遗传连锁图谱大多来自RFLP分子标记，尤其在构建高密度遗传连锁图方面，RFLP有独特的优越性。此外，在亲缘关系鉴定、品种鉴定等方面，RFLP也有广泛应用。
3.1.2 染色体原位杂交
染色体原位杂交（Chromosome in situ hybridization）是一种基于Southern杂交的分子标记技术（田义柯等，2000；许云华等，2003）。原理是利用特异性核酸片段作探针，该探针用放射性同位素或者其他非放射性的大分子如生物素、地高辛等标记特异核酸片段，直接同染色体DNA片段杂交，杂交后，杂交信号经酶联显色或荧光显示在染色体上显示特异DNA。原位杂交的优点是准确、直观，但技术非常复杂。
3.1.3 数目可变串联重复多态性（VNTR）
许多生物体的DNA存在含有大量的串联重复序列的高变异区。通常将以15～75个核苷酸为基本单元的串联重复序列称为小卫星（minisatellites），以2～6个核苷酸为基本单元的简单串联重复序列称为微卫星（microsatellites）或简单序列重复（SSR）。小卫星和微卫星也常常称作重复数可变串联重复（Variable number of tandem repeats，VNTR）标记（闰华超等，2006）。VNTR标记产生的多态性是由同一座位上的串联单元数量的不同而产生的。VNTR与RFLP的原理相似，只是限制性内切酶的酶切位点不在重复序列中，以保证小卫星或微卫星序列的完整性，但在基因组的其他部位有较多酶切位点，则可使卫星序列所在片段含有较少无关序列。由于小卫星和微卫星可分布于整个基因组的不同位置上，其重复数及重复程度存在着很大变化，在群体中表现高度的多态性，加之该技术没有组织特异性，结果稳定可靠。利用VNTR标记可进行分子定位和作图的研究工作。
3.2 以PCR（聚合酶链式反应）为基础的分子标记技术
3.2.1 随机引物的PCR标记
3.2.1.1 随机扩增片段多态性（RAPD）
1.RAPD基本原理
是采用随机合成的寡核苷酸（通常10bp）作PCR反应的引物，对所研究生物基因组DNA进行PCR扩增。一般来说某一引物在真核基因组中可能有很多的结合位点，但只有在4000 bp之内，存在反向平行的与该引物互补的双链DNA，才能将合成的新链作下一次合成的模板，经35～40个循环，即可得到大量的DNA片段，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳、EB染色，紫外光下即可显示RAPD带纹。
2.与RFLP相比，RAPD分析具有如下特点：
（1）技术简单，不需要通过Southern转移和分子杂交来显示片段长度的差异，在短时间内可获得大量的遗传标记。
（2）PCR引物没有种属的限制，具有广泛和通用性的特点。
（3）分析时需要的基因组DNA量少，纯度要求不高。
（4）绝大多数生物的RAPD标记为显性遗传。
（5）退火温度较低，允许适当的错误配对，提高分析效率，是一种理想的、有效的分子生物学技术。
但RAPD标记为显性标记，不能提供完整的遗传信息，因而不能鉴别杂合子和纯合子；是微量反应，反应体系中成分的浓度稍有变化就会产生不同的结果，甚至没结果；容易受反应条件影响，必须严格控制条件；在某些情况下试验结果不能重复，稳定性和可比性较差。它一出现就广泛用于群体遗传多样性研究、遗传图谱构建、基因定位与克隆等。但RAPD技术也具有一定的局限性，如为显性标记，无法区分纯合子和杂合子；稳定性和重复性较差，不同试验室间的研究结果可比性差等。
3.2.1.2 DAF标记
DAF标记原理与RAPD标记相似，但它使用的引物比RAPD标记的更短，一般为5～8个核苷酸，因而与模板DNA随机结合的位点更多，扩增得到的DNA条带也更多，检测多态性的能力更强，但PCR稳定性比RAPD更低。
3.2.1.3 任意引物PCR（AP-PCR）
任意引物PCR（Arbitrarily primed polymerase chain reaction，AP-PCR）AP-PCR使用的引物较长（10～50个碱基），但PCR反应前2个循环的严谨条件较低，最终的反应结果与RAPD类似（Welsh，1990）。在AP-PCR分析中，扩增分为3个部分，每个部分要求的条件和组分的浓度存在差异；在第1个PCR循环中，引物浓度较高；引物长度不定，并且常常来自为其他目的而设计的引物（如M13通用测序引物）。
3.2.1.4 相关序列扩增多态性（SRAP）
相关序列扩增多态性（Sequence-Related Amplified Polymorphism，SRAP）又叫基于序列扩增多态性（Sequence Based Am Plifted Polymorphism，SBAP）。SRAP引物包括一个17个碱基的正向引物（F-primer）和一个18个碱基的反向引物（R-primer）对开放读码框（ORFs）进行扩增。研究表明外显子一般处于富含GC区域，正向引物中的CCGG序列目的是与位于富含GC区域的开放读码框（ORFs）中的外显子进行特异结合。虽然外显子比较保守和低多态水平，但SRAP中使用的反向引物的3′端含有AATT，以特异结合内含子富含AT区，这就使得有可能扩增出基于内含子与外显子的SRAP多态性标记（唐玉海等，2006）。
3.2.1.5 靶位区域扩增多态性（TRAP）
靶位区域扩增多态性（Target region amplified polymorphism，TRAP）是从SRAP技术改进而来，2003年由Hu和Vick开发的标记技术。TRAP的原理是利用生物信息工具和序列表达标签数据库信息，产生目标候选基因区多态性。该技术采用两个18核苷酸引物，一个为固定引物，依据EST设计；另一个为随机引物，针对外显子或内含子的特点，设计分别富含GC和AT核心区的任意序列。通过对目标区域PCR扩增，产生围绕目标候选基因序列的多态性标记（王芳等，2008）。TRAP标记技术是一个简单、高效、高通量的分子标记技术，不但具有RAPD技术易于操作的特点，而且具有AFLP技术的强大功能优势。
3.2.2 特异引物的PCR标记
3.2.2.1 特征性片段扩增区域（SCAR）
特征性片段扩增区域（Sequence-characterized amplified regions，SCAR）首先由Parar和Michlmore（1993）提出并应用。SCAR标记是在RAPD技术基础上发展起来的。针对RAPD标记的缺点，为提高其在应用中的稳定性，可以将该RAPD片段测序，根据序列设计特异引物（约20 bp左右），或者对该RAPD片段进行末端测序，在原RAPD所用引物基础上相应增加约14bp，成为与原来的RAPD片段末段互补的特异性引物。以基因组DNA为模板进行PCR扩增，得到与原来的RAPD片段相同的特异条带，即RARD标记转化为SCAR（Sequence-characterized amplified regions，特征性片段扩增区域）标记。SCAR标记一般为显性，有时也表现为共显性标记。
与RAPD标记相比，SCAR具备以下优点：①由于有较长的引物，退火温度较高，因此具有更高的检测稳定性；②有将显性RAPD标记转化为共显性的SCAR标记的可能性；③如果是显性标记，则在检测中可以直接染色而不需电泳检测。另外，用RAPD找到扩增片段后不再设计引物，而是直接测序后通过电脑软件分析（如用ClustalX软件进行对位，MEGA软件计算DNA序列间的差异百分率和转换/颠换数，UPGMA软件建亲缘关系树状图等），找出特异性的碱基作为鉴定的特异性标记（闰华超等，2006）。因此，SCAR标记克服了RAPD标记的缺陷，为基因定位与克隆、遗传图谱构建，奠定了试验基础。
3.2.2.2 微卫星DNA（Microsatellite DNA）标记
微卫星（microsatellite）又叫做简单重复序列（Simple Sequence Repeat）或者短串联重复序列（Short trandem repeat，STR）、简单序列长度多态性（Simple Sequence Length Polymorphism，SSLP）。简单序列重复多态性（Simple Sequence Repeat Polymorphisms，SSRP）微卫星指的是真核生物普遍存在的遍布整个基因组的排列为2～5个核苷酸的短串联重复序列，如（CA）n、（GT）n、（CAG）n等，尤以（CA）n重复序列最为常见，其长度由重复单位的拷贝数决定。在真核生物基因组中微卫星很丰富，通常长度能够达到150bp，是一类呈高度多态的遗传标记，不仅可用于基因组遗传连锁图的构建以及基因的定位与克隆，而且可用于遗传性疾病的连锁分析和基因诊断。其重复单位数目的改变可以引起相当高的多态性，但突变率仅为0.5×10-4～5.0×10-4，在家系中可以稳定地遗传，是一种很好的遗传标志（何平，1998）。微卫星约占真核基因组的5%，其基本构成单位一般为1～8bp，多位于编码区附近，也可位于内含子、启动子及Alu序列（反向重复序列）中。人类基因组约有5万～10万个（CA）n重复序列。通常认为重复序列的产生是由于在遗传物质复制过程中DNA滑动或在有丝分裂、减数分裂期染色体不对等交换所致，因此该重复序列多存在于不经严格选择的基因组区域。目前普遍认为微卫星充当基因重组的热点是基因重排和变异的来源（朱振东等，2003）。微卫星不稳定性（microsatellite instability，MSI）是指由于复制错误（replication error，RER）引起的简单重复序列的增加或丢失，也称RER阳性或RER表型。MSI首先在结直肠癌中观察到。微卫星通过改变DNA结构或通过与特异性蛋白质结合而发挥其基因调控作用。
由于微卫星的寡核苷酸在同一物种的不同基因型之间差异很大，可以利用特异引物进行PCR扩增。引物根据与微卫星重复序列两翼的特定保守序列设计，用来扩增重复序列本身。由于重复的长度变化极大，所以这是检测多态性的一种有效方法（李云海，1999）。其特点包括：一般检测到的是1个单一的多等位基因位点；共显性遗传，故可鉴别杂合子和纯合子；得到的结果复性很高。为了提高分辨力，通常使用聚丙烯酰胺凝胶电泳，它可检测出单拷贝差异。也可以在同1个反应试管中把PCR反应与不同的SSR引物结合起来（称为multiplexing），这可节省时间，但是，这只能在不同引物的产物在大小上下不重叠的情况下才能使用（李晶炤等，2000；李晓辉等，2003）。很显然，使用SSR技术的前提是需要知道重复序列两翼的DNA序列的信息，这一方面可以在其他种的DNA数据库中查询，否则就必须先建立含有微卫星的基因组文库，再从中筛选可用的克隆，进行测序，然后设计合适的引物。同时，这种由保守序列确定的微卫星序列也具有染色体位点的特异性，因此1981年Miesfeld等首次发现微卫星后，很快成为一种常用高效的分子标记。统计分析表明，不同的物种其微卫星的突变频率也是稳定的。SSR的PCR引物也是对某一高变重复位点高度专一的。用特定引物扩增出相应的微卫星片段后，再通过电泳分离，差异可经过EB或者银染后观察。一般种群可显示出超过10种类型的等位基因。微卫星不仅重复单位变异数大，而且其重复区域总长度又在PCR易于扩增的区域，快速简便，所需的DNA用量小。与等位酶相似，微卫星是具有独立的共显性基因。由于微卫星的遗传中性并且比等位酶法有更多的可供检测的等位基因，这样就可以提供更加精细的基因变化的范围，因此在种群研究上有着更大的应用（李云海，1999；刘殊等，2002；朱作峰，2002；赵勇等，2002）。
简而言之，微卫星的最大优点在于通过简单的PCR扩增即可直接检测到已知的特定的染色体位点，不仅具有一般PCR操作简单、快速、成本低的特点，还具有RFLP的稳定可靠、特异性、共显性等特点，不足之处是其引物开发难度较大，技术复杂，周期长，成本也高。不过随着众多模式生物的全基因组测序的飞速进展，对全基因组了解的日益全面，各个大型数据库的逐步完善，并且借助越来越发达的计算机计算和预测技术，使得开发成本有所降低。
3.2.2.3 简单序列重复区间（ISSR）
Zietkiewicz等（1997）在SSR的基础上提出了锚定SSR的新策略，从而避免了SSR在基因组上的滑动，大大提高了PCR反应的专一性。简单序列重复区间（Inter-Simple Sequence Repeat，ISSR）的原理和RAPD原理比较相近，都是单引物扩增，不同的是ISSR所用的引物来自简单重度序列区域，并且在重复序列的5′或者3′端随机加上1～3个简并碱基，ISSR引物比RAPD引物长，退火的温度也高，因此ISSR比RAPD具有更高的特异性和稳定性，而且扩增出的带数也比RAPD多，显示出更好的灵敏度。因此该方法已经成功应用在种群遗传学，品系鉴定，系统进化和遗传图谱构建等研究中。
每一个ISSR引物并不适合所有的物种，而且不同引物所要求的反应条件也不同，因此在进行大量的ISSR反应以前必须对引物进行筛选和PCR反应条件的优化的工作。
3.2.2.4 单引物扩增反应（SPAR）
单引物扩增反应（single primer amplification reaction，SPAR）技术与RAPD技术相似的是也只用1个引物，但SPAR分析中所用的引物不是随机的，而是在SSR的基础上设计的，例如可能的序列是（TA）10或（CGA）6。扩增的是SSR之间的DNA序列。又称为MP-PCR（microsatellite-primed PCR）。
3.2.3 结合限制性酶切和PCR扩增两种技术的DNA标记
3.2.3.1 扩增片段长度多态性（AFLP）
1.AFLP基本原理
将基因组DNA进行限制性内切酶酶切，然后选择特定的片段进行PCR扩增，使用双链人工“接头”与基因组DNA的酶切片段相连接作为扩增反应的模板，“接头”与“接头”相邻的酶切片段的几个碱基序列作为引物的结合位点。引物由3部分组成：①与人工接头互补的核心碱基序列；②限制性内切酶识别序列；③引物3′端的选择碱基序列（1～10bp）。这样就只有那些两端序列能与选择碱基配对的限制性酶切片段被扩增，再在高分辨力的测序胶上分开这些扩增产物。该技术的独特之处在于人工设计合成了限制性内切酶的通用接头，以及可与接头序列配对的专用引物，因此在不需事先知道DNA信息的前提下就可对酶切片段进行PCR扩增。具体试验过程中，为了使酶切浓度大小分布均匀，一般采用两个限制性内切酶，一个酶为多切点，另一个酶的切点数较少，因而AFLP分析中产生的主要是由两个酶共同酶切的片段。
2.AFLP优点
①多态性强，每个反应可以检测到50～100个扩增产物，被认为是指纹图谱中多态性最丰富的一项技术。②所需DNA样本量少，检测效率高。③呈典型的孟德尔方式遗传，不需要杂交。④结果稳定可靠，分辨率高，重复性强。
3.AFLP缺点
是需要用同位素检测、费用昂贵、过程复杂、对操作人员素质及DNA模板质量要求高等。目前广泛用于遗传多样性和种质鉴定、基因定位、连锁图谱的构建等。尽管AFLP技术诞生时间较短，但它的出现是分子标记技术的又一次重大突破，被认为是目前一种十分理想的、有效的分子标记。
3.2.3.2 酶切扩增多态性序列（CAPS）
酶切扩增多态性序列（Cleaved amplimed polymorphic sequences，CAPS）技术又称为PCR-RFLP（闰华超等，2006），实质上是PCR技术与RFLP技术结合的一种方法。CAPS的基本原理是先利用已知位点的DNA序列资源（基因数据库、基因组或cDNA克隆以及以克隆的RAPD条带等）设计一套特异性的引物，然后用这些引物扩增该位点上的某一DNA片段，接着用一种专一性的限制性内切酶切割所得扩增产物，凝胶电泳分离酶切片段，染色并进行RFLP分析。CAPS标记揭示的是特异片段的限制性长度变异的信息。CAPS是一类共显性分子标记，其优点是避免了RFLP分析中膜转印这一步骤，又能保持分析的精确度（徐安毕等，2007）。另外，由于很多限制性内切酶均可与扩增DNA酶切，所以检测到多态性机会较大。
3.3 基于DNA测序的分子标记技术
3.3.1 表达序列标签技术（EST）
表达序列标签技术（Expressed sequence Tags，EST）是指一小段（通常长度300～500bp）单次重复的mRNA序列或cDNA序列。它们在特定的组织或者特定的时期内特异的表达，可以看作是特定的cDNA文库中的标记。EST计划由美国科学家Venter于1989年提出，并首先应用于人类基因组研究，之后被广泛用于植物基因组研究，它是通过大规模的cDNA随机测序，从而获得对基因组认识的一种研究策略。目前，许多国家和组织正在开展某些作物基因组EST计划的研究，如成立于1998年的国际小麦族EST协作网（International Triteace EST corperation，ITEC），就是致力于麦类EST研究和开发的（骆蒙等，2000）。近几年来国际公共数据库中的EST序列呈指数增长，截止到2006年8月，美国生物信息中心（NCBI）数据库Genbank已公布涉及205000种生物的61132599条EST序列，总长度共65369091950bp。
快速增长的ESTs数据为SSR标记的开发提供了一个巨大的有价值的来源。首先，避免了传统SSR标记开发需要构建基因组DNA文库等烦琐步骤，而且从ESTs中发掘出的SSR只是ESTs测序计划的副产品，从而节省了大量人力物力（李永强，2004）；其次，其本身是功能基因的一部分序列，所以它将为功能基因提供“绝对”的标记（Adams et al.，1991）。同时，由于不同物种间基因共线性和保守性，从一种作物中开发的EST-SSR可同时用于其他作物研究，从而能够为比较基因组学和同源基因克隆提供新的途径（Scott et al.，2000）。目前EST-SSR已被用于构建遗传图谱、分离与鉴定新基因、基因表达差异研究、比较基因组研究和制备DNA芯片等方面。
3.3.2 单核苷酸多态性（SNPs）
单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms，SNPs）标记是美国学者Lander E.于1996年提出的第三代DNA遗传标记，是基因组中单个核苷酸变异引起的DNA序列多态性，包括碱基的转换、插入及缺失等形式。
SNP的主要特点有：
（1）位点丰富，在基因组中的分布广泛。
（2）与微卫星等重复序列多态标记相比，具有高度遗传稳定性。
（3）易实现分析的自动化，适于快速和规模化筛查。
（4）因其二态性，易于基因分型。
（5）在任何物种群中，其等位基因频率都可以被估计出来。
虽然SNP是非常有效的、逐渐被广泛使用的分子标记方法，但它也存在一些问题。制作SNP分析图理论上需要500个以上有代表性的个体，而SNP多态性低，所能提供的信息量少，需要分析标记的数量多，成本太高。
SNP主要的检测方法有阵列杂交分析、基因芯片技术、同源杂交、限制性酶切法、毛细管电泳、高效液相色谱和直接测序法等（李艳杰等，2003；贾玉艳等，2003；郭刚等，2004）。直接测序检测SNP通过对不同个体同一基因或基因片段进行测序和序列比较，以确定所研究的碱基是否变异，其检出率可100%。采用直接测序法，还可以得到SNP的类型及其准确位置等SNP分型所需要的重要参数。随着DNA测序自动化和测序成本的降低，直接测序法将越来越多地用于SNP的检测与分型。
3.4 分子标记技术在鱼类育种中的应用
3.4.1 遗传多样性及种质资源鉴定和管理
鱼类基因组杂合度高，存在着大量的多态性。以往所采用的形态解剖、生理生化等方法很难对水生动物品种的鉴定和分类、亲缘关系、进化变异进行准确的研究和分析，因而限制了水生动物种质资源的获得、保持、保护和充分利用，延缓了水生动物育种效率。而DNA分子标记技术使水生动物种质资源研究中的一些难题迎刃而解。
由各种DNA分子标记而衍生的DNA指纹技术在鉴定品种真实性和纯度等方面是很有效的。DNA指纹图谱能从遗传物质基础上，即从本质上反映生物个体差异的DNA电泳图谱，它具有高度个体特异性和稳定可靠性。通过对DNA指纹的比较以及借助相关计算机软件的聚类分析（Rice，1989；Page，1996；Schneider et al.，1997），可以对水生动物种、亚种、变种、品种和品系的进化与演化，亲缘关系进行分析。各种DNA分子标记均可用于遗传多样性分析，在水生动物上目前研究最多的是RAPD指纹图谱。易乐飞等（2002）对湛江近海约氏笛鲷自然群体的RAPD分析结果显示其多态位点比例、遗传多样性指数较高，说明约氏笛鲷（Lutjanus johni ）种质资源仍维持在较好水平。邹曙明等（2001）对牙鲆和大菱鲆养殖群体进行了RAPD分析，结果显示牙鲆和大菱鲆群体内个体间的平均遗传相似度为0.905和0.945，牙鲆群体内存在显著差异，而在大菱鲆群体内差异不显著，表明大菱鲆的种质较单一，存在近交衰退的危险。杨弘等（2002）用20个随机引物成功区分了日本鳗鱼（Anguilla japonicus）、欧洲鳗鱼（A.anguilla）、美洲鳗鱼（A.rostrata ）与形态学分析结果相一致。由于SSR和AFLP分辨率高，多态性强，重复性好，且效率高，作指纹图更为理想，近年来逐渐受到青睐（Ziekiewicz et al.，1994；Vos et al.，1995）。Sckino等（2000，2001）在牙鲆上开发了大量SSR标记，并利用SSR标记对其的遗传结构进行了分析，发现日本沿海牙鲆受人为因素干扰，遗传多样性较低。Liu等（1998）研究了标记在斑点（Ictalurus punctatus），长鳍（I.furcatus ），及其F1、F2和回交后代中的应用，结果AFLP表明具有丰富的多态位点、稳定的孟德尔遗传方式和良好的可重复性。王志勇等（2001）利用AFLP技术研究了我国沿海真鲷群体的遗传变异，结果显示北部湾群体的变异量最低，北部湾与威海群体的遗传差异显著，两者明显属于相互独立的不同亚种群。
3.4.2 亲子代遗传关系研究
应用各种遗传方法改造生物的遗传结构，培育优良品种已成为当前水生动物学研究的热点之一。人工雌核发育和人工诱导雄核发育可用于性别控制、快速建立家系，因而在多种水生动物中的相关工作已展开。利用杂交优势进行育种也是生物遗传改良的一个重要方面。但仅从形态学、细胞学等方面有时很难区分雄核发育及杂交种的亲子代遗传变异等关系，而DNA分子标记在此有广阔的应用空间。Felip等（2000）利用AFLP雄性特异带为标记对雌核发育出的鲈鱼子代进行了鉴定，通过4～11条特异带对3组子代进行了分析，结果显示雌核发育率第一组为89.5%，二、三组均为100%。Gross等（1996）对大西洋鲑（Salmosalar L.）、褐虹鳟（Salmotrutta L.）及它们的杂交种GnRH基因通过AluⅠ酶切之后，在杂交种中发现它包含了父母本的2个特异标记，可用于鉴定杂交种。
3.4.3 分子遗传图谱构建和QTL定位
遗传图谱是通过遗传重组交换结果进行连锁分析所得到的基因在染色体上相对位置的排列图。经典的遗传图谱是根据形态、生理和生化标记构建的，由于这些遗传标记的数量在作图群体的两亲本上极为有限，所以发展很缓慢，且图谱分辨率和饱和度都不高，应用价值有限。DNA分子标记用于遗传图谱的构建是遗传学领域最激动人心的重大进展之一。分子遗传图谱的构建是根据某一多态性DNA片段在分离群体中的分离情况的直接观察统计而实现的。分子遗传图谱比传统遗传图谱位点多，构建速度快，效率高，且不受发育阶段及环境条件的影响，发展相当迅速。随着新的DNA标记技术的发展，标记种类越来越多，密度越来越高。
遗传图谱的构建是遗传学研究的重要领域，也是遗传学研究的有力工具。完整的连锁图谱对于深入开展各种分子生物学研究是非常必要的，如标记辅助选择（MAS）、数量性状基因位点（QTL）图谱定位功能基因、杂交优势预测、基因组进化等。因此遗传图谱的构建和对基因组进行系统性研究，是动植物遗传育种和人类遗传疾病诊断和治疗的依据。1996年，美国水产经济动物基因组计划启动，首先提出中等密度遗传图谱构建国际合作构想，第一批包括3种鱼类（罗非鱼、鲑鳟鱼类、鲶），对虾（南美对虾、斑节对虾和日本对虾）和牡蛎（太平洋牡蛎、美洲牡蛎）。
鱼类分子遗传图谱的构建中的一个难题是其基因组高度杂合，很难获得纯系。“双假测交”理论解决了这一难题。其原理是：两杂合亲本杂交得到的F1的遗传位点已经产生分离重组，一些对亲本为杂合，而对另一亲本为纯合的基因座，在F1中1∶1分离，相当于“测交”，这些位点可用于构建两亲本的分子连锁图；而一些对两亲本为杂合的基因座，在F1中出现1∶2∶1或3∶1分离，这些基因座可用于构建两亲本共同的分子连锁图。由于人们对鱼类缺乏较多了解，加之适宜作图群体较难获得，鱼类遗传作图相对滞后。但鱼类的多年生特性允许在较长的一段时间内对同一材料进行作图研究，更多新增标记可陆续定位于图上，使得图谱的密度、饱和度逐渐增大。由于这些优势，近来鱼类分子遗传图谱构建的进展很快。鱼类是水生动物中开展基因组作图较早且进展最大的类群。其作图群体构建、图谱覆盖范围及密度均高于虾类和贝类。Kocher（1998）等发表了罗非鱼的第一个遗传连锁图，其中包括112个AFLP标记和一些微卫星标记。Nichols（2002）在雄核发育的双单倍体虹鳟的连锁图上加了700多个AFLP标记，220个微卫星标记，27个型标记，4个同工酶标记，使之成为了较为详细的连锁图谱。Wada等（1999）用170个标记座位产生了青鳉（Oryzia latipes ）的第一个连锁图，共有28个连锁群，覆盖2480cM基因组。由于青鳉作图群体是F1雄性与亲本交配得到的回交群体，所以是雄性遗传图谱。之后Ohtsuka等（1999）以RAPD为主的163个标记构建了雌性青鳉的连锁图谱，共26个连锁群，图距为776cM。Liu等（2003）应用418个AFLP标记建立了斑点叉尾（Ictalurus punctatus ）的遗传图谱，该图谱包含44个连锁群，总图距1593cM。Poompuang等（2004）首次报道了利用134个AFLP标记构建了步行鲶鱼（Clarias macroce Phalus ）的初级连锁图谱，共包含3个连锁群，总图距为2037.4cM，标记间平均距离为17.07cM。
大多数鱼类的重要经济性状表现为数量遗传特点，如品质、成熟期，生长快慢、抗病性等皆为数量性状。控制数量性状的基因称作数量性状基因座（QTL）。不同的数量性状，其QTL在基因组中的数量、位置和作用各不相同。数量遗传学是以统计推理为基础的，即将控制数量性状的多基因作为一整体，通过数理统计学的一级、二级统计来剖析、描述QTL遗传特征。由于常规遗传标记的局限性，难以对单个QTL的遗传效应进行追踪，而DNA分子标记技术及分子遗传图谱的迅猛发展，QTL作图方法也得到了发展。由于RFLP、AFLP、SSR等对水生动物没有表型效应，因而成为QTL作图的理想标记。当前水生动物QTL作图正处在起步阶段。Sakamoto等（1999）找到了与虹鳟产卵时间有关的13个微卫星标记，这13个标记分布于7个连锁组中，说明虹鳟产卵时间是多基因控制的。Ozaki等（2001）利用51个微卫星标记构建了虹鳟鱼的区域连锁图谱，并定位了2个与抗病相关的QTL。
3.4.4 基因定位克隆
遗传标记最主要的应用之一是克隆基因。利用高信息量的DNA分子标记以及NIL、BSA和比较基因组作图等新技术，获得与目标基因紧密连锁的分子标记，并以之为探针筛选大片段基因组文库，通过染色体步移或染色体登陆来克隆基因的方法称作定位克隆（Map-based cloning）。这种方法可以在未知基因产物的条件下分离控制生物质量和数量性状的基因，近来受到众多发育学家和育种学家的青睐，已成为分离发育控制和重要质量和数量性状基因的最常用方法之一。在鱼类这方面的研究起步较晚，但随着鱼类分子遗传图谱、基因标记研究的深入，其重要基因的定位克隆在不远的将来会有所突破。而基因定位克隆的前提是构建大片段的鱼类基因组文库，这方面已经有一些研究工作（Morizot et al.，1998；Donovan et al.，2000；Nechiporuk et al.，2003）。如Donovan等（2000）从斑马鱼（Danio rerio ）中定位克隆了一个在脊椎动物中比较保守的铁离子转运蛋白基因。
3.4.5 分子标记辅助选择育种
遗传学家们很早就曾提出利用遗传标记和遗传图谱进行辅助选择以加速生物遗传改良进程的理论。标记辅助选择（MAS）就是通过遗传标记对目标性状实施间接选择。从理论上讲，当标记所示的加和性变异的分数超过狭义遗传力时，标记辅助选择则优于传统的遗传选育法。标记辅助选择有效的前提是标记与目标性状紧密连锁。常规遗传标记很难实现这点，而DNA分子标记信息量大、扫描遗传位点多、且用之选择不受其他基因效应、内外环境因素以及基因表达与否等因素的影响，分析结果准确可靠，可在早期进行选择，从而大大缩短育种周期，必将成为水生动物育种工作中的有效工具。一般认为应用传统选育技术，每代的遗传获得率通常在10%～15%，但分子标记选择育种技术可明显提高选育进度，特别是那些靠传统的表型工具难以度量的性状。梁利群等（1997）用70个随机引物分别对黑龙江野鲤、荷包红鲤抗寒品系和荷包红鲤3种鱼的基因组DNA进行抗寒性状的RAPD分析，其中2个引物扩增出的结果具有特异性带型，即荷包红鲤抗寒品系和黑龙江野鲤具有而荷包红鲤没有的特殊带型，很显然这些带型表示黑龙江野鲤把遗传物质传给了荷包红鲤抗寒品系，控制荷包红鲤抗寒品系抗寒性状的基因也应在这些特异带型之中或与之相关。这些不同的DNA片段有多少与鲤类耐寒有关还需要进一步研究。可以肯定，对荷包红鲤抗寒品系和黑龙江野鲤所具有而荷包红鲤没有的特异性DNA带型及相关DNA片段深入研究下去，是能建立抗寒性状与RAPD图谱之间的连锁关系，进而克隆出与鱼类耐寒性状有关的主基因，并把这种基因用于一些不耐寒鱼类的遗传改良研究。
MAS在鱼类育种中可以应用于杂交亲本的选配、杂种后代的早期鉴定选择、染色体片段去向追踪、遗传转化中目的基因的检测、多种抗病性状的同时筛选等方面。
3.4.6 比较基因组学
DNA分子标记技术的发展及其在遗传学研究的广泛应用推动了一门遗传学的分支学科——比较基因组学的产生和发展。比较基因组研究主要是利用相同的DNA分子标记在相关物种之间进行遗传或物理作图，比较这些标记在不同物种基因组中的分布特点，揭示染色体或其片段上的基因及其排列顺序的相同或相似性，并据此对相关物种的基因组结构和起源进化进行分析。比较基因组研究使得传统遗传学突破了物种的框架，发展成为新的系统遗传学。除了其对物种进化研究上的重大意义外，它也推动了整个生物遗传学的研究，使得人们对模式物种基因组研究的结果能很快推广到相关物种上去。目前在鱼类中，已经开展了斑马鱼与人类和其他动物基因组的比较研究（Postlethwait et al，1998）。红鳍东方鲀（Fugu rubripes ）的基因组由于小而且致密，本身又是脊椎动物，对其进行比较基因组学的研究较多（Brenner et al.，1993；Elgar et al.，1996；Brunner et al.，1999；Gilley et al.，1999；Yamaguchi et al.，1999），必将为克隆人类致病基因、抗衰老和药物开发等领域作出贡献。比较基因组学研究还可以清晰地提供鱼类各自类群以及相互之间基因组水平上的进化关系，克隆、鉴定质量和数量性状座位，达到高产、抗逆、环保、健康的目的。
参考文献
郭刚，姚华，朱滨.2004.DNA芯片技术与SNP分析［J］.国外医学卫生学分册，31（1）：59-62.
何平.1998.真核生物中的微卫星及其应用［J］.遗传，20（4）：42-47.
贾玉艳，陈宏.2003.SNP分子标记的研究及应用［J］.黄牛杂志，29（1）：42-45.
李晶炤，何平，李仕贵，等.2000.利用微卫星标记鉴定杂交水稻冈优22种子纯度的研究［J］.生物工程学报，16（2）：211-214.
李晓辉，李新海，李文华，等.2003.SSR标记技术在玉米杂交种种子纯度测定中的应用［J］.作物学报，29（1）：63-68.
李艳杰，龙火生，李影，杨公社.2003.单核苷酸多态性（SNP）的研究进展和应用［J］.畜牧兽医杂志，22（4）：16-18.
李永强，李宏伟，高丽锋，等.2004.基于表达序列标签的微卫星标记（EST-SSRs）研究进展［J］.植物遗传资源学报，5（1）：91-95.
李永强.2004.基于表达序列标签的微卫星标记EST-SSR研究进展［J］.植物遗传资源学报，5（1）：91-95.
李云海.1999.用微卫星DNA标记检测中国主要杂交水稻亲本的遗传差异［J］.植物学报，41（10）：1061-1066.
梁利群，孙孝文.1997.鲤鱼抗寒性状的RAPD分析［J］.中国水产科学，4（3）：89-91.
刘华，贾继增.1997.指纹图语在作物品种鉴定中的应用［J］.作物品种资源（2）：45-48.
刘殊，程慧，王飞，等.2002.我国杂交水稻主要恢复系的DNA多态性研究［J］.中国水稻科学，16（1）：1-5.
骆蒙，贾继增.2000.国际麦类基因组EST计划研究进展［J］.中国农业科学，33（6）：l10-l12.
倪静，尤锋，张培军，等.2006.牙鲆GH基因外显子多态性与生长性状关系的初步研究［J］.高技术通讯，16（3）：307-312.
闰华超，等.2006.分子标记技术的发展及应用［J］.生物学通报，41（2）：17-19.
唐玉海，郭春芳，张木清.2006.相关序列扩增多态性（SRAP）标记及其应用研究进展［J］.增刊：237-238.
田义柯，等.2000.DNA分子标记技术及其原理［J］.莱阳农学院报，17（3）：176-179.
王芳，周延清.2008.TRAP标记技术在植物研究中的应用［J］.河北农业科学，6：15-18.
王印肖，徐秀琴，纬宏伟.2006.分子标记在品种鉴定中的应用及前景［J］.河北林业科技，增刊.
王志勇，王艺磊，林利民.2001.利用AFLP指纹技术研究中国沿海真鲷群体的遗传变异和趋异［J］.水产学报，25（4）：289-293.
徐安毕，王丈泉.2007.几种分子标记方法相结合建立的新的分子标记方法［J］.生物学通报，42（1）：26-28.
许云华，等.2003.DNA分子标记技术及其原理［J］.连云港师范高等专科学校学报，9（3）：78-82.
杨弘，王希道，吴婷婷，等.2002.用RAPD技术研究3种鳗鱼的种质鉴定［J］.中国水产科学，9（3）：269-272.
易乐飞，刘楚吾，吕立强.2002.约氏笛鲷自然群体遗传多样性的RAPD分析［J］.中国水产科学，9（4）：379-381.
赵淑清.2000.DNA分子标记和基因定位［J］.生物技术通报（6）：1-4.
赵勇，杨凯，Akbar arc cheema，等.2002.利用水稻功能基因SSR标记鉴定水稻种质资源［J］.中国农业科学，35（4）：349-353.
朱振东，贾继增.2003.小麦SSR标记的发展及应用［J］.遗传，25（3）：355-360.
朱作峰.2002.用SSR标记比较亚洲栽培稻与普通野生稻的遗传多样性［J］.中国农业科学，35（12）：1437-1441.
邹曙明，李思发，蔡完其.2001.牙鲆和大菱鲆养殖群体的分子标记和遗传变异［J］.中国水产科学，7（4）：6-9.
Adams M D，Kelley J M，Gocayne J D，et a1.1991.Complementary DNA sequencing：expressed sequence tags and human genome project［J］.Science，252（5013）：1651-1656.
Brenner S，Elgar G，Sandford R，et al.1993.Characterization of the pufferfish （Fugu ）genome as a compact model vertebrate genome［J］.Nature，366：265-268.
Brunner B，Todt T，Lenzner S，et al.1999.Genomic structure and comparative analysis of nine Fugu genes：conservation of synteny with human chromosome Xp22.2-p22.1［J］.Genome Res，9：437-448.
Donovan A，Brownlie A，Zhou Y，et al.2000.Positional cloning of zebrafish ferroportin 1 identifies a conserved vertebrate iron exporter［J］.Nature，402：776-781.
Elgar G，Sandford R，Aparicio S，et al.1996.Smallis beautiful：comparative genomics with the pufferfish（Fugu rubripes ）［J］.Trends Genet，12：145-150.
Felip A，Martinez-Rodriguez G，Piferrer F，et al.2000.AFL Panalysis confirms exclusive maternal genomic contribution of Meiogyno genetic Sea Bass（Dicentrarchu labrax L.）［J］.Marine Biotechnology，2：301-306.
Gilley J，Fried M.1999.Extensive gene order differences with in regions of conserved synteny between the Fugu and human genomes：implication from chromosomal evolution and the cloning of disease genes［J］.Hum Mol Genet，8：1313-1320.
Gross R，Nilsson J，Schmitz M.1996.A new species-specific nuclear DNA marker for identification of hybrid between Atlantic salmon and brown Trout［J］.Journal of Fish Biology，49：537-540.
Kocher T D，Lee W J，Sobolewska H，et al.1998.A genetic linkage map of a cichlid fish，the tilapia（Oreochromis niloticus ）［J］.Genetics，148：1225-1232.
Liu Z，Karsi A，Li P，et al.2003.An AFLP-based genetic linkage map of channel catfish （Ictalurus punctatus ）constructed by using an interspecific hybrid resource family［J］.Genetics，165：687-694.
Liu Z，Nichols A，Li P，et al.1998.Inheritance and usefulness of AFL Pmarkers in channel catfish （Ictalurus punctatus ），blue catfish（I.Furcatus ），and their F1，F2，and backcross hybrids［J］.Molecular General Genetics，258：260-268.
Milee Agarwal，Neeta Shrivastava，Hariah Padh.2008.Advances in molecular marker techniques and their applications in plant sciences ［J］.Plant Cell Rep，27：617-631.
Morizot D C，Mcentire B B，Dellacoletta L，et al.1998.Mapping of tyrosine kinase gene family members in a Xiphophorus melanoma model［J］.Mol Carcinog，22：150-157.
Nechiporuk A，Poss K D，Johnson S L，et al.2003.Positional cloning of a temperature-sensitive mutant emmental reveals a role for sly 1 during cell proliferation in zebra fish fin regeneration［J］.Developmental Biology，258（2）：291-306.
Nichols K.2002.Plant，animal and microbe genome X［M］.USA：Proceeding of San Diego，234-251.
Ohtsuka M，Makino S，Yoda K，et al.1999.Construction of a linkage map of the medaka （Oryzias latipes ） and mapping of the Da mutant locus defective in dorsoventral patlerning［J］.Genome Res，9：1277-1287.
Ozaki A，Sakamoto T，Khoo S，et al.2001.Quantitative trait loci（QTL） associated with resistance/susceptibility to infectious pancreatic necrosis virus（IPNV） in rainbow trout （Oncorhynchus mykiss ）［J］.Mol genet Genomics，265：23-31.
Page R D M.1996.Treeview：An application to display phylogenetic trees on personal computers［J］.Comp Appl Biosci，12：357-358.
Poompuang S，Na-Nakorn U.2004.A preliminary genetic map of walking catfish （Clarias macroce Phalus ）［J］.Aquaculture，232：195-203.
Postlethwait J H，Yan Y L，Gate M A，et al.1998.Vertebrate genome evolution and the zebrafish gene map［J］.Nature Genet，18：345-349.
Rice R W.1989.Analyzing tables of statistical tests［J］.Evolution，43：223-225.
Sakamoto T，Danzmann R G.Okamoto N，et al.1999.Linkage analysis of quantitative trait loci associated with spawning time in rainbow trout （Oncorhynchus mykiss ）［J］.Aquaculture，173：33-43.
Schneider S，Kueffer J M，Roessli D，et al.1997.A software for population genetic data analysis［M］.Switzerland：Genetics and Biometry Laboratory，University of Geneva.
Scott K V，Eggler P，Seaton G，et al.2000.Analysis of SSRs derived from grape ESTs［J］.Theor Appl Genet，（100）：723-726.
Sekino M，Hara M.2000.Isolation and characterization of microsatellite DNA loci in Japanese flounder Paralichthys olivaceus （Pleuronectiformes，Pleuronectoidei，Paralichthyidae）［J］.Mol Ecol，9：2200-2202.
Sekino M，Hara M.2001.Application of microsatellite markers to population genetics studies of Japanes flounder Paralichthys olivaceus ［J］.Marine Biotechnology，3：572-589.
Vos P，Hogers R，Bleeker M，et al.1995.AFLP：A new technique for DNA fingerprinting［J］.Nucleic Acid Research，23（21）：4407-4414.
Wada H，Naruse K，Shimada A，et al.1999.Genetic linkage map of a fish，the Japanese medaka Oryzias latipes ［J］.Mol Mar Biol Biotechnol，4：269-274.
Welsh J，Mcclelland M.1990.Fingerprinting genomea using PCR with arbitrary primers［J］.Nucleic Acids Res.，18：7231-7281.
Willam J G K，Kubelik A R，Livak K J.1990.DNA polymorphisms amplified by arbitary primers and useful as genetic markers ［ J ］.Nucleic Acids Res.，18：6531-6535.
Yamaguchi F，Yamaguchi K，Tokuda H，et al.1999.Molecular cloning EDG-3 and N-Shc genes from the pufferfish，Fugu rubripes ，and conservation of synteny with the human genome［J］.FEBS Letter，459：105-110.
Zabesu M，Voa P.1993.Selective restriction fragment amplication：A general method for DNA fingerprinting［P］.Europeau Patent Application.No.0534858 Al，Application.No.0534858 Al.
Ziekiewicz E，Rafalski A，Labuda D.1994，Genome fingerprinting by simple sequence repeat（SSR） anchored polymerase chain reaction amplification［J］.Genomics，20：176-183.
Zietkiewicz E，Yotova V，Jarnik M，et al.1997.Nuclear DNA diversity in worldwide distributed human populations［J］.Gene，（205）：161-171.
4 EST-SSR标记构建的原理及方法
4.1 EST技术及其应用
4.1.1 EST技术的概念
EST是长约150～500bp的基因表达序列片段。EST技术是将mRNA反转录成cDNA并克隆到载体构建成cDNA文库后，大规模随机挑选cDNA克隆，对其5′或3′端进行一步法测序，所获序列与基因数据库已知序列比较，从而获得对生物体生长发育、繁殖分化、遗传变异、衰老死亡等一系列生命过程认识的技术。EST是基因的“窗口”，可代表生物体某种组织某一时间的一个表达基因，故被称之为“表达序列标签（expressed sequence tags，EST）”（Adams，1991）。
4.1.2 EST技术的原理和方法
基因表达遵从中心法则，即遗传信息由DNA序列经转录、剪接后流向mRNA，再经翻译，产生有功能的蛋白质。一个典型的真核生物mRNA分子由5′-UTR（5′非翻译区），ORF（开放阅读框架），3′-UTR（3′非翻译区）和polyA四部分组成；其cDNA具有对应的结构。对于任何一个基因，其5′-UTR和3′-UTR都是特定的，即每条cDNA的5′端或3′端的有限序列即可特异性地代表生物体某种组织某个时期的一个表达基因。来自某一组织的足够数量的ESTs即可代表某组织中的基因的表达情况。多数情况下，某组织的总体ESTs中的某一种cDNA的测量次数可以代表它在该组织中的表达丰度。White等（2000）将这种以cDNA测序来估计基因表达水平的方法称为“电子northern”（electronic northern）或“数字northern”（digital northern）。其基本原理是：基因X高水平表达将导致高水平的mRNAX，而与mRNAX相对应的cDNA在cDNA文库中的含量也会很丰富。所以在对cDNA文库中的大量克隆随机测序后，统计与基因X的mRNA相对应的EST数目就可估计原先mRNA群体中的mRNAX的丰度。而且，以与mRNAX相对应EST的数目除以所得到的EST总数，就可得到mRNAX绝对丰度的估计值。具体方法是首先从组织细胞中提取总mRNA，构建成标准cDNA文库，然后从中挑取大量克隆，利用载体通用引物测插入载体的cDNA片段5’端或3’端300～500碱基的序列。将测序所得的EST与dbEST等数据库中的数据进行比较分析，根据核酸或蛋白质序列的同源性比较，可以鉴定出哪些EST代表已知基因，哪些EST代表未知基因，并对所得EST进行基因表达丰度分析。
4.1.3 EST数据库
数据库是生物信息学的主要内容，从数据库的种类来看，核酸和蛋白质序列数据库是最基本的数据库。目前较为常用的核酸序列数据库有：美国国家信息中心的GenBank（http：//www.ncbi.nlm.nih/entrez），收录所有生物的ESTs；欧洲分子生物学试验室的EMBL，日本国家数据库DDBJ，这3个数据库是收录范围最广并完全向公众开放的数据库，在它们中均含有EST子数据库dbEST。在核酸序列数据库中，EST的量要占65%以上（Leipe，1996）。中国于1996年在北京大学建立了生物信息中心CBI（罗静初等，1998），引进了核酸蛋白质序列、结构等近40个数据库，作为EMBL的节点，建立了镜像系统，具有多种服务功能。在各综合数据库中，EST的增长速度最快，1991年在各个公共数据库中的EST数目不足2000条，到2004年，在最大的国际公共数据库GenBank中EST数量已增至23024916条（http：//www. ncbi. him. nih. gov/dbEST_summary.html）。数据库的发展除了具有增长与更新速度快、复杂度与网络化程度高的特点外，数据库的专门化也是一种趋势，即建立特定物种和特定内容的数据库（Gelbart，1998）。如作物研究数据库GrainGenes，包括小麦、玉米、大豆基因组子数据库等。拟南芥和水稻由于其在基因组研究中的特殊作用，也有许多独立的数据库和子数据库。
4.1.4 EST序列分析软件
在EST研究中，使用最多的方法就是序列相似性比较，以此来确定EST的功能。BLAST（Basic Local Alignment Search Tool）是应用较广的工具软件之一，为同源分析的软件包，包括有BLAST N，BLAST P，TBLASTN，TBLASTX，BLASTX等5个软件（夏云等，1997）。其中BLASTN、TBLASTX和BLASTX是为核酸序列查询设计的，在EST分析中都要用到；BLASTP和TBLASTN是为蛋白质序列设计的。BLASTN是待查询序列及其互补序列一起对库查询，速度快但灵敏度不高，BLASTX是将待查询序列按6种可能的阅读框架进行翻译，然后对蛋白质序列进行查询，该软件灵敏度高、对序列错误的忍耐性也大。在进行EST分析时，同时使用BLASTN和BLASTX会得到较准确的结果。TBLASTX是对待查序列和所有核酸序列库中的序列进行6个读码框的翻译，然后在蛋白质水平上比较。由于该软件运用计算资源量大，检索比较昂贵，所以用其查询只限于对dbEST。
4.1.5 EST技术的应用
4.1.5.1 ESTs与基因识别
EST技术最常见的用途是基因识别，传统的全基因组测序并不是发现基因最有效率的方法，这一方法显得即昂贵又费时。因为基因组中只有2%的序列编码蛋白质，因此一部分科学家支持首先对基因的转录产物进行大规模测序，即从真正编码蛋白质的mRNA出发，构建各种cDNA文库，并对库中的克隆进行大规模测序（Schuler，1997）。Adams等（1991）提出的表达序列标签的概念标志着大规模cDNA测序时代的到来。虽然ESTs序列数据对不精确，精确度最高为97%（Hillier et al.，1996），但实践证明EST技术可大大加速新基因的发现与研究。Medzhitov等（1997）通过果蝇黑胃TOLL蛋白进行dbEST数据库检索，该蛋白已证实在成熟果蝇抗真菌反应中发挥重要作用（Lemaitre et al.，1996），通过同源分析的方法，找到相应的人类同源EST（登录号为H48602），这为接下来研究人类TOLL同源蛋白的功能提供了很好的条件。hMSH5基因是从酿酒酵母菌MSH5存在30%的一致性（Her and Doggett，1998），它与hMSH4特异性相互作用，在减数分裂和精子发生过程中发挥一定的作用（Bocker et al.，1999）。由此可见，应用EST技术，可以跳过生物分类学的界限，从生物模型的已识别基因迅速克隆出人和小鼠基因组相应的更复杂的未知基因。生物间在核苷酸水平上的进货差异阻碍了传统意义上的杂交或以PCR为基础的基因克隆策略，即使是亲缘关系很接近的生物也不例外，如C.elegans和C.briggsae（Kuwabara and Shah，1994），它们仅在2000万～5000万年前分化形成（Heschl and Baillie，1990）。而通过计算机进行dbEST进行数据库筛选，其配制是电子杂交试验，提供了一条更为广泛的基因识别路线，这一路线允许基因组间存在差异，这使得基因识别与新基因克隆策略发生革命性变化，同时它也提供了一个足够大小和复杂的基因数据库，目前，ESTs数量正以平均每月10万条的速度递增。
4.1.5.2 ESTs和物理图谱构建
ESTs在多种以基因为基础的人和植物基因组物理图谱构建中扮演着重要角色（Schuler et al.，1997；Agyare et al.，1997）。在这一应用中，从ESTs发展起来的PCR或杂交分析可用来识别YACs、BACs或其他含有大片段插入克隆类型的载体（Schuler et al.，1997），它们是构建基因组物理图谱的基础，将EST与基因组物理图谱相比较即可辨认出含有剩余基因序列的基因组区间，包括调控基因表达的DNA控制元件，对这些元件进行分析就有可能获得对基因功能的详细了解。物理图谱与遗传图谱间的相互参考，形成一个用途更广泛的综合资源，获得这张综合图谱后，研究人员就可以孟德尔遗传特征为基础，将相关基因定位在基因组区间上，并且通过查询以ESTs为基础的物理图谱，即可获得这一区间上所有基因的名单。该综合资源用途的大小取决于EST数据库中拥有的基因数目。目前人和小鼠EST的不断扩充使其应用更加广泛和便捷。
4.1.5.3 ESTs和基因组序列注释
EST数据库并非完美无瑕，因为ESTs不能被剪切为单列序列位点识读，故精确度只能达到97%（Hillier et al.，1996）。另外，ESTs受制于表达倾向（expression bias），因为产生ESTs的cDNA是组织中丰富的mRNA以一定比例反转录而成，因此，表达水平很低的基因无法在EST数据库中找到，而表达量高的基因在EST数据库中却过量存在。虽然可在起始mRNA或由它合成双链cDNA时进行富集，减小cDNA文库，但cDNA文库中仍存在大量高丰度的cDNA克隆。因此，一个理想的cDNA文库必须去除或尽量消除多余信息克隆的影响，这就涉及cDNA文库的前加工技术；均等化（normalization），减少与丰富编码基因相关的cDNA数目（Bonaldo et al.，1996）；消减杂交（subtractive hybridization），应用序列标记cDNA识别并去除文库中多余的克隆，这些技术的发展，使基因识别更依赖于EST技术，甚至可通过该技术获得精确的基因组DNA序列，在华盛顿大学基因组测序中心和Sanger中心的联合攻关下，C.elegans基因组10亿个碱基对的测序工作基本完成。因此ESTs是一系列基因寻找工具中不可缺少后部分，而这些工具都是基因组序列为基础的（Waterston et al.，1992；Mccombie et al.，1992）。EST技术关于基因组DNA序列的其他应用还包括对基因内含子、外显子排列的精确预测，选择性接合事件的识别，反常基因组排列结构的识别等。
4.1.5.4 发现新基因
利用EST发现新基因也被称为基因的电子克隆（in silicon cloning），也有人称为电脑克隆或电子延伸。是与定位克隆、定位候选克隆策略并列的方法之一，基本方法是利用计算机来协助克隆基因，采用生物信息学的方法延伸EST序列，找到属于同一基因的所有的EST片段，然后将它们连接起来，以获得基因部分乃至全长的cDNA序列，这样就可假定为找到了一个新基因。依托复旦大学生命科学院的上海博容基因开发有限公司，新近建成了我国第一个人类基因数据库。该数据库可直接从基因测序设备上自动采集基因数据，并通过一系列工具软件进行基因序列拼接、同源基因比较、蛋白分析、染色体定位，能够方便地进行基因的“电子克隆”，并能调集国内外关于某基因研究的各种信息，为每条基因自动生成一个内容丰富的“档案”。它不仅可向研究人员提供某条基因的详尽信息，而且还可为研究人员筛选有重要药物开发价值的基因，为基因诊断、基因治疗研究与开发提供靶基因。但由于进行电子克隆程序设计复杂，计算量巨大，一般的PC机难以完成任务，因此很多基因组学和分子生物学网站开始提供网上电子克隆服务，已经公布如http：//www.hgmp.mrc.ac.uk/ESTblastTutorial/index.html，只要把自己感兴趣的序列通过网络提交，等待返回结果即可。
4.1.5.5 从EST中发掘SSR标记
由于SSR分布遍及真核生物的编码区和非编码区。在试验基础开发SSR标记，需要经过文库的构建，含有SSR克隆的识别和筛选、序列的测序并分析、引物设计、PCR引物检测、应用SSR标记等六大步，步骤繁琐而且还需要投入大量的人力物力。大量的公共的EST不仅SSR为标记的开发提供了丰富的资源，也为研究节约了时间和经费。
科研工作者已经意识到从EST中发掘SSR标记的重要意义，一些物种的EST-SSR合作组织相继成立，如小麦EST-SSR合作组织（http：//wheat.pw.usda.gov/ITMI/2002/EST SSR/）。同时一些发掘SSR的程序也开发出来，如USDA-ARS生物信息中心开发的SSRIT（http：//www.gramme.org/gramene/searches/ssrtool）、华盛顿大学的Abajian博士开发的Sputnik软件（http：//www.abajian.net/sputnik）SSRIT可发掘1～10个碱基为重复单元的没有插入、缺失和错配的SSR标记；Sputnik可以寻找2～5个碱基为重复单元的SSR标记，允许一定程度的插入、缺失和错配。
4.1.5.6 从EST中发掘单核苷酸多态性（SNP）
单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms，SNP）是指同一位点的不同基因之间只有一个核普酸的差异或只有一个碱基的插入、缺失。有人将SNP标记称为第三代DNA分子标记。SNP不仅分布在非编码区，而且还分布在编码区，存在于编码区的SNP称为cSNP，被认为是应用前景最好的遗传标记物。EST是随机挑选cDNA克隆单侧测序得到的，来自不同的cDNA文库和不同个体的大量冗余的EST中发掘SNP很好的资源。目前，在玉米（Barker et al.，2003）、水稻（杨伦等，2004）、大麦（Kota et al.，2001）等植物中已有EST-SNP的开发报道。
4.1.5.7 利用EST来寻找物种间差异基因
根据比较基因学研究结果，各种近缘生物在基因组成、基因在基因组中的排列顺序等宏观水平存在高度共线性。不同物种的大量的EST比较是寻找物种间差异基因的有效方法。Ewing等利用Genbank中获得的大量拟南芥和水稻EST分析了这两个物种间的差异，最终发现来自拟南芥的1138类序列和来自水稻的950类序列交叉聚成了521个大类（22359条）。这521个大类所包含的序列分别占拟南芥多拷贝序列的58.6%和水稻多拷贝序列的58.3%。表明两个物种在参与高等植物基础代谢的基因具有很高的同源性（Ewing et al.，1999/2000）。
4.2 EST-SSR标记及研究进展
4.2.1 EST-SSR开发方法
4.2.1.1 EST序列的来源
目前，EST数据库提供了大量的EST序列，包括EMBL数据库中的EST部分和GeneBank中的dbEST，均可以从网上直接下载。
4.2.1.2 EST数据的聚类和拼接
对所有录用的ESTs进行质量控制，首先要排除那些质量低的序列。如Thiel等（2003）所述，对应于真核生物mRNA polyA-tails，ESTs序列5′-或3′-端会相应地带有polyA和polyT，要先将polyA和polyT去掉，直到在50 bp大小窗口看到的5′和3′端polyA和ployT不超过（T）5，或（A）5，之后，删除序列长度小于100bp的ESTs，对大于700bp的ESTs，为防止在后续序列加工过程中影响序列质量要在其3′端进行截短处理。如果提交序列含有载体部分，还需要去除载体序列。当然，非目标生物的序列也必须排除在外。除此之外，在cDNA文库中，还有大量的冗余EST存在，而这些数据往往是无用的，反而由于可能存在大量的错误而难以处理。因此，在对EST序列数据进行前处理后，还需对冗余的EST序列进行聚类和拼接。目前，常用phrap、cap 3和Staden Package等软件进行聚类和拼接（胡松年，2005）。
4.2.1.3 发掘EST-SSR
并非全部的EST都可用来设计SSR引物，这需要从EST中发现合适的简单重复序列。首先利用SSR鉴定软件对所需要种类的ESTs数据库进行可利用性筛选。常用的SSR搜索软件有Simple Sequence Repeat Identification Tool；MISA（http：//pgrc.jpk-gatersleben.de/misa）；SSRFinder（http：//www.maizemap.org/bioinformatjcs/SSRFINDER/）；SSRIT（Cornell University网址http：//www.gramene.org/gramene/searches/ssrtool）等。利用SSRIT软件能够得到如下信息：ESTs的名称，重复碱基，重复次数，重复碱基在ESTs中开始和结束的位置以及该基因的功能。
4.2.1.4 EST-SSR引物设计
将聚类拼接后的拼接序列和单序列返回到EST数据库，以延长序列一致性或将单序列合并入新的或已经存在的类群中，从而得到更丰富的信息。然后，用BLAST对EST-SSR序列与EST数据进行两两比较，E-value<10-3或至少30个碱基中90%一致的ESTs再次合并到含有SSR的EST数据集中，用StackPACK进一步聚类。最后，用Premier3.0、Premier 5.0、Oligo等软件设计引物。
通常SSR旁侧序列在物种中是相对保守的，可以据此设计引物，但需剔除那些不能满足设计引物要求的SSR旁侧序列过短的EST。另外，为提高检测效率，应尽量选择重复次数较多的SSR。设计引物时为使设计的每对引物能够和目标区域特异性结合，应对GC含量、退火温度、引物长度和产物长度等参数限定标准。
4.2.1.5 EST-SSR引物的验证
引物设计后，还需通过试验来验证其有效性。通过优化退火温度、Mg2+浓度、引物量与模板量等条件，建立合适的EST-SSR标记的PCR反应体系。为能准确检测出SSR多态性，目前的EST-SSR标记研究中常采用分辨率较高的聚丙烯酰胺凝胶电泳来分离。但是，这种电泳方法也不能检测出由于碱基突变而产生的多态性，故可使用单链构象多态（SSCP）技术检测。在验证EST-SSR是否有效时，可在电泳时加入标准分子量来估算产物大小。若与预期长度一致，即可认为是特异性扩增。但有时也会出现大于预期长度的片段，可能是由于有内含子插入引起的，这时可对产物进行回收测序来验证。
4.2.1.6 EST-SSR功能分析
ESTs是cDNA克隆部分序列，与公共数据库中序列进行相似性比较，是发现新基因和赋予其他基因可能功能的一条有效途径。通常通过EST与GeneBank（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）中非冗余蛋白或核酸库进行相似性比较〔TblastX或blastN（e-value<10-08or<10-15）〕分析EST-SSR可能的功能。
4.2.2 EST-SSR标记的特性
4.2.2.1 EST-SSR的分布频率与特点
在分析EST-SSR的信息时，其分布频率和特点会由于限定的标准不同而发生很大变化。Rota等（Rota et al.，2005）对水稻的研究发现，不同的最小SSR长度标准，含有EST-SSR序列的比例会随着长度的不同而显著变化，各种不同类型的重复基元的比例也会发生改变。当水稻的重复基元长度不小于12bp的标准变为不小于30bp时，含有EST-SSR的序列从50%减少到1%；同时，二核苷酸重复与三核苷酸重复数量由相差10倍到基本接近，主导的重复基元类型由CCG变为AG重复。
EST-SSR在各种生物中的分布频率差异很大，从3.4kb/个（Cardle et al.，2004）到28.32kb/个（Gao et al.，2003）。不同的物种中，重复类型也存在很大差异。一般EST-SSR的主要重复类型为二、三、四重复，其中二、三重复类型的频率最高，为主导类型。目前，植物中报道的最多重复大部分为三核苷酸重复。如Varshney（2002）指出许多谷类作物中三核苷酸的频率高达54%～78%，其次为二核苷酸重复，频率为17.1%～40.4%。但在猕猴桃（Fraser et al.，2004）和茶树（金基强等，2006）等植物中以二核苷酸重复为主。多以AG/CT为主要重复基元。不同物种中三核苷酸重复的主要重复基元类型变化较大。如Yu等（2004）指出小麦的三核苷酸重复74%在编码区，20%在5′非翻译区，6%在3′非翻译区，比较而言，二核苷酸重复只有19%在编码区，在5′非翻译区和3′非翻译区分别占42%和39%。三核苷酸的高比例可能是由于当SSR长度发生改变时，编码区对突变的承受力低于UTR，即三核苷酸重复一般不会引起移码突变。
4.2.2.2 扩增率与无效等位基因
目前，引物设计还不十分科学，据报道在基因组和EST-SSR中只有60%～90%成功扩增（Thiel et al.，2003；Yu et al.，2004；Saha et al.，2004；Cordeiro et al.，2001；Gupta et al.，2003）。原因有以下几方面：
1.EST-SSR的一个或两个引物延伸到剪切位点。
2.基因组DNA序列中存在大量内含子。
3.从嵌合体的cDNA克隆中分离引物。
4.通过拼接得到的contig，设计出来的引物也可能扩增不出产物。有些产物的长度比预期产物大，可能是其中有一长度较小的内含子引起的。因此，用于设计引物的EST序列的质量是非常重要的。据调查，9%以上的谷类EST是低质量的（Sreenivasulu et al.，2002），不能用于EST-SSR引物的设计（Thiel et al.，2003）。
此外，同基因组SSR相比，扩增产物时常偏离期望值。这可能是由相应基因组序列中存在内含子或基因组序列缺失引起的（Saha et al.，2004）。EST中大量插入或缺失的基因序列均能充分改变扩增产物大小，琼脂糖凝胶电检测就可显示多态性，此种方法与丙烯酰胺凝胶相比，很大程度上缩减了花费并增加了处理量（Yu et al.，2004）。
在猕猴桃（Fraser，2004）和赤松（Rungis et al.，2004）的EST-SSR标记研究中检测到无效等位基因。在欧洲牡蛎（Launey et al.，2002）和长牡蛎（Hedgecock et al.，2004）的研究中也发现了无效等位基因。出现无效等位基因的原因可能有：①特定基因座位微卫星的缺失（Callen et al.，1993）；②引物结合位点的突变（缺失或置换）（Lehman et al.，1996）。由于杂合子不能被识别且不能检测到错误反应，无效等位基因的存在使得翻译分离数据更为复杂。后者将导致偏离孟德尔分离定律的期望值（Fraser，2004）。
4.2.2.3 多态性水平
EST-SSR的重复次数与PCR扩增产物的多态性有密切关系。Thiel等（2003）对大麦EST-SSR标记的研究表明，当二核苷酸重复在6～8次时，多态性在50%左右，当是更长一些的SSR时，多态性显著提高至80%以上；三核苷酸重复和四核苷酸重复由5次增至6次时，多态性也显著提高。Xu等（1999）对斑节对虾的研究结果表明，重复次数较少的微卫星标记多为单态性或等位基因数目较少，多态性含量也偏低。因此，为提高扩增效率，在设计EST-SSR引物时，尽可能选择重复次数较多和完全重复的SSR。
一些报道中指出由于转录区域大量DNA序列是保守的，EST-SSR标记的多态性要低于基因组SSR标记（Cho and Ishii，2000；Pérez et al.，2005）。一般来源于3′UTR的EST-SSR多态性高于5′UTR区域（Holton et al.，2002） 。这是因为在cDNA文库建立过程中末端出现了polyT，致使3′非翻译区较5′非翻译区更容易产生变异。Scott等（2000）报道不同群体中来源于3′UTR、5′UTR和编码序列的微卫星多态性有很大差异，来源于3′UTR区域的EST-SSR在培育种类具有高度多态性，来源于5′UTR的在培育种与野生种间多态性高，而编码区的EST-SSR在种属间具有高度多态性。
4.2.3 EST-SSR标记的应用
4.2.3.1 构建遗传学图谱
遗传图谱、物理图谱和转录图谱是基因组计划要获得的3张遗传学图谱。遗传学图谱既是遗传理论研究的重要内容，又是种质资源、品种选育和基因克隆等许多应用研究的理论基础。在植物上应用较为广泛。如Gao等（2004）利用小麦3个作图群体对478个EST-SSR引物进行了筛选，将88个引物的101个位点定位于硬粒小麦的20个染色体，并进一步将其定位在已有450个SSR位点的小麦遗传图谱上。其中有74个与已知基因类似，这些基因控制着新陈代谢、细胞结构、转录等，还有53个假定功能的基因被首次定位在遗传图谱上。目前，EST-SSR在水产动物的遗传图谱构建中也有了一定的应用，如Rexroad等（2005）筛选的虹鳟EST-SSR标记中，89个具有多态性，其中，30对被定位于遗传图谱上。Maneeruttanarungroj等（2006）从斑节对虾的10100个EST中筛选了997个SSR，开发了50对EST-SSRs引物，其中，36对被定位在遗传图谱上。Denise等（2007）开发了35对南美白对虾EST-SSR引物用于其遗传图谱的构建。
4.2.3.2 通用性与比较作图
同一种SSR引物在不同物种间的通用性，依赖于EST-SSR侧翼序列的保守程度和SSR进化的稳定性。研究表明，SSR引物在不同种间具有较高的通用性。例如Wang等（2007）设计的60对EST-SSRs引物中，10对引物在鲫鱼个体中显示了多态性，在银鲫中仅有3个基因座位显示多态性。虹鳟（Rexroad et al.，2005）、真鲷（Chen et al.，2005）和对虾（Pérez et al.，2005）中也有类似的报道。很明显，不同物种之间SSR引物的通用性可显著提高标记的利用价值，增加现有标记数目，为一些物种SSR标记开发提供了新的途径（李永强等，2004）。Rexroad等（2005）筛选的虹鳟的EST-SSR标记中，89个具有多态性，将其用于其他鲑科鱼类，发现至少74个标记得到有效扩增。其中20个可与四足动物、鼠或人类基因组匹配。这将有助于比较作图和同源基因克隆的发展。
4.2.3.3 遗传多样性的研究
遗传多样性的核心是基因多样性，EST-SSR正好反映了生物基因表达转录部分。利用EST-SSR具有多态性的特点，可将EST-SSRs应用于物种遗传多样性的分析和研究。Wang等（2005）从中国对虾10443个EST中筛选了229个SSR，开发了30对EST-SSRs引物，其中，9对引物显示了多态性。Denise等（2007）开发了62对南美白对虾EST-SSR引物用于野生群体和养殖群体的遗传多样性检测，其中35对具有多态性。Wang等（2007）用鲤鱼10088个EST中筛选的SSR设计了60对EST-SSRs引物，其中，25个基因座位在鲤鱼群体中显示了多态性。
4.2.3.4 品种鉴别和亲缘关系的鉴定
对某一物种基因组SSR序列分布和变异的研究，可以阐明该物种的起源、进化的分支点和人工选择的历史过程，进而对品种及其亲缘关系进行鉴别。EST-SSR标记与基因组SSR标记相比，能够更准确地检测出品种间的亲缘关系（Rossetto et al.，2002）。Rossetto等（2002）用3对EST-SSR引物对葡萄科的4个属8个种的遗传关系进行了分析，根据EST-SSR侧翼序列的碱基插入、缺失、替换，可明确这8个种之间的遗传关系，并可将亲缘关系较近的两个种区分开来。Zhan等（2005）采用16个EST-SSR标记对3个扇贝种类进行了遗传多样性分析，结果显示，当扇贝品种的起源比较近时，EST-SSR标记可以有效地显示品种间的多样性。Yu等（2008）应用开发的20对EST-SSR引物对牡蛎3个家系进行了多样性检测，进而筛选出可用于品种鉴别的特异性标记。另外，通过EST-SSR标记在不同品种或品系间的通用性还可以证明品种或品系间的亲缘关系（Yue et al.，2004；Rexroad et al.，2005）。
4.2.3.5 功能基因组学研究
EST-SSR是基因的一部分，这就提高了其作为遗传标记在资源评估方面的利用价值。因为通过对已知功能基因的EST-SSR长度变化的检测，可与表型变化或其他生物学变化相联系。而存在于基因的转录部分的SSR，很可能与基因的表达或功能相关，但需要对编码区SSR的长度变化与特定表型是否相关进行不断的研究。另外，将开发出有效EST-SSR的EST序列与GeneBank（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）中非冗余蛋白库进行同源性比较进而分析EST-SSR可能的功能。顾颖等（2009）对鲤与生长性状相关的EST-SSRs标记进行了筛选，结果8个EST-SSR标记与体长、体高、体厚性状相关，BLAST比对之后，有3条EST序列与蛋白库中已知功能的序列高度同源。这为鲤重要生长性状QTL定位和分子辅助育种提供了一定的依据。
4.2.3.6 存在问题
虽然EST-SSRs作为一种新型的分子标记，在遗传连锁图谱绘制、比较遗传作图、遗传多样性分析、功能基因分离与定位等方面已得到广泛应用，但EST-SSR标记尚有一些不足之处。
1.与传统SSR标记相比较，EST-SSR标记的多态性较低。
2.由于EST仅仅是一个基因的部分序列，所以它所揭示的基因组信息不够全面，一些调控序列、内元序列等在基因表达调控中起重要作用的信息不能体现出来。
3.由于EST是随机对大量cDNA文库克隆进行测序，因此对cDNA文库质量有较高的要求。
4.EST的测序方法存在误差，以及许多应用程序也存在一定的局限，使独立基因（Unigene）在聚类拼接过程中可能将同源性较高的不同基因混杂在一起。
4.2.4 EST-SSR标记在水产动物中的应用前景
作为一种分子标记，EST-SSR具有与基因组来源的SSR标记一样的功能，而且从EST中开发SSR标记较传统基因组水平SSR有明显的优势。从EST中开发SSR只是大规模EST测序计划的副产品，可以节省大量的资源。更重要的是EST是表达基因的一部分。因此，来自EST的SSR必定与基因的功能有直接关系，从而极大地提高了SSR作为分子标记的能力。
随着人类基因组计划和一些模式生物基因组计划的实施，功能基因组的研究将成为重点。尽管EST-SSR标记被刚刚开发，研究尚处初级阶段，使用的范围有限，但已经受到广泛的重视。目前，很多国家正在开展通过EST发展SSR标记研究工作，随着EST-SSR标记的不断开发，将在生物的遗传育种、转录图谱绘制、功能基因的发掘和利用等方面发挥重要作用。
参考文献
杜博，龚世园，童馨，等.2007.皱纹盘鲍和盘鲍南方养殖群体遗传变异的微卫星分析［J］.南方水产，3（6）：22-29.
顾颖，曹顶臣，张研，等.2009.鲤与生长性状相关的EST-SSRs标记筛选［J］.中国水产科学，16（1）：15-22.
胡松年.2005.基因表达序列标签（EST）数据分析手册［M］.杭州：浙江大学出版社，85-102.
胡雪松，李池陶，马波，等.2007.3个德国镜鲤养殖群体遗传变异的微卫星分析［J］.水产学报，31（5）575-582.
金基强，崔海瑞，陈文岳，等.2006.茶树EST-SSR的信息分析与标记建立［J］.菜叶科学，26（1）17-23.
李永强，李宏伟，高丽锋，等.2004.基于表达序列标签的微卫星标记（EST-SSRs）研究进展［J］.植物遗传资源学报，5（1）：91-95.
鲁翠云，孙效文，梁利群.2005.鳙鱼微卫星分子标记的筛选［J］.中国水产科学，12（2）：192-196.
罗静初，江涛，李兵，等.1998.分子生物信息镜像系统和数据库［J］.高技术通讯，10（10）：61-63，53.
马海涛，鲁翠云，于冬梅，等.2007.草鱼基因组中微卫星分子标记的制备及筛选［J］.上海水产大学学报，6（4）：389-393.
谭杰，孙慧玲，刘萍，等.2007.3个仿刺参地理种群遗传变异的微卫星DNA分析［J］.水产学报，31（4）：437-442.
夏军红，朱彩艳，苏天凤，等.2006.斑节对虾基因组微卫星分离及其序列特征研究［J］.南方水产，2（6）：1-7.
夏云，雷二庆，王槐春.1997.Interact实用技术与生物医学应用［M］.北京：军事医学出版社，341-354.
徐鹏，周令华，田丽萍，等.2003.从中国对虾ESTs中筛选微卫星标记的研究［J］.水产科学，27（3）：213-218.
杨伦，沈文飚，陈虹.2004.基于生物信息学的水稻的候选SNP发掘［J］.中国水稻科学，18（3）：185-191.
袁慧，张修月，宋昭彬，等.2008.岩原鲤微卫星富集文库的构建及微卫星分子标记的筛选［J］.四川动物，27（2）：210-215.
袁希平，严莉，徐树英，等.2008.长江流域铜鱼和圆口铜鱼的遗传多样性［J］.中国水产科学，15（3）：377-385.
张天时，刘萍，孟宪红，等.2003.不同对虾种间共用微卫星DNA引物的研究［J］.高技术通讯，13（11）：80-85.
Adams M D，Kelley J M，Gocayne J D，et al.1991.Complementary DNA sequencing：expressed sequence tags and human genome project［J］.Science，252：1651-1656.
Agyare F D，et al.1997.Mapping expressed sequence tag sites on yeast artificial chromosome clones of Arabidopsis thaliana DNA［J］.Genome Res，7：1-9.
Barker G，Batley J，Sullivan H O，et al.2003.Redundancy based detection of sequence polymorphisms in expressed sequence tag data using auto SNP［J］.Bioinformatics，19，421-422.
Bocker T，Barusevicius A，Snowden T.1999.A human mutS homologue that forms a novel heterodimer with hMSH4 and is expressed during Spermatogenesis［J］.Cancer Res，59：816-822.
Bonaldo M F，Lennon G，Soares M.1996.Normalization and subtraction：two approaches to facilitate gene discovery［J］.Genome Res，6：791-806.
Callen D，et al.1993.Incidence and origin of null alleles in the （AC）n microsatellite markers［J］.Am.J.Hum.Genet.，52，922-927.
Cardle L，Ramsay L，Milbourne D，et al.2004.Computational and experimental characterization of physically clustered simple sequence repeats in plants［J］.Theor.Appl.Genet，109：800-805.
Chen C X，Zhou P，Choi Y A，Huang S，Gmitter Jr F G.2006.Mining and characterizing microsatellites from citrus ESTs［J］.Theor Appl Genet，112：1248-1257.
Chen H M，Li L Z，Wei X Y，Li S H，Lei T D，Hu H D，Wang H G，Zhang X H.2005.Development，chromosome location and genetic mapping of EST-SSR markers in wheal［J］.Chinese Science Bulletin，50（20）：2328-2336.
Chen S L，Liu Y G，Xu M Y，et al.2005.Isolation and characterization of polymorphic microsatellite loci from an EST library of red sea bream（Chrysophrys major ） and cross-species amplification［J］.Mol Ecol Notes，5：215-217.
Cho Y G，Ishii T，Temnykh S.2000.Diversity of microsatellites derived from genomic libraries and GeneBank sequences in rice（Oryzasativa L.）［J］.Theor.Appl.Genet.，100，713-722.
Cordeiro G M，Casu R，Mclntyre C L.2001.Microsatellite markers from sugarcane（Saccharum spp.） ESTs cross transferable to Eranthus and Sorghum［J］.Plant Sci.，160，1115-1123.
Denise K，Garcia，Acacia Alcivar-warren.2007.Characterization of 35 new microsatellite genetic markers for the pacific whiteleg shrimp，Litopenaeus vannamel ：their usefulness for studying genetic diversity of wild and cultured stocks，tracing pedigree in breeding programs，and linkage mapping［J］.Journal of Shellfish Research，26（4）：1203-1216.
Ewing R，Poirot O，Claverie J M.（1999/2000）.Comparative analysis of the arabidopsis and rice expressed sequence tag sets［M］.In Silico Biology l，IOS press，197-213.
Fraser L G.et al.2004.EST-derived microsatellites from Actinidia species and their potential for mapping［J］.Theor.Appl Genet.，108，1010-1016.
Gao L F，Tang J F，Li H W，et al.2003.Analysis of microsatellites in major crops assessed by computational and experinental approaches［J］.Mol.Breed，12：245-261.
Gelbart W M.1998.Database in genetic research［J］.Science，282（5389）：659-666.
Goff S A，Ricke D，Lan T H.2002.A draft sequence of the rice genome（Oryza sativa L .ssp.japonica ）［J］.Science，296：92-100.
Gupta P K，Rustgi S，Sharma S，et al.2003.Transferable EST-SSR markers for the study of polymorphism and genetic diversity in bread wheat［J］.Mol.Genet.Genomics，270，315-323.
Hedgecock D，Li G，Hubert S，et al.2004.Widespread null alleles and poor cross-species amplification of microsatellite DNA loci cloned from the Pacific oyster，Crassostrea gigas ［J］.J Shellfish Res.，23，379-385.
Her C，N A.1998.Cloning，structural characterization，and chromosomal localization of the human orthologue of Saccharomyces cerevisiae MSH5gene［J］.Genomics，52：50-61.
Heschl M D，Baillie D L.1990.Functional elements and domains inferred from sequence comparisons of a heat shock gene in two nematodes［J］.J Mol Evol，31：3-9.
Hillier L.1996.Generation and analysis of 280000human expressed sequence tags［J］.Genome Res，6：807-828.
Holton T A，et al.2002. Identication and mapping of polymorphic SSR markers from expressed genes equences of barley and wheat［J］.Mol.Breed.，9，63-71.
Kota R，Varshney RK，Thiel T，et al..2001，Generation and comparison of EST-derived SSRs and SNPs in barley （Hordeum vulgare L.）［J］.Hereditas，135，145-151.
Kuwabara P E，Shah S.1994.Cloning by synteny：identifying C.briggsae homologues of C.elegans genes［J］.Nucleic Acids Res，22：4414-4418.
Launey S，Ledu C，Boudry P，et al.2002.Geographic structure in the flat oyster Ostrea edulis L as revealed by microsatellite polymorphism［J］.J Hered ，93，331-338.
Lehman T.et al.1996.An evaluation of evolutionary constraints on microsatellite lociusing null alleles［J］.Genetics，144，1155-1163.
Leipe D D.1996.Genome and DNA sequence database［J］.Curr Opin Gen Devel，6（6）：686-691.
Lemaitre B，Nicolas L，Michaut J M，et al.1996.The dorsoventral regulatory gene cassette spatzle/ Toll/ cactus controls the potent antifungal response in Drosophila adults［J］.Cell，86：973-983.
Maneeruttanarungroj C，Pongsomboon S，Wuthisuthimethavee S，et al.2006.Development of polymorphic expressed sequence tag derived microsatellites for the extension of the genetic linkage map of the black tiger shrimp（Penaeus monodon ） ［J］.Anim.Genet.，37，363-368.
Mccombie W R，Adams M D，Kelley J M，et al.1992.Caenorhabditis elegans expressed sequence tags identify gene families and potential disease gene homologues［J］.Nat Genet，1：124-131.
Medzhitov R，Hurlburt P R，Janeway C A Jr.1997.A human homologue of the Drosophila Toll protein signals activation of adaptive immunity ［J］.Nature，338：394-396.
Pérez F，Ortiz J，Zhinaula M，et al.2005.Development of EST-SSR markers by data mining in three pecies of shrimp：Litopenaeusvannamei ，Litopenaeusstylirostris and Trachypenaeusbirdy ［J］.Mar.Biotechnol.，7，554-569.
Powell W，Mchray G C，Provan J.1996.Polymorphism revealed by simple sequence repeats［J］.Trends in Plant Science，1：215-222.
Rexroad Ⅲ，C E，Rodriguez M F，Coulibaly I，et al.2005.Comparative mapping of expressed sequence tags containing microsatellites in rainbowtrout （Oncorhynchus mykiss ）［J］.BMC Genomics，6，54.
Rossetto M，McNally J，Hmry R J.2002.Evaluating the potential of SSR flanking regions for examining taxonomic relationships in the vitacene［J］.Theor.Appl.Cenet.，104：61-66.
Rota L R，Kantety R V，Yu J K.2005.Nonrandom distribution and frequencies of genomic and EST-derived microsatellite markers in rice，wheat，and barly［J］.BMC Genomics，6：23.
Rungis D.et al.2004.Robust simple sequence repeat markers for spruce（Picea spp.） from expressed sequence tags［J］.Theor.Appl.Genet.，109，1283-1294.
Saha M C.et al.2004.Tall fescue EST-SSR markers with transferability across several grass species［J］.Theor.Appl.Genet.，109，783-791.
Schuler G D.1997.Pieces of the puzzle：expressed sequence tags and the catalog of human genes［J］.J Mol Med，75（10）：694.
Scott K D.et al.2000.Analysis of SSRs derived from grape ESTs［J］.Theor.Appl.Genet.，100，723-726.
Sreenivasulu N.et al.2002.Mining functional information from cereal genomes the utility of expressed sequence tags［J］.Curr.Sci.83，965-973.
Temnykh S，DeClerck G，Lukashova A，Lipovich L，Cartinhour S，McCouch S.2001.Computational and experimental analysis of microsatellites in rice （Oryza sativa L.）：frequency，length variation，transposon associations，and genetic marker potential［J］.Genome Research，11：1441-1452.
Thiel T.et al.2003.Exploiting EST data bases for the development of cDNA derived microsatellite markers in barley（Hordeumvulgare L.）［J］.Theor.Appl.Genet.106，411-422.
Varshney R K.et al.2002.In silico analysison frequency and distribution of microsatellites in ESTs of some cereal species［J］.Cell.Mol.Biol.Lett.，7，537-546.
Venter J C，Adams M D，Eugene W M.2001.The sequence of the Human［J］.Genome Science，291：1304-1352.
Verma M，Arya L.2008.Development of EST-SSRs in watermelon （Citrullus lanatus var .lanatus） and their transferability to Cucumis spp.［J］.Journal of Horticultural Science and Biotechnology，83 （6） ：732-736.
Wang D，Liao X L，Cheng L，et al.2007.Development of novel EST-SSR markers in common carp by data mining from public EST sequences［J］.Aquaculture，271：558-574.
Wang H X.，Li F H，Xiang J H.2005.Polymorphic EST-SSR markers and their mode of inheritance in Fenneropenaeus chinensis ［J］.Aquaculture，249，107-114.
Waterston R，Martin C，Craxton M，et al.1992，A survey of expressed genes in Caenorhabditis elegans ［J］.Nat Genet，1：114-123.
White J A，Todd J，Newman T，et a1.2000.A new set of arabidopsis expressed sequence tags from developing seeds.The Metabofic Pathway from Carbohydrates to Seed Oil［J］.Plant Physiol Ggy，124：1582-1594.
Xu Z，Dhar A K，Wyrzykowski J，et al.1999.Identification of abundant and information microsatellites from shrimp（Penaeus monodon ） genome［J］.Animal Genetics，30：1-7.
Yu H，Li Q.2008.Exploiting EST Databases for the Development and Characterization of EST-SSRs in the Pacific Oyster（Crassostrea gigas ）［J］.Journal of Heredity，99（2）：208-214.
Yu J K，et al.2004.Development and mapping of EST～derived simple sequence repeat （SSR） markers for hexaploid wheat［J］.Genome，47，805-818.
Yue G H，Ho M Y，Orban L，Komen J.2004.Microsatellites within genes and ESTs of common carp and their applicability in silver crucian carp［J］.Aquaculture，234：85-98.
Zhan A B，Bao Z M，Wang X L，et al.2005.Microsatellite markers derived from bay scallop Argopecten irradians expressed sequence tags［J］.Fish Sci，71：1341-1346.
5 遗传多样性研究的原理及方法
5.1 遗传多样性的定义及研究意义
5.1.1 遗传多样性的定义
遗传多样性是生物多样性的重要组成部分，亦称基因多样性，具有广义和狭义之分，广义的遗传多样性是指地球上所有生物携带的遗传信息的总和，狭义的遗传多样性是指种内不同群体或同一群体内不同个体的遗传变异的总和（施立明等，1993）。但一般所指的遗传多样性是指狭义遗传多样性，即种内遗传多样性，或称遗传变异（葛颂等，1994）。遗传变异是生物体内遗传物质发生变化而造成的一种可以遗传给后代的变异，是遗传多样性最直接的表现形式（葛颂等，1994）。遗传变异在个体、群体以及物种间广泛存在，构成了形态、生态各异，丰富多彩的生物界。群体内遗传变异水平的高低是生物进化的基础，因为对于任何一个生物个体来说，其生命是短暂的，由个体构成的群体才在时间上连绵不断，才是进化的基本单位（葛颂等，1994）。群体在自然界有其特定的分布格局，遗传变异在群体内表现出时空分布的特点，因而遗传多样性不仅包括遗传变异水平的高低，也包括遗传变异在群体内的分布，即群体的遗传结构（葛颂等，1994）。
5.1.2 遗传多样性的研究意义
1.评价群体的遗传结构
遗传结构是遗传变异在群体内的存在格局或特征，它反映了遗传多样性的组成形式和变化特征。评价群体的遗传结构，即研究群体的基因频率和基因型频繁、交配与繁殖模式、群体分化模式、群体间的基因流动模式等（陈晓峰等，2001），了解突变、选择压力（包括自然选择与人工选择）、迁移扩散、交配基因流等因素对群体遗传多样性的影响，是对群体遗传资源进行开发、利用和保护的基础。
2.揭示物种的起源与进化历史
物种或群体的遗传多样性大小是长期进化的产物，是其生存和进化的前提（葛颂等，1994）。一个群体的遗传变异越高或遗传多样性越丰富，对环境变化的适应能力就越强，越易扩散其分布范围和开拓新的环境（葛颂等，1994）。一个物种的进化潜力和抵御不良环境的能力既取决于群体的遗传变异大小，也依赖于群体的遗传结构（葛颂等，1994）。群体的遗传变异大小与其进化速率成正比（葛颂等，1994）。因而，对群体的遗传多样性研究可揭示群体的进化历史（起源的时间、地点和方式等），也可为进一步分析其进化潜力和未来的命运提供重要的资料。同时，对不同群体间的遗传多样性比较研究可探讨群体间的遗传分化与系统进化关系。
3.珍稀濒危物种保护
由于过度捕捞、生境恶化以及外来物种入侵等因素的影响，一些物种正步入濒危、灭绝的境地。对于濒危物种，往往存在有效繁殖群体太小，性别失衡、遗传漂变导致的遗传衰退和近交衰退等现象，遗传多样性极为贫乏。因为种群太小，易发生近交现象，导致遗传多样性的丢失，并降低了群体适应环境、抵抗病害的能力，同时近交会导致遗传杂合度降低，从而导致物种灭绝的概率增加。不进行物种的遗传多样性研究，不了解其遗传变异大小、时空分布及其与环境条件的关系，就无法采取科学有效的措施来保护人类赖以生存的遗传资源（基因），来挽救濒于绝灭的物种，保护受到威胁的物种（葛颂等，1994）。对珍稀濒危物种保护方针和措施的制定，如迁地或就地保护的选择等，都有赖于对物种遗传多样性的认识（陈灵芝等，1993）。
4.有利于生物遗传改良或育种
遗传多样性的理论研究始于达尔文时代，起步较晚。但自远古时代起，人们却在有意或无意地运用遗传多样性的原理，即生物的遗传变异，如野生生物的驯化，品种选育等，来为人类的社会生产和生活服务。养殖对象的遗传改良与育种，就是利用生物的有益遗传变异，使其优良性状充分表现出来为人类服务。因而，对生物的遗传多样性研究，是对其进行遗传改良或育种的基础。特别是近期随着附录Ⅱ鱼类遗传多样性研究概述分子生物学技术的飞速发展，分子标记辅助育种技术（Molecular Marker-assisted Selection，MAS）的出现，需要对物种的遗传多样性进行广泛而深入的研究。
5.2 鱼类遗传多样性研究的基本原理和主要方法
5.2.1 形态水平
从形态水平或表型水平来检测遗传变异是最古老也是最简便易行的方法（葛颂等，1994；夏铭，1999）。通常利用的表型性状有两类，一类是质量性状（如体色、鳞被和鳞式、脊椎数、鳃耙数等），另一类是数量性状（如大多数形态性状、生活方式性状等）。对于质量性状通常采用较为简单的文字描述和简单的生物统计方法，对于数量性状可通过方差、相关、回归及多元统计分析等方法。随着数量遗传学的不断发展，对表型水平的研究将更为科学和严密，因为数量遗传学方法估算的许多重要的遗传参数、不仅用来度量群体间或群体内遗传变异的大小，而且能推断群体中已发生过的进化事件以及预期未来因素将如何影响群体（葛颂等，1994），这对珍稀濒危物种保护措施的制定和实施具有重要价值。
形态（表型）水平研究具有简易、快速、易行的优点，可直接对研究标本进行分析，不需进行较为复杂的测定与分析。但形态学水平往往建立在个体性状描述和宏观观测的水平上，可利用的形态性状标记较少，无法随机代表生物群体的遗传组成。同时表型和基因型之间存在基因表达、调控、个体发育等一系列复杂的中间环节，加上环境条件的影响，表型差异不一定反映基因型上差异，基因型上的差异也不一定在表型上体现出来。如何根据表型性状的差异来反映基因型的差异就成为形态学方法研究遗传变异的关键（葛颂等，1994）。但目前，用形态性状来估测遗传变异是一种较为现实的方法，尤其是当需要在短期内对变异有所了解或其他方法无法开展时，形态学研究不失为一种有价值的选择（葛颂等，1994）。
从形态水平来研究鱼类的遗传多样性是一项长期而基本的方法，国内外在此方面做了大量的工作（李思发等，1989；Tudela，2001）。鱼类分类学上通常以形态差异（体型、鳞被、鳍式及脊椎骨数等）来进行鱼类群体鉴别和分类。随着统计方法的不断发展，形态水平的研究逐渐从性状的直观描述和宏观观测发展到形态性状的多元统计分析，从鱼类的传统可数、可量性状发展到现代的框架结构数据（李思发等，1991，1998；Tudela，2001）。近年来，图形映像处理技术也开始用于鱼类形态学的研究中（Steven et al.，1999），使鱼类的形态水平研究进入更科学、更精确的研究水平。但表型性状是基因与环境共同作用的结果，而鱼类的表型性状变异较其他脊椎动物要高得多，即使是遗传上完全相同的群体也存在较大程度的形态变异。因而在形态水平上进行鱼类的遗传多样性研究时，应考虑环境条件对形态性状的影响。
5.2.2 细胞（染色体）水平研究
随着解剖学和细胞生物学的发展，生物的遗传多样性研究也从宏观的形态水平向微观的染色体水平深入。染色体在希腊语的意思是“带颜色的物质”（colored body）。它是遗传物质的载体，是基因的携带者。由于生物的遗传信息均包含在染色体上，染色体的变异必将导致遗传变异的发生，染色体变异是生物变异的重要来源。每种生物的染色体数目是相对恒定的，通常为一套父本和一套母本遗传物质的二倍体。但在不少物种中，染色体水平的变异广泛存在。染色体变异包括染色体数目变异和结构变异。染色体数目变异主要是表现在染色体整倍性（单倍体、三倍体及多倍体等）和非整倍性变异，染色体非整倍性变异常导致生物个体败育或发育不正常，它在进化中的意义不大。染色体结构的变异（缺失、重复、易位和倒位）在群体内最为常见，据估计，大约500个个体中就有一个发生染色体结构变异，在某些群体中，变异频率可能会大大超过此数，只是结构变异不像数目变异那样容易观察和分析（孙超等，2000）。除染色体数目和结构变异外，染色体在着丝点位置、缢痕和随体以及超数染色体（B染色体）等特征上体现出多样性。染色体变异在生物进化中具有十分重要的作用（葛颂等，1994），是生物进化的档案库（姚世鸿，1993）。染色体水平上的遗传多样性研究主要研究在细胞的特定分裂时相（通常是有丝分裂中期）的染色体的数目和形态（着丝点位置、相对长度、臂长、臂比等参数），以及通过染色体显带（如C、G、R、T、Q带等）技术和染色体原位杂交（FISH）技术检测染色体的多样性。但染色体水平的研究只有当染色体内部结构的微小变异积累到一定程度，导致染色体表型结构发生变化时，才能检测出表型变化来，再加上技术问题，重复性和稳定性差以及检测数量的有限性，其结果往往不尽如人意，难以获得令人信服的证据（邓务国，1994；贾永红等，1998）。
全世界对鱼类染色体水平上的研究较多，但主要集中在常规的核型分析上，在显带技术方面的研究还较不足（楼允东，1997）。据不完全统计，全世界已对近2000种鱼类进行过核型研究，约占鱼类种数的10%，遍及30个目（耿德贵等，1999）。我国于20世纪70年代初开始鱼类染色体研究，1975年长江水产研究所等首次报道了我国鱼类的染色体研究（长江水产研究所等，1975）。至今我国已报道307种鱼类的染色体研究，其中海水鱼类50种，淡水鱼类257种（楼允东，1997，1999；赵金良，2000）。目前正开始实行的的染色体原位杂交（FISH）技术为染色体水平的遗传多样性研究开辟了更广阔的前景。
5.2.3 酶（蛋白）水平研究
1955年Smithies发明了淀粉凝胶电泳技术分离人的血清蛋白，报道了不同人群中有不同的蛋白谱。1957年，Hunter和Market将蛋白质淀粉凝胶电泳技术与组织化学染色技术结合起来，创立了蛋白质（同工酶）电泳酶谱分析方法。1959年Market和Moller用此法发现了乳酸脱氢酶（LDH）具有多种形式，从而产生了同工酶的概念，即催化同一反应的不同分子形式的酶。1966年，Harris、Hubby和Lewontin分别报道了利用同工酶凝胶电泳技术对人和果蝇遗传变异的定量研究，是遗传变异研究以至进化研究历史上发生重要转折的一年（葛颂等，1994），表明对生物的遗传多样性研究进入到酶（蛋白）水平。
酶是基因的产物，是基因表达的结果。酶蛋白多肽链中的氨基酸序列，是由DNA分子上的核苷酸序列决定的。同工酶电泳技术就是针对同种酶不同分子形式（同工酶）的结构、大小和所带的电荷差异，在一定的介质和电流强度下，分离同工酶，然后运用特殊染色，显示分离的电泳图谱，最后通过对电泳显示谱带的分析，来识别控制这些谱带表达的基因位点和等位基因，推断群体的等位基因频率和基因型频率，并在此基础上，通过各种参数（如多态位点比例和平均杂合度等）对遗传变异进行定量评估，从而达到在基因水平上研究生物遗传多样性的目的。
同工酶在生物界广泛存在，如群体间、个体间、同一个体的不同组织器官以及不同发育阶段等均可检测到同工酶。由于同工酶变异丰富，且呈共显性遗传，能比较客观地代表基因组的变异，因而能较客观地度量群体的遗传变异大小，加上试验条件较为简单，成本较低，结果快速可靠等优点，该技术已成为一种经济有效的群体遗传学研究手段，是近20年来检测遗传多样性研究最普遍的方法（孙超等，2000）。
同工酶虽然是一个检测遗传多样性的有效手段，但也存在一定的局限性：一是同工酶检测的是基因的表达产物，检测的位点有限，因为表达产物的基因在生物体的整个基因组只占极少部分，还有大量的遗传变异未能检测出来；二是由于密码子存在简并性，编码基因DNA的无义突变无法检测出来，还有可能受到哑基因（不表达或表达很弱的等位基因）的影响；三是易受环境条件和生物不同发育阶段的影响，无法准确确定DNA水平上的变异；四是谱带分析有时较为困难，并非有所的带均在电泳图谱上显示出来，相同的带有时不一定是相同的酶。除同工酶电泳分析外，在酶（蛋白）水平研究上还有血液生化检测、组织免疫检测等，只是它们远没有同工酶应用广泛。
鱼类的同工酶研究始于1960年，Kaplan首先研究了鲽科鱼类的LDH同工酶。1965年，Market同时分析了30种鱼类的乳酸脱氢酶，指出不同个体间以及同一个体的不同组织具有特定的同工酶谱。我国在鱼类同工酶方面的研究起步较晚，1982年，朱蓝菲等对几种鲤科鱼类的LDH同工酶进行了研究，并探讨了它们间的亲缘关系，开始了我国的鱼类同工酶研究（朱蓝菲，1982）。我国学者李思发等（1986）对长江、珠江、黑龙江的鲢、鳙和草鱼原种种群进行了同工酶分析，发现3条江中3种鱼的平均杂合度是：草鱼：长江0.1076>珠江0.0833>黑龙江0.0454；鳙鱼：长江0.1133>珠江0.1042>；鲢鱼：黑龙江0.0511>长江0.0493>珠江0.0484。赵金良等（1996）对长江中下游鲢、鳙、草鱼和青鱼种群进行的同工酶分析表明，长江中下游的这4种鱼各属一个没有显著分化的种群，均为“长江种群”。
5.2.4 分子水平研究
5.2.4.1 以DNA杂交技术为基础的检测方法
RFLP（Restriction Fragment Length Polymorphisms，限制片段长度多态）是Bostein等（1980）提出的，属于第一代DNA分子标记技术。是使用时间最长、应用最为广泛的分子遗传多样性检测技术。其原理是限制性内切酶识别不同来源DNA链上的特异性位点，由于酶切位点的差异而出现长度不一的片断，经过电泳或转移到一定的支持物（如醋酸纤维膜或尼龙膜）与特定标记的DNA探针杂交而显示出多态性。
鱼类的遗传多样性研究中，RFLP的应用是仅次于同工酶技术，是应用最广泛的分子生物学技术，尤其是在线粒体DNA的RFLP分析方面。进行整个线粒体DNA的RFLP分析来研究不同鱼类群体的遗传差异已有大量报道（Avise et al.，1987；Palva et al.，1987；Saitoh et al.，1995；肖武汉等，2000）。国内对鱼类线粒体DNA的RFLP研究始于20世纪80年代中期，1984年陈关君等首次报道了鲤、鲫线粒体DNA的限制性内切酶分析（陈关君等，1984）。至今我国已对近20种鱼类的线粒体DNA进行了RFLP分析，如乌鳢、方正银鲫、白鲫、鲫、鲤、鲢、鳙、草鱼、团头鲂、鲇、长吻、黄颡鱼、鳗鲡、黄鳝、泥鳅、银鲴及彩鲤等（张四明等，1991，1992，1996；崔建勋等，1992；晏勇等，1994；戴建华等，1994a，1994b，1994c，1996；宋平等，1994；李殿香等，1999；肖武汉等，2000；王成辉等，2002）。一些作者还将PCR技术与RFLP技术结合来，对线粒体DNA的某一基因或片段进行PCR扩增，对扩增产物进行RFLP分析，在鱼类遗传多相样性研究上取得了很好的结果（Rognon et al.，1997；李思发等，1998；姚纪花等，1998）。
5.2.4.2 以PCR技术为基础的检测方法
1.RAPD技术
RAPD（Random Amplified Polymophic DNA）技术是1990年美国杜邦公司的Williams等和加利福尼亚生物研究所的Welsh几乎同时发展起来的（Williams et al.，1990；Welsh，1990）。其原理是利用一系列10碱基的随机引物对生物的基因组DNA进行PCR扩增，扩增产物经琼脂糖或聚丙烯酰胺电泳分离，溴化已锭（EB）染色，在紫外灯下观察扩增产物的多态性。扩增产物的多态性反映了基因组相应区域的多态性。
它一出现就广泛用于群体遗传多样性研究（Chalmers et al.，1992；Jain et al.，1993）、遗传图谱构建（李斌等，2000）、基因定位与克隆等（Levin et al.，1993）。但RAPD技术也具有一定的局限性，如为显性标记，无法区分纯合子和杂合子；稳定性和重复性较差，不同试验室间的研究结果可比性差等（赵凯，2000）。
在鱼类的遗传多样研究中，RAPD是目前仅次于RFLP的一项分子水平上遗传多样性检测技术。如邓怀等（1998）对青、草、鲢、鳙、鲤、团头鲂等10种常见淡水鱼类进行了RAPD分析；薛国雄等（1998）对长江、珠江和黑龙江三水系的草鱼种群进行的RAPD分析表明，三水系草鱼各有其特异性的基因谱带；张四明等（1999）用RAPD技术对7种鲟形目鱼类的亲缘关系进行了研究，发现长江白鲟与匙吻鲟为一支，中华鲟、达氏鲟、史氏鲟与意大利鲟和短吻鲟为另一支。
2.卫星DNA（Satellite DNA）
在20世纪70年代中叶，生物学家就在真核生物的基因组中发现了短串联重复位点。1980年，Whman和White在筛选人的DNA基因文库时，偶然发现人类基因组中存在某高可变区（Hypervariable regions）。Hamada等（1982）在人心肌肌动蛋白（Ha-25）的内含子中发现了一个重复25次的TG序列，并指出这一序列在人和其他真核生物基因组中广泛存在。1985年，Jeffreys用人的肌红蛋白基因第一个内含子中重复序列（重复序列长33bp）为探针，从基因组中筛选出多个重复序列，首次证明了卫星DNA（Satellite DNA）的存在。卫星DNA根据串联重复的数目不同可分为小卫星DAN（Minisatellite DNA）和微卫星DNA（Microsatellit DNA）两部分。小卫星DNA的重复序列一般为10至几百个碱基，微卫星DNA重复序列一般为1～6碱基。因为小卫星DNA或微卫星DNA在同一位点的重复数存在很大变化，在群体中表现高度的多态性，因而通常将二者称为可变串联重复数目（Variable number of tandem repeats，VNTR），其中微卫星DNA由于串联重复数目少又称为短串联重复（Short Tandom Repeats，STR），简单序列重复（Simpl Sequence Repeats，SSR）或简单序列长度多态（Simple Sequence Length Polymorphisms，SSLP）（何平，1998）。用克隆的小卫星DNA或微卫星DNA作探针，与不同物种或同一物种基因组中的多个位点DNA杂交，可获得具有个体专一性的片段杂交谱带，即我们通常所说的DNA指纹图谱（DNA fingerprinting，DFP）。
卫星DNA是一种非编码的重复序列，在真核生物基因组中广泛存在，约10～50kb就有一个微卫星序列（何平，1998），其杂合度可达100%，每代变异超过2%，多态性极为丰富。同时微卫星具有重复性好，其显性遗传，操作简便，所需DNA样品少等优点，是进行群体遗传多样性研究（Beacham et al.，1999）、遗传图谱构建和基因定位的理想分子标记（Slettan et al.，1997）。
微卫星DNA技术一出现，就在水产领域得到了广泛应用。许多作者对鱼类基因组中的微卫星序列进行了大量研究（Estoup et al.，1993），一些鱼类的特异性微卫星探针已被克隆出来，如金鱼、虹鳟、鲤鱼等。目前微卫星DNA已在鱼类遗传多样性研究、种质鉴定及渔业管理等方面广泛应用（Beacham et al.，1998；Norris et al.，1999；Jean et al.，2001）。
3.AFLP标记
RFLP可靠性强，但操作繁琐；RAPD虽然操作简便，但重复性和可靠性差。1992年，荷兰科学家Zabeau和Vos等将RFLP和RAPD技术结合起来，创立了AFLP（Amplified Fragment Length Polymorphisms，扩增片段长度多态）技术。由于AFLP结合了RFLP的可靠性和RAPD的简便性，它一出现就显示了巨大的应用价值，1993被Keygene公司以专利形式买下，直至1995年才正式向外公布。
目前广泛用于遗传多样性和种质鉴定、基因定位、连锁图谱的构建等。AFLP标记出现较晚，鱼类上的应用较少，国内较早的研究见王志勇等的报道（王志勇等，2001）。
4.SNP标记技术
SNP（Single Nucleotide Polymorphisms，单核苷酸多态）是指基因组上的单个核苷酸发生变异而引起的DNA序列多态性（杨昭庆等，2000）。单核苷酸多态的发生频率极高，在人的基因组中平均1000个碱基中就有一个SNP标记，在整个人的基因组中共有30万个SNP标记，其分布密度比微卫星标记更高，SNP的遗传稳定性也高于微卫星标记。
虽然SNP是非常有效的、逐渐被广泛使用的分子标记方法，但它也存在一些问题。制作SNP分析图理论上需要500个以上有代表性的个体，而SNP多态性低，所能提供的信息量少，需要分析标记的数量多，成本太高。其检测的最佳方法是新近发展起来的DNA芯片技术。
5.2.4.3 DNA序列分析
遗传变异在分子水平上的直接表现形式是DNA序列（或RNA序列）。通过DNA序列分析，可获得有关生物遗传变异的最确切的、最深层次的信息（陈晓峰等，2001）。与其他分子水平上的遗传多样性研究方法相比具有很大优越性：直接度量DNA序列的遗传变异，可研究分析的信息（分析的基因组区域或片段）足够多，可揭示从个体间到物种间不同层次的变异，分析结果可靠性和可比性强等。
自1977年Sanger创立双脱氧核苷酸（ddNTP）链终止测序法以来，DNA序列分析技术已成为遗传多样性研究中的一种重要方法，尤其是近几年应用越来越普遍。目前对鱼类的DNA序列分析主要是线粒体DNA序列。经初步统计，至2001年12月30日，全世界已对17种鱼类的线粒体DNA进行了全序列测定，即台湾缨口鳅（Crossostoma lacustre）、鲤（Cyprinus carpio）、多鳍鱼（Polypteruornatipinnis）、大西洋鳕（Gadus morhua）、虹鳟（Oncorhynchus mykiss）、细鳞非洲肺鱼（Crossostoma lacustre）、矛尾鱼（Latimeria chalumnae）、鲫（Carassius auratus）、日本仙女鱼（Aulopus japonicus）、香鱼（Plecoglossus altivelis）、日本辫鱼（Ateleopu japonicu）、大眼大辫鱼（Ijimaia dofleini）、纤钻光鱼（Gonostoma gracile）、鲨（Scyliorhinus canicula）、海七鳃鳗（Petromyzon marinus）、花氏溪鳉（Aulopujaponicus）、斑马鱼（Danio rerio ）（Tzeng et al.，1992；Chang et al.，1994；Noack et al.，1996；Johansen et al.，1996；Zardoya et al.，1995，1996，1997；Lee et al.，1995，2001；Murakami et al.，1998；Delarbre et al.，1998；Hershler et al.，1999；Miya et al，1999，2001；Kawaguchi et al.，2001；Rechard et al.，2001）（均引自Genebank）。目前线粒体DNA部分基因或区域（片段）的序列分析是遗传多样性研究的主要方向，研究较多的序列是D-loop区（控制区）、细胞色素b基因，12s RNA和16s RAN 基因（Alvarado et al.，1994；Brtio et al.，1997；Simons et al.，1998；Okazaki et al.，2001）。McVeith（1991）对大西洋鲑的11个欧洲群群体和8个北美群体的细胞色素b基因的259bp片段的进行分析，发现种内和群体的遗传变异均较小。Okazaki（2001）对来自中国、日本、韩国和德国的27种鳑鲏鱼的12s RAN的709bp片段进行了分析，结果表明27种鱼的种间遗传变异极小，它们起源于一共同祖先。
5.2.5 不同水平研究方法的综合应用
因为生物的遗传多样性可体现在形态（表型）水平、细胞（染色体）水平，酶（蛋白）水平及分子水平等层次上，因而对遗传多样性的研究是建立在以上几个层次上的。但目前任何研究遗传多性的方法都是从特定的角度或特定层次进行研究，或在理论上或在实际应用中都有各自的优点和局限，还找不到一种能全方位检测遗传多样性的研究方法与技术。因而在遗传多样性的研究过程中可根据具体情况选择适合的方法与技术。通常形态学和细胞学方法能快速地遗传变异大小有一个大致的了解，同工酶分析在技术上比较成熟，能从分子水平上对基因组遗传变异的大小进行较为客观的度量；DNA分析是目前及将来的发展方向，值得进行深入研究，每种研究方法与技术并不互相排斥，都能提供许多有价值的信息（葛颂等，1994）。因而在进行遗传多样性研究时，最好是多种方法与技术共同使用，从形态到分子水平等进行多方位研究，以得出一个客观、系统而深入的认识。目前应用多种方法与技术对鱼类遗传多样性的研究已有一些报道（Reilly et al.，1999；Mamuris et al.，1999；Desvignes et al.，2001）。
5.3 鱼类遗传多样性研究的应用
5.3.1 群体鉴别
实现群体鉴别是鱼类遗传多样性研究的一个最主要目的。如Avise等（1986）用14种限制性内切酶对大西洋的欧洲鳗鲡和美洲鳗鲡的线粒体DNA进行了遗传分析，可完全将欧洲鳗鲡和美洲鳗鲡区分开来，并发现尽管繁殖地很接近，但仍存在严格的生殖隔离。Palva等（1989）通过对同一地区的虹鳟群体的线粒体DNA进行限制性内切酶分析，将的溯河与非溯河群体区分开来；DeSalle等（1996）对大量鲟鱼的mtDNA的细胞色素b基因进行PCR扩增与测序，成功地鉴别了来附录Ⅱ鱼类遗传多样性研究概述源不同种的鲟鱼子酱，解决了长期以来靠鱼卵大小、形态、颜色等鉴别鲟鱼子酱不太准确的方法。
5.3.2 渔业资源管理
Wirgin等（1993）对美国哈德逊河和Chesapeake海湾以及捕捞区纽约东长岛湾的条纹鲈的线粒体DNA进行了RFLP分析，估计捕捞区的条纹鲈有73%来源于哈德逊河，27%来源于Chesapeake海湾。研究还发现加拿大的条纹鲈的几个群体与哈得逊河和Chesapeake海湾的不同，提出恢复加拿大条纹鲈群体的方法是以加拿大群体为孵化群体，不选用美国条纹鲈群体，以防止异源群体对地方群体的影响。近年来，人们对养殖群体逃逸对天然群体遗传多样性所造成的影响颇为关注，对二者的遗传多样性研究较多，已找到许多鱼类养殖群体与天然群体的遗传标记，为渔业资源监测提供了依据。
参考文献
长江水产研究所育种室，武汉大学生物系动物教研室.1975.几种经济鱼类及其杂种染色体的初步研究［J］.淡水渔业（2）：11-13.
陈关君.1984.鲤鱼、鲫鱼肌细胞线粒体DNA的限制性内切酶酶切图谱的比较［J］.遗传学报，1（2）：141-146.
陈灵芝.1993.中国的生物多样性——现状及其保护对策［M］.北京：科学出版社，99-11.
陈晓峰，谭声江，栗士朋，等.2001.遗传多样性研究的理论方法及应用［A］.陈灵芝和马克平，主编：生物多样性科学原理与实践［M］.上海：上海科学技术出版社，93-125.
崔建勋，俞其兴，陈修海.1992.三种鱼mtDNA限制性内切酶分析［J］.动物学研究，13（3）：256-262.
戴建华，殷文莉，杨代淑，等.1994a.长吻肝脏线粒体DNA的研究［J］.武汉大学学报：自然科学版（1）：115-120.
戴建华，殷文莉，杨代淑，等.1994b.鲇鱼线粒体DNA的酶切图谱［J］.水产学报，18（4）：312-320.
戴建华，殷文莉，杨代淑，等.1994c.黄颡鱼线粒体DNA多态性及酶切图谱的研究.中国动物学会成立60周年纪念陈桢教授诞辰100周年论文集［C］.北京：中国科学技术出版社，168-174.
邓怀，邹素云.1998.十种常见淡水鱼类的RAPD鉴定［J］.淡水渔业，28（1）：8-10.
邓务国.1994.物种遗传多样性研究方法的发展.生物学通报，29（1）：7-9.
葛颂，洪德元.1994.遗传多样性及其检测方法［A］.见中国科学院生物多样性委员会，主编：生物多样性研究的原理和方法［M］.北京：中国科学技术出版社，123-140.
耿德贵，王景明，江山，等.1999.鱼类染色体显带的研究进展［M］.动物学杂志，34（1）：40-43.
何平.1998.真核生物中的微卫星及其应用［J］.遗传，20（4）：42-47.
贾永红，简承松，史宪伟.1998.遗传标记及其在动物遗传育种中的应用（上）［J］.黄牛杂志，24（6）：45-46.
李斌，鲁成，周泽扬，等.2000.RAPD标记构建家蚕分子连锁图谱［J］.遗传学报，27（2）：127-132.
李殿香，李传印，戎茜，等.1999.泥鳅线粒体DNA限制性酶切图谱［J］.动物学研究，20（2）：153-155.
李思发，蔡完其，周碧云.1991.团头鲂种群间的形态差异和生化遗传差异［J］.水产学报，15（3）：204-221.
李思发，王强，陈永乐.1986.长江、珠江、黑龙江三水系的鲢、鳙、草鱼原种种群的生化遗传结构与变异［J］.水产学报，10（4）：351-372.
李思发，周碧云，倪重匡，等.1989.长江、珠江、黑龙江鲢、鳙和草鱼原种种群形态差异［J］.动物学报，35（4）：390-398.
李思发.1998.中国淡水主要养殖鱼类种质研究［M］.上海：上海科学技术出版社，184-228.
楼允东.1997.中国鱼类染色体组型研究的进展［J］.水产学报，21（增刊）：82-96.
楼允东.1999.鱼类育种学［M］.北京：中国农业出版社，327-343.
施立明，贾旭，胡成昂.1993.遗传多样性［A］.见陈灵芝，主编：中国的生物多样性——现状及其保护对策［M］.北京：科学出版社，99-113.
宋平，李晓迎.1994.鲢鳙线粒体DNA的九种限制性内切酶酶谱的比较［J］.水产学报，18（3）：221-230.
孙超，雷引莲.2000.家畜遗传多样性的表达水平及其检测技术［J］.黄牛杂志，26（4）：53-56.
王成辉，李思发，徐志彬，等.2002.瓯江彩鲤线粒体DNA的限制性内切酶分析［J］.上海水产大学学报，11（1）：14-18.
王志勇，王艺磊，林利民.2001.利用AFLP指纹技术研究中国沿海真鲷群体的遗传变异和趋异［J］.水产学报，25（4）：289-293.
夏铭.1999.遗传多样性研究进展［J］.生态学杂志，18（3）：59-65.
肖武汉，张亚平.2000.银鲴自然群体线料体DNA的遗传分化［J］.水生生物学报，24（1）：1-9.
薛国雄，刘棘.1998.三江水系草鱼种群RAPD分析［J］.中国水产科学，5（1）：1-5.
晏勇，张兴忠，龙华.1994.草鱼线粒体DNA限制性内切酶分析［J］.淡水渔业，（3）：30-31.
杨昭庆，洪坤学.2000.单核苷酸多态性的研究进展［J］.国外医学遗传学分册，23（1）：4-8.
姚纪花，楼允东，江涌.1998.我国六个地区银鲫种群线粒体DNA多态性的研究［J］.水产学报，22（4）：289-295.
姚世鸿.1993.染色体进化与生物进化关系研究的历史与现状［J］.贵州师范大学学报：自然科学版，11（4）：75-83.
张四明，龙华，张兴忠.1992.方正银鲫、白鲫与鲫线粒体DNA限制性内切酶酶切比较［J］.水产学报，16（2）：120-129.
张四明，龙华.1991.乌鳢线粒体 DNA 限制性内切酶酶切分析［J］.淡水渔业，（4）：38-39.
张四明，龙华.1996.湖北淤泥湖团头鲂mtDNA限制性片段长度多态性的研究［J］.水产学报，20（4）：289-293.
赵金良，李思发.1996.长江中下游鲢、鳙、草鱼、青鱼种群分化的同工酶分析［J］.水产学报，20（2）：104-110.
朱蓝菲.1982.几种鲤科鱼类LDH同工酶的研究［J］.水生生物学报，4：539-543.
Avise J C，Helfman G S，Saunders N C，et al.1986.Mitochondrial DNA differentiation in North Atlantic eels：population genetic consequences of an unusual life history pattern［J］.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.83：4350-4354.
Beacham T D，Wood C C.1999.Application of microsatellite DNA variation ot estimation of stock composition and escapement of Nass River sockeye salmon（Oncorhynchus nerka ）［J］.Can.J.Fish.Aquct.Sci.56：297-310.
Beachman T D，Dempson J B.1998.Population structure of Atlantic salmon from the Conne River，Newfoundland as determined from microsatellite DNA［J］.Journal of Fish Biology，52：665-676.
Chalmers K J，Waugh R，Sprent J，et al.1992.Detection of genetic variation between and with populations of Cliricidra sepium and Gmaculara using RAPD makers［J］.Heredity，69：465-472.
Chang Y C，Huang F，Lo T B.1994.The complete nucleotide sequence and gene organization of carp（Cyprinus carpio ） mitochondrial genome［J］.J.Mol.Evol，38：138-155.
Desvignes J F，Laroche J，Durand J D，et al.2001.Genetic variability in reared stocks of common carp（Cyprinus carpio L.） based on alloaymes and microsatellites［J］.Aquaculture，194：291-301.
Estoup A，Presa P，Krieg F，et al.1993.（CT）n and （GT）n microsatellites：a new class of genetic markers for Salmo truttra L.（brown trout）［J］.Heredity，71：488-496.
Jain A，Bhatic S，Banga S.1994.Potential use of random amplified polymorphic DAN （RAPD） technique to heterosis［J］.Theor. Appl.Genet，88：116-122.
Jean F D，Jean L，Jean D D.2001.Genetic variability in reared stocks of common carp（Cyprinus carpio L.） based on allozymes and microsatellites［J］.Aquaculture，194：291-301.
Noack K，Zardoya R，Meyer A.1996.The complete mitochondrial DNA sequence of the bichir （Polypterus ornatipinnis ），a basal ray-finned fish：ancient establishment of the consensus vertebrate gene order［J］.Genetics，144 （3）：1165-1180.
Norris A T，Bradley D G，Cunningham E P.1999.Microsatellite genetic variation between and within farmed and wild Atlantic salmon （Salmo salar ） population［J］.Aquaculture，180：247-264.
Palva T K，Palva E T.1987.Restriction site polymorphism in mitochondrial DNA in rainbow trout，Salmo gairdneri Richardson，stocks in Finlang［J］.Aquaculture，67：283-289
Pava T，Heikkilenvaslaiho，Palva E T.1989.Identification of anadromous and non-anadromous salmon stocks in Finland by mitochondrial DNA analysis ［J］.Aquaculture，81：237-244.
Saitoh K，Tanaka M，Ueshima R，et al.1995.Preliminary data on restriction mapping and detection of length variation in Japanese flounder mitochondrial DNA［J］.Aquaculture，136：109-116.
Slettan A，Olasker I，Lie O.1997.Segregation studies and linkage analysis of Atlantic salmon microsatellites using haploid genetics［J］.Heredity，78（6）：620-627.
Steven X C，Kevin D F.1999.The utility of image processing techniques for morphometric analysis and stock identification［J］.Fisheries Research，43：129-139.
Tudela S.2001.Morphological variability in a Mediterranean，genetically homogeneous population of the European anchovy，Engraulis encrasicolus［J］.Fisheries Research，42：229-243.
Tzeng C S，Hui C F，Shen S C，et al.1992.The complete nucleotide sequence of the Crossostoma lacustre mitochondrial genome，conservation and variation among vertebrates［J］.Nucleic Acids Res.20：4853–4858.
Welsh J K.1990.Fingerprinting genoms using PCR with arbitrary primers［J］.Nacl.Acids Res，18：7213-7218.
Williams J G K，Kubilik A R，Liavk K J.1990.DNA polymorphism amplified by arbitrary primers is useful as genetic markers［J］.Nacl.Acids Res，18：6531-6535.
6 单核苷酸多态性的原理与方法
6.1 SNPs的概念和特点
6.1.1 SNPs的概念
SNPs主要是指在基因组水平上由于单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性，即同一物种不同个体间染色体上遗传密码单个碱基的变化。常表现为单碱基的转换、颠换、插入和缺失，但通常所指的SNPs不包括后两种情况，即插入和缺失；满足SNPs条件的另一规定是其中一种等位基因在群体中出现的频率应不小于1% （Alain et al，2002）。通常发生转换与颠换的SNPs之比为2∶1，这是由于CpG二核苷酸的胞嘧啶是最易发生突变的位点，胞嘧啶可发生甲基化脱去氨基而形成胸腺嘧啶。理论上，在一个二倍体生物群体中，SNPs可能是由2个、3个或4个等位基因构成，但实际上3个或4个等位基因的SNPs罕见，所以SNPs通常被认为只有2种等位基因，即双等位基因分子标记（Brookes，1999）。根据SNPs在基因组中的位置可分为编码区SNPs（coding region SNPs）、基因周边SNPs（perigenic SNPs）和基因间SNPs（intergenic SNPs）3类（Alain et al，2002）。大多数SNPs位于基因组的非编码区，对蛋白质无直接影响，这一类SNPs作为遗传标记在群体遗传和生物进化地研究中有着很重要的作用（Syvanen，2001）。少数分布在基因编码区的SNPs称为cSNPs（coding SNPs）。Halush等（1999）根据对75个基因的检测结果推测人类基因组中约存在100万个SNPs位点，其中约50万个分布在非编码区，20万～40万个SNPs在编码区，而分布在编码区的非同义突变SNPs只有2.4万～4万个。根据对遗传性状的影响，cSNPs还可分为：①同义突变。编码序列的改变并不影响所翻译的氨基酸序列，蛋白质的功能不变。②非同义突变。可分为错义突变和无义突变，前者指改变编码序列导致翻译的氨基酸序列改变，从而改变蛋白质的生物学功能；无义突变是指突变形成终止密码子，翻译终止。Henikoff（2002）估计SNP数据库中3084条非同义SNPs中，25%的SNPs影响蛋白质的功能。
6.1.2 SNPs的特点
1.数量多且分布广泛
据估计，在人类基因组中大约平均每1900bp就会出现1个SNPs，整个基因组中大约有142万个SNPs，其发生频率超过1%（2001）。正是由于SNPs数量巨大，从而弥补了其多态性不足的缺点。Kruglyak（1997）认为使用700～900个SNPs进行基因组扫描构建遗传图谱的能力相当于目前使用300～400个微卫星标记，而如果使用1500～3000个SNPs作基因组扫描，其结果明显高于目前普遍采用的微卫星标记。
2.富有代表性
某些位于基因内部的SNPs有可能直接影响蛋白质结构或表达水平，因此它们可能代表某些性状的遗传基础。
3.遗传稳定性
SNPs是基因组中分布最广泛且稳定的点突变，突变率低，与微卫星等重复序列多态标记相比，SNPs具有更高的遗传稳定性，尤其是处于编码区的SNPs（Weber，1993）。
4.检测易于实现自动化
SNPs通常是一种双等位基因的遗传变异，在检测时无须像检测微卫星标记那样对片段的长度做出测量，只需一个“+/-”或“全或无”分析的方式，有利于发展自动化筛选或检测SNPs（Brookes，1998）。
6.2 SNPs的检测方法
6.2.1 直接测序法
直接测序法是检测SNPs最准确的方法，其检出率可达到100%。主要是指对不同个体同一基因或基因片段的PCR产物进行测序和序列比较，或对已定位的序列标签位点（STS）和表达序列标签（EST）进行再测序。其流程为：PCR扩增目的片段→纯化、回收→测序。随着测序自动化程度的提高和测序成本的降低，直接测序将会越来越多地用于SNPs的检测与分型，但目前直接测序仍然是一种费用较高的方法，而且对于杂合体不易分型。另外常用的一种方法为简化代表性散弹（Reduced Representation Shotgun，RRS）测序。其主要步骤为：首先用限制性内切酶消化DNA成许多片段，然后将这些片段连接到载体，载入受体细胞，最后进行测序。Altshuler等（2000）用该方法在人类基因组中发现了47172个SNPs，为建立人类高密度SNPs图谱奠定了基础。
6.2.2 以构象为基础的检测法
6.2.2.1 单链构象多态性
日本学者Orita等（1989）研究发现，单链DNA片段呈复杂的空间折叠构象，这种立体结构主要是由其内部碱基配对等分子内相互作用力来维持的，当有一个碱基发生改变时，会或多或少地影响其空间构象，使构象发生改变，空间构象有差异的单链DNA分子在聚丙烯酰胺凝胶中受排阻大小不同。因此，通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE），可以非常敏锐地将构象上有差异的分子分离开。该方法称为为单链构象多态性（Single-strand conformational polymorphism，SSCP）。在随后的研究中，Orita等（1989）又将SSCP用于检查PCR扩增产物的基因突变，从而建立了PCR-SSCP技术，进一步提高了检测突变方法的简便性和灵敏性。
PCR-SSCP的基本过程包括：①PCR扩增靶DNA。②将特异的PCR扩增产物变性，而后快速复性，使之成为具有一定空间结构的单链DNA分子。③将适量的单链DNA进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。④最后通过放射性自显影、银染或溴化乙啶显色分析结果。若发现单链DNA带迁移率与正常对照的相比发生改变，就可以判定该链构象发生改变，进而推断该DNA片段中有碱基突变。经试验证明，小于300 bp的DNA片段中的单碱基突变，90%可被SSCP发现。该方法简便、快速、灵敏，不需要特殊的仪器，但它的不足之处是只能作为一种粗略地突变检测方法，要最后确定突变的位置和类型，还需进一步测序；此外电泳条件也要求较严格；另外，由于SSCP是依据点突变引起单链DNA分子立体构象的改变来实现电泳分离的，这样就可能会出现当某些位置的点突变对单链DNA分子立体构象的改变不起作用或作用很小时，再加上其他条件的影响，使聚丙烯酰胺凝胶电泳无法分辨造成漏检。尽管如此该方法还是在各领域得到了广泛的应用，乃至今天仍然不失为一种检测SNPs的经典方法（Murakami et al.，1991；Michaud et al.，1992）。
SSCP技术自创立以来，经历了自身发展和完善的过程，刚建立时是将同位素掺入PCR扩增物中，通过放射自显影来显示结果。这给该技术的推广造成一定的困难，随着DNA银染方法与PCR-SSCP结合，使得该方法大大简化。SSCP值得注意的改进是将DNA-SSCP分析改为RNA-SSCP分析，其基本原理是：RNA有着更多精细的二级和三级构象，这些构象对单个碱基的突变很敏感，从而提高了检出率，其突变检出率可达90%以上。另外，RNA不易结合成双链，因此可以较大量的进行电泳，有利于用溴化乙啶染色。但该方法增加了一个反转录过程，还需要一个较长的引物，内含有启动RNA聚合酶的启动序列，从而相对地增加了该方法的难度。Sarkar等（1992）用RNA-SSCP法检测了28名B型血友病患者的凝血因子Ⅸ的基因序列，对于全长2.6 kb的凝血因子Ⅸ基因组用直接测序法检测到的20处碱基点突变，用RNA-SSCP可检测出其中的70%，而DNA-SSCP只能检测出35%，证明了RNA-SSCP比DNA-SSCP具有更高的灵敏性。另一方面，为了进一步提高SSCP的检出率，还可将SSCP分析与其他突变检测方法相结合。其中与杂交双链分析（Heterocluplex analysis，Het）法结合可以大大提高检出率。Het法是用探针与要检测的单链DNA或RNA进行杂交，含有一对碱基对错配的杂交链可以和完全互补的杂交链在非变性PAG凝胶上通过电泳被分离开。对同一靶序列分别进行SSCP和Het分析可以使点突变的检出率100%，而且试验简便。Ravnik-Glavac等（1994）对膀胱纤维基因27个外显子中的134个突变点进行了检测，结果表明，单独用SSCP检出的效率为75%～98%，而结合Het法则能全部检测出来。
6.2.2.2 温度梯度凝胶电泳
温度梯度凝胶电泳（Temperature gradient gel electrophoresis，TGGE）方法主要是根据点突变和正常DNA片段由于解链温度Tm值的不同所表现出的不同解链行为。DNA片段在聚丙烯酰胺凝胶电泳中通过设置温度梯度来进行分离，当温度达到最低熔解区即开始解链，使片段呈Y形结构，因而降低其迁移速率。一个碱基的不同足以导致迁移速率的不同，从而达到在温度梯度电泳中分离的效果。如果序列是已知的，则DNA双链片段的变性行为可以用Poland软件进行预测。该方法可用于200～900 bp内的DNA片段，检出率可达100%（Risesner et al.，1992）。
6.2.2.3 变性梯度凝胶电泳
变性梯度凝胶电泳（Denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）是利用双链DNA分子在一定浓度梯度变性剂的凝胶中电泳时，会在一定变性剂浓度下发生部分解链，导致电泳迁移率下降，两个DNA分子间即使只有一个碱基对的差异，也会在不同时间不同地点发生部分解链，从而被分离成两条带（Cotton，1991）。DGGE与TGGE类似，只是DGGE依靠变性剂使Tm值不同的分子分离，而TGGE是依靠温度梯度。DGGE能检测的片段可长达1 kb，若SNPs发生在最先解链的DNA区域，其检出率也可达100%，尤其是100～500 bp的片段，所以该技术已被广泛应用于SNPs的检测。
6.2.2.4 变性高效液相色谱
变性高效液相色谱法（Denaturing highperformance liquid chromatography，DHPLC）是近年来在DGGE和SSCP基础上发展起来的一种检测SNPs的技术，其基本原理是：含有突变位点的PCR扩增产物经变性、逐步降温退火后，将形成同源和异源双链2种DNA分子。在部分变性条件下，由于异源双链的解链温度较低，发生错配的异源双链DNA更易于解链为单链DNA，会先形成单螺旋DNA从色谱柱中流出，从而与同源双链DNA分离（Oefner，1995）。DHPLC的检出率为90%～95%，有效片段大小为70～1000bp。它的优点是成本低，操作简单，易自动化，与DGGE和SSCP相比，更适合于大样本筛选，且有较高的重复性；缺点是仍然不能准确指明SNPs在片段中的位置。
6.2.3 基于PCR、酶切的检测法
6.2.3.1 聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）
检测 PCR-RFLP是SNPs筛选中最经典的方法之一，已广泛应用于SNPs的检测中。限制性片段长度多态性（Restricted Fragment Length Polymorphism，RFLP）是指用限制性内切酶切割不同个体基因组DNA后，含有同源序列的酶切片段在长度上的差异。最初由Botstein等（1980）首先提出利用RFLP标记构建遗传图谱，直至1987年Donis Keller等（1987）才构建出第一张人的RFLP图谱。由于传统的RFLP检测需要Southern杂交等过程，使得分析成本偏高、速度较慢，其应用受到了很大的限制。现在的RFLP标记一般与PCR技术结合起来应用，其原理是根据基因的突变会产生或消除某些酶切位点，从而利用限制性内切酶的特异性，用一种或一种以上的限制性内酶作用于同一DNA片段，如果存在SNPs位点，酶切片段的大小和数目就会出现差异，然后进行电泳检测就可以判断是否有SNPs位点以及碱基替换的类型。不难看出，该方法只适合于检测酶切位点处的SNPs，对于酶切位点以外的SNPs则无法检测，因而在一定程度上限制了该方法的应用。
6.2.3.2 突变酶学检测（EMD）
突变酶学检测（Enzymatic mutation detection，EMD）是利用T4内切酶Ⅶ的特性检测SNPs，T4内切酶Ⅶ又称为离解酶，能够解离重组中间体，识别并切割一些特殊DNA底物，如：十字结构、分支DNA、单链突出、单碱基错配而形成的泡状结构及因插入或缺失而形成的突变（Del et al.，1998）。EMD检测的方法简述如下：PCR扩增不同个体的DNA片段，混合，经变性、复性形成异源双链，用T4内切酶Ⅶ处理，电泳分离产物片段，根据片段大小判断是否存在SNPs及大致位置。EMD的优点是：方法简单，速度快，检出率可高达100%；可分析几个kb的DNA片段，能检测多种类型的SNPs，并且可以找出SNPs的大致位置。
6.2.4 基于杂交的检测法
6.2.4.1 TaqMan探针技术
TaqMan技术是以荧光共振能量传递（Fluorescent resonance energy transfer，FRET）为基础的检测方法，在PCR反应中，将供者—受者染料对（发光基团和淬灭基团）分别结合到Taqman探针的两端，探针未与目标序列结合时，通过FRET作用使供者不发荧光；完全互补配对后，由于Taq DNA聚合酶具有5′核酸酶的活性，可将供者从探针上切下来从而发出荧光。如果探针与目标序列中存在错配碱基，就会减少探针与目标序列结合的紧密程度及Taq DNA聚合酶切割供者的活性，也就影响了供者的荧光释放量，从而使碱基突变链和正常链得以区分。TaqMan技术将检测结合在PCR反应过程中，无须分离或洗脱，提高了速度并减少了PCR污染的可能性（Ranade et al.，2001）。其缺点主要是：敏感性受Taq酶活性影响较大；设计探针时需注意FRET的传递效率和PCR扩增效率，探针设计成本较高。
6.2.4.2 基因芯片（Gene chip）检测
基因芯片又称DNA芯片（DNA chips），是在固相支持介质上进行分子杂交并原位荧光检测的一种高通量SNPs分析方法。根据核苷酸的碱基配对原理，设计2种或多种探种，在优化操作后，探针只与其完全互补的序列杂交，而与含有单个错配碱基的序列不杂交。特定序列的探针固定在特殊的载体表面上，如玻璃、硅片等，制成DNA芯片。待测基因经提取扩增、荧光化学标记后，与固定的探针进行杂交。然后洗去没有发生杂交的样品，即可检测杂交样品。由于目标基因和探针杂交的程度与荧光强度及种类有关，因此通过激光扫描，可根据荧光强弱或荧光的种类检测出被检序列的碱基类别（Wang et al.，1998）。利用基因芯片技术筛查SNPs是随着近几年芯片技术的迅速发展而建立的一种高通量、自动化的检测手段，应用该方法可以寻找新的SNPs位点，并实现SNPs位点在基因组中的精确定位。但是该项技术还不够成熟，由于杂交条件对不同GC含量的DNA是完全不同的，还没有找到一种普遍性的杂交条件，另外还需要解决重复序列对杂交准确度的影响。
6.3 SNPs在水产动物遗传育种中的应用
6.3.1 构建高密度遗传连锁图谱
遗传连锁图谱（Genetic linkage map），是生物基因组结构研究以及进行QTL准确定位的一个重要前提。遗传连锁图谱上包括的标记数越多，分布越均匀则定位的基因就越精确，这将为标记辅助选择、重要经济性状的QTL定位及至最终实现基因型选择创造条件。到20世纪80年代，各种DNA分子标记的出现使得构建中、高密度遗传连锁图谱成为可能，特别是微卫星（SSR）曾一度成为育种学家的最爱。SNPs在基因组中分布的广泛性及其在同一位点上的双等位特性，使之适合于自动化大规模扫描，成为继SSR之后最受推崇的作图标记。人类（Syvanen，2001）以及作为试验遗传的模式动物鼠（Musmusculus）（Lindblad-Toh et al.，2000）、果蝇（Drosophila melanogaster）（Hoskins et al.，2001）、模式植物拟南芥（Arabidopsis thaliana）（Cho et al.，1999）等的SNPs遗传连锁图谱已经建立起来。在水产动物方面，Stickney等（2002）采用寡核苷酸微阵列（Oligonucleotide microarrays）技术，对模式动物斑马鱼（Danio rerio ）中712个基因和表达序列标签（EST）进行大规模扫描得到了2035个SNPs，其中发生转换的SNPs占54.6%，由颠换造成的SNPs占45.4%。构建了斑马鱼的第一幅SNPs遗传图谱，该图谱由25个连锁群（Linkage Group，LG）组成，其全长为3000cM，包括了1930个SNPs，平均分辨率为6.98 cM。利用斑马鱼的SNPs图谱，将以前一些用基因图谱或微卫星图谱不能定位的突变和基因进行了定位。通过斑马鱼SNPs图谱，Stickney成功地将Talbot等（1995）发现的floating head（flh）突变定位于LG13；功能基因st11也被成功地定位到LG2。SNPs图谱的构建无疑将更有利于QTL的精确定位。目前用SNPs标记构建遗传连锁图谱还只限于模式种斑马鱼，它所确立的一系列方法也可用于水产动物的SNPs遗传图谱的构建。
6.3.2 连锁不平衡、关联分析和功能学验证
SNPs标记在群体水平上的应用研究最具有吸引力的方面是利用群体遗传学中的连锁不平衡（Linkage disequilibrium，LD）原理来进行关联分析（Associate study）（Brookes，1999）。连锁不平衡是一个复杂现象，遗传距离、不同等位基因的选择压力、遗传漂变、群体的瓶颈效应以及发生新突变均对连锁不平衡有着很大的影响。但由于漂变和选择产生的不平衡在不连锁的基因座之间将很快消失，而紧密连锁的基因座之间的连锁不平衡消失很慢，因而通过研究一个位标与性状相关基因座之间的连锁不平衡将有助于目标性状的精细定位。由于SNPs在基因组十分丰富，它的稳定性和容易记录使得人们可以利用连锁不平衡分析来深入研究群体遗传学的一些基本理论问题，并在此基础上进行关联研究。进行关联分析时，采用候选基因法来分析功能基因的等位基因与表型的关联性，是一个有效的方法（Lynch，1998）。候选基因SNPs标记是一种重要的QTL定位方法，它通过揭示直接在生理上或在生长发育过程中能得以表现的标记基因与控制数量性状的主效基因的关系，而用于QTL定位。
肉质是家畜重要经济性状之一，其中影响最为突出的是双肌性状。双肌性状是由于肌肉生长抑制素（Mysatatin，MSTN）缺失或突变从而导致肌肉过度生长或肥大引起的。Grobet等（1998）研究表明皮埃蒙特牛MSTN基因在第三外显子处发生错义突变（G→A），使得蛋白质成熟区酪氨酸替代胱氨酸，导致MSTN基因失活，从而表现出双肌性状。生长性状是水产动物中最重要的一个经济性状，与水产动物生长性能相关的候选基因主要包括生长激素（Growth hormone，GH）、生长激素受体（Growth hormone receptor，GHR）、类胰岛素生长因子（Insulin-like growth factor，IGF）等。国内外学者通过候选基因法在寻找与水产动物生长性状相关的SNPs位点上也取得了初步成效。Tao等（2003）采用PCR-RFLP和双向特异等位基因扩增（Bidirectiona amplification of specific alleles，Bi-PASA）技术对北极嘉鱼（Salvelinus alpinus L.）两个全同胞家系中与生长相关的10个候选基因进行了SNPs位点的筛选，并进行了SNPs位点与生长性状的关联分析。结果表明，10个候选基因中有5个（GH 1、GH 2、IGF 1、Pit 1及GHRH/PACAP 2）含有SNPs位点（8个），其中位于基因GHRH/PACAP 2上的SNPs位点与北极嘉鱼早期生长速率存在极显著性相关（P=0.00001）；同时表明，对于非模式生物，通过近缘种序列比对来设计引物扩增候选基因进行QTL定位是一种切实可行的方法。Gross等（1999）用TaqI酶切大西洋鲑（Salmo salar L.）GH 1基因从第一外显子到第四外显子的1825bp片段，结果在内含子3上发现了一个新的TaqI酶切位点，在1龄大西洋鲑中共检测到了3个等位基因8种基因型，在这3个群体中不同等位基因和基因型的分布存在显著性差异（P<0.05）。Xu等（2006）克隆了与尖吻鲈（Lates calcarifer ）肌肉生长相关的小清蛋白基因（PVALB 1和PVALB 2），在PVALB 1基因的3′非编码区发现了1个微卫星位点，该位点与尖吻鲈孵出90天后的体质量、体长极显著相关（P<0.01）同时通过直接测序法在PVALB 2基因的3个内含子上检测到了3个SNPs位点，但没有发现与尖吻鲈的生长性状存在相关性。Kang等（2002）利用Southe杂交技术对牙鲆（Paralichthys olivaceus ）GH第一外显子到第5外显子的2114bp进行了分析，Sau3A限制性内酶在牙鲆大中小3个群体中检测到了6个等位基因15种基因型，这些等位基因和基因型在3个不同群体中的分布具有显著性差异（P<0.05）可以将这些位点作为与牙鲆生长相关的标记。Case等（2006）用DraⅠ酶切大西洋鳕（Gadus morhua ）和其他海域鳕panⅠ基因中的313bp片段，发现大西洋鳕panⅠ基因的变异对其生长性状有着重要的影响其中属于pan Ⅰab基因型的鳕在出生10周后的体质量和体长明显高于pan Ⅰ bb型的鳕（P<0.01）。
国内学者倪静等（2006）根据牙鲆生长激素（GH基因的5个外显子序列设计引物，通过PCR-SSCP分析技术对其进行检测，结果表明，该群体生长激素基因的第4个外显子存在多态性（C→T），进行关联分析发现不同基因型的个体在体质量和头长上存在显著性差异（P<0.05）。本试验室于凌云等通过候选基因法，对大口黑鲈（Micropteru salmoides ）MyoD基因进行了SNPs位点的筛选在内含子上发现有7个SNPs位点，这些位点在分析群体中的突变频率为4.2%～35.3%，均大于1%因而可以认为是突变点，为接下来分析这7个SNP位点与大口黑鲈生长性能的相关性奠定了基础（待发表）。相对畜牧和家禽而言，SNPs标记应用于水产动物关联分析方面起步较晚，研究还很少，但随着SNPs技术的迅速发展和各国学者对水产养殖业的重视，必将在水产动物分子标记辅助育种中得到广泛的应用。
对于SNPs位点与某一性状的关联性研究，不同试验室得出的结果往往也存在很大差异甚至完全相反，而且与某一性状显著关联的SNPs到底是发挥功能性作用，还是仅仅与功能性SNPs相连锁的遗传标记甚至二者只是某种联系上的假象，这都需要进行功能学研究来加以证实。预计引起细胞功能学改变的SNPs在所有SNPs只占极小一部分，大多数是分布在基因启动子区域可能发挥调节转录效应的SNPs和蛋白质编码区域引起编码氨基酸改变的SNPs。分子生物学技术的迅速发展，极大地推动了SNPs功能学验证的深入研究。现在比较成熟的对于启动子区域SNPs功能学研究技术主要包括：①报告基因转染技术。这一技术主要用于研究启动子SNPs对于mRNA转录效率的影响，通过观察转录结果来判断SNPs是否具有功能。②凝胶迁移滞后试验（Electrophoretic mobility shift assays，EMSA）。该技术通过在体外合成含SNPs位点的寡核苷酸与转录因子特异性结合，观察二者结合的强度和效率，但是该技术只是人工合成较短长度的寡核苷酸，没有考虑SNPs位点周围遗传背景环境的影响（Pitarque et al.，2004）。③染色质免疫沉淀分析（Chromatin immunoprecipitation assay，CHIP）。该技术通过超声将染色体碎片化，再将碎片化的核酸片段与转录因子结合，然后通过PCR技术扩增观察判断二者结合的效率和强度（Buck，2004）。
现阶段对于SNPs功能学的研究主要集中在人类复杂疾病上。Sun等（2007）通过关联分析发现CASP 8基因启动子区域-6526N缺失与肺癌风险的降低存在显著相关性。同时对其进行了SNPs功能学验证，发现由于-6526N的缺失使得CASP 8基因对应的mRNA表达量有所下降，最终导致T淋巴细胞中CASP 8的活性和在癌细胞抗原诱导下的细胞死亡率降低。SNPs的功能学验证这一特点是其他分子标记所不具备的，因而用SNPs标记来进行关联性研究再进行功能学验证很大程度上提高了标记的可靠性，具有其他分子标记无可比拟的优越性。虽然SNPs功能学验证在水产动物中还没有相关研究，但随着水产动物分子生物技术的不断发展，该技术独特的优点在水产动物遗传育种中将具有广泛的应用前景。
6.3.3 种群进化和亲缘关系的研究
SNPs具有分布广泛位点丰富、低突变率（10-8～10-9）能稳定遗传及二等位基因标记易于实现自动化等特点，非常适合群体遗传学中种群进化和亲缘关系的研究（Brumfield et al.，2003）。线粒体DNA（mtDNA）具有分子结构简单、严格的母性遗传、几乎不发生重组、进化速度快、不同区域进化速度存在差异等特点，使其成为群体遗传学和分子系统学研究的重要标记。在水产动物方面，将SNPs标记应用于mtDNA来研究特种的进化和亲缘关系已经取得了一系列进展。Chow等（1997）用4种限制性内酶（Alu，DdeⅠ，HhaⅠ和RsaⅠ）对13个不同海域的456尾剑鱼（Xiphias gladius ）的线粒体DNA进行了PCR-RFLP分析，共检测到了52种基因型，遗传距离为0.702～0.962。RsaⅠ在地中海剑鱼群体中没有发现多态性，说明很少有外来剑鱼进入该水体中；同时还成功地将大西洋与太平洋的剑鱼群体进行了区分。Aranishi等（2005）对亲缘关系非常接近的3种鳕科鱼类的细胞色素b基因进行了PCRRFLP分析，结果在阿拉斯加州鳕中扩增出了3条带（106 bp，161 bp和291 bp），太平洋鳕为两条带（106 bp和452 bp），而在大西洋鳕中没有切开，从而很好地将3种鳕区分开来。Itoi等（2005）运用PCRRFLP和TaqMan MGB探针技术，得到的不同大小的酶切片段及荧光密度的不同能够很好地将日本鳗鲡（Anguilla japonica）和欧洲鳗鲡（Anguilla anguilla ）区分开来。由于等位酶标记受到取样数量大小的限制，而微卫星标记在不同试验室或国家之间的数据传输困难，Smith等（2005）利用10个SNPs位点成功地将分别位于美国和加拿大流域的大鳞大马哈鱼区分开来，其精确度达到95%。汪登强等（2005）利用PCR-RFLP对13种鲟形目鱼类mtDNA进行了分析，结果显示，鲟科的6种鱼与匙吻鲟和白鲟分成两大支；鲟科中两种鳇没有聚到一起，支持了鳇不能作独立分类单元的观点，为鲟形目鱼类遗传和进化研究提供了科学依据。
6.4 问题与展望
SNPs是生命遗传物质基因变异的主要存在形式，既可用于高密度遗传图谱的构建，也可用于基于候选基因或整个基因组的关联研究。近年来，SNPs在人类流行病学关联研究中取得的成果，极大地促进了SNPs在动物基因组研究中的应用。一系列发现和检测SNPs的方法、构建图谱的策略以及连锁不平衡和关联分析等技术正被广泛应用于动物基因组研究领域中。水产动物的主要经济性状（如生长性状）大都属于数量性状（QTL），其遗传机制比较复杂，受到众多基因控制。要想精确定位这些QTL从而辅助育种，就必须建立高密度的遗传图谱。SNPs标记的出现可以很好地解决这一问题，与微卫星相比，SNPs在基因组中的分布更为广泛，拥有更庞大的遗传信息，并且易于自动化。因而，更适合于建立水产动物遗传图谱，进行QTL精细定位。但由于SNPs应用于水产动物研究起步较晚，缺乏足够的SNPs位点来构建遗传图谱或进行关联分析。在今后的研究中，应致力于用高效的检测方法来大规模筛选SNPs位点，进行关联分析以及SNPs功能学验证研究；另一方面可从已知的与重要经济性状相关的基因着手，研究这些基因外显子、内含子SNPs多态性，特别是调控序列上的SNPs多态性，这样更容易找到与特定功能相关的分子标记，提高水产动物选择育种的效率。
参考文献
倪静，尤锋，张培军，等.2006.牙鲆GH基因外显子多态性与生长性状关系的初步研究［J］.高技术通讯，16（3）：307-312.
汪登强，危起伟，王朝明，等.2005.13种鲟形目鱼类线粒体DNA的PCR-RFLP分析［J］.中国水产科学，12（4）：383-389.
Alain V，Denis M，Magali S C，et al.2002.Areview on SNP and other types of molecular markers and their use in animal genetics［J］.Genet Sel Evol，34：275-305.
Altshule D，Pollara V J，Cowles C R，et al.2000.An SNP map of the human genome generated by reduced representation shotgun sequencing［J］.Nature，407：513-516.
Aranishi F，Okimoto T，Izumi S.2005.Identification of gadoid species（Pisces，Gadidae）by PCR-RFL Panalysis［J］.J Appl Genet，46（1）：69-73.
Botstein D.1980.Construction of a genetic linkage map in the man using restriction fragment length polymorphism［J］.Hum Genet，32：314-331.
Brookes A J.1999.The essence of SNPs［J］.Gene，234：177-186.
Brookes A，Day I.1998.SNP attack on complex traits［J］.Nat Genet，20（3）：217-218.
Brumfield R T，Beerli P，Nickerson D A，et al.2003.The utility of single nucleotide polymorphisms in inferences of population history［J］.Trends Ecol Evol，18：249-256.
Buck M J，Lieb J D.2004.CHIP-chip：considerations for the design，analysis，and application of genome-wide chromatin immunoprecipitation experiments［J］.Genomics，83：349-360.
Case R A J，Hutchinson W F.2006.Association between growth and Pan I genotype within Atlantic cod full-sibling families［J］.American Fisheries Society，135：241-250.
Cho R J，Mindrinos M，Richards D R，et al.1999.Genome-wide mapping with biallelic markers in Arabidopsis thaliana［J］.Nature，23：203-207.
Chow S，Okamoto H，Uozumi，et al.1997.Genetic stock structure of the sword fish（Xiphias gladius ）inferred by PCR-RFL Panalysis of the mitochondrial DNA control region［J］.Marine Biology，127：359-367.
Cotton R G H，Malcolm A D B.1991.Mutation detection［J］.Nature，353：582-583.
Del Tito B J，Poff H E，Novotny M A，et al.1998.Automated fluorescent analysis procedure for enzymatic mutationdetection［J］.Clinic Chem，44：731-739.
Donis-Keller H，Knowlton R G，Braman J C，et al.1987.Genotyping by restriction fragment length polymorphisms［P］.European Patent：0221633，05/13/.
Grobet L，Poncelet D，Royo L J，et al.1998.Molecular definition of an allelic series of mutations disrupting the myostatin function and causing double-muscling in cattle［J］.Mammal Genome，9：210-213.
Gross R，Nilsson J.1999.Restriction fragment length polymorphism at the growth hormone 1gene in Atlantic salmon（Salmo salar L.）and its association with weight among the offspring of a hatchery stock［J］.Aquaculture，173：73-80.
Halush M K，Fan J B，Bentley K，et al.1999.Patterns of single nucleotide polymorphisms in candidate genes for blood-pressure homeostasis［J］.Nat Genet，22：239-247.
Henikoff S.2002.Accounting for human polymorphisms predicted to affect protein function［J］.Genome Res，12（3）：436-446.
Hoskins R A，Phan A，Naeemuddin M，et al.2001.Single nucleotide polymorphism markers for genetic mapping in Drosophila melanogaster［J］.Genome Res，11：1 100-1 113.
Itoi S，Nakaya M，Kaneko G，et al.2005.Rapid identification of eels Anguilla japonica and Anguilla anguilla by polymerase chain reaction with single nucleotide polymorphism-based specific probes［J］.Fish Sci，71：1356-1364.
Kang J H，Lee S J，Park S R，et al.2002.DNA polymorphism in the growth hormone gene and its association with weight in olive flounder Paralichthys olivaceus ［J］.Fish Sci，68：494-498.
Kryuglyak L.1997.The use of a genetic map of biallelic markers in linkage studies［J］.Nat Genet，17：21-24.
Lindblad-Toh K，Winchester E，Daly M J，et al.2000.Large-scale discovery and genotyping of single-nucleotide polymorphisms in the mouse［J］.Nat Genet，24：381-386.
Liu Z J，Cordes J F.2004.DNA marker technologies and their applications in aquaculture genetics［J］.Aquaculture，238：1-37.
Lynch M，Walsh B.1998.Genetics and analysis of quantitative traits［M］.Sinauer Assoc Inc.Sunderland，MA，USA，980p.
Michaud J，Brody L C，Steel G，et al.1992.Strand-separating conformational polymorphism analysis：efficacy of detection of point mutations in the human ornithine delta-a minotransferase gene［J］.Genomics，13：389-394.
Murakami Y，Katahira M，Makino R，et al.1991.Inactivation of the retinoblastoma gene in a human lung carcinoma cell line detected by single-strand conformation polymorphism analysis of the polymerase chain reaction product of cDNA［J］.Oncogene，6：37-42.
Oefner PJ，Underhill PA.1995.DNA mutation detection using denaturing high performance liquid chromatography（DHPLC）［J］.Am J Hum Genet，57：226.
Orita M，Iwahana H，Kanazawa H，et al.1989a.Detection of polymorphisms of human DNA by gel electrophoresis as single-strand conformation polymorphisms［J］.Proc Natl Acad Sci USA，86：2766-2770.
Orita M，Suzuki Y，Sekiya T，et al.1989b.Rapid and sensitive detection of point mutations and DNA polymorphisms using the polymerase chain reaction［J］.Genomics，5：874-879.
Pitarque M，Richter O，Rodriguez-Antona C，et al.2004.A nicotine Coxidase gene（CYP2A6） polymorphism important for prometer activity［J］.Hum Mutat，23：258-266.
Prudence M，Moal J，Boudry P，et al.2006.An amylase gene polymorphism is associated with growth differences in the Pacific cupped oyster Crassostrea gigas ［J］.Anim Genet，37：348-351.
Ranade K，Chang M S，Ting C T，et al.2001.High-Throughput genotyping with single nucleotide polymorphisms［J］.Genome Res，11：1 262-1 268.
Ravnik-Glavac M，Glavac D，Dean M.1994.Sensitivity of single strand conformation polymorphism and heteroduplex method for mutation detection in the cystic fibrosis gene［J］.Hum Mol Genet，3：801-807.
Risesner D，Steger G，Wiese U，et al.1992.Temperature-gradient gel electrophoresis for the detection of polymorphic DNA and for quantitative polymerase chain reaction［J］.Electrophoresis，13（9）：63-66.
Sarkar G，Yoon H S，Sommer S S.1992.Screening for mutations by RNA single-strand conformation polymorphism（rSSCP）：comparison with DNA-SSCP［J］.Nucleic Acids Res，20（4）：871-878.
Smith C T，Templin W D，Seeb J E，et al.2005.Single nucleotide polymorphisms provide rapid and accurate estimates of the proportions of U.S.and Canadian Chinook salmon caught in Yukon River fisheries［J］.NorthAmerican J Fish Manag，25：944-953.
Stickney H L，Schmutz J，Woods L G，et al.2002.Rapid mapping of zebrafish mutations with SNPs and oligonucleotide microarrays［J］.Genome Res，12：1 929-1 934.
Sun T，Gao Y，Tan W，et al.2007.Asix-nucleotide insertion-deletion polymorphism in the CASP8 promoter is associated with susceptibility to multiple cancers［J］.Nat Genet，39（5）：605-613.
Syvanen A C.2001.Accessing genetic variation：genotyping single nucleotide polymorphisms ［J］.Nat Rev Genet，2：930-942.
Talbot W S，Trevarrow B，Halpern M E，et al.1995.A homeobox gene essential for zebrafish notochord development［J］.Nature，378：150-157.
Tao W J，Boulding E G.2003.Association between single nucleotide polymorphisms in candidate genes and growth rate in Arctic charr（Salvelinus alpinus L.）［J］.Heredity，91：60-69.
Weber J L，Wong C.1993.Mutation of human short tandem repeats［J］.Hum Mol Genet，2：1 123-1 128.
Xu Y X，Zhu Z Y，Lo L C，et al.2006.Characterization of two parvalbumin genes and their association with growth traits in Asian seabass（Lates calcarifer ）［J］.Anim Genet，37：266-268.
7 牙鲆EST-SSRs标记开发及应用
7.1 材料与方法
7.1.1 牙鲆EST-SSR标记的信息分析与建立
7.1.1.1 材料采集
试验用鱼来自于中国水产研究院北戴河中心试验站两性生殖家系，共计100尾。所采样本均为2cm左右的仔鱼，分装至液氮罐中，到达试验室后转移到-80℃冰箱中保存，以防止其降解。
7.1.1.2 总DNA提取
1.DNA提取液的成分
Tris·HCl（pH8.0）： 30mmol/L；
EDTA（pH8.0）： 200mmol/L；
NaCl： 50mmol/L；
SDS： 1%；
Proteinase K： 200 μg/mL
2.样本个体DNA的提取
（1）将保存于-80℃冰箱的仔鱼取出，去掉内脏，加入DNA提取液400μL，在45℃消化2～3h，每10min颠倒混匀1次；
（2）加入饱和苯酚、氯仿、异戊醇混合液（体积比25∶24∶1）400 μL抽提，5000r/min，离心10min，取上清液，再重复抽提2次；
（3）上清液中加入等体积的去离子水稀释；
（4）2.5倍稀释后体积的无水乙醇进行DNA的沉淀，该无水乙醇需-20℃静置过夜使用；
（5）12500r/min，离心15min，留沉淀去上清；
（6）加入70%乙醇100μL，10000r/min，离心6min，清洗沉淀，重复清洗1次；
（7）留沉淀去上清，室温下自然晾干，加入50 μL的TE缓冲液（pH8.0）室温溶解DNA；
（8）DNA溶液可在4℃保存过夜或在-20℃下永久保存。
7.1.1.3 引物序列与PCR反应
1.牙鲆EST来源
从NCBI数据库（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/dbEST）中搜索所有牙鲆的EST序列，搜索结果均以FASTA格式显示，并且以文本文件的格式保存，用于生物信息学分析。
2.EST的预处理
对检索到的EST序列采用VectorNTI ContigExpress软件进行重叠群分析和聚类以去除冗余序列，除去5′端或3′端的polyT或polyA，初始装配参数为最小重复碱基数（minmatch）为20，最小得分值（minscore） 为40，每一个聚类需经过检查以确保其准确度，从而避免由微卫星重复基元和长字符串引起的假聚类。
3.牙鲆EST中SSR的筛选
在线（http：//www.gramene. org/db/searches/ssrtool）对聚类后的EST进行微卫星序列搜索。选取重复次数在6次及以上的双碱基重复序列，5次及以上的三碱基重复序列，重复次数在4次以上的四碱基和五碱基重复序列，重复次数在3次以上的六碱基重复序列，均为完全重复，并对搜索出的 SSR 的频率与长度进行统计和分析。
4.微卫星引物设计合成
使用引物设计软件Primer Premier 5.0对获得的含有微卫星序列的ESTs进行引物设计，选取引物30对，由上海生工生物工程公司合成。在引物设计中，退火温度范围在45～65℃，PCR产物的预期大小在100～300 bp（表7-1）。
5.PCR扩增筛选及聚丙烯酰胺凝胶电泳
PCR扩增总体积为25 μL，10×buffer 2.5 μL，2 μL Mg2+（1.5mmol/L），1.5 μL dNTP（10mmol/L），0.5 U Taq 酶（2 U/μL），模板DNA 1 μL，引物各1μL，加ddH2O补足体系。扩增反应均在PE9700型PCR仪（PE公司）上完成。反应程序为94℃预变性5min；然后94℃变性30 S，50～54℃退火30 S，72℃延伸30 S，30个循环；最后72℃延伸10min。扩增产物利用8%非变性聚丙烯凝胶电泳进行分离，130 V电泳3h，电泳结束后经1%硝酸银染色10min，显色液（1%甲醛，2%氢氧化钠，0.04%无水碳酸钠）显色直到条带清晰。用H PScanjet 4850扫描仪扫描凝胶成像，凝胶分析软件（Gel-Pro Analyzer 4.5）对电泳谱带进行分析。
6.统计分析
微卫星是共显性遗传，可从琼脂糖凝胶电泳图谱上直接判断出个体的基因型，用PopGene（Version 3.2）软件统计各微卫星基因座的等位基因频率（allele frequency，P）、等位基因数（observed number of alleles，Na ）、有效等位基因数（effective number of alleles，Ne ）、观测杂合度（observed heterozygosity，Ho ）、期望杂合度（expected heterozygosity，He ）等遗传分化指标。
Hardy-Weinberg遗传偏离指数（d）及多态信息含量（polymorphism information content，PIC ）由下列公式计算：
鱼类分子育种原理与方法
式中，n——等位基因数；
P，P——等位基因频率。
Tab.7-1 Characterization of EST-SSRs in japanese flounder
表7-1 牙鲆EST-SSRs分子标记（续）-1
7.1.2 牙鲆两性生殖家系和雌核发育家系的遗传差异及生长性状分析
7.1.2.1 材料
试验用鱼取自中国水产科学研究院北戴河中心试验站，两性生殖家系（N系）个体与雌核发育家系（C系）个体均来自同一母本，选择有明显生长性状的1龄鱼，每个家系93尾，测量其体长（Body Length，BL）、体高（Body Height，BH）、体重（Body Weight，BW）等生长性状。同时剪取每尾鱼的尾鳍或胸鳍，分装后放入-80℃冰箱备用。
7.1.2.2 方法
1.DNA提取液成分
Tris-HCl（pH 8.0）： 1mol/L
EDTA（pH 8.0）： 500mmol/L
NaCl： 5mol/L
SDS： 10%
2.样本个体DNA提取
采用盐析法提取牙鲆鳍条DNA。
（1）将鳍条从-80℃冰箱中取出，剪取约0.2g，用剪刀剪碎，加入DNA提取液400 μL，再加入蛋白酶K（20mg/mL）6 μL，充分混匀，50℃消化2～3h，每30min颠倒混匀1次；
（2）将裂解完全的混合液取出，每管逐滴加入265 μL的NaCl，8000 r/min，离心10min，取上清液转入新的做好标记的Ep管中；
（3）加入与上清液相同体积的氯仿抽提，10000r/min，离心10min，吸上清转入新的管中；
（4）再加入与上清液等体积的异丙醇（-20℃预冷）；颠倒混匀，12000r/min，离心20min，弃上清；
（5）加入1mL 75%乙醇清洗沉淀，8000r/min，离心5min，弃上清，室温下自然晾干，至无异丙醇味。
（6）加入30～100μL的TE缓冲液室温溶解DNA；
（7）DNA溶液可在4℃保存过夜或在-20℃下永久保存。用紫外分光光度计和琼脂糖凝胶电泳对所提取DNA的含量和质量进行检测。
3.EST-SSR引物
从7.1.1.4中合成的30对牙鲆EST-SSRs引物中选取9对稳定扩增的标记，用于两性生殖家系与雌核发育家系的遗传结构分析（表7-2）。
Tab.7-2 9 Pairs of microsatellite maker sequence
4.PCR扩增及聚丙烯酰胺凝胶电泳
同7.1.1.3。
5.数据统计与分析
（1）等位基因频率、杂合度及多态信息含量。同7.1.1.3。
（2）微卫星标记与生长性状的相关分析。根据本研究试验群体的特点，采用线性模型：Y=μ+p+e
其中Y为第i类基因型中第j个个体的生长性状表型值，μ为生长性状群体均值，p为第i种微卫星座位基因型的固定效应，e为随机残差。根据不同微卫星座位基因型分析结果和各性状测定结果，采用JMP8.0软件对牙鲆表型性状与不同微卫星座位的相关性进行最小二乘方差分析，进而判断有差异的等位基因片段与牙鲆生长性状是否具有相关性。
6.等位基因片段的克隆与测序
将于生长性状相关EST-SSR进行回收、纯化与测序。测序结果，通过NCBI数据库BLAST搜索引擎比对，以验证所克隆的片段是否为相应EST-SSR位点序列，再应用Blastx在非冗余蛋白库中进行EST序列搜索与相似性比对，并对这些EST序列的功能进行诠释。
7.2 结果与分析
7.2.1 牙鲆EST-SSR标记的信息分析与建立
7.2.1.1 牙鲆EST-SSR的分布频率
本研究共搜索到8842条牙鲆ESTs序列（截至2008年5月13日），这些序列来自其肾、肝脏、脾脏、肌肉、心脏、脑、肠、胃、卵巢、皮肤等多个组织的cDNA克隆。经聚类和拼接后，共得到5927条无冗余EST序列，总长度为3.72×106 bp，平均长度为627 bp。在线进行SSR的搜索结果表明，这些无冗余的EST序列共发现分布于390条EST中的471个SSR，平均7.9kb出现1个SSR，出现频率为7.95%。在390条含有SSR的EST中，只含有1个SSR的EST有313条，含有2个SSR的有62条，含有3个SSR的有13条，含有4个SSR的有2条。SSR重复基元类型丰富，包括二碱基序列、三碱基序列、四碱基序列、五碱基序列和六碱基序列。重复基元含量最多的为二核苷酸重复，共有278个，所占比例达到全部SSR的59.02%，在全部 EST 中的出现频率为4.69%；其次为三核苷酸重复，占全部SSR比例的26.33%，出现频率为2.09%（表7-3）。四核苷酸重复、五核苷酸重复和六核苷酸重复类型很少，合计占所有类型的14.65%，其中五核苷酸序列重复类型最少，仅占0.21%。由此可见，在牙鲆EST-SSR中，二核苷酸重复占主导地位。
Tab.7-3 Occurrence frequency of SSRs in a set of Japanese flounder ESTs
7.2.1.2 牙鲆EST-SSR的特点
所筛选出的EST-SSRs共包括112种重复基元，其中二核苷酸重复基元10种，三核苷酸重复基元38种，四核苷酸重复基元34种，五核苷酸重复基元1种，六核苷酸重复基元29种（表7-4）。
Tab.7-4 Repeat motif of EST-SSRs in Japanese flounder
二核苷酸重复基元以AC最多，占二核苷酸重复基元类型的16.91%，其次是TG、CA、GT、TA、GA，分别占二核苷酸重复基元类型14.03%、13.67%、12.59%、9.71%和8.63%。三核苷酸重复基元、四核苷酸重复基元和六核苷酸重复基元种类较多，但核苷酸重复基元类型分布相对分散，出现频率较低，所占比例也不高，其中三核苷酸重复基元GAG、CAG和CTG分别占所有三核苷酸重复基元类型的7.26%、6.45%和6.45%（表7-5）。五核苷酸重复基元种类最少，仅出现（TTTAT）n一种重复。
Tab.7-5 Frequency of main repeat motif in Dinucleotide and Trinucleotide
7.2.1.3 牙鲆EST-SSR的理论多态性与可用性分析
牙鲆的基序长度主要集中在12～24 bp。18 bp的基序长度最多，有78个，包括9次重复的二核苷酸基元、6次重复的三核苷酸基元和3次重复的六核苷酸基元。其次是15 bp，数量为65个，系五次重复的三核苷酸基元。基序最长的为132 bp，为二核苷酸基元的66次重复。基序长度在12～20 bp的SSR占全部SSR的72.4%，20～30 bp的占17.41%，大于30 bp的占10.19%。
7.2.1.4 DNA提取结果
提取的牙鲆DNA经紫外分光光度计测定，A260/A280比值均为1.6～1.8之间，琼脂糖凝胶电泳后可清晰见到基因组DNA条带（图7-1），说明本试验的DNA可用于下一步的试验。
Fig.7-1 1% agarose gel electrophoresis analysisof total DNA in Japanese flounder
7.2.1.5 引物筛选
在465个含有微卫星的ESTs中随机选择出29个设计了30对牙鲆EST-SSRs引物，PCR扩增后，结果发现27个标记对所有个体都有扩增产物，引物的有效扩增率为90%。
7.2.1.6 EST-SSR的多态性分析结果
利用牙鲆随机群体对以上筛选出的27对EST-SSRs引物进行多态性检测，经过8%浓度的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，结果表明：有17对在牙鲆个体间显示出多态性，占设计引物总数的56.67%，多态性比例为62.96%，呈现出较高的多态性（图7-2）。
Fig.7-2 Electrophoresis pattern of PCR product of partial individuals in the population of amplified with several EST-SSRs
17个多态性位点的检测到等位基因数为2～6，平均为3.5，片段大小109～328bp，观测杂合度为0.28～0.92，期望杂合度为0.3155～0.8003，PIC在0.2646～0.7658之间，其中PIC >0.5的座位12个，平均值为0.5509（表7-6）。等位基因和基因型的分布频率在Hardy-Weinberg 平衡下与期望值比较，经邦弗朗尼校正（P＜0.05）后17个位点上有2个座位（JF19和JF31）显示显著偏离Hardy-Weinberg 平衡，同时还有15个EST-SSRs标记符合Hardy-Weinberg 平衡（表7-6）。
Tab.7-6 Statistic result of 17 polymorphic EST-SSR loci in japanese flounder
7.2.2 牙鲆两性生殖群体和雌核发育群体的遗传差异及生长性状分析
7.2.2.1 电泳结果
9对EST-SSRs引物对基因组DNA进行PCR扩增和聚丙烯凝胶电泳检测（图7-3），其中7对EST-SSRs引物（JF17、JF19、JF23、JF24、JF28、JF32和JF33）在两性生殖家系个体中扩增片段均具有多态性，JF31和JF41座位扩增出的片段均为单带带型。在雌核发育家系个体中除了JF23扩增片段具有多态性外，其余位点的扩增结果均为单带带型。说明雌核发育个体的遗传多样性水平比两性生殖个体的大大降低。
Fig.7-3 Electrophoresis pattern of PCR product of partial individuals in the N strain and C strain
7.2.2.2 性状分布
所有生长性状都呈现出连续变异的特点，说明这些性状都是典型的数量性状或者多基因遗传。使用SPSS13.0软件通过Shapiro-Willk检验生长性状的频率分布是否显著偏离正态分布，结果见表7-7。
Tab.7-7 Test of Gaussian distribution in growth traits
7.2.2.3 两个牙鲆家系的遗传结构分析
9个EST-SSRs标记在两个牙鲆家系中共检测到23个等位基因，片段大小为109～320 bp。两性生殖家系（N系）中，平均有效等位基因数2.6483。其中，JF17、JF32和JF33座位的等位基因数目最多，共4个；JF24座位等位基因数目为3个；JF19、JF23和JF28位点的等位基因数目为2个，JF31和JF41均为单带型，即等位基因数为1。9个EST-SSRs标记平均杂合度为0.4609，平均多态信息含量为0.3922（表7-8）。在雌核发育家系（C系）中，仅有JF23出现多态，其等位基因数目为2个，杂合度为0.4872，多态信息含量为0.3685（表7-8），无多态性的标记信息未在表中列出，9个座位在雌核发育家系的平均杂合度为0.0847，平均多态信息含量为0.0526。由此可见，两性生殖家系属中度多态，而雌核发育家系多态性低，遗传均一性强。
Tab.7-8 Statistic information of 9microsatellite loci in the population
7.2.2.4 EST-SSR标记与生长性状的相关分析
利用最小二乘法对SSR标记与牙鲆生长性状进行连锁显著性检验，结果见表7-9。JF24位点的等位基因与体长显著相关。在9个微卫星标记中，有4个标记分别与体重、体长、体高显著相关。其中，JF19位点与JF28位点的基因型与体长、体重显著相关（P<0.05），JF23位点的基因型与体重、体长和体高均显著相关（P<0.05），JF24位点的基因型与体长显著相关（P<0.05）。对差异显著的标记，利用Duncan法进行不同等位基因与不同基因型间不同性状的多重比较，结果见表7-10与表7-11。
Tab.7-9 F-test of deviation between alleles，genotypes and growth traits in japanese flounder
Tab.7-10 Means and multiply comparisons of body weight，bodylength，body height among alleles in JF24 locus
Tab.7-11 Means and multiply comparisons of body weight，bodylength，body height among genotypes in 4 EST-SSR loci
表7-11 4个EST-SSR座位不同基因型体重、体长、体高的平均值和多重比较（续）-1
在标记 JF19上基因型为BB个体的体重、体长及体高值均高于其他基因型。在体重、体长方面 BB 个体均值显著高于 AB 个体，但与AA个体差异不显著；而在体高上AA、AB、BB 3 种基因型无显著差异。
在标记JF23中，基因型为BB个体的体重、体长、体高值均高于其他基因型个体。在体重方面，BB个体体重显著高于AA和AB个体，AA基因型个体与AB基因型个体间的差异不显著。在体长和体高方面，基因型AA和基因型BB个体均值显著高于AB个体，但AA个体与BB个体差异不显著。
由表7-10可知JF24位点对体长的优势等位基因为C，所对应的体长均值为28.9884cm。由表7-11可知，JF24座位中，AB与BC型个体所对应的体重、体长、体高值均高于BB型个体。在体重和体高上AB、BB、BC这3种基因型间均无显著差异；在体长上，BC型个体的均值显著高于BB与AB型个体。从以上两方面可推断等位基因C与体长正相关。
标记JF28中，AA型与BB型个体的体重与体长值均高于AB型个体，但AA型与BB型之间、BB型与AB型之间差异不显著，AA型与AB型个体间存在显著差异；体高方面，各种基因型之间均无显著差异。这说明AA基因型与体重和体长正相关。
7.2.2.5 几个生长性状相关的EST-SSR克隆测序与基因功能的连锁分析
将上述与体重、体长和体高连锁的4个EST-SSR标记克隆测序，序列通过NCBI上Blast 确认PCR产物在EST序列上。利用Blastx搜索引擎在非冗余蛋白库中进行搜索分析，发现有3条序列（JF23、JF24和JF28）与蛋白数据库现有的序列有明显的相似性（E-20），其中JF23与青鳉（Oryzias latipes ）胞质苹果酸脱氢酶同源水平高达97%；JF24与斑马鱼（Danio rerio ）PDZ-LIM结构域蛋白7同源（比值为94%）；JF28与真鲷（Pagrus major ）高迁移率族蛋白同源水平为89%（表7-12）。JF19所在序列表现的同源水平略低，与斑马鱼泛素样蛋白同源性为60%。
Tab.7-12 Results of blast in databases of protein
7.3 讨论
7.3.1 牙鲆EST-SSR标记的信息分析与建立
7.3.1.1 牙鲆 EST-SSR标记信息分析
在本研究分析了牙鲆EST序列中SSR的分布频率和重复基元的特点，发现NCBI 数据库中大约有7.95%的牙鲆EST能够检索出SSR，这一比例低于斑节对虾 （Penaeus monodon ）（Maneeruttanarungroj et al.，2006）（13.7%），红旗东方鲀（Fugu rubripes ）（Edwards et al.，1998）（11.5%）和斑点叉尾（Serapion et al.，2004）（11.2%），但又高于栉孔扇贝（Chlamys farreri ）（1.61%）（Zhan et al.，2008）、中国对虾（Wang et al.，2005）（2.2%）、长牡蛎（Crassostrea gigas ）（Yu and Li，2008）（3.63%）海湾扇贝（Zhan et al.，2005）（3.9%）、真鲷（Chrysophrys major ）（Chen et al.，2005）（4%）和鲤鱼（Wang et al.，2007）（5.55%）。这些差异可能由EST-SSR在水产动物中高度的物种特异性引起，也可能是由于用来搜寻SSR的软件不同，所设定的参数不同而造成的。
cDNA文库的随机序列使得EST中的冗余序列比例较高，为了降低分析数据的长度，应消除冗余序列。本研究中，EST-SSR的平均密度在去除冗余序列之前是11.54 kb，而去除之后，平均每7.9 kb出现1个SSR。因此，在非冗余EST序列中，SSRs的分布频率能更准确地反映其在转录基因组中的密度。
本研究发现牙鲆EST-SSR重复基元以二核苷酸为最多，占所有SSR的59.02 %，其次是三核苷酸重复，占所有SSR的26.33%，这与中国对虾（徐鹏等，2003）的研究结果相一致，而大多数植物的EST-SSR都以三核苷酸重复为主（Varshney et al.，2005；李永强等，2004）。牙鲆二核苷酸重复中AC为优势基元，这与鲤鱼（Wang et al.，2007）和斑点叉尾（Serapion et al.，2004）的研究结果相一致。而在栉孔扇贝中二核苷酸重复中出现频率最高的为GC（Zhan et al.，208），斑节对虾中出现频率最高的二核苷酸重复基元为AT（Maneeruttanarungroj et al.，2006），长牡蛎（Yu and Li，2008）和美国黄金鲈（Zhan et al.，2009）中以AG/CT重复基元的数量最多。在本研究的二核苷酸重复中各种类型的均具有，而长牡蛎中未检测出CG重复（Yu and Li，2008）。这种不同物种EST-SSR主导类型的差异可能是由于各报道中所用EST来源和EST数目不同所致。牙鲆的三核苷酸重复基元、四核苷酸重复基元和六核苷酸基元种类繁多，分别为38种、34种和29种，但是基元分布相对分散。其中，三核苷酸重复基元略有优势的为GAG、CAG和CTG，所占比例仅为三核苷酸重复基元类型的7.26%、6.45%和6.45%，这说明碱基偏倚性不太明显。
Temnykh等（2001）的研究指出，当SSR基序长度大于或等于20 bp时多态性较高，长度在12～20 bp之间的多态性中等，而长度在12 bp以下时多态性极低。依照此标准可推测本研究中72.4%的牙鲆EST-SSR具有中等多态性，17.41%的EST-SSR具有较高多态性。本研究所得的主要基元是二、三核苷酸重复基元，均属于低级基元，表明牙鲆的EST-SSR大部分具有高多态性潜能，并具有较高的可用性。
7.3.1.2 牙鲆EST-SSR标记的多态性分析
由于进化的保守性，基因编码序列的突变率是低于非编码的基因序列。另外，自从发现5个二核苷酸重复有多态，而6个或7个重复却没有多态时，就说明多态性不是完全依赖于重复长度的（Nonneman and Waldbieser，2005）。因此，在一些物种中与基因组微卫星比较时，其EST-SSRs的多态性水平一般是略低的（Cho et al.，2000；Pérez et al.，2005）。小麦中46个 EST-SSRs的等位基因数为2～31，明显低于31个基因组SSRs的3～34（杨新泉等，2005）。本研究EST-SSRs的多态性与来源于基因组的SSR多态性相比也较低，特别是当EST-SSRs位于外显子或者开放阅读框而不是在非翻译区（UTR）时，这种特点尤为明显（Kantety et al.，2002）。本研究所设计的引物不仅选用了二核苷酸重复和三核苷酸重复序列，还选用了四核苷酸重复、五核苷酸重复和六核苷酸重复序列，Gupta（2003）指出二核苷酸重复和三核苷酸重复比其他类型的多态性高，因而本研究获得的37对EST-SSRs中只有19多对具有多态性。
然而，最近的一些研究报导了高度多态的EST-SSRs（Eujayl et al.，2004；Saha et al.，2005），这些EST-SSRs的多态性与基因组SSR一致或高于基因组SSR（Liewlaksaneeyanawin et al.，2004）。 Yu等（2008）从长牡蛎ESTs序列中获得26个SSRs，等位基因数为3～18，平均等位基因7.55，而79个基因组SSR的等位基因数为2～10，平均等位基因数为5.7。Yue 等（2004）从鲤鱼基因及ESTs序列获得的28个微卫星也比从基因组文库中得到的8个微卫星具有较高的多态性。其它物种例如海湾扇贝72%的EST-SSRs表现出多态性（Zhan et al.，2005）。
本研究从27个有扩增产物的标记中筛选出17个具有多态性的标记，等位基因数只有2～6，平均为3.5，多态性比例为56.67%，其中高度多态标记12个（PIC >0.5），中度多态标记5个 （0.25<PIC <0.5），平均 PIC 值为0.5509。因此，多态性比例高的EST-SSRs可用于牙鲆群体的遗传多样性研究。
7.3.1.3 无效EST-SSR位点分析
有些种类会由于DNA序列高度变异，而出现无效等位基因（Huvet et al.，2003；McGoldrick et al.，2000；Launey et al.，2002；Li et al.，2003；Hedgecock et al.，2004；Reece et al.，2004）。大多数情况下，可以准确地推导出无效等位基因，并不影响种群分离和图谱分析（McGoldrick et al.，2000）。而在某些情况下，还可以利用无效等位基因从杂合子中分离纯合子（Wang and Guo，2007）。无效等位基因使群体结构的遗传分析复杂化，因此，无效等位基因对于群体遗传研究是不利的。无效等位基因也会引起群体中杂合子缺乏。尽管无效等位基因可以通过改善引物设计而减少，但无效等位基因的高频率将会限制一些位点。
本研究中的引物虽以严格的标准设计合成，但仍有3个位点（JF22，JF27，JF29）的引物未能在牙鲆中得到扩增。Wang等（2007）筛选鲤的EST-SSR标记中也有位点未扩增出，数量为6个。原因主要可能有（Varshney et al.，2005）：①引物的序列落在两个外显子上；②两引物间有一长的内含子，扩增不出产物；③测序导致的EST 序列错误；④扩增区段存在比较复杂的高级结构。这些无效的EST-SSRs也会导致当前研究的EST-SSRs多态性水平低于估计值。
7.3.1.4 牙鲆EST-SSR的应用前景
快速增长的ESTs数据为 SSR标记的开发提供 了一个有价值的来源，截至2010年4月6日，Gene Bank数据库中牙鲆的ESTs数量已达11078个，从中发掘的SSRs只是ESTs测序计划的副产品，节省了大量人力和物力，其本身是功能基因的一部分序列，将为功能基因提供标记。对于EST-SSRs多态性相对较低的缺点，可以通过筛选 EST-SSRs，优化PCR反应程序等方面进行探索，例如选用具有较高重复数的EST-SSRs（n≥10的双碱基重复序列和n≥5的三碱基或四碱基重复序列）。
从本研究结果可以看出，牙鲆EST-SSR的出现频率较高，且类型丰富。从多态性潜能角度考虑，搜索到的这些EST-SSR也具有较高的可用性。总的来说，本研究结果证明以前的发现，即采用水产动物的最新EST序列开发Ⅰ型微卫星标记是一种相对容易和有效的方法。这些新的EST-SSRs 标记为将来的牙鲆亲缘关系鉴定、群体遗传学和比较基因组学的研究提供了充分的多态性水平，是牙鲆现有微卫星标记量的有效补充，而在一些缺少微卫星标记的种类，EST-SSR标记的开发和利用势必推动此种类遗传背景的研究。
7.3.2 牙鲆两性生殖群体和雌核发育群体的遗传差异及生长性状分析
7.3.2.1 EST-SSR座位的特异性分析
本研究中，有7个座位在两性生殖家系个体中有多态，其中，JF17、JF24、JF32与JF33座位的多态性较高。JF19、JF23与JF28座位均只扩增出两个等位基因，说明两性生殖家系个体在这3个位点的变异较小，且有的个体在该位点已达纯合。而这7个座位在雌核发育家系个体中只有JF23扩增出两条带，其余6个座位均只扩增出一条带，说明除JF23位点外，其余位点在雌核发育家系个体中的变异程度低于两性生殖家系，这些标记对于区分两性生殖家系与雌核发育家系具有重要的指导作用。是否可作为家系间的特异性标记还有待进一步验证。
7.3.2.2 两个牙鲆家系的遗传结构分析
Crawford等（1998）指出，要保存尽量多的遗传多样性，必须有可靠的方法对品种间的遗传分化进行测定。本研究在9个EST-SSR标记位点检测到23个等位基因，两性生殖家系中有效等位基因数在1.0000～3.528，等位基因的频率大小在0.1022～1.000。雌核发育家系中有效等位基因数在1.000～1.9501，等位基因频率为0.42～1.000。李俊清（1994）认为等位基因频率由于随机遗传漂变会发生变化，尤其是频率较低的等位基因，更容易丢失。为了维持较高的生物多样性，必须保护低频率等位基因，一个等位基因一旦固定，便发生不可逆转的纯合性，变化停止，生存力下降。因此，这些低频率等位基因在多样性保护方面更具重要意义。
多态信息含量（PIC）是等位基因频率和数目变化的函数，反映出基因变异程度的高低，是衡量位点多样性的另外一种较好的指标。根据Bostein等（1980）提出的衡量基因变异程度高低的多态信息含量指标，本研究两性生殖家系基因座多态信息含量0.3508～0.6649，平均值为0.3392。雌核发育家系基因座多态信息含量为0.000～0.3685，平均值为0.0527。基因杂合度又称基因多样度，表示群体在某座位为杂合子的比例，普遍认为它是度量群体遗传变异的一个最适参数（梁利群等，2004）。在本研究的牙鲆两性生殖家系中，杂合度0.4537～0.7166，平均值为0.4609。在雌核发育家系中的杂合度为0.000～0.5926，平均杂合度为0.0847。由以上结果可知雌核发育家系的等位基因数目和遗传多样性明显低于两性生殖家系。王晓梅等（2009）利用微卫星标记对牙鲆雌核发育和来自同一母本两性生殖家系的遗传结构进行分析时，指出2个雌核发育家系和2个两性生殖家系的平均等位基因数分别为1.5714、1.4286、2.4286、3.0000，平均观测杂合度为0.3571、0.3825、0.5207、0.7465，平均期望杂合度为0.2210、0.2158、0.4180、0.5608，平均多态信息含量为0.1604、0.1595、0.3617、0.5603。与之相比，本研究结果中雌核发育家系的遗传多样性相对较低。由此可见，雌核发育家系遗传均一性强，适合作为目的基因筛选和QTL定位等遗传研究的材料。
另外，本研究结果与以上研究结果相比也可以看出，两性生殖家系的平均杂合度和平均多态信息含量也比其中一个两性生殖家系的低，这说明基因座位的多态性呈现下滑趋势。分析其原因一方面可能是因为试验站的牙鲆亲本是较早培育的群体，来源单一，数量过少，筛选的强度不够高，也很可能是系统选育对遗传特性产生了影响；另一方面可能是多态性检测方法不同，物种本身的差别，以及引入基础群体数量上的差异都会对该养殖物种遗传多样性是否下降的判定产生影响。
7.3.2.3 微卫星标记与生长性状的相关分析
许多生物自然种群的基因杂合度与生长速度呈显著的正相关（Gosling and Nolan，1987），但这种相关性在水产动物中并非是普遍性的规律（Singh and Zouros，1978）。国内关于生长性能与基因杂合度的关系，在畜禽上研究得比较多（姜勋平等，2003；刘桂琼等，2003；刘国庆等，2006），在水产动物上的报道较少，目前仅见到两例（何毛贤等，2002；王昭萍等，1998）。从本研究的结果来看，在某个位点上基因纯合的性状反而高于基因杂合的性状，在这一群体中杂种优势不明显。由于数量性状是多基因控制，每个位点可能存在着多种效应不同的等位基因，不同等位基因之间互作的情况和程度可能不同，本研究所用的有效微卫星座位过少，分析基因杂合度与生长速度的关系可能还远远不够，还有待通过采用更多标记观察更多的群体来进一步验证。
本试验利用9个微卫星标记分析牙鲆两性生殖群体，将得到基因型与表型性状进行最小二乘法分析，共得到4个标记（JF19、JF23、JF24和JF28）分别与牙鲆体重、体长和体高显著相关（P<0.05）。其中，JF23与体重、体长和体高均相关，JF19和JF28位点均与体重、体长相关，JF24位点的基因型与体高显著相关。一个标记同几个性状相关，或几个标记同一个性状相关的情况，说明这些位点存在一因多效或多因一效现象，并且，也说明这些性状可能由多个QTL控制。顾颖等（2009）筛选与鲤生长性状相关的标记中也得到了相似的结论。
鱼类大多数的经济性状属于数量性状。数量性状是那些必须借助数和量才能准确描述和表达的性状（Mitton and Grant，1984）。数量性状受多基因控制，易受环境影响，且遗传基础复杂，表现为连续变异，表现型与基因型之间没有明确的对应关系。长期以来只能借助于数理统计的手段，将控制数量性状的多基因系统作为一个整体来研究。方宣钧等（2001）曾指出用平均值和方差来反映数量性状的遗传操作特征，无法了解单个基因的位置和效应。这种状况制约了人们在育种中对数量性状的遗传操纵能力。目前，研究者们不断采用分子标记的方法对不同鱼类的生长性状进行研究，如张义凤等（2008）与叶小军（2008）分别利用微卫星标记对鲤鱼和大黄鱼的生长性状进行了研究，找到了对生长性状有利的等位基因及基因型。与EST-SSR标记相比，基因组SSR进行BLAST比对时很难找到理想的蛋白，无法做出基因预测。刘永新（2009）指出与牙鲆生长性状相关的标记中只有poli9-8TUF序列与牙鲆胶原蛋白β链前体序列相匹配，但同源性仅为78%。
本研究所用材料是同池混养的，可以最大限度地降低环境、性别等因素对试验结果的影响。造成表型差异的主要原因可能是个体的遗传基础不同，另外，卵子大小不同、成熟度不同、孵化时间不同，摄食竞争，染病等也都会造成个体差异。
有关牙鲆生长性状QTL的研究在国内外尚未见到报道，在国内水产动物育种领域相关的研究也仅限于鲤鱼（Cyprinus carpio ）上的报道。由于没有与牙鲆生长相关的QTL的结果比较，本试验所得遗传标记结果需进一步分析和验证。
7.3.2.4 序列比对分析
1.JF23与胞质苹果酸脱氢酶同源性分析
将与牙鲆重要生长性状相关的4个功能基因进行BLAST比对，得到3个EST序列（JF23、JF24和JF28）与GenBank中编码已知功能的蛋白质基因相似。JF23与青鳉（Oryzias latipes ）胞质苹果酸脱氢酶同源水平高达97%，因此推测基因JF23是编码牙鲆胞质苹果酸脱氢酶的。苹果酸脱氢酶（MDH）是NAD依赖型脱氢酶家族的一员（Chapmanl et al.，1999），催化草酰乙酸盐和苹果酸盐的相互转化反应，与二核苷酸辅酶的氧化还原相关。依生物体的功能不同、组织差异、细胞内定位的不同其表达种类不同，MDH具有多种同工酶形式 （王晓云等，2006）。
胞质苹果酸脱氢酶（cMDH）存在于细胞胞质内，担负着将NADH转入线粒体的重任，并且还对调控三羧酸循环有作用（Lo et al.，2005），同时cMDH还是核酸通路（NACh）复合体的一个组成部分（Hanss et al.，2002）。但目前对cMDH的研究相对较少，且主要的研究集中在植物上（姜瑞华等，2004；Lin et al.，2004）。Heber（1974）指出细胞质苹果酸脱氢酶在细胞质中运输反应底物和间接提供还原动力，从而为植物的生长和发育提供能量和物质。硬骨鱼类通常会表达两种平行基因形式的胞质苹果酸脱氢酶（cMDH-S和cMDH-L），这与鸟类和哺乳动物类这些四足动物只表达一种是不同的，而cMDH-L与线粒体苹果酸脱氢酶（mMDH）很相似（Lin et al.，2002）。草鱼cMDH具有典型的苹果酸脱氢酶功能区保守序列（朱文漓等，2008）。从NCBI的GenBank数据库中我们搜索发现硬骨鱼类模式生物斑马鱼的cMDH基因存在于其多个染色体中，且有文献报道其属于多拷贝基因家族（Merrit et al.，2003；Woods et al.，2005；Song et al.，2004）。Yoon 等（2006）指出cMDH对雌鼠的卵母细胞成熟与胚胎发育有影响。卢建平等（2000）的研究表明MDH在胚胎发育时期表达较为稳定，这可能因为它是满足细胞基本功能代谢所需的酶。由此可推测cMDH可能与生长性状相关，目前还没有相应的研究报道。
2.JF24与PDZ-LIM结构域蛋白7同源性分析
JF24与斑马鱼（Danio rerio ）PDZ-LIM结构域蛋白7同源（比值为94%），因此推测JF24为牙鲆PDZ-LIM结构域蛋白7。PDZ和LIM功能域都是蛋白间相互作用的motif，能够介导蛋白与细胞骨架以及与信号传导有关的蛋白的相互作用（Tsunoda et al.，1997；Roof et al.，1997；Hagmann et al.，1998）。PDZ-LIM蛋白包括六个家族，即Enigma/LMP-1，ENH，ZASP/Cypher，RIL，ALP和CLP-36。Enigma protein能够和RET（receptor tyrosine kinase）较短的一个异构体相互作用，其突变和MEN2综合征有关（Borerllo et al.，2002）。Passier等（2000）结合抑制性消减杂交技术（SSH）和Northem杂交、小鼠胚胎原位杂交等研究发现，Oracle（两种新的PDZ-LIM区域蛋白选择剪接变体，都包含了氨基酸氨基末端的PDZ区域和羧基端的3个LIM区域）对心脏的早期发育和功能有意义。该家族成员LMP-4在鸡四肢和心脏的发育过程中，能和Tbx5及Tbx4转录因子相互作用（Krause et al.，2004）。Cypher是一个间板蛋白，它可作为一种丝柱起作用，在肌肉收缩过程中保持细胞骨架结构，小鼠敲除试验表明其缺失可引起先天性肌病（Zhou et al.，2001）。而ZASP最初是在与α辅肌动蛋白的结合中被发现的，它仅在肝脏和骨骼肌中特异表达（Faulkner）。肌动蛋白关联LIM蛋白（ALP）在肌细胞和α肌动蛋白相连的肌小节中起作用（Xia et al.，1997）。该家族的新成员Pdlim2能与α肌动蛋白和丝蛋白A相互作用（Torrado et al.，2004）。反转诱导LIM蛋白（RIL）主要在非肌肉上皮细胞中表达，定位在肌动蛋白张力丝上，是作为肌张力丝翻转的调控子，能够增强α肌动蛋白和丝状肌动蛋白的连结（Va1lenius et al.，2002）。C末端LIM蛋白（CLP-36）主要在非肌肉细胞中表达，定位在肌动蛋白张力丝上，也和α肌动蛋白联结在一起，其PDZ功能域与细胞骨架相互作用，而通过LIM功能域将激酶招募至肌动蛋白张力丝上（Va1lenius et al.，2002）。Elisabeth等（2008）指出敲除胚胎期斑马鱼的LIM结构域蛋白7会影响其心脏的发育。目前PDZ-LIM结构域蛋白7对生长性状的影响还没有相关的研究报道。
3.JF28与高迁移率族蛋白同源性分析
JF28与真鲷（Pagrus major ）高迁移率族蛋白同源水平为89%，因此推测JF28为牙鲆的高迁移率族蛋白。高迁移率族蛋白（high mobility group，HMG）因在聚丙烯酰胺凝胶电泳中有很高的迁移率而得名（Goodwin et al.，1973）。广义的HMG包括了两类蛋白：HMG-基序蛋白和经典的HMG蛋白。前者蛋白序列中含有一个或数个HMG的DNA结合结构域，如SRY（sex determining region protein）（Baxevanis et al.，1995）。经典的HMG蛋白分为3类：HMGB（原HMG-1/-2），HMGA和HMGN（徐佳等，2005）。最近，数据库（www.ncbi.nlm.nih.gov）将HMGB按最初的HMG 1和HMG 2分类。HMG蛋白家族广泛参与多种重要的核内生物学功能的完成，包括调节DNA复制、转录、重组和修复等，其中最为重要的是对基因表达转录的调控。通过与染色质或DNA发生结合使HMG蛋白变形或弯折，或影响其与表达有关的结构，或促进其他调节蛋白的结合，影响大分子复合物的形成，从而调节转录的起始过程（Bustin et al.，1999）。目前HMG 1基因的相关研究，主要集中在二倍体脊椎动物基因组内HMG 1的克隆和表达方面，如鳖（郑济芳等，2006）和人（别良峰等，2003）等。刘东等（2009）对不同倍性鲫鲂高迁移率蛋白蛋白1进行了克隆，指出在不同倍性鱼中扩增出HMG 1，说明HMG 1基因在鱼类的转录调控不受倍性效应调节。事实上，HMG 1基因编码蛋白参与了生物体内诸如调节基因转录、核小体重建和细胞凋亡等生物发育的基本过程，这类功能性基因真实地从亲本遗传给子代，对杂交种的存活是必要的。越来越多的文献报道，HMG与众多疾病的发生发展密切相关。研究表明HMGB 1是重要的炎症因子，广泛参与各种急慢性炎症过程并在疾病的转归中起关键作用（Erlandsson et al.，2004）。HMGB还与众多的癌症发生有关，参与癌症的转移和扩散（Meyer et al.，2004）。同时HMG蛋白作为药物治疗的靶点也正在研究之中，并取得了一定进展（Reeves et al.，2003）。目前HMG对于生长性状的影响还没有相关的研究报道。
鱼类的生长和发育受多种因素的影响，如环境（水温、溶解氧、营养等因素）、激素和分子调控等。本研究利用已知功能的EST-SSR标记，找到了与牙鲆重要生长性状相关的功能基因。从而可以利用分子生物学手段对有利用价值的基因进行分离，以实现目标性状的遗传改良。
7.4 结论
通过本研究可以得出以下结论：
1.牙鲆EST中SSR的出现频率较高，重复基元类型丰富。5927条牙鲆非冗余 EST 序列检索出471个SSR，分布于390条EST中，出现频率为7.95%，平均分布距离为7.9 kb。牙鲆EST-SSR以二核苷酸重复为主，优势重复基元为AC重复。
2.17对EST-SSRs在牙鲆个体间显示出多态性，占设计引物总数的56.67%，多态性比例为62.96%，呈现出较高的多态性。
3.EST-SSR标记分析牙鲆两性生殖家系和雌核发育家系的遗传差异显示两性生殖家系属中度多态，雌核发育家系多态性低，遗传均一性强。
4.筛选出4个与生长性状显著相关的EST-SSR标记（P<0.05）。JF24位点的等位基因与体长显著相关。JF19位点与JF28位点的基因型与体长、体重显著相关（P<0.05），JF23位点的基因型与体重、体长和体高均显著相关（P<0.05），JF24位点的基因型与体长显著相关（P<0.05）。经序列比对，JF23与青鳉（Oryzias latipes ）胞质苹果酸脱氢酶同源水平高达97%，JF24与斑马鱼（Danio rerio ）PDZ-LIM结构域蛋白7同源（比值为94%），JF28与真鲷（Pagrus major ）高迁移率族蛋白同源水平为89%。
参考文献
别良峰，于文彬，程晓东，等.2003.人高迁移率族蛋白Ⅰ基因的克隆和表达［J］.第四军医大学学报，24（3）：232-234.
方宣钧，吴为人，唐纪良.2001.作物DNA标记辅助育种［M］.北京：科学出版社，35-40.
顾颖，曹顶臣，张研，等.2009.鲤与生长性状相关的EST-SSRs标记筛选［J］.中国水产科学，16（1）：15-22.
何毛贤，沈琪，林岳光，等.2002.合浦珠母贝二倍体、三倍体和非整倍体群体的基因杂合度与生长比较［J］.热带海洋学报，21：55-62.
姜瑞华，林长发，申国安，等.2004.水稻苹果酸脱氢酶基因的克隆及其在E.coli中的表达［J］.复旦学报（自然科学版），41（1）：67-69.
姜勋平，熊远著，刘桂琼，等.2003.猪个体基因杂合度对生长性状的影响［J］.遗传学报，30：431-436.
李俊清.1994.植物遗传多样性保护及其分子生物学研究方法［J］.生态学杂志，13（6）：27-30.
李永强，李宏伟，高丽锋，等.2004.基于表达序列标签的微卫星标记（EST-SSRs）研究进展［J］.植物遗传资源学报，5（1）：91-95.
梁利群，常玉梅，董崇智.2004.黑龙江乌苏里白鲑遗传多样性分析［J］.中国水产科学，11（6）：501-505.
刘东，刘臻，刘少军，等.2009.不同倍性鲫鲂高迁移率族蛋白1基因的克隆和原核表达［J］.自然科学进展，19（8）：819-828.
刘桂琼，姜勋平，熊远著，等.2003.猪个体基因杂合度对肉质的影响［J］.南京农业大学学报，28：55-60.
刘国庆，孙业良，杨利国，等.2006.级进杂交绵羊微卫星基因杂合度与生长性能的关系［J］.南京农业大学学报，29：67-71.
卢建平，姜乃澄.2000.罗氏沼虾发育过程中同工酶的研究［J］.东海海洋，18（3）：34-39.
王晓梅，陆桂，刘海金.2009.牙鲆雌核发育家系和两性生殖家系遗传结构分析［C］.水产太空育种与健康养殖海峡两岸青年科学家研讨会暨水产生物技术专业委员会2009年会，26.
王晓云，毕玉芬.2006.植物苹果酸脱氢酶研究进展［J］.生物技术通报，4：44-47.
王昭萍，郭希明.1998.太平洋牡蛎人工培育群体的基因型及杂合度研究［J］.青岛海洋大学学报（自然科学版），28：263-268.
徐佳，刘志锋，姜勇.2005.高迁移率族蛋白与真核基因表达调［J］.生物化学与生物物理进展，32（5）：397-402.
徐鹏，周令华，田丽萍，等.2003.从中国对虾ESTs中筛选微卫星标记的研究［J］.水产科学，27（3）：213-218.
叶小军.2008.大黄鱼人工养殖和雌核发育群体的微卫星标记分析［C］.集美大学.
张义凤，张研，鲁翠云，等.2008.鲤鱼微卫星标记与体重、体长和体高性状的相关分析［J］.遗传，30（5）：613-619.
郑济芳，胡弼，吴端生.2006.中华鳖HMGI基因的克隆与序列分析［J］.水生生物学报，30（2）：192-197.
朱文漓，顾继锐，辜文博，等.2008.草鱼胞质苹果酸脱氢酶（cMDH）的序列克隆及分析［J］.淡水渔业，38（4）：66-72.
Baxevanis A D，Landsman D.1995.The HMG-1 box protein family：classification and functional relationships［J］.Nucleic Acids Res，23（9）：1604-1613.
Borerllo M G，Merealli E，Perego C，et al.2002.Dieffrential interaction of Enigma protein with the two RET isoforms［J］.Biochem Biophys Res Commun，23296（3）：515-22.
Botstein D，White R L，Skolnick M，et al.1980.Construction of a genetic linkage map in mall using restriction fragment length polymorphisms［J］.American Journal of Human Genetics，32：314-331.
Bustin M.1999.Regulation of DNA-dependent activities by the functional motifs of the high-mobility-group chromosomal proteins［J］.Mol Cellul Boil，19（8）：5237-5246.
Chapmanl A D M，Coehs A，Afforn T R D，et al.1999.Structural basis of substrate specificity in malate dehyrogenases：Crystal structure of a ternary complex of porcine cytoplasmic malate dehyrogenase，d-Ketomalonate and TetrahyoNAD［J］.J Mol Biol，285：703-712.
Chen S L，Liu Y G，Xu M Y，et al.2005.Isolation and characterization of polymorphic microsatellite loci from an EST library of red sea bream（Chrysophrys major ） and cross-species amplification［J］.Mol Ecol Notes，5：215-217.
Cho Y G，Ishii T，Temnykh S.2000.Diversity of microsatellites derived from genomic libraries and GeneBank sequences in rice（Oryzasativa L.）［J］.Theor.Appl.Genet.，100，713-722.
Crawford A M，Littlejohn R P，1998.The use of DNA marker in deciding conservation priorities in sheep and other live stock［J］.Animal Genetic Resources Information，23：21-26.
Elisabeth B Ott，Nynke M.S.van den Akker，Philippe A.Sakalis.2008.The lim domain only protein 7 is important in zebrafish heart development［J］.Developmental dynamics，237（12）：3940-3952.
Erlandsson Harris H，Andersson U.2004.The nuclear protein HMGB1 as a proinflammatory mediator［J］.Eur J Immunol，34（6）：1503-1512.
Eujayl I，Sledge M K，Wang L，May GD，et al.2004.Medicago truncatula EST-SSRs reveal cross-species genetic markers for Medicago spp［J］.Theor Appl Genet，108：414-422.
Goodwin G H，Sander C，Johns E W.1973.A new group chromatin associated proteins with a high content of acidic and basic amino acids［J］.Eur J Bioehem，38（1）：14-19.
Gosling E M，Nolan A.1987.Triploidy induction by thermal shock in the manila clam tapes semidcussates［J］.Aquaculture，78：223-228.
Gupta P K，Rustgi S，Sharma S，et al.2003.Transferable EST-SSR markers for the study of polymorphism and genetic diversity in bread wheat［J］.Mol.Genet.Genomics，270，315-323.
Hagmann J，Grob M，Welman A et al.1998.Reeruitment of the LIM Protein hic-5 to focal contaots of human platelets［J］.J Cell Sci，111：2181-2188.
Hanss B，Leal-Pinto E，Teixeira A，et al.2002.Cytosolic malate dehydrogenase confers selectivity of the nucleic acid-conducting channel［J］.Proc Natl Acad Sci.U S A，99（3）：1707-1712.
Heber U.1974.Metabolite exchange between chloroplasts and cytoplasm［J］.Annu Rev Plant Physiol，25：393-421.
Hedgecock D，Li G，Hubert S，et al.2004.Widespread null alleles and poor cross-species amplification of microsatellite DNA loci cloned from the Pacific oyster，Crassostrea gigas ［J］.J Shellfish Res，23，379-385.
Huvet A， Boudry P， Ohresser M，et al.2000.Variable microsatellite in the Pacific oyster Crassostrea gigas and other cupped oyster species［J］.Anim Genet，31，71-72.
Kantety R V，Rota M L，Matthews D E，Sorrells M E.2002.Data mining for simple sequence repeats in expressed sequence tags from barley，maize，rice，sorghum and wheat ［J］.Plan Molecular Biology，48：501-510.
Krause A，Zaeharias W，Camarata T，et al.2004.Tbx5 and Tbx4 transcription factors interact with a new chicken PDZ-LIM proetin in limb and heart development［J］.Dev Biol.，273（1）：106-120.
Launey S，Ledu C，Boudry P，et al.2002.Geographic structure in the flat oyster Ostrea edulis L as revealed by microsatellite polymorphism［J］.J Hered ，93，331-338.
Li H L，Song L S，Wang L L，Xu W，Xiang J H.2003.Screening microsatellite markers from EST sequence of Chlamys farreri ［J］.High Technology Letters，12：72-75.
Liewlaksaneeyanawin C，Ritland C E，El-Kassaby YA，et al.2004.Single-copy，species- transferable microsatellite markers developed from loblolly pine ESTs［J］.Theor Appl Genet，109：361-369.
Lin C Y，Chen Y H，Lee H C，et al.2004.Novel cis-element in intron1 represses somite expression of zebrafish myf-5［J］.Gene，334：63-72.
Lin J J，Yang T，Horng Y，et al.2002.Phylogenetic relationships and biochemical properties of the duplicated cytosolic and mitochondrial isoforms of malate dehydrogenase from a teleost fish，Sphyraena idiastes ［J］.J Mol Evolution，54（1）：107-17.
Lo A S，Liew C T，Ngai S M，et a1.2005.Developmental regulation and cellular distribution of human cytosolic malate dehydrogenase （MDH1） ［J］.J Cell Biochem，94（4）：763-773.
Maneeruttanarungroj C，Pongsomboon S，Wuthisuthimethavee S，et al.2006.Development of polymorphic expressed sequence tag derived microsatellites for the extension of the genetic linkage map of the black tiger shrimp（Penaeus monodon ） ［J］.Anim.Genet.，37，363-368.
McGoldrick D，Hedgecock D，English L J，et al.2000.The transmission of microsatellite alleles in Australian and north American stocks of the Pacific oyster （Crassostrea gigas ）：selection and null alleles［J］.J Shellfish Res，19，779-788.
Merrit T J，Quattro M.2003.Evolution of the vertebrate cytosolic malate dehyrogenase gene family： duplication and divergence in actinopterygian fish ［J］.J Mol Evolution，56（3）：265-276.
Meyer B，Murua Escobar H，Hauke S，et al.2004.Expression pattern of the HMGB1gene in sarcomas of the dog［J］.Anticancer Res，24（2B）：707-710.
Passier R，Richardson J A，Olson E N.2000.Oracle，a novel PDZ-LIM domain protein expressed in heart and skeletal muscle［J］.Mech Dev，92（2）：277-284.
Pérez F，Ortiz J，Zhinaula M.，et al.2005.Development of EST-SSR markers by data mining in three pecies of shrimp：Litopenaeusvannamei ，Litopenaeusstylirostris and Trachypenaeusbirdy ［J］.Mar.Biotechnol，7，554-569.
Reece KS，Ribeiro WL，Gaffney PM，et al.2004.Microsatellite marker development and analysis in the eastern oyster （Crassostrea virginica ）：confirmation of null alleles and non-Mendelian segregation ratios［J］.J Hered，95，346-352.
Reeves R，Beckerbauer L M.2003.HMGA proteins as therapeutic drug targets［J］.Prog Cell Cycle Res.，5：279-286.
Roof D J，Hayes A，Adamian M et al.1997.Molecular charaeterization of abLIM，a novel actin～binding and double zinc finger protein［J］.J Cell Bio，138：575-588.
Saha M C，Mian R，Zwonitzer J C，et al.2005.An SSR- and AFLP-based genetic linkage map of tall fescue （Festuca arundinacea Schreb.）［J］.Theor Appl Genet，110：323-336.
Serapion J，Kucuktas H，Feng J N，Liu Z J.2004.Bioinformatic mining of type I microsatellites from expressed equence tags of channel catfish（Ictalurus punctatus ）［J］.Mar.Biotechnol.6，364-377.
Singh S M，Zouros E.1978.Genetic variation associated with growth rate in the American oyster（Crassostrea virginica ）［J］.Evolution，32：342-353.
Song H D，Sun X J，Deng M，et al.2004.Hematopoietic gene expression profile in zebrafish kidney marrow ［J］.Proc Natl Acad Sci.USA，101（46）：16240-16245.
Temnykh S，DeClerck G，Lukashova A，et al.2001.Computational and experimental analysis of microsatellites in rice （Oryza sativa L.）：frequency，length variation，transposon associations，and genetic marker potential［J］.Genome Research，11：1441-1452.
Torrado M，Senatorov V V，Trivedi R et al.2004.A novel PDZ-LIM domain protein，inetarets with alpha-actinins and filamin A［J］.Invest Ophthamlol Vis Sci.，45（11）：3955-3963.
Tsunoda S，Sierralta J，SunY et al.1997.A multivalent PDZ-domain protein assembles signalling complexes in a G-portein-coupled cascade［J］.Nature，388：243-249.
Va1lenius T，Makela T P.2002.Clikl：a novel kinase targeted to actin stress fibers by the CLP-36 PDZ-LIM protein［J］.J Cell Sci，115：2067-2073.
Varshney R K，Graner A，Sorrells M E.2005.Genic microsatellite markers in plants：features and applications［J］.TRENDS in Biotechnology，23（1）：48-55.
Wang D，Liao X L，Cheng L，et al.2007.Development of novel EST-SSR markers in common carp by data mining from public EST sequences［J］.Aquaculture，271：558-574.
Wang Y P，Guo X M.2007.Development and Characterization of EST-SSR Markers in the Eastern Oyster Crassostrea virginica ［J］.Marine Biotechnology，9，500-511.
Wang H X，Li F H，Xiang J H.2005.Polymorphic EST-SSR markers and their mode of inheritance in Fenneropenaeus chinensis ［J］.Aquaculture，249，107-114.
Woods I G，Wilson C，Friedlander B，et al.2005.The zebrafish gene map defines ancestral vertebrate chromosomes［J］.Genome Res，15（9）：1307-1314.
Xia H，Winokur S T，Kuo W L，et al.1997.Actinin-associated LIM protein：identification of a domain intearetion between PDZ and spectrin-like repeat motifs［J］.J Cell Bio，139：507-515.
Yoon S J，Koo D B，Park J S，et al.2006.Role of cytosolic malate dehydrogenase in oocyte maturation and embryo development［J］.Fertility and Sterility，86（4）：1129-1136.
Yu H，Li Q.2008.Exploiting EST Databases for the Development and Characterization of EST-SSRs in the Pacific Oyster （Crassostrea gigas ）［J］.Journal of Heredity，99（2）：208-214.
Yue G H，Ho M Y，Orban L，Komen J.2004.Microsatellites within genes and ESTs of common carp and their applicability in silver crucian carp［J］.Aquaculture，234：85-98.
Zhan A B，Bao Z M，Hu X L.2008.Characterization of 95 novel microsatellite markers for Zhikong scallop Chlamys farreri using FIASCO-colony hybridization and EST database mining［J］.Fisheries Science，74（3）：516-526.
Zhan A B，Bao Z M，Wang X L，et al.2005.Microsatellite markers derived from bay scallop Argopecten irradians expressed sequence tags［J］.Fish Sci，71：1341-1346.
Zhan A，Wang Y，Brown B，et al.2009.Isolation and characterization of novel microsatellite markers for yellow perch （Perca flavescens ）［J］.Int J Mol Sci.10（1）：18-27.
Zhou Q，Chu P H，Huang C，et al.2001.Ablation of Cypher a PDZ-LIM domain Z-Iine protein，causes a severe form of congenital myopathy［J］.J Cell Bio，155（4）：605-612.