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译者序
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8 利用噬菌体展示技术研究蛋白质—蛋白质相互作用
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前言
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近年来，噬菌体展示技术已经发展成为一种有力的工具，为阐明天然蛋白质间的相互作用关系和模建新配体的受体创造了条件。噬菌体展示技术主要优势在于它将蛋白质与其遗传物质整合到单个噬菌体颗粒中（Smith，1985）。由于在表达的蛋白质与为其编码的遗传信息之间提供了直接的物理联系，人们可以有效地对所需功能的克隆进行反复筛选，并随之对其进行扩增。因此，在文库筛选（或淘选）的过程中，特定的噬菌体克隆由于对其配体的特异亲和性而不断地得到富集。从而使相对稀少的可以结合配体的克隆能够快速、有效地从一个大文库中被筛选出来。由于这些表达克隆体系已经成熟，所以在各种不同的免疫化学和生物学应用中，出现了多种多样的基于被展示蛋白质特性的筛选方法。
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为了更好地认识噬菌体展示技术的独特优势，我们必须了解其区别于其他克隆表达方法的有关特点。在其他的表达方法中（Helfman et al.，1983；Young and Davis，1983；Seed and Aruffo，1987；Sikela and Hahn，1987；Singh et al.，1988；Fields and Song，1989；Germino et al.，1993），编码目的蛋白的基因也能从基于原核宿主表达的复杂克隆文库中得到鉴定。它们两者主要的区别在于如何分离出特定的结合体。在这类早期的表达体系中，筛选时需要将翻译出蛋白质的表达文库固定在固相支持物上，例如转移膜，这样可能会使重组蛋白的构象改变，而正是这种构象包含了重组蛋白的结构及与配体结合的特性，而且在这些方法中，只有有限数目的单克隆能够轻易被检测出来，在增加文库容量而又能被完全检测出的前提下，很难实现这些方法的进一步放大。因此，在这类早期肽的文库中，低丰度表达基因的鉴定是技术要求高和耗时、费力的。相比之下，在噬菌体展示技术中，某个克隆的表型特征与编码的遗传信息之间的直接联系使得通过各种功能性相互作用为基础的筛选和富集得以有效进行，而且这些得到的亚库易于扩增。
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各种具有不同大小和特征的分子已成功展示于丝状噬菌体表面。其中包括酶（McCafferty et al.，1990）、抗体（Burton and Barbas，1993；Winter et al.，1994）、细胞因子（Gram et al.，1993）、蛋白质片段（Petersen et al.，1995）和多肽（Smith，1985；Cwirla et al.，1990；Scott and Smith，1990）。这些研究表明，定位于大肠杆菌外周腔中的重组蛋白通常可以重新折叠成一定的构象，从而表现出与其在天然环境下相似的功能和特征。因此，这项发展中的技术提供了一种可以用于开发高级结构分析结果（图8.1）和不断激增的来源于宿主基因组DNA序列的工具。这项技术也已被用于发现和描述新的配体受体结合相互作用（参见综述，O'Neil and Hoess，1995；Katz，1997），有时甚至是在具体的结构功能相互关系还不清楚的情况下。事实上，通过将理性设计和组合策略相结合，噬菌体展示技术能够用于创造在特征和功能上优于现有天然蛋白的新的小蛋白。
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图8.1 基于结构信息的蛋白质工程
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程序纲要
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噬菌体展示技术的生物学概论
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正是由于人们对高度相关的f1和M13丝状噬菌体遗传学和生理学的深入认识，才使噬菌体展示技术得以出现（图8.2）（综述见Sambrook and Russell，2001；Molecular Cloning，pp.3.1～3.49；Webster，2001）。尽管在方法上存在各种各样可能的变化，但多数研究人员使用以携带编码外壳蛋白/靶肽融合蛋白DNA序列的质粒或噬菌体为载体的克隆体系（Sambrook and Russell，2001；Molecular Cloning，pp.3.42～3.49），其中也包括丝状噬菌体的DNA复制起点。因此，当含有这些质粒的大肠杆菌随后被含有其他的天然噬菌体蛋白的辅助噬菌体感染（或援助）时，产生的噬菌粒结构能够被有效地包装进入噬菌体颗粒。辅助噬菌体带有一个弱的复制子，因此，与噬菌体基因组序列相比，辅助噬菌体的基因组不能被有效地包装，这样就增加了库中有用克隆的数量。与噬菌体载体相比，噬菌粒体系使肽库可以以质粒的形式进行操作，操作简单。这也关系着展示的有效性和可能的展示效价（如下所述）。
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选择何种噬菌体外壳蛋白与重组蛋白融合直接影响筛选体系的特性。丝状噬菌体基因组仅有11个编码产物（表8.1）。到目前为止，最常用的方法是将外源基因克隆到成熟或截断的噬菌体外壳蛋白Ⅲ或Ⅷ，对于pⅧ，每个病毒粒子约有2700个拷贝。含有pⅧ的融合蛋白能够提供多价展示，从而根据亲和力进行目的克隆的筛选。例如，鼠源抗神经节苷酯特异的抗体可以在以pⅧ为融合蛋白质载体的噬菌体展示肽库中筛选出来，但在相同的pⅢ肽库中则筛选不到，这可能是因为单价的pⅢ展示肽所呈现的亲和力达不到亲和筛选所需要的阈值（Qiu et al.，1999）。进一步的实验结果表明，在以低亲和力相互作用为基础的筛选中，基于pⅧ的展示体系有利于筛选到在基于 pⅢ 展示体系中得不到的克隆（Folgori et al.，1994）。然而仅由相对无效的克隆间的竞争，也不能有效地得到高亲和力的克隆。pⅧ体系还受限于克隆片段插入的大小（Iannolo et al.，2000），因为如果将大于10个氨基酸残基的多肽与pⅧ融合会使噬菌体无法承受，导致噬菌体无法组装。噬菌体体系最重要的限制，是不能利用辅助噬菌体的野生型外壳蛋白进行和融合有外源蛋白的外壳蛋白混合组装。相比之下，pⅢ则经常用于展示由cDNA和基因组序列编码的多肽，因为它能够容纳较大的多肽融合蛋白（Crameri and Suter，1993；Shanmugavelu et al.，2000）。对于pⅢ而言，每个病毒粒子仅有5个拷贝，并且都定位于噬菌体颗粒的一端。因此，表达pⅢ融合蛋白的载体可以实现低价（或者甚至是单价）的相互作用，利用这一优势可以通过基于亲和力的筛选从大容量的肽库中筛选稀有噬菌体。
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表8.1 f1噬菌体的基因和基因产物
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丝状噬菌体其他的外壳蛋白，包括pⅥ（Jespers et al.，1995；Fransen et al.，1999）或者pⅦ和pⅨ（Gao et al.，1999）也已经被用来展示外源蛋白质。这些体系被改进后用于构建cDNA和基因组表达文库（Sambrook and Russell，2001，Molecular Cloning，pp.11.1～11.124，14.1～14.51）。现已发展了其他的几种非丝状噬菌体的展示体系。这其中包括与λ噬菌体衣壳蛋白D融合，它可以在其N-和C-末端接纳大的融合片段（Sternberg and Hoess，1995；Santini et al.，1998），还包括λ噬菌体的尾蛋白Ⅴ（Maruyama et al.，1994；Dunn，1995；Kuwabara et al.，1997）。另外，T4噬菌体也已经被开发，用于展示多肽和较大的蛋白质结构域（Efimov et al.，1995；Ren et al.，1996；Houshmand et al.，1999）。
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图8.2 Ff噬菌体颗粒
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噬菌体展示技术潜在的局限性
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蛋白质工程研究的一个主要目的是通过改变多肽的组成，有时通过改变其大小来提高某个结构域的功能。这些研究需要有效和高产率的体外表达系统。几十年的研究使蛋白质的体外表达取得了巨大的成功。然而，真核细胞功能蛋白的表达时常会表现出与细菌体系不相容性。这些限制经常是由于细菌固有的不能进行某些方面的翻译后修饰造成的。在其他情况下，经常会遇到一些意想不到的缺陷，这些缺陷归因于蛋白质折叠，因为哺乳动物蛋白质折叠为有功能的构象需要分子伴侣蛋白。对于这些分子伴侣如何发挥必要的功能，目前还知之甚少。同时，局部结构也会影响蛋白质的折叠；把一个基因序列与一个外源基因融合也会影响其天然活性。从这一点来看，很难期望哺乳动物蛋白能够与丝状噬菌体外壳蛋白融合而展示于丝状噬菌体表面，还能表现其天然活性。但目前文献报道成功展示的蛋白质已经很多（综述见Lowman et al.，1991；Chiswell and McCafferty，1992；Clackson and Wells，1994；O'Neil and Hoess，1995）。
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从某种意义上来说，一个生物体系中的功能结构域代表着一个高度定向进化过程的终产物。但出人意料的是，在大量的研究中利用噬菌体展示技术的确筛选出了各种各样性能得到大大改良的结构域，这其中包括亲和力、精确的特异性和通过结构的精细优化而提高的稳定性等各方面（Robert et al.，1992）。
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关于设计噬菌体展示文库方法的考虑
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在对一个结构域进行工程学研究中，建立噬菌体肽库的第一个标准步骤就是，原则上要证明天然的结构域展示于噬菌体表面后依然保持生物学功能。只有在这之后，才能应用噬菌体展示技术去研究特定的功能活性所需的最低结构要求。当制备噬菌体展示文库时，表达的一个必须条件就是将编码序列定向克隆到展示载体中，以保持其具有适当的5'和3'方向。同样重要的是编码序列必须位于细菌分泌信号序列的C-末端和下游pⅢ或pⅧ丝状外壳蛋白基因之间，并保持正确的阅读框。尽管可以轻易设计有效的策略来建立相对均一的基因文库，例如抗体基因文库和编码限定多肽的文库，但在更多的文库中，例如基因组DNA文库和cDNA文库，序列的5'和3'端可能是不均一的和/或者是未确定的。对于这类基因，每建立约18个克隆中（2×3×3）可能只有一个克隆包含适宜的融合体。这需要正确的插入方向（2种可能性）和正确的阅读框，这种阅读框架包括了使可溶性蛋白分泌到细菌周质腔中所必需的信号序列（3种可能性）和对于展示噬菌体表面所必需的噬菌体外壳蛋白（3种可能性）。这些问题的存在大大减少了展示于文库中可用于筛选的功能克隆的数量。
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在制备cDNA文库的过程中，还有额外的复杂问题，这源自克隆的真核细胞基因mRNA 3'末端的翻译终止密码子。在这种情况下，一个终止密码子出现在噬菌体外壳蛋白N-端之前，过早地截断了融合产物，有效地阻止了表达多肽在噬菌体表面的展示。近来已有报道，将多种结构域文库融合于外壳蛋白pⅢ和pⅧ的C-末端，以避免这一问题（Fuh and Sidhu，2000；Fuh et al.，2000）。
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成功利用噬菌体文库技术需要对目的蛋白cDNA或基因组表达文库中的构象和功能的完整性有所了解。通过了解哪些特定的氨基酸残基是负责功能性质的关联残基，或者哪些可以稳定蛋白质的整体结构（也称之为框架），极大促进了改变蛋白质功能的尝试。晶体结构或核磁共振（NMR）的研究可以确证特异的相关联的位点。像丙氨酸扫描（Sambrook and Russell，2001；Molecular Cloning，pp.13.81）这类方法可以确定这些位点对于活性和结构的相对贡献。通过这些认识，可以进一步界定有限数目的关键氨基酸残基，将编码这些残基的密码子随机化（或称多样性）以制备文库，从中分离功能被设计改变了的变异体。
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必须充分认识到，利用现在可用的方法建立组合文库，其大小和多样性都有一定的限制，特别是通过将密码子随机化而大大增加序列的多样性时。为了将在关键位点表达的氨基酸随机化，必须合成具有简并密码子的寡核苷酸，这些密码子最多包含64种核苷酸序列（4×4×4）。因此，如果需要将一个基因的N密码子随机化，则库容量要达到64N。为了减少需要的密码子多样性，经常会应用一些核苷酸策略浓缩。这其中包括简并密码子，NNK（N代表任意核苷酸，K代表G或T），这样可以利用32种密码子实现对20种氨基酸的编码。另外，简并密码子VNS（V代表A、C或G，S代表G或C）可以顾及24种密码子，而忽略掉了Tyr、Phe、Cys密码子和全部的终止密码子。这些策略由于在文库的大小（或独立转化子数目）和完全随机化位点的最大数目之间存在严格的数字关系而备受青睐。运用最常用的克隆和转化方法，这类文库的实际库容量只能达到108～109。所以，在实际操作中，只能考虑对6～8个位点可以进行随机化（代表206～208）（Clackson and Wells，1994）。然而，有证据表明，没有必要制备代表所有可能变异序列的“完整肽库”来成功获得有价值的克隆。如下所述，Nord等报道说，即使有13个密码子被随机化（这将形成大约4×1019个变异体，Nord et al.，1997），也可以从只有4×107个独立克隆文库中成功分离到有价值的克隆，这表明不完全的肽库也足可以用来分离特异性结合体。
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可以利用一些方法建立更大的文库，以产生更大的多样性，这些方法包括使用λ包装体系（Sambrook and Russell，2001，Molecular Cloning，pp.2.1～2.117），它可以提高转化效率（Alting-Mees and Short，1993）；或基于Cre-lox的体内重组形成的双重肽库（Fisch et al.，1996）（Sambrook and Russell，2001，pp.4.82～4.85）。这些方法还没有被广泛的采用。在近来的报道中（Sidhu et al.，2000），Sidhu 与其同事描述一个菌株，利用电穿孔方法进行转化能大大提高库容量（Sambrook and Russell，2001，pp.16.33～16.36）。
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尽管起初的报道多集中于针对固定在固相支持物上的配体的筛选，现在已有足够的证据表明，可以通过多种方式有效地筛选配体特异性克隆，而不必分离或纯化感兴趣的目的配体。在各种可供选择的方法中，酶联免疫吸附分析（ELISA）平板、磁粒甚至是细胞表面都成功地用于筛选。一般认为蛋白质构象和功能特性会受到其连接的方式或固定化的影响。特别需要提出的是，有报道表明将纯化的蛋白质直接固定到塑料表面上，会由于其构象和可接触到的结合表位的改变导致蛋白质部分失活。这方面的文章已有详细的综述（Silverman，2001），重要的是，要考虑到所设计的筛选条件应尽可能保证所筛选的克隆具有的特性能够用于后续的研究。否则，人们会发现筛选结束后得到的克隆并没有预期（或者有用）的结合活性。
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噬菌体展示技术和模建结构域
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已有报道，通过各种不同的方法利用噬菌体展示技术来获得具有预期特性的变异体或者基因片段的克隆。为了提供一个有用的事例，我们选列一个含有有限变异密码子数目的变异结构域文库的详细制备方法。下述列举的改良方法已经在我们实验室得到确认，并正用于寻找基于由临床上分离的金黄色葡萄球菌产生的毒性因子—蛋白质A（SpA）的变异结构域。
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天然形式的SpA是一个45kD的分泌型膜蛋白，包含5个高度同源的56到61个氨基酸残基的结构域，每个结构域都显示两种独立的免疫球蛋白（Ig）结合活性，即IgG Fc（结晶片段）结合特异性和Fab（抗原结合片段）结合特异性。细菌的这种Ig结合蛋白已被证明是一个对于认识特定结构域功能很吸引人的模型。这些蛋白质之所以引起人们的兴趣，部分原因在于它们高度有序的二级结构，它赋予蛋白质高度的结构稳定性，而不需要形成内部二硫键。两个独立的研究组都报道，噬菌体所展示的融合pⅢ外壳蛋白的N-末端一个SpA的结构域仍保留着Fc的结合活性，而IgG的结合活性被用于从稀释的肽库中进行有效的筛选。
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Wells和同事利用对IgG Fc-SpA结合作用结构基础的详细了解，设计了一种策略来创造具有相同功能的但小得多的蛋白质变异体［图8.3（A）］。在天然分子中，SpA的含59个氨基酸残基的结构域B的3个α螺旋中只有两个参与了Fc的结合，而第三个α螺旋表现为稳定疏水核心的作用，并可能参与Fab结合活性。为了优化Fc结合结构域，创建了基于前38个氨基酸残基的肽库，并对几个密码子进行了几轮的随机化，筛选得到了一种变异体，其螺旋1和螺旋2的疏水相互作用稳定，同时保留了Fc结合活性［图8.3（B）～（D）］。因此，以折叠成3股α螺旋束的59个氨基酸残基的结构域（其以10nmol/L的KD值结合IgG的Fc片段）为基础，鉴定出一个38个残基结合体（命名为Z38），它能以43nmol/L的KD结合IgG的Fc片段（Braisted and Wells，1996）。在后来的研究中（Starovasnik et al.，1997），NMR分析表明，合成的Z38多肽的三级结构由两个反向平行的α螺旋组成，这一点与在B结构域/Fc复合物（Deisenhofer，1981）中观察到的B-结构域的头两个螺旋极其类似。已设计了一种34个氨基酸残基的类似物（Z34C），它的螺旋间二硫键大大增加了其稳定性，同时IgG的结合活力提高了9倍。NMR分析表明，Z34C和Z38相似，具有与SpA对应区域相同的结构。这种稳定的、最小化的双螺旋多肽实际上模拟了天然结构域的结构和功能，但其结构大小只是天然结构的一半，且有1/3的保留氨基酸残基被改变（Braisted and Wells，1996；Starovasnik et al.，1997）。这种小的工程性的肽类似物Z34C，目前代表了具备典型的折叠蛋白性能的最小功能多肽。
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SpA的这种高度有序的三股α螺旋束结构域也已被成功用于开发出具有新型结合活性、有效且稳定的结构域。利用固相合成策略，合成58个氨基酸残基的SpA结构域的基因，其中螺旋1、螺旋2中暴露在表面的13个非连续残基的密码子被随机化，创建了小于108个独立克隆的不完全肽库（Nord et al.，1995，1997）。这13个位点中有7个直接参与天然的Fc结合活性的形成。参与稳定疏水核心的氨基酸残基被保留。经过3～5轮的筛选，从噬菌体展示文库中得到了具有不同特异性的“亲和体”，其中包括Taq DNA 聚合酶结合体，人胰岛素结合体和人载脂蛋白结合体。在E.coli 中表达的克隆经过SDS-PAGE、生物传感器研究和CD色谱评价表明，它们保留了原有蛋白质的α螺旋结构和微摩尔水平的特异结合活性。这些结合体的亲和常数（解离常数，KD）如下：Taq DNA聚合酶结合体的亲和常数约为2×10－6，人胰岛素结合体的亲和常数约为3×10－5，人载脂蛋白结合体的亲和常数约为3×10－6。这些研究表明，利用SpA结构域稳定的二级结构构建新的结合活性有序骨架有巨大潜力。在这些研究中，SpA异常的稳定性和高度可溶性是很有用的，有人建议在细胞内表达这些亲和体以起到治疗作用。
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我们的研究小组主要对SpA对Fab的特异结合活性感兴趣。在早期的研究中，我评价了SpA与人Ig抗体蛋白已知的可变区的结合作用（Sasano et al.，1989，1991）。为了进一步了解这种结合作用，我们用固定化的SpA筛选用健康人外周淋巴细胞构建的IgM和IgG可变区噬菌体展示文库（Sasano et al.，1993；Silverman et al.，1996）。这些研究表明，SpA的结合活性限于表达VH3家族的可变区的抗体，这种结合活性不受抗体分子中轻链种类的影响。最近，通过对人VH3家族的IgM的Fab片段和SpA共结晶体的晶体结构分析，阐明了这种特异相互作用的分子基础。结构分析表明，这种相互作用是通过VH3家族的Fab片段中的框架1和框架3中特定的残基介导的，而可变区中的β环，即参与抗体结合的互补决定区（CDR）并不参与这种相互作用（图8.3）（Graille et al.，2000）。虽然在任何种类的抗原受体的相互作用中，还未见报道Fab的β链决定性地参与相互作用，但是，对应于T细胞的某些微生物超抗原的特性让人想起了这种相互作用的某些特征。值得注意的是，VH3的SpA特异结合模体在几乎所有的哺乳动物B细胞库中是高度保守的，它至少在两栖类动物的免疫系统中就已出现。
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图8.3 SpA结构域的免疫球蛋白结合作用
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通过调查鼠对SpA免疫的反应，我们证实SpA能够诱导大规模的表达SpA结合模体的B细胞克隆的特异性剔除（Silverman et al.，1998，2000）。通过努力，我们建立了下面的实验方案，以决定噬菌体展示技术能否用于发展新的具有更优化的B细胞超抗原活性的SpA变异结构域。
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方案
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方案1：变异结构域文库的制备
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材料
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缓冲液和溶液
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分子克隆手册：蛋白质—蛋白质相互作用
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分子克隆手册：蛋白质—蛋白质相互作用
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抗体
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Anti-M13 抗体（Pharmacia Biotech 27-9410-01）
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辣根过氧化物酶（HRP）标记的Anti-M13抗体（Pharmacia Biotech 27-9411-01）
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酶和缓冲液
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AmpliTaqDNA聚合酶（Perkin Elmer N801-0533）
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10×PCR 缓冲液（Perkin Elmer，和聚合酶一起提供）
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10×限制性酶切缓冲液（和酶一起提供）
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Sfi Ⅰ限制性内切酶（Roche Molecular Biochemicals，40单位/μl，1288059）
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T4 DNA连接酶（GIBCO-BRL，1单位/μl，15224090）
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5×T4 DNA连接酶缓冲液（和酶一起提供）
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质粒和细菌细胞
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pComb3XSS（由Prof.Carlos Barbas Ⅲ惠赠，The Scripps Research Institute，La Jolla，California）
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ER2738甘油保存液（New England Biolabs E4104S）
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XL1-Blue MRF′电转感受态细胞（Stratagene 200158）
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特殊试剂和装置
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Dynal磁力架MPC-S（Dynal 120.20）
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电转仪（例如，Gene PulserⅡ，Biorad）
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电转杯（2mm，BTX 10-000295-01）
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ELISA板（96孔，Corning Coster 3690）
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黏性Linbro封板膜（ICN Biochemicals 76-401-05）
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寡核苷酸片段
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QIAEXⅡ 凝胶回收试剂盒（Qiagen 20021）
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Quik Pik 电洗脱池（Stratagene 400855）
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特异的寡核苷酸引物
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阶段1：文库制备
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方法
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第一轮重叠PCR反应
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最初的PCR扩增需要混合等摩尔的两种寡核苷酸链形成随后PCR的模板。图8.5表示的是完整重叠PCR步骤示意图。基于经验，每50μl反应产生2～4μg不纯的产物。为了确保能获得足够量正确大小的纯化的PCR产物，经常将10个单独反应产物合并收集。
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1.配制10个反应体系，扩增
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分子克隆手册：蛋白质—蛋白质相互作用
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2.加入无核酸酶蒸馏水至终体积50μl。
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3.按照下列条件进行PCR：94℃ 5min，随后94℃ 15s、56℃ 15s、72℃ 90s进行30个循环，最后72℃ 10min。
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4.用DNA凝胶上样染料和适当的分子量标准在2%TAE/琼脂糖凝胶上电泳，对5～10μl PCR产物进行鉴定。
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通过这一扩增过程，得到的PCR产物的大小应该与寡核苷酸模板大小的计算值相等。
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分离PCR产物
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5.收集10个PCR反应产物，用乙醇沉淀。
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6.加入10%（V/V）3mol/L乙酸钠（pH 5.2），混匀。
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7.加入2.2倍体积的无水乙醇，混匀。
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8.－70℃放置1h至过夜。
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9.4℃，14000r/min离心30min。
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10.去除乙醇，用70%乙醇洗涤沉淀。
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11.4℃，14000r/min 离心15min。
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12.去除70%乙醇，沉淀在工作台上晾5～10min。
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13.用适当体积的无核酶蒸馏水（50～100μl）重悬沉淀。
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14.将产物进行2%TAE/琼脂糖凝胶电泳，并回收大小正确的片段。
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15.利用电洗脱（例如，Quik Pik columns，Stratagene）或树脂结合（例如，QIAEX Ⅱ gel Extraction Kit，QIAGEN）纯化回收产物。
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16.利用适当的质量梯度标准在2%TAE/琼脂糖凝胶上定量，或者测定260nm的光密度（1O.D.=50μg/ml）。
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如果第一次反应产物低于特定的大小，就不能用某些纯化方法。请检查制造商提供的方案。
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第二轮重叠PCR反应
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17.为了产生完整的结构域，应进行第二轮PCR伸展。将第一轮的PCR产物以等摩尔与第三个寡核苷酸片段混合，加入特定的外部引物（其应包含Sfi Ⅰ酶切位点）以产生全长产物。
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18.配制10个50μl反应体系，每个反应组成如下：
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第一轮PCR产物 100ng
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寡核苷酸片段3（正义） 100ng
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引物3（正义） 60pmol
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引物4（反义） 60pmol
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10×PCR buffer 5μl
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2.5mmol/L dNTPs 8μl
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Taq DNA聚合酶 0.5μl
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加入无核酸酶蒸馏水至终体积50μl。
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19.按照下列条件进行PCR：94℃ 5min，随后94℃ 15s、56℃ 15s、72℃ 90s进行30个循环，最后72℃ 10min。
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20.用DNA凝胶上样染料和适当的分子量标准在2%TAE/琼脂糖凝胶上电泳，对5～10μl PCR产物进行鉴定。
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分离PCR产物
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21.按照上述在分离PCR产物中介绍的方法收集PCR产物，乙醇沉淀，纯化，在1%～2%TAE/琼脂糖凝胶上定量。
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用Sfi Ⅰ对pComb3XSS载体和蛋白质结构域的PCR产物进行限制性酶切
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22.用Sfi Ⅰ限制性内切酶制备用于克隆的pComb3XSS和PCR产物。我们推荐较高的酶浓度（40单位/μl）和Roche Molecular Biochemicals的10×缓冲液M。
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a.对PCR产物的酶切体系应包括：
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纯化的PCR产物 10μg
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SfiⅠ（每微克DNA为36单位） 360单位
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10×缓冲液M 20μl
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加水至终体积为200μl。
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所用的酶量应视所要酶切的结构域的大小而定。
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b.对载体的酶切体系应包括：
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pComb3XSS（在两个Sfi Ⅰ克隆位点 20μg
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间含有一个填充片段）
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SfiⅠ（每微克DNA为6单位） 120单位
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10×缓冲液M 20μl
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加水至终体积为200μl。
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c.50℃条件下酶切5h。
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d.如上所述方法分离PCR产物进行乙醇沉淀，用1%～2%TAE/琼脂糖凝胶纯化结构域片段，用1%TAE/琼脂糖凝胶纯化载体和填充片段。
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我们建议利用Quik Pik column（Stratagene）电洗脱纯化。最佳的酶切和纯化条件对制备高转化效率的载体和连接后的低背景是必要的。填充片段也应被纯化以用于连接测试，来确定载体的质量。
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连接测试
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为了确保制备的载体和插入片段能够用于创建足够大的文库，首先要确定载体和插入片段的连接效率，以及载体单独转化的本底转化频率。如果没有插入片段的载体样品连接后，达到相对较高的转化频率（>10%），说明制备的载体质量较差。因为，由于文库中太多克隆没有插入片段，制备物中只产生了非常有限的文库，所以应制备另外一份载体。
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在以下的许多操作步骤中，细菌要在有抗生素的条件下培养，原因如下：
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● XL1-Blue和ER2738菌株含有四环素抗性基因。在培养基中加入四环素的原因在于：（a）这样将避免被其他细菌株培养物污染。（b）四环素可以促进细菌表面F-纤毛的表达，这对于噬菌体感染是必需的。
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● 本方案中使用的质粒（pComb3X）具有羧苄青霉素抗性基因，所以，含有此基因的细菌菌株都可以抵抗培养基中羧苄青霉素的作用。
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● 在培养基中表达噬菌体颗粒时，要加入辅助噬菌体，而在辅助噬菌体基因组中存在一个卡那霉素抗性基因。所以，利用卡那霉素可以筛选共感染辅助噬菌体细菌。
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图8.5 利用交叠PCR法制备用于克隆插入pComb3X体系的结构域基因
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23.配制下列小规模的连接反应体系。
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a.PCR产物连接
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pComb3X（SfiⅠ酶切与纯化） 140ng
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蛋白质结构域PCR产物（Sfi Ⅰ酶切与纯化） 70ng
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5×连接酶缓冲液 4μl
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连接酶 1μl
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加水至20μl。
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b.对照样品连接
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pComb3X（SfiⅠ酶切与纯化） 140ng
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填充片段（Sfi Ⅰ酶切与纯化） 70ng
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5×连接酶缓冲液 4μl
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连接酶1μl
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加水至20μl。
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c.载体自体连接对照
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pComb3X（SfiⅠ酶切与纯化） 140ng
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5×连接酶缓冲液 4μl
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连接酶 1μl
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加不含核酸酶的水至20μl。
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d.所有连接反应均在室温下过夜。
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e.利用电转化法将每个连接反应产物1μl转入50μlER2738或XL1-Blue（详见下述转化测试）。
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f.分别将100μl、10μl和1μl连接体系铺制到含羧苄青霉素的LB平板上，37℃培养过夜。
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此结果会预示利用准备的试剂可以制备出的肽库的大小。每微克载体DNA的文库至少应有1×107个转化子，然后才能进行大规模文库制备。自体连接的本底应少于10%（＜5%较理想）。如果上述的要求有一项没有达标，载体必须重新酶切、纯化和连接，直到制备出高质量的载体。
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转化测试
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为了获得尽可能高的转化效率，我们建议采用电穿孔转染。可以查阅电转感受态细胞制备的方法（Rader et al.，2001），但XL1-Blue的电转感受态细胞可以购买到（Stratagene 200158）。
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24.进行如下电转化：
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a.向适当数量的标记好的14ml的聚丙烯管中加入室温的SOC培养基。
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b.将-20℃预冷的2mm电转杯在电转前置于2ml冰上（每个样品一支）。
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c.将Gene Pulser Ⅱ电转仪的脉冲控制单位置于容量25μF，2.5kV，200Ω。
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d.从每一20μl连接测试样品中，取出1μl置于新的Eppendorf管中，冰上保存。在手里缓慢融化电转感受态细胞。将50μl感受态细胞加入到1μl连接测试样品中，并用加样枪吸头混匀。
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e.转移DNA—细胞混合物到预冷的电转管中，轻轻敲打使样品到管底，避免产生气泡。
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f.将电转管置于Gene Pulser Ⅱ电转仪上，进行一次脉冲，持续4～5ms。
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g.立即加入1mlSOC培养基，缓慢重悬细胞。如果延误加入SOC培养基会导致转化效率的降低（延误1min效率降低3倍）。
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h.将细胞重悬液转入标记的含有2mlSOC培养基的聚丙烯管中。
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i.37℃，250r/min振摇培养1h。
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j.取100μl、10μl、1μl铺制到含有羧苄青霉素的LB平板上，37℃培养过夜（应该将培养物梯度稀释，共铺制100μl）。
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25.对每块平板上的克隆计数，以确定总转化数：总转化数＝［克隆数×培养基体积（μl）/铺制平板所用体积（μl）］×［总连接体积（μl）/用于转化的连接物的体积（μl）］
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将连接测试中得到的总转化数乘以7.14就可以确定转化1μg连接文库得到的文库大小，或乘以10来确定转化全部连接文库的大小。确定制备5×107转化子规模的文库，所需的连接文库的数量。
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文库连接和转化
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26.配制足够的反应体系以产生至少5×107个转化子：
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pComb3X（SfiⅠ酶切与纯化） 1.4μg
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蛋白质结构域PCR产物（SfiⅠ酶切与纯化） 700ng
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5×连接酶缓冲液 40μl
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连接酶 10μl
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加水至200μl。
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27.室温下温育连接反应过夜。
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28.进行乙醇沉淀（如在分离PCR产物步骤中所述）。
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29.用15μl无菌水重悬乙醇沉淀的连接反应产物。
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文库转化
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各种不同来源的噬菌体造成的文库污染是灾难性的。因此，在下面的实验步骤中有必要利用10%的漂白液清洁工作台、离心机、试剂瓶和吸头以避免其他噬菌体颗粒（辅助噬菌体的、环境中的、以前肽库中）的污染。
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30.取出一支-20℃预冷的2mm的电转管，置于冰上。
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31.在手中融化电转感受态细胞（ER2738），每个肽库转化体系中加入300μl细胞。一旦细胞融化，直接加入到15μlDNA中，轻轻吹打混匀。
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32.转移DNA-细胞混合物到预冷的电转管中，在Gene Pulser Ⅱ电转仪上进行脉冲电转（持续时间为约4ms）。
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33.立即加入1ml室温的SOC培养基，缓慢与细胞混合。转移1ml到预先标记的14ml聚丙烯管中。利用1mlSOC培养基冲洗电转管两次后并入聚丙烯管内。37℃，200～250r/min振摇培养1h。
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34.向3ml培养物中加入6ml预热的（37℃）SB培养基，其中含有20μg/ml羧苄青霉素（3.6μl 50mg/ml的羧苄青霉素贮液）和10μg/ml四环素（18μl 50mg/ml的四环素贮液）。为测定肽库滴度，取出20μl含有培养物的培养液加入到180μl培养液中（1∶10稀释），涡漩混匀，将上所述稀释液按照1∶10、1∶100、1∶1000的稀释度进行稀释。每个稀释度取出100μl铺制含羧苄青霉素的LB平板，37℃过夜培养。
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转化子的总数＝克隆数×（培养体积/铺板体积）
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35.将9ml培养物在37℃下，250r/min振摇培养1h。
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36.加入5.4μl羧苄青霉素贮液使羧苄青霉素的浓度达到50μg/ml，37℃，250r/min继续振摇培养1h。
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37.向9ml培养体系中加入1ml辅助噬菌体，然后加入90ml预热的含羧苄青霉素/四环素（浓度分别为50μg/ml和10μg/ml）的SB培养基至体积增加为100ml。转入无菌的250ml锥形瓶中，37℃，250r/min继续振摇培养2h。
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38.向100ml培养物中加入140μl卡那霉素贮液，37℃，250r/min继续振摇培养过夜。
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聚乙二醇沉淀
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39.4℃，3000g（例如Beckman JA-10 转子的4000r/min），培养物离心15min。
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40.转移上清至250ml无菌离心管中，加入25ml5×PEG/NaCl，冰上放置30min。
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41.15000g（例如Beckman JA-10 转子的9000r/min）离心上清30min，去除离心后上清。将离心管倒置放在纸巾上将噬菌体沉淀中多余的液体吸干。
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42.用2ml1%的BSA/PBS重悬噬菌体沉淀，用0.2μm的滤膜过滤除菌。
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噬菌体重悬液可长期在4℃下保存，但如果想进行淘选，可以马上使用。
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阶段2：淘选
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现在有很多方法可以用于噬菌体文库的筛选，但在这一节我们将讨论利用链霉亲和素包被的磁球进行筛选的方法（其他方法参见Rader et al.，2001）。目的克隆的回收策略应以所选用的淘选方案和目的配体的特性而定。在多种可选方案中，我们比较了几种常用的回收策略，包括降低pH法、固定肽库的胰蛋白酶消化法以及可溶性抗原竞争法等。当要选择应用某种方法时，必须了解这种方法可能对欲回收结合体的影响。降低pH会解离大多数甚至全部结合体，而不管其与靶抗原结合是特异的或是非特异的，而胰蛋白酶作用于蛋白质和基因Ⅲ的融合区，使其特异性地断裂，因此，只有与蛋白质结合的噬菌体才能得到回收。相比之下，可溶性抗原法可以得到相对较高亲和力的特异性结合体，因为这是一种竞争洗脱方式。
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我们建议根据经验选择最适宜的方法。对于降低pH的方法，我们经常使用50μl 100mmol/L的甘氨酸-盐酸（pH2.2）作用10min，然后利用3μl 2mol/L的Tris碱中和。胰蛋白酶法则使用200μl新鲜制备的10mg/ml胰蛋白酶溶液，然后在37℃下温育。抗原洗脱法我们经常把50～100μg 非生物素化的目的蛋白溶液（用1×PBS稀释）作为竞争性结合体，混合后，在37℃下培养30min。
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1.准备扩增筛选到的噬菌体时，首先准备侵染用的细菌培养物。经常选用在文库转化时使用的电转感受态细菌。在筛选前，取5μl，-70℃保存。
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2.向一个含5mlSB培养基＋四环素（10μg/ml）的15ml聚丙烯管中接种5μl电转感受态细菌，37℃，250r/min振摇培养1.5～2.5h，直至OD600约为1。
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3.把100μl PEG沉淀的噬菌体重悬液与5～10μg生物素化的目的蛋白混合（按Dynal 手册，根据方案中应加入的磁球量估计需要的蛋白量）。加入10μl封闭缓冲液，加1×PBS至总体积为200μl。37℃温育并混合2h（翻转）。
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4.用封闭液洗涤1mg Dynabeads（100μl）3次以除去防腐剂。简言之，分装100μl磁球到一个Eppendrof 管里，把它放在Dynal 磁性支架上。放置2min使得Dynabeads紧靠磁体。吸出液体，用200μl封闭液洗涤。重复3次。留下最后的200μl封闭液与磁球，在室温下混合1h。
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5.此时，准备用于滴度测定的噬菌体。向180μl SB中加入20μl噬菌体重悬液进行10倍稀释，随后继续系列稀释至10-6、10-7和10-8。
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6.从磁球中除去封闭液，利用生物素化蛋白/噬菌体溶液重悬Dynabeads，37℃下温育并混合30min。
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7.用200μl 1×PBS/0.5%吐温-20洗涤Dynabeads 5次。将Eppendrof 管放置在Dynal 磁性支架内，一旦磁球被吸住后，吸去液体。加入200μl洗涤液，轻轻混合，重新放置到磁性工作台内，除去洗涤液，重复5次。
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在随后几轮的筛选中，可以加大洗涤的次数和力度以除去更多的非特异性和弱亲和力的结合体。
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8.最后一轮淘洗后，用适宜的洗脱液重悬Dynabeads：生物素化蛋白—噬菌体复合体（无论是用低pH，或胰蛋白酶，或可溶性抗原洗脱），37℃温育并混匀10～30min。
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9.利用磁性支架从磁球中移出洗脱液，用此洗脱液去感染细菌，扩增筛选到的噬菌体。
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10.把噬菌体溶液加到2ml准备好的细菌培养物中，室温温育15min。
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11.向其中加入6ml预热（37℃）的SB、3.2μl 50mg/ml羧苄青霉素、16μl 5mg/ml四环素，然后将培养物转移到一个50ml聚丙烯管中。
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12.对于产出噬菌体滴度测定，取出20μl样品加入到180μl SB中，以1∶10、1∶100、1∶1000的稀释度铺制平板（从第一个1∶10稀释度中依次稀释20μl到180μl SB中，来达到1∶100、1∶1000 的稀释度）。将8ml培养物在37℃下，250r/min振摇培养1h。
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13.同时，投入的噬菌体开始感染细菌。分别加2μl 10-6、10-7和10-8稀释的噬菌体重悬液到各自含有98μl预制的细菌培养物的Eppendrof 管中。室温温育15min。
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14.用50μl投入噬菌体和100μl产出噬菌体铺制含有羧苄青霉素的LB平板，37℃温育过夜。计算投入和产出噬菌体：
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投入滴度（cfu/ml）=集落数×（1/稀释度）×1000
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产出滴度（cfu）=集落数×（培养物体积/铺制平板体积）
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确定投入和产出滴度可以评价文库筛选效率。在大多数情况下，投入噬菌体的滴度在每轮都是一致的。然而产出噬菌体的滴度则依赖于文库中存在的特异性噬菌体的数目和它们的回收效率。理论上，原始文库只含有一少部分特异性结合体，所以产出率很低。随着每轮的筛选，在文库中的特异性噬菌体的数目应增加（富集），产出噬菌体数目也会增加。因此，计算投入/产出滴度是检验文库筛选效率的简单方法，如果显示有不断增加的产出是很有帮助的。
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15.8ml培养物温育1h后，加入4.8μl 50μg/ml的羧苄青霉素，37℃，250r/min振摇培养1h。
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16.向这8ml培养物中加入1mlVCSM13辅助噬菌体（1012～1013pfu），再加入91ml预热的含有92μl 50μg/ml羧苄青霉素和184μl 5mg/ml四环素的SB至总体积100ml，转移至250ml的无菌锥形瓶中。37℃，250r/min振摇培养2h。
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17.加入140μl 50mg/ml卡那霉素，以37℃，250r/min继续振摇培养过夜。
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18.利用上述方法用PEG沉淀，继续筛选3～6轮。具体应筛选的轮次依赖于筛选策略、蛋白质的相互作用、洗涤力度和肽库大小。
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阶段3：结合分析
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筛选后，每轮筛选都应进行分析来评价结合体的富集度。为了做到这一点，每轮得到的PEG沉淀的噬菌体都可以用基于ELISA或流式细胞仪的检验方法来测定富集度。检测应该包括从最初没进行筛选的噬菌体到最后一轮筛选的噬菌体。用来评价整个噬菌体文库的方法也可以用来评价从某轮中筛选出单克隆的噬菌体。合适的筛选轮次应该是得到的文库表现出最好的与蛋白质相互作用相关的结合特性（或在检测中具有最佳的信号）的那一轮。这部分主要介绍基本的ELISA分析策略。
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1.用25μl以包被缓冲液（依赖于蛋白质，例如，1×PBS或0.1mol/L NaHCO3，pH8.0）稀释的适宜蛋白包被酶标板。包被的蛋白质的浓度应为0.5～5μg/ml。Anti-M13抗体也应以5μg/ml平行包被。这样可以确定在样品中噬菌体的水平。用Linbro plate sealer 封板，4℃温育过夜。
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2.弃掉包被液，每孔加入150μl封闭液。用Linbro plate sealer 封板，37℃温育1h。
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3.弃掉封闭液，以1∶5直至1∶10的稀释度每孔加入50μl 噬菌体样品。37℃温育2h（所有的噬菌体都利用1%BSA/PBS缓冲液稀释）。要设立复孔以检测样品对于所有包被蛋白，包括Anti-M13的亲和力。
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4.弃掉噬菌体溶液，用1×PBS/0.05%吐温-20洗涤酶标板5次。洗涤缓冲液要充满整个孔。
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5.用1%BSA/PBS 以1∶3000稀释HRP-标记的anti-M13抗体。每孔加入50μl稀释好的二抗，室温温育1h。
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6.用上述方法洗涤酶标板，加入50μl TMB过氧化物酶底物体系（Kirkegaard and Perry Laboratories，Gaithersburg，Maryland）显色。
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7.根据信号强度在适当的时间点，用酶标仪读取405nm处的光密度值。当信号很强且背景信号可以忽略时，加入50μl 1mol/L H3PO4终止反应。反应终止后，在450nm处读板。
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8.用ELISA（例如，相对最高OD值）或其他的结合分析方法，在比较亲和力的基础上确定筛选的最佳轮次。利用上述方法分析单克隆。从评价投入产出数目的测定滴度的平板上挑取单克隆，接种至5～100ml含50μg/ml羧苄青霉素SB中。
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9.根据培养物体积的不同，37℃下培养单克隆4～8h，并以可比的体积加入辅助噬菌体（加入的体积参照本章淘洗过程中扩增那一步）。
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10.2h后，加入卡那霉素至终浓度70μg/ml，37℃，250r/min振摇培养过夜。
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11.按照使用的体积，如上所述，以PEG沉淀培养物（参见本章：聚乙二醇沉淀），进行分析。
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确定阳性克隆后，可以进行大规模的制备。为在E.coli 中制备没有基因Ⅲ片段的可溶性蛋白，必须将单克隆转入其他非抑制型E.coli 菌株中。利用pComb3X（图8.6）上的琥珀（amber）终止密码子，产生可溶性蛋白。具体产生可溶性蛋白的方法参见Barbas等（2001）。
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图8.6 详细的pComb3X克隆位点
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致谢
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这一章节是在原章节的基础上改编的，原章节只是更完整的关于丝状噬菌体生物学和各种噬菌体展示技术应用开发著作的一部分（Silverman，2001）。关于噬菌体展示技术的背景知识和方法的更详细的介绍，读者可以参阅这本书。
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参考文献
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9 在出芽酵母中鉴定蛋白质—蛋白质相互作用的遗传学策略
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前言
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为什么使用遗传方法
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像任何实验方法一样，抑制基因分析既有优点也存在缺点。其中一个优点就是整个过程内在的、固有的生理学特性，不存在像酵母双杂交中那样的人为的基因融合或蛋白质被迫在细胞特定部位的聚集。此外，由于所有的反应发生在细胞内，不存在由于提取制备或体外结合实验导致的假象。但如果目的是得到与某一特定靶标直接作用的蛋白质，选择遗传途径就可能存在一些问题。比如，抑制基因可以在远离特定靶蛋白的好几个步骤的上下游甚至完全独立于靶蛋白的另一个通路中发挥作用，这种特性对于整个通路的研究固然十分有用，但如果目的仅仅是寻找特定靶标的直接作用因子，上述特性反而会成为失败的原因。另外，抑制基因分析成功的关键是在靶蛋白上选择正确的突变位点。有些位点可以奏效，但另外一些位点，无论做多大努力，都不会发挥抑制作用。通过突变位点的仔细选择以及下面将要介绍的第二次筛选实验的慎重使用，这些担心可以被尽量减少。图9.2是抑制基因搜索的流程图，图中列出了需要考虑的基本问题，后面的章节有每一步的详细说明。
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图9.2 抑制基因搜寻流程图
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程序纲要
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抑制基因搜寻的准备
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表型的选择
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表型常选用两种方式：选择和筛选。可选择的表型使用生存和死亡来分别区别野生型和突变型。比如靶基因上的某种突变在特定生长条件下可以导致细胞死亡（图9.3A）。在试验条件下，这个突变的一个抑制基因可以使细胞恢复生长。因此只有生长的个体才是我们感兴趣的。这种策略可以很方便地对大量候选突变迅速进行检测。第二种通用的表型分析是筛选。与选择不同，筛选过程中必须对每一个个体进行检测以确定是野生型或突变型。举例来说，特定培养/生长条件下，原始突变可以导致细胞出现形状异常（图9.3B中的空心集落），而抑制基因/突变可以将形状恢复成野生型（图9.3B中的实心集落）。尽管比较费时，筛选已被证明在线虫、果蝇以及酵母中还是十分有用的。像大多数遗传策略一样，抑制基因搜寻最后总是归结为检测集落数的多少。因为用一种选择性的方案可以检测更多的单个集落，因此发现稀有抑制基因的可能性就越大。因此只要可能，就推荐使用选择性方案以节省时间和充分利用该系统。
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图9.3 抑制基因分析的突变表型
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靶等位基因的选择
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为提高抑制基因搜寻成功的机会，开始时选择合适的靶等位基因至关重要。由于最终的目的是鉴定直接与靶标相互作用的蛋白质，那些缺失性的或会导致蛋白质明显缩短的突变应该避免。相反，那些改变蛋白质—蛋白质相互作用结构域（如卷曲的卷曲区，螺旋—环—螺旋）的突变应该优先考虑。特别地，像冷、热敏性条件突变也已被成功采用。无论选择什么突变位点，突变蛋白质的存在最终都应该通过Western Blot验证。使靶蛋白极端不稳定的突变将使分离获得相互作用抑制基因的机会降低。
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在基因组时代，许多基因都是通过目的基因的基因家族的同源性分析而不是经典的抑制基因搜寻来确定的。那么我们如何才能构建一个理想的突变体以作为抑制基因寻找的出发点呢？David Botstein及其合作者通过用Ala取代肌动蛋白中的簇集的带电氨基酸，可以以较高频率发现条件突变基因（Wertman et al.，1992）。该方法的依据是：那些高度带电的区域很可能暴露在蛋白质的表面而不是被包埋在蛋白质的内部，而这些暴露在外的氨基酸残基可以通过其带电侧链与其他蛋白质相互作用。上述方法也被成功用来研究那些不具高度有序结构的蛋白质（Diamond and Kirkegaard，1994）。因此应该首先对目的蛋白质进行目测，确定簇集的带电氨基酸（平均5个氨基酸中有3个带电），一旦确定，通过常规寡核苷酸介导突变即可用Ala取代所有的带电氨基酸。然后，检查突变位点在正常条件下的活性以及其热敏（ts）或冷敏（cs）特性，选择那些表现为严格的条件突变行为的位点用于下一轮的分析。
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表型阈值的确定
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通常情况下，一个突变表型的抑制总是不完全的。因此最好用能够提供最敏感的起始条件进行抑制分析。比如，如果使用ts敏感位点，每次将温度降低0.5℃然后重新检查表型。最后选择可以提供的工作表型的最低温度。这样可以提高那些只导致温和抑制的第二次突变被发现的机会。然而如果阈值设定得过低，最终可能会得到大量非特异的抑制基因。因此，如果得到了许多抑制基因（比方说50个以上），应选择最强的抑制基因进行下一步的分析。对于温敏位点，只要简单的升高温度即可鉴定那些当目的蛋白质逐渐失去活性时仍能发挥作用的抑制基因。除了支路（bypass）抑制基因（见下文）外，上述方法总是有效。如果靶突变不是条件性突变，选择一个较强的位点，然后或者重新分析已经鉴定的抑制基因或者重新开始。
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抑制基因搜寻的实施
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高拷贝抑制基因
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通过提高基因剂量、使用强的异源启动子、提高与突变靶标结合的蛋白质的浓度等可以实现高拷贝抑制。高拷贝抑制的原理是靶蛋白上的一个突变使其结合另外一个蛋白质的能力降低从而导致突变表型的出现。而第二个蛋白质浓度的提高可以弥补这种亲和力的降低（图9.1）。与下面将要介绍的突变相比，高拷贝抑制有3个优点。首先，尽管同样需要精心选择靶位点，但只需要进行一次酵母细胞的转化即可开始分析。其次，通过重新转化大肠杆菌，文库质粒可以得到恢复，这样可以迅速鉴定提供抑制物活性的基因。最后，只要含有酵母表达和质粒维持的元件，文库可以来源于任何有机体。如果在酵母中建立了一种异源表达系统，这一优势尤其重要（见下文）。正是由于具有以上优点，高拷贝抑制系统通常都是抑制基因搜寻的首选。
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载体的选择
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高拷贝抑制体系中需要相互作用的蛋白质被高表达，有两种方法可以达到上述目的。首先，酵母基因组的随机片段被插入到含有2μ复制起始子但却没有着丝粒的载体中（一个着丝粒将大致使质粒拷贝数降低到一个），这样的质粒其每个细胞中的拷贝数目将达到20～30个（Nelson and Fangman，1979），许多还具有合适的克隆位点和选择标志（Christianson et al.，1992）。与其他缺少着丝粒的高拷贝质粒系统（如Yrps，Strch et al.，1986）不一样，这些质粒可稳定传代。如果插入片段大小在8～12kb，连接效率达到85%以上，4000个左右独立的克隆即可覆盖所有基因。如果需要表达异源cDNA，GALSET质粒系列（Enomoto et al.，1998）则是高拷贝质粒骨架的一个很好的选择。除了提供高拷贝质粒，使用强的启动子如GAL1等也可增强表达（Johnston and Davis，1984）。该启动子可以被培养基中的半乳糖诱导，被葡萄糖抑制。对于一些更高等有机体，随着基因组的复杂性的增加，得到功能性的融合基因的效率会降低，因此，如果构建高等有机体GAL1-cDNA文库，就需要分析更多的独立克隆（大约100000到1000000）。
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突变诱导的抑制基因
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在标准的抑制基因搜寻方案中，通常使用包含靶突变的单倍体菌体来恢复隐性的失活等位基因，但是如果研究的最终目的是鉴定相互作用的蛋白质，应该使用含有靶突变的纯合二倍体菌体。二倍体的使用将确保抑制基因成为显性的、功能性的等位基因，它们即使在野生型等位基因存在下，也能发挥功能。许多不同类型的诱变剂如化学物质、紫外线等被用来提高酵母细胞的突变率。在实验方案部分，乙基甲烷磺酸（EMS）的诱变过程有详细介绍。使用EMS可以使突变频率提高到10-3，而酵母菌的自发突变频率只有约10-6。不管选择什么诱变剂，抑制基因的实际搜寻过程完全一致。检测的存活克隆的数目则依赖究竟是使用筛选还是选择策略（见下文）。
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抑制基因搜寻的实施
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如果使用选择策略，转化子或诱变后的存活子可以以每板大约5000～10000个的较高密度进行铺板。但如使用筛选策略，则每板只能铺大约400个克隆形成单位cfu。究竟需要多少比例的转化反应才能达到上述两种不同数字，则需根据经验决定。由于诱变剂一般会降低细胞的生存能力，在开始抑制基因搜寻实验之前，还应事先确定诱变后的培养物的铺板效率。不仅如此，在铺板过程中也应非常小心。良好的克隆间距可以使整块平板直接被复制到表型分析培养基上，而不必非常费时地用牙签挑取克隆制作母板。如果仍然需要制作母板，可以采用如图9.4所示的两种形式。每次筛选的克隆数目受许多因素的限制，但是通常是5000～10000个。最后，如果使用报告质粒表达表型，必须通过经典的顺反试验来进一步确定所得到的抑制基因是由高拷贝文库/宿主突变还是报告基因自身的改变等所致。报告基因的突变与真正的抑制基因表现一样，可以抑制突变表型，表现为显性。因此必须通过在非选择性培养基如YPDA上培养酵母以剔除突变的报告质粒，最后再重新转化未突变的报告质粒。
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图9.4 酵母母板。两个平板示意如何产生母板用于抑制基因筛选
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抑制基因的分析
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如果目的是鉴定与靶蛋白直接相互作用的蛋白质，抑制基因通常具备以下特点：（1）新突变或高拷贝质粒将无法抑制靶基因上的无效位点。（2）抑制作用是位点特异的。
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第一个特点是绝对必需的，该条件要求在两种不同类型抑制基因产生野生表型之前靶蛋白必须存在于细胞中，通过基因替换破坏靶基因可以检测该条件（Rothstein，1991）。对高拷贝抑制基因，只要重新将获救质粒转化到含有无效突变位点的靶基因的细胞中即可确定。那些在无效突变存在下仍然能够发挥功能的抑制基因，通常是靶基因下游或与靶基因无关的基因。如果无效突变是致死的，必须通过引入带有野生型等位基因、以URA3或LYS2为选择标记的质粒来恢复致死突变。质粒转化以后，染色体上的靶基因就会被破坏。为验证抑制基因是否对无效位点发挥作用，只要将细胞分别转到含有5-荧光乳酸（5-FOA）或氨基乙二酸的培养基即可，5-FOA或氨基乙二酸分别是带有URA3或LYS2基因的质粒的抗性选择剂（Boeke et al.，1984；Zaret and Sherman，1985）。在没有野生型靶基因的情况下，细胞仍能生长说明分离到的是一个旁路（bypass）抑制基因。这种抑制基因，对于整个研究也许有用，但这些抑制基因通常情况下都不是相互作用的蛋白质。
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第二个条件位点特异性是判定直接相互作用抑制基因的根本标准。位点特异性意味着抑制基因上的改变可以特异性地弥补靶蛋白上的突变。通过突变基因的简单测序确定突变位置，并界定两个蛋白质的相互作用结构域，这点尤为重要。对于抑制基因突变，有必要与另一个不同的靶位点公转化来进一步确定。对高拷贝抑制基因，位点特异性与直接相互作用之间的联系就不太好证明了。然而，向一个带有不同突变的细胞中转化含有抑制基因的质粒，也可非常简单地对高拷贝抑制基因的位点特异性进行检测。
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异源体系
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合成表型
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根据外源靶基因，可有两种策略在酵母中建立一种遗传体系即失去或得到功能。失能方法需要在酵母中确定有异源的目的蛋白质的功能性同源物。酵母基因组全序列的测定提供了所有的开放阅读框架。如果确定了在酵母中存在一个潜在的同源物，与之有关的文献信息可以从两个极好的网址获得，这两个网址是酵母基因组数据库（SGD：http：//genome-www.stanford.edu/Saccharomyces/）和酵母蛋白组数据库（YPD：http：//www.proteome.com/databases/index.html）。可以按照上面介绍的方法，考察这种酵母同源物的表型是否适合用于抑制分析。如没有明显的同源物存在，可以采用另一条途径来鉴定与目的蛋白质具有相似功能的酵母蛋白质。该方法是根据十几年前的一种合成的致死性筛选模型的修改而来（Krandz & Holm，1990；Bender & Pringle，1991）。简单地说，该策略涉及鉴定一种酵母突变，该突变必须使目标靶基因对酵母的生长成为必需基因。这种方法有助于鉴定那些使用现存算法还无法从数据库中得到足够序列相似性的功能性同源物。与其他方法相比，以上方法比较费时并且成功机会最小。因此，只有在使用所有其他方法都失败时，才可考虑使用这种策略。一旦序列比较确定了一个可能的同源物，这种相似性的生理学意义就可通过对酵母基因进行突变并对期望的表型进行分析来探索。比如，如果靶蛋白参与离子的内稳态，对应的酵母突变体就有可能对培养基中的过高或过低的钙离子比较敏感。哺乳动物中与之相对应的基因的互补突变将进一步证明这两个蛋白质是功能性的同源物。当然即便是紧密相关的蛋白质，跨物种的互补也并不总是有效。
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另一条可以采取的路线就是使用异源启动子高表达目的基因以产生一种表型。有许多载体和启动子可以用来在酵母中表达外源基因（有关综述参见Buckholz，1993）。由于靶基因的过表达可能导致细胞死亡，因此使用像半乳糖代谢途径的GAL1或GAL10这样的条件启动子可能是最佳选择。死亡本身并不能提供多少有用信息，但至少可以为抑制基因分析提供一种可资利用的强表型。
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方案
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方案1：诱变
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材料
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缓冲液和溶液
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分子克隆手册：蛋白质—蛋白质相互作用
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酵母菌株
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酵母宿主菌
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方法
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1.接种25ml的酵母培养物到合适的培养基中。如不需要维持质粒，应使用丰富培养基（如YPDA），这样细胞会生长达到较高的密度。如需进行质粒选择以仔细描述靶表型，应使用添加有所需氨基酸或核苷的合成葡萄糖培养基SD。
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有关酵母菌的维持和增殖的一般性指导，有参考文献（Sherman 1974#306；Burke et al.，2000），应事先查阅对半乳糖响应的启动子的诱导，在非抑制但不是非诱导条件下，应用2%的棉籽糖取代，通过向培养基中加入1%的半乳糖可以活化这些启动子。
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2.在合适温度下，振荡培养接种物2d。培养物一定要生长达到饱和，这样群体中才只有很少数（＜5%）出芽细胞，这一点十分重要，因为单纯母体而不是芽体的突变会掩盖集落的任何表型。离心（6000g）收集细胞，以1×培养体积的0.1mol/L的磷酸钠盐（pH7.0）缓冲液洗涤一次。
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3.1/10培养体积的磷酸钠盐缓冲液重悬细胞。如果使用筛选策略，轻微超声分开细胞（最小挡，50%负载循环，30s）以保证集落来源单一细胞。将制备的培养物转移到一个25ml的烧瓶中添加0.05ml的EMS，在化学通风橱中的旋转台上轻轻摇动烧瓶3h。
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4.取0.1ml诱变过的培养物，加9.9ml5%硫代硫酸钠和0.1mol/L的磷酸钠盐（pH 7.0）终止EMS的作用。处理好的样品可以直接铺板，4℃保存1周活性也不会明显降低。如果需要，向剩余的培养物中加100ml硫代硫酸钠以终止EMS的作用，4℃保存备用。然后进行表型筛选或选择。
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方案2：酵母菌总DNA的制备
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材料
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缓冲液和溶液
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分子克隆手册：蛋白质—蛋白质相互作用
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酵母菌株
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酵母宿主菌培养物（见前面的方法）
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专门设备
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玻璃珠（0.5mm）
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方法
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1.在15ml用于质粒维持的培养基中培养过夜（如果合适）。
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2.离心（6000g）收集细胞，用1ml的H2O重悬，悬浮物转移到微量离心管中。
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3.加1×细胞沉淀物体积的0.5mm的玻璃珠，0.2ml的YRLB，0.2ml的PCI。
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4.剧烈涡旋振荡2min，加0.3mlYRLB，0.2mlPCI，重新涡旋振荡。
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5.12000g离心5min。
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6.取出液相，用0.4mlPCI抽提，收集液相。
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7.加0.8ml100%的乙醇，室温孵育15min。
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8.离心10min，0.5ml70%的乙醇洗涤。
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9.晾干的细胞重悬于100μl的H2O。
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为拯救可能的高拷贝抑制基因，取1～2μl总DNA制备物转化感受态大肠杆菌。
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方案3：酵母菌的转化
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有关出芽酵母的高效转化，已有几个非常好的方法，最详细的是由Gietz及其合作者提供的。
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（http：//www.umanitoba.ca/faculties/medicine/biochem/gietz/Trafo.html）
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参考文献
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10 研究蛋白质相互作用的FRET显微成像技术
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前言
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GFP：对分子和细胞生物学的影响及在蛋白质相互作用研究中的应用
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自从水母Aequorea victoria（Prasher et al.，1992）中发现并克隆了绿色荧光蛋白（GFP）以来，GFP在基因功能及蛋白质—蛋白质相互作用研究中得到了广泛的应用。在从追踪蛋白质的空间和时间行为到利用GFP及其衍生物的光物理特性进行定量分析的应用中，GFP被广泛用作生物活性/过程中及蛋白质相互作用的指示剂或传感器（相关综述，可参阅Wouters et al.，2001）。
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GFP是一种内源性荧光蛋白质，不需要其他辅助因子或底物，这一特性使GFP在作为遗传编码的报告标签方面极为有用。因此，GFP在胚胎基因表达分析和完整器官外源调节（基因捕获），或组织特异启动子调控（Chalfie et al.，1994；Moss et al.，1996）研究中具有极高的应用价值。GFP也可用于融合蛋白的亚细胞定位（Chalfie et al.，1994；Moss et al.，1996；Arnone et al.，1997），器官特异定位信号与GFP突变体融合，可将GFP定位在内质网、高尔基体（Dayel et al.，1999）、线粒体（Niwa et al.，1999）及质膜（Okada et al.，1999）上。此外，根据GFP的光物理特性，还可用做胞内生物活性传感器。例如，检测激发态反应时，即荧光共振能量转移（FRET），GFP可用做蛋白质接近度的指示剂。目前，GFP已用于钙离子敏感性结构的研究（Miyawaki et al.，1997，1999），用做cAMP（Zaccolo et al.，1999）或cGMP（Honda et al.，2001）的传感器，蛋白酶底物分析（Heim and Tsien，1996；Mitra et al.，1996；Xu et al.，1998；Mahajan et al.，1999），以及检测多种蛋白质间的相互作用（Day，1998；Mahajan et al.，1999）。另外，GFP和Cy3的FRET测定已用于细胞生物过程成像，如胞内及跨膜蛋白的磷酸化过程（Ng et al.，1999；Wouters and Bastiaens，1999；Verveer et al.，2000）。本章中，我们将详细介绍显微FRET成像实验的几种方法。
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荧光共振能量转移
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FRET的光物理学原理
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11 绿色荧光蛋白邻近成像法（GFP-PRIM）检测同型蛋白质间相互作用
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前言
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FRET检测同型蛋白质间相互作用
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FRET检测中，两种研究蛋白，即典型蓝绿荧光蛋白（typically cyano fluorescent protein，CFP）与荧光供体、典型黄色荧光蛋白（typically yellow fluorescent protein，YFP）与荧光受体分别融合。如果两种蛋白质相互作用，CFP与YFP的临近作用促使激发态CFP向YFP发生能量转移。能量转移的效率依赖于发色团间的距离及跃迁偶极的相对方位。利用其后复杂的CFP的激发获得降低的蓝绿荧光、黄色荧光发射比率，从而可检测到能量转移（见第10章）。利用FRET可以更容易的检测到异型蛋白质间的相互作用。如果分别用CFP及YFP标记的两种蛋白质之间存在稳定的相互作用，并具有高亲和力，则形成的每一个复合体将包含邻近的荧光供体及受体［图11.1A］。因此，若CFP与YFP间隔适当，所有的异源蛋白相互作用都可产生FRET信号。相反，如果将两种可形成稳定和高亲和力同源二聚体的蛋白质（分别用CFP和YFP标记）共孵育，在形成的复合体中将有50%发生荧光供体及受体的临近作用［图11.1B］。其余50%的相互作用不产生FRET（CFP/CFP或YFP/YFP）。
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图11.1 比较应用FRET检测异型及同型蛋白质—蛋白质相互作用
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GFP-PRIM检测同型蛋白质间相互作用
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近来，我们报道了利用GFP标记蛋白质可提供关于蛋白质寡聚状态的线索（De Angelis et al.，1998）。在这些试验中我们使用了特殊的变异体——温度耐受性GFP（ttGFP）（Siemering et al.，1996）。ttGFP是将野生型GFP（wtGFP）的两个氨基酸突变（V163A和S175G），在37℃可促进蛋白质的有效折叠和突变，有可能减少wtGFP的聚集趋势（Yokoe and Meyer，1996；Fukuda et al.，2000）。ttGFP在395nm和475nm 处各有一个极大的激发峰（图11.2A）。用这两个峰值波长的光照射蛋白质均可产生GFP的特征绿色发射光（508nm）。在相同的缓冲体系和恒定的温度下，两个激发峰值的比率（R395/475）对于任何单体ttGFP融合蛋白都是相同的。当ttGFP与能发生自身结合的蛋白质融合时，同型寡聚状态下的激发比率与单体状态显著不同，具体情况与附着蛋白本身有关（图11.2B）。PRIM通过研究这些光谱变化以检测ttGFP标记的蛋白质在体内、外自身结合的程度。
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PRIM与FRET的差异
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PRIM与FRET有根本上的不同（表11.1）。利用FRET计算发射比率的改变是通过光谱匹配的荧光供体和受体的量子力学相互作用。CFP与YFP间的有效相互作用可使CFP/YFP发射比率降低；因此临近作用导致的荧光改变是单向的。与此相反，PRIM对一些在395nm和475nm处均有激发峰的GFP变异体是特异的。最近有证据表明PRIM测量出的激发比率的变化是由于两个ttGFP部分间的直接结构相互作用（De Angelis et al.，1998）。在PRIM中，变化是双向的：ttGFP标记的蛋白质间同型相互作用可导致单体R395/475基值升高或降低。虽然需进一步研究以阐明GFP-PRIM升高的确切机制，但仍很容易看到其在检测同型蛋白质相互作用方面优于FRET之处。FRET需用CFP和YFP标记的蛋白，且须有相同的表达水平。更重要的是，只有一半同型蛋白质相互作用会发出CFP-YFP FRET信号，如前述（图11.1）。相反，PRIM中只要有ttGFP标记候选蛋白质的表达即可，且每一同型蛋白质相互作用都可发出信号。
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表11.1 FRET与PRIM间基本差异的总结
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GFP-PRIM能检测给定蛋白质体内、外自身结合程度的变化。GFP-PRIM试验的理想候选蛋白质应可存在两种状态（单体或自身聚合，如形成二聚体或三聚体或四聚体等）且给予刺激后可产生自身结合或解聚。成功的GFP-PRIM试验需两个先决条件：（1）存在可使同型寡聚体解聚为单体的实验条件；（2）不同状态下得到的ttGFP激发比率必须有足够的差异。如满足以上条件，PRIM便可成为检测同型蛋白质相互作用动态的有效方法。以下部分列出了在体外通过光谱荧光计以及在体内通过活细胞激发比率成像进行GFP-PRIM试验的主要步骤。
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方案
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方案1：体外GFP-PRIM：荧光分光光度法测量激发比率
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确定PRIM的动力学范围
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GFP-PRIM观察到的光谱改变不是可预知的：对于二聚体，ttGFP标记的多肽的R395/475值可以上升、下降或者保持不变。结果主要取决于在同型复合体中ttGFP部分的相对方位。为了保证试验成功，可以分别构建感兴趣蛋白质的N端及C端的ttGFP融合并对其分别进行检测。原则上，如果候选蛋白质的一端或两端必须保持游离状态以保持其活性，将ttGFP插入多肽中也是可行的。用分光光度计记录蛋白质溶液在395nm和475nm波长照射后发射的508nm绿光的强度，即可测量蛋白质最终的激发比率。两个强度的比值即为激发比率或R395/475。图11.2所示的激发光谱记录了350nm到500nm的激发波长获得的508nm发射光的强度。
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图11.2 PRIM检测同型蛋白质相互作用
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如果ttGFP融合蛋白的激发比率不同于ttGFP本身，该蛋白质可能会发生一定程度的自身结合。自身结合的程度可通过凝胶过滤色谱这种生化方法确定，它可在自然状态下利用分子量大小分离蛋白质。这种技术也被称作体积排阻色谱或凝胶渗透色谱，已有其理论和实践方面的论述（Stellwagen，1990）。凝胶过滤可达到两个重要目的：（1）使同型寡聚体解聚为单体，从而可分别测量它们的激发比率；（2）可计算ttGFP标记蛋白在单体及寡聚体中的确切比例。将粗提物过柱子，ttGFP标记蛋白的大小和激发比率均可由收集组分的荧光分光光度值决定。当以单体状态存在时，每个检测到的ttGFP标记蛋白都与ttGFP本身具有相同的激发比率。在大多数情况下，同型寡聚体的R395/475值与单体显著不同（De Angelis et al.，1998）。对于一给定的ttGFP融合蛋白，PRIM的动态范围——不同状态间激发比率差别的定量测量——通过将单体的R395/475除以同型寡聚体的R395/475获得（如果结果小于1则取其倒数）。
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知道100%同型寡聚体和100%单体的ttGFP融合蛋白的激发比率后，可通过下列公式计算出R395/475为中间值的混合物中单体蛋白的相对含量：
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R395/475［混合物］=χ（R395/475［单体］）+（1-χ）（R395/475［同型寡聚体］）
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其中χ是单体的相对含量，（1-χ）是同型寡聚体的相对含量。只有当蛋白质仅有一种同型寡聚体状态（二聚体或三聚体）时才可这样计算。更大的动态范围可以更准确地计算出处于不同状态的ttGFP融合蛋白的比例。这样，就可通过荧光分光光度计测定蛋白质在试验物质刺激后自我聚合或解聚的动力学变化。
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激发比率对其他变量的灵敏度
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wtGFP的激发比率会随温度、pH、离子强度等发生变化（Ward et al.，1982）；ttGFP也是如此。虽然在特定样品的测量过程中参数不会出现很大变化，但需注意保持不同样品间参数的统一。
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更重要的一点是，在特定的照射条件下，ttGFP会发生光异构作用。表现为在第一个激发峰处强度下降，第二个激发峰处反而增加，导致激发比率随时间逐渐降低。紫外范围的光有特别强的致光异构作用，即使在倾向性较低的395nm峰处激发也是如此（Cubitt et al.，1995）。这种现象可通过以下方法予以减弱：（1）降低激发光强度；（2）减少激发时间（读值间歇停止激发）。如不能实施以上方法，试验样品的激发比率改变必须用同样激发条件下未发生自身结合的对照样品来进行校正。这样可区分光异构作用及自身结合所导致的激发比率的改变。
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试验对照、假阴性及假阳性
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不论实验所用样品为纯化蛋白或为粗提物，GFP-PRIM试验中都应包含对照样品。将ttGFP置于与ttGFP融合蛋白相同的溶液环境中，不应出现激发比率的改变。如有可能，还应包含ttGFP与不能寡聚化的蛋白突变体形成的融合蛋白；这种蛋白的R395/475不应变化。另一阴性对照将ttGFP标记的蛋白置于失活的寡聚化试剂中。这种阴性对照对于校正光异构体对激发比率的影响是必需的（前面已讨论过）。也应实施ttGFP标记和未标记多肽之间的竞争。增加未标记蛋白量以诱导自身结合应导致PRIM信号的进行性降低。
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即使ttGFP与ttGFP标记蛋白的激发比率相似，也不排除形成同型寡聚体的可能。如果同型复合体中的ttGFP亚单位之间相距太远以致不能相互作用，或它们的相对方位使它们之间的结构性相互作用不能产生PRIM信号，则会出现假阴性。分别对C端和N端ttGFP融合蛋白进行检测以最大限度减少假阴性。
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假阳性尚未发现，但在理论上是可能存在的，因为PRIM信号的产生需要一定的结构（相对于光谱）。可以想像ttGFP融合蛋白中连接蛋白的一部分回折至ttGFP表面，这样激发比率的变化是由分子内（连接蛋白与ttGFP间）而非分子间（相邻ttGFP融合体间）产生。
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高浓度时，纯化的wtGFP有形成特异二聚体的趋势（Ward et al.，1982；Palm et al.，1997）。在含有V163A点突变的所谓GFP“折叠”突变体（如ttGFP）中，这种二聚化趋势减少了（Yokoe and Meyer，1996）。Ward及其同事在他们的开创性工作中报道了高浓度wtGFP激发比率升高的现象。有趣的是，与特定蛋白质（如谷胱甘肽转移酶GST）融合诱导的ttGFP临近作用也会导致单体激发比率增高。因此ttGFP在ttGFP-GST二聚体中的相关几何构象可能类似于高浓度下或在一些晶体结构中所见的特异wtGFP二聚体（参见Yang et al.，1996）。但是，ttGFP与其他二聚化蛋白融合会使R395/475降低（例如ttGFP-FKBP；图11.2）。这种完全相反的光谱学行为表明两个ttGFP分子邻近形成的特异二聚体并不一定与高浓度wtGFP时形成的类似。尽管ttGFP形成特定二聚体的趋势低于wtGFP，但仍应保持各次测量间蛋白质浓度的恒定以避免对R395/475值的真实变化产生影响。
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方案2：活细胞GFP-PRIM：同型蛋白质相互作用成像
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材料
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仪器
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计算机及图像采集和分析软件（Metamorph/Metafluor 3.0software，Universal Imaging）
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二向色镜和带通滤片组合器用于捕捉ttGFP在410nm和470nm激发波长下发射的绿光（分别为500DCXR和HQ535/550，Chroma Technology）
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试验槽，配有温控器（Medical Systems Corp.）
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光源，可发射计算比率所用波长，结果可耦联至显微镜（多彩Ⅱ光栅单色器，配有50W 氙灯，Till光子仪）
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低光水平照相机（Pentamax 521EFT 框转移照相机，配有纤维耦联Gen Ⅳ图像增强器；Princeton 仪器冷却的12-bit EEV 37电荷耦联设备芯片）
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显微镜（Zeiss Axiovert 135TV）
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细胞高水平的自发荧光使完整细胞的透明小容器分析变得复杂，它可干扰甚至掩盖PRIM信号。并可妨碍荧光分光光度法对活细胞内的自身结合程度的精确测量。在单个活细胞内可通过激发比率成像分析ttGFP标记蛋白间的同型相互作用的时空动态变化。体内邻近成像试验使用荧光分光光度计，与体外试验在概念上相似：两者的ttGFP标记蛋白的激发比率在加入刺激物后都被跟踪一段时间。利用显微镜，可综合其他有关活细胞内同型相互作用亚细胞定位的信息。
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显微镜中的光路比荧光分光光度计更为复杂：光需先通过位于样品前、后的多个透镜组，然后才形成可被数字化捕获、贮存和分析的图像。物镜的球面和光学偏差需要校正。光源需要为整个视野提供平面的和均匀的照明。有关激发比率成像系统的深入讨论超出了本章的范围，读者可参考有关这方面更详细的评述（Bright et al.，1989；Dunn and Maxfield，1998；Silver，1998）。
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方法
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记录活细胞激发比率
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12 质谱表征多元蛋白质复合物
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前言
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两个复合物研究例子的背景介绍
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TTR∶RBP复合物
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在血浆中，RBP是视黄醇（维生素A）的特异性载体，负责将其从肝中的存储地转运到目标细胞的表面（Kanai，1968）。第二个蛋白质TTR参与甲状腺素的转运并与RBP形成复合物（Peterson and Berggard，1971）。之所以形成复合物是为了防止RBP及其结合的视黄醇在肾小球中被过滤掉（Raz，1970）。TTR∶RBP复合物在许多生物体中被鉴定，包括人（Kanai，1968；Peterson，1971）和鸡（Mokady and Tal，1974）。这些生物的RBP和TTR的分子量分别为21kD和55kD。TTR由四个相同的亚基组成。TTR∶RBP的亲和力（一般在1.1×10-7～1.5×10-7mol/L之间）在不同生物中基本相同（Kopelman，1976）。但是，蛋白质组装的早期研究提供的该复合物的化学计量学数据相互矛盾：一组认为在含有4分子TTR的复合物中，只有1分子RBP（Kanai，1968；Peterson，1971；Raz，1970），另一组认为含有4分子的RBP（van Jaarsveld，1973）。包括凝胶过滤、电泳、圆二色谱在内的研究实验表明，1mol/L人TTR最多可结合1.35mol/L RBP，且蛋白浓度最高只能到20mg/ml，溶液pH只能为7.0（Heller and Horwitz，1974）。在不同实验条件下的荧光极化研究表明，不多于2分子人RBP或者最多4分子鸡RBP能分别结合到相应的TTR上（Kopelman，1976）。
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MtGimC
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MtGimC是嗜热甲烷菌Methanobacterium thermoautotrophicum 的分子伴侣，能抑制非天然蛋白质在体外凝聚并使它们稳定以便进一步折叠（Leroux，1999）。MtGimC由两个不同的亚基组成：MtGimα和MtGimβ，其分子量已知。在当时的质谱实验中，复合物的精确化学计量学或亚基排布并不知道。
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程序纲要
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制样与样品导入
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本分析成功的关键是在合适的缓冲溶液中制备蛋白质复合物。先用Centricon过滤器（Amicon）除去小分子和污染物，也可以用PD-10（Pharmacia）或 biospin柱（Biorad）。最好用挥发性缓冲溶液配制成pH 6～8的样品溶液。蛋白浓度一般为5～20μmol/L，用量为1～2μl。许多生化常用的缓冲试剂和添加剂对电喷雾有不良影响，最好不要使用，如毫摩尔级（mmol/L）NaCl、CaCl2、黏性强的甘油或多元醇等。挥发性的缓冲试剂如Tris和乙酸铵、添加剂DTT、巯基乙醇和EDTA可以在毫摩尔浓度级。
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将含有蛋白质的溶液从合适的纳流毛细管中导入质谱仪也是实验成功的关键。纳流针一般是用微拉器将硼硅玻璃毛细管拉制而成，并经喷溅涂覆系统在表面镀上厚约50nm的金。可以买到各种纳流毛细管。锥形针尖的毛细管一般用于有机体系的蛋白质或多肽测序。对于蛋白质相互作用研究，由于溶液的黏性，毛细管的内径需要大些。在显微镜下手工打开电喷雾针并在其背端施加一定的压力，可以获得细喷雾（图12.1）。来自鸡血清的TTR∶RBP复合物的制备和MtGimα、MtGimβ的表达参见文献（Rostom et al.，1998；Leroux et al.，1999）。
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图12.1 纳流电喷雾针将蛋白质样品导入质谱仪。镀金的硼硅玻璃毛细管用热挤出和喷溅制成。
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单个蛋白质及其复合物的质谱
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常规电喷雾方法使用有机辅助溶剂和酸来提高非折叠蛋白质分子的带电荷能力。这些添加剂很可能使蛋白质变性并打破非共价作用，曾观察到溶液中紧密折叠的蛋白质的电荷数大大降低的现象。电荷的减少需要质谱仪比常规四极杆质谱仪有更宽的质荷比扫描范围。因此，选择电喷雾TOF质谱仪。另一个概念是“碰撞冷却（collisional cooling）”，通过它，可以维持大分子离子较低的内能，这对于保持大分子离子为气态是重要的。可以通过与大量惰性气体如氩气发生低能碰撞而实现，实际上这还增加了质谱仪不同部位的压力（图12.2）。高电荷气态离子的能量通过许多低能碰撞转移给中性气体（Krutchinsky et al.，1998）。相反，低压下高能碰撞很少导致大分子复合物解离为单个亚基。碰撞冷却在粒子穿过质谱仪到达检测器的过程中被证明是有效的（Rosmom et al.，2000；Tito et al.，2000）。为了评价大分子复合物在质谱仪中的生存条件，可以用常见的蛋白质如血红蛋白或乙醇脱氢酶来优化条件，使m/z5000处离子强度最大。
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图12.2 Q-TOF质谱仪中不同区域的压力分布（Micromass UK Ltd.）
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在优化的条件下RBP和TTR形成的复合物的质谱见图12.3。所得质量数大于亚基质量数之和。这一结果以及高质量寡聚物质谱宽峰特性很可能是由于反离子或水分子加和引起的。这与实际所测质量数高于计算值的事实一致，在其他系统中也有类似报道（Loo，1995；Nettleton et al.，1998）。为了克服指认这些宽峰电荷数的困难，利用单个蛋白质的已知同位素浓度和小分子分布对质谱图进行高斯分布曲线模拟（图12.3B），这一模拟确定了在多个组分中有10～90个小分子分布，与TTR四聚体中央通道的部分占有率一致（Rostom et al.，1998）。
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图12.3
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常规真空下TOF质谱测定的MtGimα（15698.9kD）、MtGimβ（13862.7kD）质谱证实了它们各自的质量数。而所使用的所有方法都发现MtGimα是以单体形式存在，在优化的实验条件下，有两个系列的离子峰（图12.4）。偶数电荷系列如m/z3200，既可以是单体带5个电荷也可以是二聚体带10个电荷。但是，奇数电荷系列（+9和+11）是二聚体特有的。这些结果表明，在最温和的条件下MtGimα亚基是最常见的，这与交联实验和凝胶过滤实验的结果一致：在溶液中，MtGimα主要以二聚体存在（Leroux et al.，1999）。
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图12.4 MtGimα和MtGimβ亚基的质谱
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纯化的复合体MtGimC 在低能量条件下（5v）进行分析，产生一系列电荷离子、对应质量数86910±17D［图12.4B］。所测质量数为所有电荷离子的平均数。该质量数也很好地与其沉降平衡离心法的结果一致（83.7±8kD）（Leroux et al.，1999），并与两种蛋白质亚基类型的惟一可能的组合一致：含有2份MtGimα和4份MtGimβ的六聚体（MtGimα2MtGimβ4）的质量数为86848.6D。采用其他生化技术，如超速离心分析，仍非常困难，因为需要排除溶液中蛋白复合物精细组成不均一的可能性。相反，基于精确的质谱数据，含有不同亚基化学计量数的MtGimC六聚体可以很确定地被排除。
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单个蛋白质及其复合物的电荷状态
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电喷雾质谱中离子的电荷及其与蛋白质氨基酸组成的关系与许多因素有关，包括溶液的pH、离子强度、蛋白质的结构（Chowdhury and Chait，1990）、反离子（Mirza and Chait，1994），以及样品锥、喷雾针的电压等。从pH7.0溶液中TTR∶RBP复合物的分析结果看，低能条件下产生许多不同的离子系列（图12.3）。鸡TTR的氨基酸组成含17个酸性残基（包括羧基端）和18个碱性残基（含N端）。在中性条件下，总电荷将是+1，但实际测得为+7、+8、+9，这表明了电喷雾的充电效应。因为单体（ttr）和四聚体（TTR）同时出现在质谱图中，这样，在理想的溶液、电喷雾和仪器设置的情况下，电荷数可能为+28～+36，只要把单体的电荷数+7、+8、+9乘以4即可。但是，TTR四聚体的电荷数是+15和+16，表明形成四聚体时丢失了13～20个电荷。
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当1分子RBP结合到1分子TTR上时，电荷数也有类似的改变。所测得的1∶1复合物的电荷数表明，5～6个正电荷残基参与了RBP与TTR四聚体的离子对相互作用。由于视黄醇结合到RBP包含无电荷的视黄醇在RBP中的疏水包埋，而且，结合相关的微小构象变化不大可能导致任何带电残基的包埋变化（Cowan，1990），所以，实验观察到的变化一定是源于RBP与TTR之间的相互作用。上述模型涉及5个碱性残基，电荷的变化说明在TTR∶RBP复合物中可能是5个离子相互作用的平均结果。当第二个RBP结合到TTR∶RBP时引起电荷变化，这一事实进一步支持了离子相互作用的存在。测得的复合物的电荷表明，当TTR与第二个RBP结合时，形成了5或6个离子相互作用。
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复合物中亚基的排布
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尽管蛋白质复合物的气态结构与其溶液态结构的关系还是一个正在探索的课题，但是许多例子已经显示，颗粒周边上的亚基在增加能量时有选择的被释放（Rostom，2000）。轻微增加碰撞能量，以及稀释复合物溶液浓度和稍稍降低离子强度以减弱离子相互作用，能促进复合物的部分解离（Fandrich，2000）。就TTR∶RBP复合物来说，增加电喷雾接口中残留气态分子的碰撞能量，所得质谱与模拟溶液行为的条件下得到的质谱图明显不同（图12.3）。对应于解离的RBP和单体ttr的m/z离子系列占主导，而高m/z处的宽峰的强度显著降低，还产生了一系列弱得多的离子（m/z3500～5500），这一定是带电更少了或者聚合体更大了。峰的分析证实它们相当于蛋白亚基数的改变并揭示最强峰是3ttr∶1RBP∶1视黄醇复合物，第二强峰是2ttr∶1RBP∶1视黄醇复合物，较弱的峰是TTR∶1RBP∶1视黄醇复合物。多元蛋白质复合物的精确解离机制还是一个正在研究的课题，但是，稳定裸露的气态聚合体的反离子很可能扮演着某种角色。然而，这些结果表明，TTR∶2RBP的X-射线分析中观察到的相互作用（Monaco，1995）是一种六聚体复合物形式，因为每一个RBP分子与3个ttr亚基作用。
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为了研究原始MtGimC的四级结构，特别是评价是否是2个MtGimα直接作用，在气态下将复合物部分破坏（图12.4）。从观察原始MtGimC的优化条件开始，通过增加碰撞能量并保持质谱仪压力恒定使复合物解离。所产生的最主要的离子峰在m/z5000～8000范围，对应于五聚体MtGimα2MtGimβ3。在低m/z范围，有另外一个系列的离子峰，对应于单体MtGimβ。进一步增加样品锥电压，产生更强的五聚体的离子峰，在谱图中它占主导。解离初期单个MtGimβ分子的丢失表明，这些亚基位于MtGimC的周边，从而在增加碰撞能量时它们被选择性释放。除了五聚体MtGimα2MtGimβ3 之外，谱图中有许多解离后的离子，它们的强度极弱。但是，在高能量条件下，亚基在气态中重排产生如此低强度的离子的可能性不能完全排除。
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蛋白质复合物的热稳定性探测
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对纳流毛细管温度的控制使得通过质谱可以研究复合物的热稳定性。这可以通过把纳流喷雾针放在铝导热块中并安装热电设备和带回读控制的电阻传感器来实现（Tito，2001）。假定低微摩尔浓度的每个纳流雾滴只含单一分子（Wilm and Mann，1994），并且因为离子从溶液中挥发到气态中的速度非常快（Kebarle，2000），蛋白亚基不可能在溶液中解离然后在气相中重新结合。这种方法的一个例子是MtGimC。因为M.thermoautotrophicum是高度嗜热菌，优化生长温度为65℃，考察提高温度对MtGimC结构的影响。将MtGimC溶液的无盐部分从40℃加热到70℃并测定质谱（图12.5A）。低于60℃时，MtGimC占总离子强度的50%以上，表明这种条件下复合物存留超过一半。温度达到70℃时，原始MtGimC离子信号降低而解离物增加。但是，在50～70℃，温度低于MtGimα二聚体的熔点（Fandrich，2000），MtGimα既存在单体形式又存在二聚体形式，反映了溶液中二聚体的稳定性。而MtGimβ存在单体、二聚体和三聚体，这可能表示温度高于熔点后原本为非折叠态的MtGimβ聚集成为去折叠变性状态。因此，质谱数据支持这一模型：MtGimα与MtGimβ结合形成MtGimC稳定了复合态的MtGimα亚基，使其抗热变性。
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多元蛋白质复合物的实时组装
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为了研究从单个亚基组装成复合物的过程，将单个亚基混合并尽快导入质谱系统。对于MtGimC，将MtGimα与MtGimβ按1∶2摩尔混合后立即分析。记录各时间点的质谱，观察各样本的时间——质量变化关系［图12.5B］。第一张谱对应混合后80s，这是混合与进样之间的有效死时间。在此时间点，带电离子系列对应于MtGimβ单体、MtGimα单体及其双体。但是，混合130s后，在高m/z区域出现一系列宽峰，其分子量对应于原始MtGimC。250s后，只有极弱的MtGimα离子峰，而复合物占主导，强度超过MtGimβ。265s后，质谱图显示溶液中的主要成分为MtGimC。在所有谱图中未发现其他离子，表明MtGimC的组装是高度协同的过程。
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图12.5 MtGimC的热解离（A）和从α、β亚基组装为复合物的过程（B）
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展望
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通过这两个复合物的质谱分析对蛋白质相互作用的许多方面进行了举例说明。尽管质谱的这一应用还处在初级阶段，从血浆中分离出的生理学上极为重要的TTR-RBP复合物还是提供了不同蛋白质组分的非均一溶液的一个例子。相反，来自分子伴侣MtGimC的亚基和复合物则形成了一个结构确切的复合物，能够在各种质谱条件下进行分析。多元蛋白质复合物能存在于气态并能归属复合物和单个蛋白质亚基，这一事实使得我们能够评价溶液现象，如估计Kd（解离常数，Rostom，1998）。单体蛋白质和复合物电荷状态的比较可推测出蛋白质亚基产生的离子相互作用数。通过增加碰撞能量引起蛋白质复合物解离，我们有机会探测亚基的接触情况，进而了解复合物的组装。质谱产生解离物的模式与MtGimC模型一致，在此模型中，MtGimα形成了二聚体核心，每个MtGimα与两个MtGimβ结合［图12.4C］。MtGimα二聚体的高度稳定性、4个α/β型结构、惟一的α/α相互作用都与实验结果一致：一个MtGimβ亚基丢失是基本的和最主要的解离步骤。根据热稳定的质谱研究结果，原始的MtGimC六聚体很可能代表了嗜热菌M.thermoautotrophicum 内部的一个结构单元。从独立亚基到六聚体复合物的组装为一协同过程，反映了六个蛋白质亚基的高度偏好性结合。更进一步说，这些例子突显出质谱的威力，它不仅可以检测多元蛋白质复合物的化学计量，而且能研究大分子复合物的组装与分解过程。详细的信息、少的样品需求（1～2μl，5μmol/L浓度）以及混合物的耐受力使得质谱在阐明蛋白质复合物结构方面表现出良好的前景。
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方案
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方案1：质谱表征多元蛋白质复合物
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材料
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专用设备
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分子克隆手册：蛋白质—蛋白质相互作用
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方法
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1.调节压力以获得最优质谱条件：在不同的真空区域限制抽气或加惰性气体。用于仪器调节的合适的复合物可以购买，包括酵母乙醇脱氢酶，血红蛋白（Sigma），在合适的质谱条件下，两者均可以在pH6.5的乙酸铵缓冲溶液中，m/z4000～6000的质量范围内得到非共价四聚体。如果检测不到四聚体，应重新调节质谱仪。
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2.质谱仪校正。CsI（Sigma）最适合校正高m/z区域，因为它产生高分子量离子簇，并且因为它是单同位素的，会得到间隔均匀的窄峰。马肌红蛋白用于低m/z区域校正。
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3.在合适的缓冲溶液中制备复合物，可采用透析、Centricon浓缩机（Amicon）或柱色谱法。4℃下操作，重复5次以保证除去非挥发盐。如果所得溶液不能产生稳定的电喷雾，则需要重新制样。
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4.用纳流毛细管导入样品，优化离子源和压力。在此过程中，喷雾针很容易堵塞。为此，最好改变溶液的pH和离子强度来优化复合物的总溶解度。
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5.研究碰撞诱导解离来探查亚基的空间排布，常改变样品锥参数来微扰蛋白质亚基相互作用。也可以减小压力来去除碰撞冷却以使复合物部分解离。
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6.通过调节溶液来研究溶液pH和离子强度的影响。
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参考文献
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13 用原子力显微技术检测配体—受体间相互作用
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前言
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近些年来，一些新的技术方法已被开发出来以直接检测蛋白质—蛋白质相互作用。先前研究配体—受体相互作用通常采用生物化学方法，如测定亲和力或结合速率常数。尽管这类检测方法在研究蛋白质相互作用中仍然占有重要地位，它们却不能提供有关内力及外力作用的影响的信息。例如血流影响游移白细胞粘附于血管内皮。当细胞沿血管滚动时，这一外力使粘附受体经历粘附及去粘附周期。现在，这一研究领域已经扩展到检测生物分子在外力作用下的机械性质。这些直接检测技术能被用来检测蛋白复合物解体期间的动力强度及自由能变化（即能量图）。已经应用的技术包括显微操作针（Kishino and Yanagida，1988）、光镊（Ashkin et al.，1990；Svoboda et al.，1993）、磁性珠（Smith et al.，1992）、生物膜力探针（BFP）（Evans et al.，1995）和原子力显微镜（AFM）（Burnham and Colton，1989）。最初的力测量所用的样品有肌动蛋白微丝（Kishino and Yanagida，1988）、DNA（Perkins et al.，1994）和配体—受体系统（Florin et al.，1994）。虽然每一种不同方法都有其自身价值，本章仅阐述用AFM测定配体—受体间相互作用，同时包括能用来研究大多数蛋白质—蛋白质相互作用的具体方法和实验方案。
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AFM开始是作为一种成像工具而设计的（Binnig et al.，1986）。AFM从扫描隧道显微镜（STM）演变而来，它在对样品进行扫描过程中，弹性悬臂随样品表面形貌而偏折，通过将悬臂偏折转化为表面高度起伏，从而获得原子级分辨率的表面形貌图像。因为对表面的成像不但可以在空气中而且可以在液体环境中进行，可在接近生理条件下对生物分子进行成像研究，因此研究者可以对诸如生物膜（Zasadzinski et al.，1988）、菌视紫质（Butt et al.，1990）和DNA（Hansma et al.，1992）等生物结构进行细致的研究。关于AFM成像的详细综述，请参考 Heinz和Hoh（1999）或 Engle等（1999）的文献。
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AFM还能以力扫描方式进行操作。在这种方式下，它能以单分子水平的高分辨率测量两相对表面之间的作用力。在配体—受体间作用力研究中，配体被固定于 AFM的弹性悬臂表面，受体被固定于适当的基底表面。在悬臂接近和离开基底的过程中，通过悬臂的偏折便可测得配体—受体间的作用力。用这一方法，Lee等（1994b）直接测得单一配体—受体对的去结合力。这一新奇的应用使AFM成为检测生物分子间相互作用的一种超高灵敏度的力传感器。表13.1列出部分已测得的配体—受体对间的去结合力。近几年来，这种非成像AFM技术（常称为力谱技术）还被用来研究个别蛋白质分子的去折叠（Rief et al.，1997b；Marszalek et al.，1999；Oesterhelt et al.，2000）。
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表13.1 配体—受体键的去结合力
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用AFM测定配体—受体间作用力可以用Bell在1978年提出的理论体系加以解释。这一理论指出，在配体—受体结合键上施加一个机械力能降低激活能，从而加速结合键的断裂，并且配体—受体对的去结合力随外部机械力施加速率（即负荷速率）呈对数增高。为证实Bell的理论，用BFP和AFM对链抗生物素/生物素体系进行研究，结果表明负荷速率增加引起去结合力的增加（Merkel et al.，1999；Yuan et al.，2000）。其他配体—受体体系也证明了负荷速率与去结合力的这种关系，包括荧光素和其不同抗体（Schwesinger et al.，2000）、刀豆素A（ConA）/D-甘露糖（Chen and Moy，2000）、钙粘着蛋白（Baumgartner et al.，2000）和DNA双链（Lee et al.，1994a；Strunz et al.，1999）。
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本文首先介绍AFM仪器，包括一个可能的商品供应者表格及一个AFM悬臂校正方法；接着介绍检测配体—受体间作用力的实验方案，受体蛋白固定于琼脂糖珠上或活细胞表面；最后，总结AFM力谱技术令人振奋的进展并讨论这一领域的发展方向。
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程序纲要
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AFM仪器
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AFM仪器制造厂家
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Asylum Research，CaliforniaWITec GmbH，Germany
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http：//asylumresearch.com/http：//www.WITec.de/
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Burleigh Instruments Inc.，New York
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http：//www.Burleigh.com/Pages/surface.htm
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Digital Instruments，California
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http：//www.di.com/
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Molecular Imaging Corporation，Arizona
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http：//www.molec.com/index.html
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OMICRON，GmbH，Germany
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http：//www.omicron-instruments.com/
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ThermoMicroscopes/Park Scientific
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Instruments，California
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http：//www.thermomicro.com/
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TopoMetrix，California
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http：//www.topometrix.com/
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悬臂校正
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将悬臂偏折量χ转化为力单位F，必须要确定悬臂的弹性系数k（即F=k）。目前有几种校正针尖的技术和估计k近似量的理论方法（Sader，1995）。用经验方法确定k的值包括施加一个固定的已知力来测量悬臂偏折（Senden and Ducker，1994）或测量悬臂的共振频率（Hutter and Bechhoefer，1993）。我们在Hutter和Bechhoefer（1993）的方法基础上建立一种新的方法来校正悬臂并将这种方法简述如下。
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为检测配体—受体间作用力，我们使用钝的三角形镀金氮化硅探针悬臂，它的弹性系数是10～50mN/m。探针悬臂可被视为一个简单的共频振动器，它的热力波动谱可以用来推导弹性系数。简单地说，将悬臂从样品表面抬高几个微米，在2～3s内能探测到悬臂的本位振动频率（共振频率）。因为悬臂的每一种振动模式获得等同于一个自由度的热能k/2，悬臂标准偏折量＜χ2>能用来计算弹性系数，即0.5k=0.5k＜χ2>，这里k和T分别是Boltzmann常数和温度。为在记录系统中把基本的振动方式引起的偏折与其他偏折或噪音区别开来，必须确定温度所致偏折的力谱密度，并只能用基本振动方式对应的力谱成分来估算弹性系数。用这种方法，悬臂的弹性系数既能在空气中，也能在溶液中测算。利用计算得到的弹性系数k可进一步计算去结合力F，即F=kΔV，这里ΔV是光二极管探测到的结合断裂发生前及发生后瞬间的电压改变，C是与偏折和光二极管电压有关的校正系数。C可用悬臂压在刚性表面（如塑料培养皿底部）时发生的偏折来确定。
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AFM在配体—受体相互作用研究方面的应用
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AFM是测定配体—受体结合键强度的有力工具。然而在进行直接力测量时必须考虑几个问题。首先，必须确定和/或消除可能的非特异结合力；第二，配体—受体结合键的强度受测量时负荷速率的影响。换句话说，使配体与受体分离的速率、配体及受体蛋白附着表面的弹性都会影响结合性质。下面，我们会详细讨论这两个因素的影响，然后给出在琼脂糖珠和细胞上实现AFM力测量的策略。
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针尖—样品间的非特异作用力属典型的静电力，因此可以用简单的方法消除这种非特异结合力。在磷酸盐缓冲液（PBS）等电解质溶液中进行实验可避免表面所带电荷参与针尖与样品的接触，使静电力降至最小限度。另外，还应避免将受体蛋白直接固定于本身含有电荷的表面（如玻璃表面含有一层负电荷）。不带电荷的基底如琼脂糖和右旋糖酐可被用来支持蛋白质。在样品液体池中加入0.1mg/ml牛血清白蛋白（BSA）也能降低非特异作用力。
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AFM力测量中另一个需要关注的问题是，外力施加的速率（即负荷速率）能影响配体—受体结合性质。负荷速率高时，去结合力也较高，反之，去结合力较低。配体与受体分离的速度及配体和受体附着表面的弹性决定负荷速率，所以在比较不同配体—受体的去结合力时，一定要考虑悬臂撤回速率和支持物的参数（即表面弹性）。
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最近出现的亲和力成像和细胞—细胞粘附实验为应用AFM研究配体—受体相互作用指出了前景广阔的发展方向。亲和力成像将配体—受体间作用力测量与AFM的成像功能结合起来。将特异受体或配体固定于探针悬臂，AFM可以提供一幅粘附图，它能详细反映配体—受体结合对在表面上的分布密度（Ludwig et al.，1997）。使用抗体功能化悬臂能获得基底上的抗原亲和力图像（Willemsen et al.，1998；Raab et al.，1999）。这一技术已经扩展到在柔软的细胞表面上进行。Grandbois等（2000）在测量Helix pomatia凝血素和A型红细胞血浆膜蛋白之间特殊作用力的基础上能区别A型红细胞与O型红细胞。
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AFM还能用来研究细胞—细胞间的粘附作用（Razatos et al.，1998；Benoit et al.，2000）。这些实验与以前不同，在以前的细胞粘附研究中，细胞被固定在悬臂末端作为探针来使用，而新的方法能在接近生理情况下研究配体和受体。这一方法还能应用于研究细胞激活后的调节性粘附。
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AFM还在不断改进以提高灵敏度（Viani et al.，2000），AFM研究面临的挑战是能使用AFM的实验室数目很有限。随着基因组计划的进展，许多蛋白质序列已经被发现，然而它们的生物物理学性质和功能仍然不清楚。AFM将是这一研究领域的重要工具。
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下面分几部分介绍用AFM测定配体—受体间作用力的实验方案。简言之，将特定配体或受体固定于悬臂探针表面，将与之对应的受体或配体固定于基底表面。在悬臂探针表面和基底表面相接近和相分离的过程中，悬臂受力偏折，从而测得两功能化表面之间的作用力。两表面间的粘附力即是配体—受体间作用力。
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方案
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方案1：悬臂功能基化
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材料
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缓冲液及其他溶液
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丙酮〈！〉生物素-BSA（Sigma-A-6403）〈！〉
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生理盐水磷酸缓冲液（PBS，0.01mol/L，pH 7.4）
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碳酸氢钠（0.1mol/L，pH 8.3）
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抗体
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链霉亲和素（Sigma）
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专用设备
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AFM悬臂（MLCT-AUHW；Thermomicroscopes，Sunnyvale，California）
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方法
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1.悬臂浸入丙酮5min，然后紫外线照射〈！〉15min。
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2.在37℃的湿润孵化器中，悬臂浸入一滴50μl生物素-BSA（0.5mg/ml0.1mol/L碳酸氢钠，pH8.3），孵育过夜。
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3.用PBS（pH 7.4）洗3次，除去非结合蛋白。
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处理至此的悬臂在4℃可于PBS中保存2周。
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4.在室温下悬臂浸入一滴50μl链霉亲和素（0.5mg/ml0.1mol/L PBS，pH 7.4），孵育10min。
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在加入链霉亲和素之前，用1%戊二醛使表面结合的生物素-BSA交联，有助于稳定固定化蛋白。
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●生物素-BSA吸附（步骤2）在pH 8.3或更高的pH条件下进行，这一点很重要，因为碱性环境似乎有利于BSA吸附于悬臂。
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●使感兴趣的配体生物素化的试剂盒可从Piece化学试剂公司得到。
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5.悬臂使用前用PBS冲洗3次。
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6.此步骤是使生物素化的配体可偶合于链霉亲和素功能基化的尖端（如生物素化的刀豆素A；0.5mg/mlPBS，室温下孵育10min）。
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方案2：固定于琼脂糖珠上的配体的AFM检测
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材料
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缓冲液及其他溶液
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0.01% 牛血清白蛋白PBS
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生理盐水磷酸缓冲液（PBS，pH 7.4）
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碳酸氢钠（pH 9.6）
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抗体*
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链霉亲和素（Sigma）
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专用设备
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生物素化琼脂糖珠（Sigma）〈！〉
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塑料Prtri皿（35mm）
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方法
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1.制备固定生物素化琼脂糖珠用Petri皿：
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a.将100μl链霉亲和素（0.05mg/ml碳酸氢钠，pH 9.6）滴加于35mm塑料Petri皿底部。
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b.37℃的湿润孵化器中孵育过夜。
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c.正好于加入琼脂糖珠之前，将皿清洗3次。
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2.在1.5mlPBS中加入100μl生物素化琼脂糖珠。
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3.洗珠：10000g离心10s，去除上清液。
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4.重洗2次。
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5.去除最后洗涤的上清液之后，重新将珠悬浮于0.01%牛血清白蛋白PBS。
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6.在链霉亲和素包被的Petri皿中加入100μl洗过的琼脂糖珠。琼脂糖珠几乎立即粘附于Petri皿。
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图13.3是用链霉亲和素功能基化的AFM悬臂和生物素化琼脂糖珠进行作用力测定的图示。在逼近轨迹中，压电移位器的伸长使悬臂降低至琼脂糖珠上，并将AFM尖端压入有弹性的珠中。表面的接触由悬臂向上的形变所指示，并使链霉亲和素—生物素复合物形成。形成的复合物的数目依赖于接触的表面积，这可由悬臂所施加的力和琼脂糖珠的弹性估计出来。施加1nN的力常常导致几个复合物的形成。这些复合物的去结合力在回拉的轨迹中被记录到。回拉轨迹的锯齿形状揭示复合物的去结合并不一定同时发生。回拉轨迹表现力的多步骤变化过程，归因于一个或多个链霉亲和素—生物素键的断裂。加入可溶性生物素或链霉亲和素，可使AFM尖端与底物间的相互作用减少到单个链霉亲和素—生物素相连接的水平。在这些情况下，表面分离时力的改变对应于单个链霉亲和素—生物素复合物间作用力的断裂。证实链霉亲和素—生物素间特异性相互作用的对照实验，以加入游离的链霉亲和素或游离的生物素来进行。
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图13.3 链霉亲和素功能基化的尖端与生物素化的琼脂糖珠间的相互作用的力—位移曲线
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方案3：活细胞上的AFM测定
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材料
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缓冲液和其他溶液
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生物素化刀豆素A（Con A）（Sigma）
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戊二醛
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NIH-3T3成纤维细胞
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RPMI培养基，无葡萄糖，加0.01% BSA和0.01mol/L氯化镁〈！〉。
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专用设备
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塑料组织培养皿（无包被）
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方法
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1.测定前用Con A功能基化AFM尖端（见本章：方案1，悬臂功能基化）。
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2.测定在室温下、无葡萄糖、加有0.01% BSA和0.01mmol/L MnCl2的培养基中进行。从培养基中除去葡萄糖以防止与ConA-功能基化的尖端竞争性地与细胞上的Con A受体发生结合。加入BSA以减少非特异性结合，促进培养的NIH-3T3成纤维细胞附着于未包被的塑料培养皿底部。
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3.在未固定的和用戊二醛轻微固定的两种细胞上进行测定，确定Con A受体的交叉连接是否会影响受体的去结合力。
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与在琼脂糖珠和固定细胞上所进行的测定相比，在未固定细胞上于尖端与细胞膜最后分离前具有更长的牵拉范围（将图13.4A与图13.3和图13.4B进行比较）。未固定细胞的典型距离达500nm。这样，Con A受体似乎是锚于细胞膜系连物上。这种系连物在受体受到牵拉时可以伸展。
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断裂力测定揭示化学固定细胞（173±6.1 pN）有比未固定细胞（86±2.6 pN）较强的断裂力（图13.4C，D）。而且，细胞弹性间的差异从探针在细胞表面上被拉动时的回拉轨迹的斜率就可以明显看出。力直方图（force histogram）揭示的多量子峰（图13.4D）在未固定细胞的直方图上并不存在，提示断裂力增加，大部分原因是由于细胞的结合向协同方向转化。
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图13.4
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用这种方法，能够得到小到单个分子对水平的粘附力的直接测定，不像早先的细胞粘附力测定研究及生化方法，这些方法依赖非直接测定且只能测定受体的群体动力学。而且，因为AFM能够施加和测定细胞或蛋白质上的微小的力的变化，因此可能同时测定细胞表面的粘附力及细胞弹性。
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致谢
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我们实验室的工作获得美国癌症协会的资助，以及国立卫生研究院给V.T.M的资助（1R29 GM 55611-01）。
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14 Biacore表面等离子体共振分析相互作用的蛋白质
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前言
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定性和定量技术，包括凝胶过滤、热量测定和超滤已经被用在研究生物大分子的相互作用。三种互补的定量方法在研究蛋白质与蛋白质相互作用中已经证明是可行的，包括分析型的超速离心、等温滴定热量测定和表面等离子体共振（SPR）。热量测定和分析型超速离心需要毫克级的纯蛋白，然而SPR只需要微克级的蛋白质。SPR提供了一种获取动力学数据的方法（大分子相互作用的微观速率常数），分析型超速离心提供了蛋白质聚集态的最好证据，等温滴定热量测定提供了一个完全的热力学轮廓图，包括平衡常数、反应化学计量、焓和熵。理想情况下，这些方法应共同使用以完全表征大分子的相互作用。
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SPR是一种光学共振效应，通过这种效应，薄传导镜的后侧影响少量反射光存在的角度（图14.1）。与传感器芯片金表面接近的介质介电常数的任何改变，都会产生非常敏感的SPR响应。通过记录反射光最小时角度的改变可以检测SPR信号的变化。测量SPR商业化仪器的应用业已简化了生物大分子相互作用研究，它提供了一种格式，可以用小型分析型仪器实时测量大分子相互作用（Jonsson et al.，1991）。SPR仪器种类繁多，从最简单的、最便宜的模型到较完善的仪器，带有辅助机器人、光学接口和软件。最简单的装置称为Spreeta芯片，由Texas Instrument研发（www.ti.com/spreeta）。Texas Instrument维护一个信息网站用来解释SPR的物理基础。更复杂的仪器是Biacore仪器（www.biacore.com），Biacore仪器常用来表征大分子相互作用的几个不同方面，包括蛋白质与蛋白质、蛋白质与小分子、蛋白质与核酸、蛋白质与脂类相互作用（Celia et al.，1999；Raut et al.，1999；Saenko et al.，1999）。Biacore网站保持一个广泛的参考列表，包含已经用于SPR技术的大量实验设计，并且提供了关于SPR和Biacore仪器的技术和应用信息。公司还提供了Biacore仪器和BIAevaluation软件的技术支持和指导，关于SPR详细全面的讨论在生命科学全书中可以找到（www.els.net）。
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图14.1 SPR示意图
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BIA技术依赖于SPR现象，它发生于表面等离子波在金属/液体界面处激发时，光线直射表面的边缘并反射回去，不与样品接触，SPR将在特定的角度和波长组合条件下使反射光强度下降。生物分子结合事件导致表面层折射指数变化，进而以SPR信号变化的形式被检测。（引自Biacore，Sambrook and Russell 2001，Molecular Cloning.）
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程序纲要
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传感器芯片
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由Biacore引入的芯片技术，由1cm2的镀金玻璃片构成，为了操作方便，玻璃片嵌于塑料支持体中。标准的芯片是Sensor Chip CM5，也有其他几种用途不同的特殊芯片（www.Biacore.com）。Sensor Chip CM5具有相当于2%～3%的羧甲基化葡聚糖共价结合至金表面，已开发多种连接配体分子至葡聚糖表面的方法（O’Shannessy et al.，1992），这样在羧甲基化葡聚糖上生成活性的基团能够与配体分子产生共价反应。所用偶联化学的选择通常依赖于配体分子的特性（图14.2）。每个芯片有4个不同的流体池，因此，3个表面上的配体浓度可以变化，第四个可以用于对照或空白表面。
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图14.2 通过天然-NH2，-SH2，-CHO和COOH的配体移动
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图14.3 目标分子的俘获（A）生物素标记大分子的俘获，（B）组氨酸标记蛋白质的俘获
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选择固定配基在Sensor Chip CM5上的方法时应经过深思熟虑，如果可能，所选择的方法应尽可能减小不均一性并最优化结合配基的功能。通过另外一个共价键合在羧甲基葡聚糖上的分子俘获配体的技术是很有用的，因为它们可以使配体整齐地指向单一的附着点，使配体优先与芯片表面直接偶联。这样的俘获表面的例子有：链霉亲和素（Morgan and Taylor 1992；O'Shannessy et al.，1992），镍螯合物（NTA）（Nieba et al.，1997），兔抗小鼠Fc 结构域（RaM Fc）以及anti-GST。在羧甲基葡聚糖上偶联链亲和素（图14.3A）或NTA（图14.3B）的芯片可以买到。用Biacore胺基偶联试剂盒可将俘获分子如抗体和链霉亲和素通过伯胺基团结合到表面上（如下方法所述）。
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其他的一些传感器芯片可以提供其他特性，有些芯片促进脂单层（HPA）（图14.4）或脂双层形成（Pioneer Chip L1），而其他的有：缩短的葡聚糖分子（Pioneer Chip F1）、带有低电荷的葡聚糖分子（Pioneer Chip B1）、没有葡聚糖基体的羧甲基化表面（Pioneer Chip C1）或是没有任何附着分子的平滑金属表面（Pioneer Chip J1）。
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图14.4 膜生物化学和膜结合受体研究
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芯片表面的再生
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强有力的再生系统对于配基固化的表面再利用是很重要的，多种多样的原料（酸、碱、溶剂、盐、去污剂或这些试剂的复合物）可以用于再生（Andersson et al.，1999）。通过重复加入分析物和重复使用再生溶液来确定配基是否连接在表面，可以验证再生能力高低。利用正确的再生条件，在同一表面反复使用100个循环是没有问题的。
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数据采集
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该仪器利用流式体系和附着（固定化）配体的传感器芯片，待分析的溶液由系统注入，通过扩散和对流运动从溶液传送到传感器芯片表面，并在此处与配基相互作用。图14.5演示了通过Biacore传感图检测相互作用的过程。SPR角度的改变实时反映了配基与分析物分子间的相互作用。再生就是尽可能用温和的方法从表面移走非共价键结合的物质，从而使配基在随后的结合/再生循环中重新被利用。
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图14.5 监测相互作用进展的传感图
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分析物质扩散的过程称为物质转运，所有的结合体系都在一定程度上受这种现象的影响，部分动力学研究的实验设计就涉及到确定配基的最低表面浓度和最高流动速率以尽量减小迁移效应。在满足了实验的最低标准后，可以进行数据收集，并随后与适当的模件相匹配。我们强烈推荐传感器芯片的三个通道（也称流动池）应加以修饰使之包含不同水平的配基，而第四个通道用来作为适当修饰的对照表面。另外一种被推荐的方法是通过双参比来校正低密度配体表面，分析物注入到参考通道所产生的信号从注入到活性表面所产生的特异结合信号中差减掉，进一步从每一次分析物注入所产生的信号中差减掉缓冲液注入的信号以消除数据因机器引起的误差。每一种技术应用时都应小心，特别是当噪音大于结合信号时，如果参照通道（对照表面）有非特异性的结合，在从活性表面产生的信号中减去参照通道的信号时要谨慎。
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结果的传感图或系列传感图可利用BIAevaluation软件所提供的几个结合模件之一或自定义模件进行模式化，分析Biacore的数据时，切记仪器灵敏度会返回低噪音信号，其中对机器的效应尤其灵敏，如阀门开和关，运行缓冲液和样品之间温度和折射指数（溶液浓度）不匹配所引起的体积效应。由于这些经常出现的不可避免的效应会使结合信号的解释复杂化。Biacore（BIAuniversity）的基础训练和BIAevaluation软件的特别训练（Kinetics I和Kinetics II）是学习仪器操作、实验设计和数据评估的良好助手，与这些课程相关的信息可以从Biacore网站上得到。
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动力学检测
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最早的Biacore仪器，首先于1990年引入，应用非常少，并且只有一个初步的方法用于分析数据，这些限制引起了关于应该用非线性（O'Shannessy et al.，1993）或是线性（Karlsson et al.，1991；Altschuh et al.，1992；Pellequer and Van Regenmortel，1993）方法分析数据的讨论。现今用的模式是非线性的，用实际的数据而不是像线性模式用重构的图谱。动力学数据的模式化在Fisher和Fivash（1994）以后得到很大的提高，他们提出一个两腔模型来描述分析物从流动的缓冲液（腔1）到芯片结合区（腔2），这种工作也引入了一种用在Biacore数据上的分析新方法，称为整体分析。一系列的不同表面配体浓度和不同分析物浓度的传感图用单一系列的聚集和解离速率常数分开（Fisher and Fivash，1994；Fisher et al.，1994）。两腔模式（Myszka et al.，1998）和整体模型（Roden and Myszka，1996；Karlsson and Falt，1997）在该领域被广泛认可。
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Biacore数据适宜模型的一致性促进了Biacore评价软件的提高，可以进行数据整理（基线调节、时间回零、从一系列传感图去除空白注入），用软件包含的一系列模型进行动力学分析。可以计算kt（k输运——分析物质到芯片表面的传递）、微观速率常数ka（k结合——结合速率常数）和kd（k解离——解离速率常数），ka和kd的比值可以用来确定平衡常数kD。获得这些分子间相互作用的微观速率常数的可能性（有时指开或关速率）激发了研究者的想像力。然而，应该认识到，用Biacore分析获得的动力学常数具有不确定性，直到用其他方法得到证实。（注：可能较好的描述应为这些结果是表观速率或平衡常数，大量的数据表明从SPR实验得到的结果与下面列出的及其他的试验一致。）生物分子资源机构协会（ABRF）（www.abrf.org）下属的分子相互作用研究组（MIRG）打算用SPR、分析型超速离心和等热滴定热量计分析样品来探讨这个问题，这些结果将首次提供这些不同方法的直接比较。
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另外，SPR测量基于一个来自溶液和表面基质结合的分析物，其中涉及混合相（固态和溶液态），利用混合相和利用单相测量之间的相互关系已经并且将继续引起争论（Ladbury et al.，1995；Nieba et al.，1996；Muller et al.，1998）。
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浓度测定
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在物质（质量）输运限制下的结合，最初的斜率应该是与分析物的浓度呈线性相关（Karlsson et al.，1993；Nieba et al.，1996；Christensen，1997）。当分析物和自由的配基分子在进样前孵育（使系统达到平衡）时，最初的结合斜率显示自由分析物（没有复合）的数量。这个概念非常有用，因为可以计算配基分析物相互作用的平衡常数，而不用考虑何种相互作用模型。这种技术也可用于确定在溶液中分析物浓度的校正系统。
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至少有三种方法可以计算得到平衡结合常数，而不必借助于模型，在竞争实验中找到分析物的浓度（见上）是一种有用的方法，用这种方式找到的常数是溶液常数，对于表面常数，可以注入足够的分析物来观察半饱和处的信号。分析物在流动缓冲液内长时间循环来达到平衡可用来替代上一方法（Myszka et al.，1998；Schuck et al.，1998）。
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设计方案
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为了设计一个良好的实验方案，需要几个初步实验来检验一些试剂。此处描述了分析一个典型抗原抗体系统的一系列步骤，包括与Biacore实验设计相关的几个细节，其中用于优化系统参数的抗原和抗体已商品化。
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该方案分成两个部分，第一部分讲解RaM Fc俘获表面的制备方法，紧接着是特异抗体促甲状腺激素（anti-TSH）与RaM Fc表面的结合测试，以及抗原促甲状腺激素（TSH）与抗体（anti-TSH）的结合测试。该方案的第二部分推出一系列动力学分析的程序，即测定结合的平衡常数。
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该系列的第一步描述在兔抗小鼠FC结构域（RaM Fc）表面俘获anti-TSH的方法，以制备anti-TSH表面，用于TSH与anti-TSH结合的动力学分析。RaM Fc通过伯胺偶联固定于传感器芯片的羧甲基葡聚糖上，当用作俘获抗体的分子时，使二价抗体分子以一种能够结合两个抗原分子的方式进行定向。另外一种制备用于动力学分析表面的方法是利用伯胺基团将其中一种还原剂直接偶联于传感器芯片。如果该方法用于抗体，获得表面的不均一性会使一个抗体分子上结合的抗原分子少于两个。
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在anti-TSH上有两个抗原结合位点，因此使得TSH结合anti-TSH的计量比应该为2∶1，要确定TSH（Mr=50000）与anti-TSH（Mr=150000）的结合效率，需计算被俘获抗体上能结合分析物的共振单位（RUs）最大数目。
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=（MW分析物）/（MW配体）×（RUs配体）×价键数=2/3×RUs anti-TSH
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如果RaM Fc表面俘获250RUs的anti-TSH，且所有抗体具有活性，理论上应结合167RUs的TSH。
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方案的第二部分提出一系列方法模块或分析程序，以测定相互作用的平衡常数。该程序设定在每一个周期开始时利用RaM Fc表面俘获已知数目RUs的anti-TSH，然后注入TSH，在每一个周期结束时通过注入20mmol/L HCl来再生RaM Fc表面，一共六个不同浓度TSH（通过系列稀释制备）注入同样条件制备的anti-TSH表面，抗体与俘获表面的高度重复性结合必然产生同样的anti-TSH表面，用于与每一个周期中注入的不同浓度TSH相互作用。
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相互作用指南（Biacore控制软件3.0以及Biacore 2000，Biacore 3000）可用来在动力学分析、浓度系列和利用俘获分子结合选项条件下设计实验。但如果使用指南，实验中一次只能使用一个anti-TSH的表面密度，直接编写方法的优点是可以创建不同的anti-TSH表面密度，并且暴露于同样的TSH浓度系列，这样就满足了全面分析的数据需求（见上文动力学检测一节）。在Biacore仪器手册中有关于Biacore方法定义语言（MDL）编写方法的详细讨论。直接编写Biacore方法给实验设计带来的灵活性使我们完全值得花一定时间去熟悉MDL。另外，在Biacore控制软件3.0及更高版本中的客户应用指南允许用户编辑同一个实验。
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方案
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方案1：Biacore表面等离子体共振使用
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材料
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缓冲液和溶液
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分子克隆手册：蛋白质—蛋白质相互作用
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分子克隆手册：蛋白质—蛋白质相互作用
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抗体
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鼠anti-TSH单克隆抗体（1mg/mlHBS溶液）（来自Alexon-Trend，Inc.，Ramsey，Minnesota）
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稀释抗体至2μg/ml并制备1000μl或制备由15～20步所决定的达到目标RUs所需要的体积
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兔抗鼠Fc结构域（RaM Fc）（来自Biacore，Inc.）
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30μg/ml于10mmol/L乙酸钠溶液（pH5.0）〈！〉
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TSH（于HBS中20μmol/L）（来自Sigma）
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为了动力学分析，准备TSH的系列稀释液用于注入：
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1.准备TSH系列稀释液包括200，100，50，25，10，5 nmol/L，各于280μl的实验用运行缓冲液中；
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2.将每管不同浓度的上述溶液分装至4个塑料7mm管中，各70μl，并盖好帽；
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3.参照样品循环参数，将7mm管放于Biacore架上的适当位置。
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特殊装置
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此处装置可以从Biacore购得，相关信息见www.biacore.com
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Biacore仪器（包括Biacore控制软件和BIAevaluation软件）
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Sensor Chip CM5
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Sensor Chip CM5，偶联于RaM Fc（从步骤14起用于随后动力学分析）
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方法
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俘获表面制备
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RaM Fc以伯胺偶联方式偶联至Sensor Chip CM5表面，该步骤需45min左右，可以通过Biacore控制软件下拉菜单或工具栏上的图标来执行命令。
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1.固定Sensor Chip CM5至Biacore仪器。
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2.用过滤并脱气的HBS初始化设备。
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3.将分别含有100μl NHS、EDC、乙醇胺、RaM Fc及20mmol/L盐酸的小管放于Biacore仪器自动进样器架子的适当位置。
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4.在Biacore自动进样器架子上放一个空管。
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如果软件中有固定化指南可以用于此程序，在Biacore 2000和Biacore 3000的控制软件3.0版本及更高版本指南中已标准化，如果用该指南，需专门设计分装体积，结合RaM Fc的目标RUs数目为13000。在Biacore仪器中，一个RU人为定义为一度的万分之一。
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5.以一个流动池5μl每分钟的流速启动仪器。
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6.转移75μl NHS至空管。
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7.转移75μl EDC至同一管。
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8.混合两种溶液。
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9.注入35μl NHS/EDC混合液激活表面。
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10.注入35μl RaM Fc以偶联抗体至已激活的表面上。
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11.注入35μl的乙醇胺用以使多余的活性基团失活。
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12.快速注入10μl 20mmol/L HCl，紧接着用Extraclean除去非共价结合的材料。
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13.开始注入RaM Fc前设置基线报告点和20mmol/L HCl注入结束后2min设置第二个报告点，由此来测定RaM Fc结合水平。
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固定上的RaM Fc的最终RUS数应在10000至13000之间，如果获得较低水平，可能是因为所用RaM Fc的浓度较低，或是因为所用的NHS和EDC溶液储存期超过了2个月，含较少RUs的RaM Fc表面可以使用，但anti-TSH体积需要根据经验值调整，通常获得预期结合水平需要一些努力。
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14.停止流动，关闭命令行窗口，保存结果文件。
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此时，Biacore可以停留在待机状态（继续工作），或如下一节所述直接利用表面。在连续缓冲液流动下，RaM Fc表面在仪器中很稳定，或将芯片卸下，4℃储存在含少量水的50μl锥型管中，该条件下表面可以稳定数周。
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测试anti-TSH与RaM Fc表面的结合状态
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该步骤需20min左右，可以通过Biacore控制软件下拉菜单或工具标上的图标来执行命令。
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15.启动仪器，使偶联RaM Fc的流动池中流速为10μl/min。
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16.注入10μl 2μg/ml的anti-TSH（共需40μl anti-TSH溶液）。
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10μl的anti-TSH大约增加250RUs，如与RaM Fc表面的结合没有达到这个水平，再生（见步骤17）并重复注入不同体积anti-TSH直至确定必要的注入体积。
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17.快速注入10μl 20mmol/L HCl，随后用Extraclean再生RaM Fc表面。
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18.重复注入结合250RUs anti-TSH所需的anti-TSH体积，以测试与RaM Fc表面结合的重复性。
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19.快速注入10μl 20mmol/L HCl，随后用Extraclean再生RaM Fc表面。
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20.停止流动，关闭命令行窗口，并保存结果文件。
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测试TSH与俘获了anti-TSH表面的结合状态
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该步骤需要20min左右，可以通过控制软件下拉菜单或工具栏上的图标来执行命令。
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21.启动仪器，使偶联RaM Fc的流动池中流速为10μl/min。
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22.注入10μl 2μg/ml的anti-TSH或由步骤15～20所确定的250RUs anti-TSH所需体积。
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23.注入25μl 200mmol/L TSH后，设定120s的解离时间（共需65μlTSH溶液）。120s的解离时间可以满足测量抗体抗原复合物解离的速度。
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注入约20μl20mmol/L的TSH后，曲线应该平直（斜率接近零），呈现出一个抗体和抗原分子的Stochastic稳定期，如果曲线不平直，再生表面，重复步骤21～23用400nmol/LTSH在步骤23（图14.5和图14.6）。
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图14.6 anti-TSH结合至RaM Fc
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24.快速注入10μl20mmol/LHCl，随后用Extraclean再生RaM Fc表面。
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25.停止流动，关闭命令行窗口，并保存结果文件。
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相互作用的动力学分析
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整个程序由三个方法模块或节组成；MAIN、APROG及LOOP，有四个不同的分析程式（定义为APROG模块），与四个APROGs一一对应的是MAIN（bind1，bind2，bind3及bind4）。每个APROG需要不同体积的鼠anti-TSH单克隆抗体注入到同样的RaM Fc表面上，每一次注入anti-TSH后紧跟着注入TSH系别稀释液。要进行TSH样品重复注入，需适当加入样本循环行。正如方法中所述需要1000μl anti-TSH稀释液：400μl用于APROG1（8次20μl注入，每次需50μl），320μl用于APROG2（8次10μl注入，每次需40μl），280μl用于APROG3（8次5μl注入，每次需35μl）。如果需要不同体积的anti-TSH以达到目标RUs，APROGs必须修改，所需抗体的总体积也不同。重要的是，要记住每一个INJECT命令，需要设定的体积再加上30μl用于注入。在TSH系列注入前有两次缓冲液注入anti-TSH表面上，以稳定抗体的结合。
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Biacore软件编辑方法时，方法命令应该大写，用户自定义参数应小写。跟随声明点（！）的解释被仪器识别为文本而不是命令代码，它们的插入是用来解释前边命令的意义。
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理论讨论
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由于anti-TSH中有两个抗原结合位点，因此认为TSH与抗体的结合计量比应为2∶1。为了测定TSH（Mr=28000）结合anti-TSH（Mr=150000）的效率，需要计算结合到被俘获抗体上的分析物的最大共振单位数（RUs）。
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Rmax=（MW分析物/MW配体）×（RL）×共价键
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Rmax是理论最大响应，条件是100%的配体位点处于（1）活性状态以及（2）与被分析物结合，RL是固定化配体数目，单位RU，价键数是每个配体分子可结合被分析物分子的数目。在250RUs anti-TSH被俘获在Rmax表面的情况下，如果所有抗体有活性，则应结合93 RUs的TSH。
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分子克隆手册：蛋白质—蛋白质相互作用
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分子克隆手册：蛋白质—蛋白质相互作用
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分子克隆手册：蛋白质—蛋白质相互作用
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数据分析
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15 石英晶体微平衡生物传感器在蛋白质相互作用分析中的应用
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前言
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16 蛋白酶足迹法
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前言
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优点与局限
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尽管有许多技术可用来鉴定一种蛋白质与另一个分子之间的相互作用，仅有几种方法被用来表征所涉及的精确区域。突变分析、化学交联和通过X-射线晶体衍射或核磁共振（NMR）是用来检测某一蛋白质的结构/功能关系的最普通的方法。蛋白酶足迹法提供了一种易于被多数实验室所接受的直接的生化方法来鉴定在复合物组装中所涉及的结构域。蛋白酶足迹法是一种体外实验，可对溶液中的天然蛋白质进行检测，并且能够同时检测某一蛋白质的多种区域。相比而言，体内遗传学分析方法经常仅仅是推测的，并且需要对所研究的各种结构域构建突变，耗时巨大。利用NMR对某一单链蛋白质的水相状态进行结构确定时，蛋白质的分子量限制在30kD以下。通过X-射线晶体衍射进行结构确定时，要求在非生理状态下形成单晶，通常由遗传分析或蛋白酶足迹法来加以补充，以证实其意义。
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其他蛋白质图谱技术的局限和困难强调了蛋白酶足迹法的优点。
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1.所要求的惟一的蛋白质设计是加入磷酸化位点，以产生末端标记。多数蛋白质的末端是暴露的，因此一个末端标记可以在那些位置被接受，而不会破坏蛋白质的结构。如果末端标记的直接方法影响蛋白质的结构，那么通过诸如针对某一末端的特异的抗体免疫标记进行间接的末端标记可以使蛋白质可视化，这种方法已经应用。与之相反，突变发生研究要求通过更改密码子来改变氨基酸，这增加了导致结构改变的可能性。
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2.蛋白酶足迹法能够鉴定发生在组装蛋白质复合物过程中产生的一系列构象变化。X-射线晶体衍射也能被用来鉴定这些结构变化，但是这要求解答和比较游离（未结合的）蛋白质及其每一种更高级的结构。突变研究通常在确定其变构状态下不作为直接的方法，特别是在缺乏结构数据的情况下。
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3.蛋白酶足迹法只要求NMR和X-射线晶体衍射所需样品量的一小部分，并且多数实验室都具有一些必需的试剂和设备。
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4.在进行蛋白酶足迹法实验中蛋白质的大小没有差别。与之相反，利用NMR和X-射线晶体衍射方法，对大蛋白质进行分析是非常困难的，因为要求比较多的数据点才能获得与较小蛋白质分析所达到的同样分辨率。而在蛋白酶足迹法实验中，对大蛋白质并不要求附加的足迹反应，尽管需要多块不同浓度的聚丙烯酰胺凝胶来检验蛋白质的整个长度。
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蛋白酶足迹法有下列局限性。
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1.末端标记的分子对于其配体的亲和性必须足够强，才能定量组装复合物。另外，必须存在一种方法可以从游离的蛋白质中纯化结合的蛋白质。一种用来纯化蛋白质复合物的方法是在游离的蛋白质之中出现错误折叠的蛋白质。如果游离蛋白质的初始溶液中含有相当一部分比例的错误折叠的蛋白质，可能会得到一种反映活性与非活性蛋白质间构象差异的错误足迹法。
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2.这种蛋白质不应该含有妨碍特定末端标记的加入的任何内源性磷酸化位点。然而，内源性PKA相同序列的出现并不一定意味着它在体外可能进行磷酸化；在通过突变来除去这个位点之前最好进行检查。
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3.这种蛋白质应该以其全长序列的形式来进行均一纯化。降解的产物（含有磷酸化位点）也会被标记，并且产生干扰信号的背景片段。减少这种问题出现的方法将在本章“末端标记”那一部分中进行描述。
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尽管蛋白酶足迹法有一些局限，但是它仍然是一种相对简单的方法，可以对涉及与其他分子相互作用的蛋白质区域进行直接描绘。表16.1包括已经利用蛋白酶足迹法进行研究的代表性蛋白质，并根据所采用的蛋白质水解方法和特征性的复合物的类型加以分类。这些研究已经与已知的三维结构进行比较，并且所应用的检测方法类型已经在表16.1中进行总结。这张列表有助于说明必须检测几乎任何一种类型大分子组装的灵活性。
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蛋白质水解的类型
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两种最普通的、用于蛋白质消化的试剂是小分子化学制品（主要产生羟基自由基的金属—螯合复合物）和酶（如：蛋白酶K）。这两种试剂都被广泛地应用（表16.1）。化学物质，如溴化氰和BNPS〔3-溴-3-甲基-2-（2-硝基苯巯基）-3H-吲哚，粪臭素〕可以在特定的残基断裂蛋白质（分别是蛋氨酸和色氨酸），并且在描绘蛋白质结构和相互作用方面已经成功地应用几十年。然而，大多数试剂要求极端苛刻的反应条件，很难用这种试剂来作用于天然蛋白质，并且因为它们的特异性而不能频繁断裂，从而产生少量的数据。与之相反，金属—螯合复合物，例如：铁-EDTA和菲咯啉—铜（Baichoo and Heyduk，1999），可以产生相对复杂的断裂图谱。起初，这些试剂从均一的梯形条带形式产生DNA足迹，也给蛋白酶足迹法带来同样的利益。在温和的条件下，铁-EDTA产生羟自由基，它能非特异地断裂蛋白质和核酸。这些自由基在大小上可以与水分子相比的事实，允许一个蛋白质的全部暴露于溶剂的表面用于断裂，导致了对经过与其他分子相接触的或发生构象变化的区域进行较细致和精确的描述。
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表16.1 通过蛋白酶足迹法鉴定蛋白质复合物
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表16.1 通过蛋白酶足迹法鉴定蛋白质复合物（续）-1
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利用铁-EDTA螯合来消化蛋白质主要存在两个缺陷。首先，其断裂位点并不通过序列来确定，因此当归属断裂位置时要求详细地分析它们与标准标志物的关系。其次，在鉴定蛋白质内对断裂的敏感而发生微妙变化的区域时必须进行广泛的数据分析（在本章“定量分析”中描述）以及进行几次实验的均化。因此，依据所采用的末端标记的类型，必须应用一种磷屏阅读装置，或者经光密度仪分析的X-光胶片，或者荧光图像分析设备来采集用于该类型分析的数据。
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另一方面，酶促蛋白酶对大多数研究者来说是比较熟悉的，并且有几个优点。首先，它们简单且易于操作。蛋白酶可以轻易地跨越几个数量级。其次，产生相对较少的消化产物，通常使数据便于解释。
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采用酶促蛋白酶的主要缺点是：（1）断裂反应的序列特异性和（2）蛋白酶的分子量较大，则进一步限制了它们与潜在断裂位点的接近。因此，对于将仅含有几个断裂位点或根本就没有断裂位点的区域的蛋白质而言，酶促的蛋白酶将不可能完全鉴定这些区域。
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其他方法
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另一种应用化学蛋白质水解来对大分子相互作用进行描绘的方法是利用限定的金属—螯合复合物。在这种方法中，限定的金属—螯合物以共价形式附着于某一未标记蛋白质的半胱氨酸或赖氨酸残基上，它可以形成含有目的末端标记蛋白的大分子复合物。随后，加入过氧化氢和抗坏血酸盐而产生羟自由基来启动断裂（综述见Datwyler and Meares，2000）。如果半胱氨酸或赖氨酸残基是惟一的，这将导致特异裂解以及便于描述与这些残基邻近的其他蛋白质区域。另外，这种金属—螯合物被限定在多重赖氨酸或半胱氨酸残基，以产生这个复合物内的较为普遍的相互作用特征（Traviglia et al.，1999）。当这种断裂产物在变性蛋白凝胶中进行分离时，并列放置在与金属—螯合复合物结合的邻近位点的蛋白质复合物区域内的末端标记蛋白内的残基可通过鉴定断裂位点的位置来确定（在本章“定量分析”中进行描述）。
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利用限定蛋白酶的优点是它能鉴定邻近的残基。广谱的蛋白酶不能对某一特定残基的邻近位置作图。另一种优点在于其结果较应用广谱金属—螯合物时容易解释，因为仅产生较少的片段。此外，这项技术比较敏感，因为相互作用相对于空白背景而言产生断裂产物，而不是一种信号的降低，这更有利于鉴定低亲和性的相互作用。缺陷在于只能限制应用赖氨酸或半胱氨酸残基附加在金属-螯合基团上，只能鉴定连接子支臂距离内的残基/区域而非直接接触点，并且不能确定诱导的构象改变。
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另一种基于化学修饰法，而不是直接酶切的蛋白质足迹法能够产生高分辨率的数据（Hanai and Wang，1994）。此外，这种技术对于检测发生轻微断裂即产生变性，但对于所应用的化学物质却维持稳定的蛋白质是特别有用的。在这种方法中，游离的蛋白质（未结合）和组装在蛋白质复合物中的蛋白质平行予以一定量的柠檬酸酐处理，可以可逆修饰暴露的赖氨酸残基。随后，蛋白质发生变性，并且所有的之前没有被柠檬酸化的赖氨酸发生乙酰化。接着，通过在醋酸中孵育修饰的蛋白质来除去柠檬酰基。终产物得以回收，而解除封闭的赖氨酸残基随后进行完全消化。当组装成复合物时，已经暴露的赖氨酸残基逐渐被包埋，并显示出降低的消化速率（例如：保护）。这种方法的优点在于能够利用小分子化学物质接近几乎所有暴露的区域，并且已组装的复合物不会发生蛋白质水解从而破坏其完整性。其缺点在于只含有赖氨酸的区域的蛋白质能够被鉴定。一种用来检测含有半胱氨酸残基的结构域的类似方法也已经得到发展（Tu and Wang，1999），并且可被用来获得其他的信息。
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蛋白酶足迹法是一种一般分子生物学实验室都应具备的方法。在图16.2的流程中描述了基本步骤，这种技术的不同版本是通用的。这种强有力的方法提供了获得关于特定大分子相互作用的结构信息的途径。对于完全测序的基因组，现在遗留的问题是：这些基因序列编码的蛋白质的功能及作用是什么？在细胞内执行关键酶促反应和调节功能的大分子复合物的直接结构研究，是对于遗传学方法、计算方法和其他现代生物学方法的有力补充。
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图16.2 蛋白酶足迹法的步骤流程图
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程序纲要
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末端标记
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一种特定的末端标记对于蛋白酶足迹法的成功是很关键的，而蛋白激酶A（PKA）提供了一种简单、可重复的方法（Pestka et al.，1999）。含有一个PKA识别位点（X-Arg-Arg-X-Ser-Y，然而X与Y最理想的情况分别是精氨酸和疏水性残基）的蛋白质可通过分别在氨基端和羧基端进行设计制备，这已经用在蛋白酶足迹法中（表16.1）。关于识别位点的诸多细节，请参见Songyang等（1994）。分析时，同时使用氨基端和羧基端标记的蛋白质可以获得比较完全的数据。在[γ32P]ATP、[γ33P]ATP和PKA的催化亚单位存在时，丝氨酸残基发生磷酸化，产生一个末端标记。32P和33P在蛋白酶足迹法中都用来作为标记末端。
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在应用这种方法标记一个蛋白质之前需要检查以下几种性能。首先，被介入的PKA位点是独一无二的，或者其他的位点应被包埋且不能接近。这是很重要的，因为内源位点或多个表面位点会使含有磷酸化末端标记的片断不再清晰。应该检测野生型蛋白质的序列是否存在内源性的PKA识别序列。如果有PKA序列，野生型蛋白质的磷酸化效率将与一个已知能被PKA磷酸化的蛋白质进行比较性测试。如果目的蛋白能够被有效地进行磷酸化，假定突变不能影响这个蛋白质的结构和功能，这些位点可以通过定点突变加以排除〔另外，末端标记也能通过酪蛋白激酶Ⅱ产生，并且一个在末端进行设计后所含有的识别序列不同于PKA所产生的（Schwanbeck et al.，2000）〕。如果一个蛋白质缺乏内源性的PKA识别位点，则可将其设计到这个蛋白质的末端。此外，在一个磷酸化反应中，隐藏的磷酸化位点也应该通过与等量的含有或缺乏设计PKA标签的蛋白质进行孵育来检测，并且选择这些反应的小量产物进行SDS-PAGE分析。结合的比例和特定的磷酸化与偶然的背景磷酸化的比率应利用磷屏阅读装置分析或通过光密度仪检测放射自显影而确定。在进行蛋白酶足迹法的实验中，这种比率应至少为10∶1。可通过反应的时相和酶的滴定过程来优化标记的程度和特殊的标记。
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在末端标记反应中所需蛋白量依磷酸化反应和复合物组装的效率而定。为了获得最高特异活性的末端标记蛋白，需要合适的PKA位点（Songyang et al.，1994）以及使用含有10～30pmol蛋白质和超过3～10倍量的[γ32P]ATP或[γ33P] ATP参与的反应体系。仅当（1）获得低结合速度，（2）由于低亲和相互作用，并且纯化结合蛋白质导致材料严重丢失，而只有部分游离蛋白质可被组装成复合物时（参见本章“复合物的组装”），最佳标记条件的应用特别重要。另外，在反应中，如果这个信号足以用来观察消化的图谱，则通过增加蛋白质浓度或降低ATP浓度所获得的低特异活性是可承受的；而且如果加大蛋白质的量可促进组装复合物的反应，这种低特异活性具有一定的优点。人的一种通用转录因子TFIIA的磷酸化反应在图16.3中加以说明。TFIIA利用两个名为αβ和γ的亚单位进行重新组装。在TFIIA分子的反应中，含有（泳道1）或者缺乏（泳道2）PKA识别位点γ的亚单位在图16.3B中显示。特异性与非特异性的比率是20∶1。
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图16.3 人TFIIA γ亚单位的末端标记
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其次，将磷酸化蛋白质的特异活性与野生型进行比较是重要的，以确保磷酸化或孵育状态下活性没有产生严重的丢失。正如前面所讨论的，无活性或者错误折叠蛋白质的存在能产生一个“假”足迹。因此，应该对已知量的蛋白质分别用或不用[γ32P]ATP进行一种磷酸化反应的测试。如果磷酸化反应导致活性的丢失，则将PKA识别位点放在相反的一端可能足以排除这种影响。如果无活性仅由孵育所致，那么磷酸化反应可以在4℃过夜进行，或者进行其他的反应条件的筛选。
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第三，被标记蛋白质的完整性也是很重要的因素。任何含有PKA识别位点的降解产物都将被标记，并且在检测时产生背景条带。有两种方法可用来排除降解所导致的潜在问题。首先，可用来纯化蛋白质的序列如6个组氨酸标签被设计到PKA位点相反的一端。因为纯化的标签和PKA位点在相反的两端，因此只有全长的蛋白质才能既被标记，又被纯化。TFIIA，利用含有His6和PKA识别位点的γ亚单位在同一端进行重新组装，由于降解产生了背景磷酸化产物（见图16.3A，泳道1）。利用相反一端的His6标签纯化得到同一个蛋白质可排除背景的标记（见图16.3A，泳道1和16.3B，泳道1）。另外，数据分析也可用来校正降解产物的出现。对于既定的制备样品，在全长蛋白质、末端标记蛋白和截短体之间存在一种可定义的关系。这些数值可以用来校正每一泳道中所检测的图谱。对于这种分析，一种潜在的问题是在截短体之间增加了错误折叠形式的可能性。在某种情况下，可能暴露或阻碍了这种蛋白质的区域，并产生或减少了与正确折叠部分相关的消化片段。
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在完成磷酸化反应的时候，已标记的蛋白质可以通过几种方法，包括旋转柱或透析等从未结合的[γ32P] ATP中纯化。另外，过量的非放射标记的ATP被加入到反应体系中，以防止在随后的实验中标记到其他蛋白质。只要混合溶液中这些组分不抑制下一步的反应，则可不经进一步的纯化而被使用。因为ATP是小分子，它能迁移到一定的位置。仅阻碍小于10个残基片段。例如：在图16.5中，末端标记的TFIIB溶液也含有未结合的[γ32P]ATP，但是它没有被观察到，尽管梭菌蛋白酶或胰酶（泳道2～11）产生的约5个残基的片段可明确鉴定。
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如果磷酸化不是一个用来标记蛋白质的有效方法，还有其他的方法可以达到这个目的。利用赖氨酸或半胱氨酸残基，通过特异性地在一端附加一种荧光标签，也可以进行直接末端标记。在下面的一个例子中，Cy5荧光染料可经过修饰，被附加到一个特定的半胱氨酸残基上（Callaci et al.，1998）。另外，可利用免疫印迹方法进行间接末端标记。这个蛋白质经过设计后含有一种抗原表位，例如：FLAG，myc或者His6标签，使其商品化而成为高亲和性的抗体（Lindsley and Wang，1993）。
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当抗原表位位于一端时，某些抗体不能工作，因此，应该仔细考虑其工作性能。作为另一种选择，取代抗体的是生物素化的亚硝基醋酸，它能被用来探测含有His6标签的膜蛋白（McMahan and Burgess，1999）。如果这个蛋白质不能在末端加入或改变残基，那么识别内源性末端的抗体可被应用（Heyduk and Heyduk，1994；Cheng et al.，1998）。在这种情况下，一个复合物内的多种蛋白质可通过使用多种荧光标签或不同蛋白质的抗体，在同一个实验中得以检测（Greiner et al.，1996；Owens et al.，1998）。测试任何设计残基对蛋白质活性的影响，以及从这些方法中检测背景的实验必须进行。
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一旦用于对目的蛋白质进行末端标记的方法得以建立，则须确定电泳标志物，以测定每一裂解位点所产生的蛋白质水解片段。这些标志物将在本章“断裂位点的鉴定”中详细描述，包括末端标记蛋白质的特定位点的蛋白质水解以及含有同样末端标记的设计缺失突变，但是从相反的末端被切割。
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复合物的组装
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在蛋白酶足迹法实验中，当非复合物蛋白质在那些位点进行消化时，会产生阻碍保护作用的背景信号，因此末端标记的蛋白质必须定量地装配成所需要的复合物。如果亲和性很高，可能通过简单地加入过量的配体得以完成。应该应用足够的量，以便所产生的消化图谱能得以观察，并且所得的数值取决于末端标记蛋白的特异活性。在每个消化过程中，所应用的常用浓度是含有10000～30000Cerenkov计数的结合标记的蛋白质的量。当标记的效率比较低时，需要较高浓度的蛋白质才能观察到结果。在某些情况下，如果亲和性不足，必须应用其他措施从非复合物蛋白质中分离复合物蛋白质。几种方法在操作手册中可见，这里仅做简单的讨论。在蛋白质—蛋白质复合物的情况下，末端标记的蛋白质可以与携带配体蛋白质的亲和树脂结合。一种产生这样一种亲和树脂的简单策略是表达这种与谷胱甘肽-S-转移酶（GST）相融合的配体蛋白质，然后利用谷胱甘肽琼脂糖进行纯化。融合的蛋白质必须经过活性检测，这部分将在第4章描述，如果存在活性，随即用来组装复合物。同一融合蛋白的突变体（含有终止复合物形成的特异突变）的平行亲和树脂，和/或GST自身，应该设为对照组，来建立特异组装复合物的条件。
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蛋白质—DNA和蛋白质—RNA复合物可以利用生物素化的、附着在含有链霉亲和素基质的核酸来进行纯化。显示含关键突变的寡核苷核、或从组装反应中消除所需要的蛋白质的亲和树脂应作为对照，来建立特异复合物形成和随后的蛋白质水解的反应条件。当亲和性很低，而要求用其中一种方法来纯化目的复合物时，大部分的材料不能重新获得。这在设计组装的时候必须要考虑。通常每个消化反应中（例如：每个泳道）含有大于10000Cerenkov计数的末端标记蛋白质是足够的。与亲和基质必须进行孵育的末端标记蛋白质的实际用量将取决于复合物形成的特异活性和效率。
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蛋白质水解
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与DNase足迹法的情况类似，基本上每个蛋白质分子根据其长度都应被进行最大单次切割。为了达到“单一切割反应条件”，蛋白质水解反应应该被控制在大于50%的蛋白质没有被切割（Brenowitz et al.，1986）。这得通过比较在一个泳道内未切割条带的强度和整体强度才能确定。对单一切割反应的蛋白质水解时间依经验而定，并且应该考虑被鉴定复合物的稳定性。例如肌球蛋白的抗体能够在较低蛋白酶浓度下孵育过程中生存较长时间（Zhong et al.，1995）。然而，经常首先考虑缩减消化的时间，因为初始断裂可能导致一些蛋白质的解折叠。增加消化反应的时间会提供给已暴露的次级位点以断裂的时间。在复合物不是很稳定的情况下，应该在较高浓度的蛋白酶条件下缩短孵育时间。或者必须进行一系列的浓度和时间梯度的优化，来平衡适应复合物稳定性要求的单一条件。
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进行含有末端标记蛋白和游离（未结合）末端标记蛋白质的对照组的平行消化反应是必要的。另外，其他的一些对照可能也是必需的，取决于组装（或纯化）复合物所研究的方法。如果复合物已经被组装到亲和基质中，那么末端标记蛋白应该在对照亲和树脂存在的情况下进行消化。例如：当蛋白质—蛋白质复合物在一个GST为基础的亲和基质中被组装和纯化时，与 GST—配体和GST自身进行孵育后应该检测末端标记蛋白质。
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GST树脂在形成特定的复合物的状态下，将仅会保留一小部分末端标记的蛋白质。在这种情况下，必须使组装反应经过较小的一个周期的“清洗”而保留足够的末端标记蛋白来进行检测。在另一个例子中，当要检测三元复合物时，为了确定每一个组分的作用，对照应该包括游离的蛋白质和二 元组分。通常，蛋白酶足迹法所要求的对照将与那些要求建立复合物组装特异性的实验一致。
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羟自由基断裂实验需考虑更多的因素。试剂的准备和它们加入蛋白质之中的时间是重要的。铁-EDTA复合物通过混合硫酸铵亚铁和EDTA溶液而产生（Dixon et al.，1991；Heyduk and Heyduk，1994），或者通过已经形成的铁-EDTA复合物制备（Greiner et al.，1996；Kumer et al.，1997）。这些溶液应该在临用前配制。利用1mmol/L EDTA和0.5mmol/L铁作为最小的浓度，并且用抗坏血酸和过氧化氢来进行常规滴定确定最佳浓度。图16.4说明了这样实验的一个例子，通过铁-EDTA复合物进行蛋白质水解来检测cAMP受体蛋白（CRP）—cAMP结合DNA。与DNA结合的CRP区域转变成包埋状态，将会使来源于此结构域的片段的信号强度降低，而蛋白质区域转变成暴露状态将会产生增强的信号强度。当CRP结合DNA时，利用不同的图谱来确定任一特定位点的相关变化来鉴定受到严重影响的位点，以及在图例说明中利用描述的方法进行计算。负值反映包埋比较多的（保护）区域，而正值反映比较暴露的区域（高敏感性）。从多次试验中计算所得超过2倍标准误差的变异（泳道1、3）被认为是有意义的。注意在残基161～183位置的保护作用从胶上观察是很明显的，而48～58和79～88残基的保护作用则要求分析来加以明确。
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图16.4 CRP—cAMP及其与DNA复合物的铁-EDTA断裂
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图16.5 检测TFIIB的蛋白质水解反应
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因为铁—螯合物复合物必须产生羟自由基才能工作（Croft et al.，1992），所以必须在无自由基清除剂如甘油和巯基的缓冲液中才能发生反应。如果一个蛋白质储存于含有清除剂的缓冲液中，则需要透析和除盐以更换缓冲液。
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许多不同的酶促蛋白酶已经应用到蛋白酶足迹法中（参见表16.1）。它们与化学蛋白酶比较将会在更加有限的几组位置发生断裂，并且在每一种情况下产生最好信号的酶必须依经验而定。当确定所应用的消化条件时，所应用的蛋白酶量和反应时间可以变化。通过产生一系列的稀释，并在较宽的范围内检测蛋白质水解的产物才能确定最佳的蛋白酶浓度。通常蛋白酶的应用范围是20～2000ng。图16.5说明建立人TFIIB消化条件的一组反应。
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蛋白酶的最佳量是能够使全长蛋白质有30%～50%发生消化的蛋白酶量。在这种条件下，蛋白酶水解片段的信号是最强的，而在这个范围内，会产生单一酶切反应。不同的蛋白酶消化蛋白质的不同部分，并且在目的蛋白质区域发生断裂的酶应该在实验中加以应用。通常，要求稍微大量的蛋白酶来消化与游离蛋白相关的组装复合物。甚至在一个试验中已经鉴定出一个最佳浓度之后，以此浓度为中心所设的三个浓度在随后的实验中也经常被应用，以期获得最佳的结果。为了获得最一致的结果，蛋白酶应该等量分装冻存，通常的浓度是1mg/ml。在反复冻融过程中会发生自身降解和/或变性，这会增加实验结果的变异（R.Hori，unpubl）。
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断裂位点的鉴定
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用于分离消化产物的体系分辨率越好，断裂位点的归属就越精确，因此，在保护和高敏反应中涉及的残基也越精确。应用N-三（羟甲基）甲基甘氨酸来替代甘氨酸作为载体离子可以对较小片段产生较高的分辨率（Schagger and von Jagow，1987），尽管它能用来分析分子量大小为100kD的片段，而它最大的优点在于从分子量20kD到1kD之间可增加片段的分辨率。此外，凝胶中丙烯酰胺比例的变化允许不同分子量范围的断裂产物被靶定和分析。N-三（羟甲基）甲基甘氨酸和甘氨酸为基础的系统已经被用来联合分析大分子量蛋白质的片段（Casaz and Buck，1999）。甘氨酸为基础的凝胶对分离从分子量15kD到100kD之间的片段是有效的。较大的分离胶也可以增加分辨率。其他候选的分离片段的方法是毛细管电泳和质谱（Cohen et al.，1995；Kriwacki et al.，1996）。质谱的高灵敏性也允许其分离大小非常接近的片段。然而，通过金属-螯合复合物断裂所得的结果很难利用这种方法进行分析。羟自由基能攻击氨基酸侧链和肽键；断裂产生的不同大小的片段，每一个都来源于这个蛋白质的相同部分。近来，基质辅助激光解析电离（MALDI）被用来对通过羟自由基修饰的侧链进行作图，该方法有希望进一步应用（Maleknia et al.，1999）。
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检测断裂片段所用的方法依末端标记的类型和所用的分离系统不同而异。在变性聚丙烯酰胺凝胶的情况下，磷屏阅读装置或放射自显影能被用来检测放射性末端标记，而且荧光图像阅读装置则针对荧光标记。免疫印迹将利用抗体直接对抗内源性或设计末端。不管如何检测断裂产物，需要对鉴定相互作用和/或构象变化的位点进行作图。通过比较利用蛋白质水解所产生的片段迁移性与已知标准相比，包括商品化预染的分子量标志物，缺失突变和末端标记蛋白质的位点断裂产物。因为不同肽片段的分子量不可能与其迁移性保持一种精确的对数关系，所以预染的标志物仅能给我们提供大约断裂位置的第一印象。位点的精确鉴定（5个残基以内）则要求下面所描述的标志物。通过位点特异性断裂来产生移动标志物，末端标记蛋白处于非折叠状态，然后通过化学或者通过酶促蛋白酶进行消化特异的氨基酸残基，如溴化氰（靶定蛋氨酸），及内切肽酶赖氨酸C（靶定赖氨酸）。通过比较产生片段与从这个蛋白质的一级序列所推测的片段的大小和数目来归属断裂位点。然而实际上，由于环境和残余蛋白质结构的不同，某些位点的切割超过其他的位点。为了提高对片段归属的可信度，我们用一组由特殊方法产生的标志物来归属由不同方法产生的另一组蛋白质标志物。利用标准的分子克隆技术对一组缺失突变进行设计，并且必须含有作为全长分子的同样末端标记。这些对于描述那些在一个复合物内受到影响、但不能通过位点特异性断裂标志物来作图的关键区域是特别有用的。伴随缺失突变，利用化学和酶促方法联合产生标志物从而精确归属断裂位点是可能的。
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定量分析
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当利用金属—螯合复合物时，由于产生大量的断裂位点使得我们很难看到微小但是在断裂易感性上发生的显著变化，或者很难确定由于复合物形成而对此发生效应的条带强度的差异变化。因此，必须利用统计学或图表方法来鉴定在相互作用中所涉及的蛋白质区域。定量分析的第一步是获得一个数字化图像。利用光密度仪、磷屏或荧光图像分析仪，对每一个泳道的长—宽进行扫描，加以量化，产生作为迁移功能的强度图表。这可以利用与图像分析相关的软件，或者通过将数据库文件输出到图、表程序中。通过校正迁移中微小差异对不同泳道内相似的条带随后进行对齐。我们通过在一个表中用手工调节行或者画图，或者利用特殊的软件，如ALIGN（用BASIC语言编写，T.Heyduk应用）来完成。对齐扫描随后通过对凝胶上样量和断裂效率加以校正，并且通过差异图进行相互比较。在一般情况下，我们必须利用统计分析的多次实验均值来观察断裂图谱的差异，并且能利用标准的表格软件来完成。另外，特殊软件，如DIFPLOT（由Sigmaplot转化语言编写，T.Heyduk应用），使归一化和平均化联合起来，也被应用（Baichoo and Heyduk，1999；Loizos and Darst，1999）。这些图表使得游离和结合蛋白质之间的差异归一化来表明氨基酸残基的数目。这种分析的例子可在图16.4中见到（前已描述）。为了排除人工假象，并且突出真正的差异，需要通过多次实验来确定差异间的均值，并且一些统计方法，如标准误（图16.4的细线）和Student’st检验可被应用。经广泛分析之后，我们将明确地归属发生变化的蛋白质区域。
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方案
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方案1：利用蛋白激酶A进行末端标记
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材料
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缓冲液和溶液
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分子克隆手册：蛋白质—蛋白质相互作用
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酶和缓冲液
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从小牛心脏而来的催化亚单位（PKA）（Sigma P2465）
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根据产品说明，在6mg/mlDTT的溶液中重悬瓶中全部内容物，使其浓度达到5单位/μl。分成每次所需的量，随后冻在干冰上，在-70℃下保存。经观察单次的冻融没有发生酶活性的显著丢失（R Hori，unpubl）。
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凝胶
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分子克隆手册：蛋白质—蛋白质相互作用
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附加试剂
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小牛血清白蛋白
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Milli-Q（Millipore）
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三氯醋酸〈！〉
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标记成分
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[γ32P] ATP（大于5000Ci/mmol）或 [γ33P] ATP（大于1000～3000Ci/mmol）〈！〉
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方法
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1.将下面的成分混合：
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5×磷酸化缓冲液 20μl
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PKA的催化亚单位（30units） 6μl
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[γ32P] ATP（大于5000Ci/mmol；约100pmol） 500μCi
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或者[γ33P] ATP（大于1000～3000Ci/mmol） 100～300μCi
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野生型和PKA为标签的YFP 10～30pmol
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对于高特异活性，需要应用超过3～10倍标记的ATP。最佳的量需要经验来确定。
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加Milli-Q 水到100μl。
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2.在25℃孵育45min。
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3.加入1μl 100mmol/L ATP来终止反应，并且置于冰上。
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另外，末端标记的蛋白质能够利用凝胶过滤柱或透析的方法从未结合的ATP中纯化出来（Kumar et al.，1997）。
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4.从每个反应中取2μl加到10μl 2×SDS 凝胶上样缓冲液中，90℃加热3min。
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5.将样品加到SDS聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳，直到溴酚蓝前沿移至底部2/3的位置。将凝胶转移至一片旧膜上，并用塑料膜完全包裹。利用放射自显影和光密度仪（或者在70℃下真空干燥1h后通过磷屏阅读装置）来确定放射性结合的效率及特异性和非特异性标记的比率。
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另外，这些反应可用凝胶过滤柱或沉淀来分析（Kumar et al.，1997）：
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a.将3μl的标记反应物，0.5ml的0.1mg/ml的小牛血清白蛋白（作为载体）和0.5ml冰冷的20%的三氯醋酸共同冰浴30min。
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b.在10000g条件下离心5min，随后用1ml冰冷的丙酮清洗沉淀。
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c.对沉淀物和3μl初始标记反应直接通过闪烁仪进行记数（Cerenkov）。通过比较数值来决定结合速率。
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6.将蛋白质分成5个等份，每份20μl，使冻融循环减少到最小（通常每次足够发生一次反应），干冰上冷冻，随后冻存于-70℃下。
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方案2：铁-EDTA蛋白酶足迹法反应
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材料
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缓冲液和溶液
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分子克隆手册：蛋白质—蛋白质相互作用
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凝胶
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SDS聚丙烯酰胺凝胶（甘氨酸或N-三（羟甲基）甲基甘氨酸为基础）
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对于SDS—聚丙烯酰胺凝胶的详细情况，请参见Sambrook and Russell 2001，Molecular Cloning（以甘氨酸为基础）和这一部分（以N-三（羟甲基）甲基甘氨酸为基础）。
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附加试剂
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从方案1和对照而来的复合物
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方法
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1.在25μl 的40mmol/L硫酸铵亚铁和25μl的80mmol/L的EDTA混合之前，开始准备铁-EDTA 复合物，随后加入50μl的反应缓冲液。另外，已成形的铁-EDTA复合物能被应用（Greiner et al.，1996；Kumar et al.，1997）。
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2.组装复合物来进行蛋白质水解反应。用来进行消化反应的对照实验应该平行进行，并且在其他的方法中，还要包括末端标记的蛋白质自身（例如：非复合物），在对照的亲和基质不能特异性结合的情况下，或者在二级复合物存在的情况下（需要鉴定一种四级复合物）。
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3.按照下面的顺序加入：用铁-EDTA、过氧化氢和抗坏血酸来组装复合物和对照。
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如果有许多样品需要处理，可以简化这些步骤，将每种适量试剂加至微量离心管盖内侧的不同位置，随后合上盖子，同时离心，并启动反应。
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对于cAMP受体蛋白（CRP），需要应用下面的量：1μl铁-EDTA复合物1μl0.2mol/L抗坏血酸1μl10mmol/L过氧化氢
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将10μl的反应体积加到蛋白质复合物（6μmol/L CRP）和反应缓冲液。
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图16.4是蛋白酶足迹法实验的一个例子，比较在DNA结合位点出现和缺乏时的CRP。
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4.在一定的合适时间内消化。（在各种研究中1～30min的反应时间被采用。）
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5.加入5μl 3×样品缓冲液终止断裂。将样品储存于-70℃，直到通过电泳分离。
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6.在SDS聚丙烯酰胺凝胶上分离样品〔甘氨酸或N-三（羟甲基）甲基甘氨酸为基础，取决于末端标记蛋白的分子量和目的蛋白的区域〕。对照组应该加至同一块凝胶上，包括未消化的末端标记蛋白，标准化梯形条带（位点特异性的断裂和/或设计的切割），以及预染的分子量标志物。每一个样品在90℃加热3min。每一个样品加样14μl。
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7.在70℃真空干胶1.5h，将胶通过磷屏阅读或者膜曝光来检测。
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方案3：利用酶促蛋白酶进行蛋白质水解
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材料
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缓冲液和溶液
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分子克隆手册：蛋白质—蛋白质相互作用
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酶和缓冲液
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各种蛋白酶，如碱性蛋白酶（枯州蛋白酶）、胰酶和胰凝乳蛋白酶，根据说明书通常用浓度为1mg/ml，并且于-70℃保存分装
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凝胶
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SDS聚丙烯酰胺凝胶〔甘氨酸或N-三（羟甲基）甲基甘氨酸为基础〕
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对于SDS-聚丙烯酰胺凝胶的详细情况，请参见Sambrook and Russell 2001，Molecular Cloning（甘氨酸为基础）和这一部分〔以N-三（羟甲基）甲基甘氨酸为基础〕。
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方法
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检测反应体系以优化蛋白质水解
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1.在冰上，进行一系列的3倍稀释，在复合物组装缓冲液+0.1mg/mlBSA中每种蛋白酶从1∶3到1∶729。
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2.在室温条件下，混合1pmole的末端标记蛋白质（占高特异活性的末端标记反应的3%）。将反应体系用复合物组装缓冲液加至140μl。将此溶液分装成20μl等份。
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3.在0、12、24、36、48、60s时加入2μl每种蛋白酶稀释液。
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4.在室温下孵育2min。在每个反应中加入合适的蛋白酶抑制剂2μl，立即在干冰上冷冻。
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5.通过SDS聚丙烯酰胺蛋白凝胶分离样品〔甘氨酸或N-三（羟甲基）甲基甘氨酸，依靠末端标记蛋白质和目的区域的分子量〕。加入24μl 2×SDS凝胶上样缓冲液，在90℃下加热3min。每个样品加样16μl。电泳到溴酚蓝前沿抵达凝胶底部的3/4为止。
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6.干胶，并将膜或者磷屏曝光，来检测断裂图谱。
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从这个实验所建立的条件可以用来进行蛋白酶足迹法实验。可以用下面的操作替代上面的步骤2。伴随所设合适的对照，复合物进行组装（例如：未形成复合物的蛋白，或者在对照亲和基质存在下的蛋白质）。组装复合物之后，立即分成4等份，并且3份利用各种蛋白酶量进行有限的蛋白质水解，1份不经过消化。这种组装的复合物通常比游离的蛋白质要求2～5倍多的蛋白酶。
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方案4：Tricine SDS-聚丙烯酰胺蛋白凝胶
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材料
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缓冲液和溶液
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分子克隆手册：蛋白质—蛋白质相互作用
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方法
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1.制作分离胶。将7ml50%丙烯酰胺、7ml凝胶缓冲液和7ml40%甘油混合，过滤，随后加入70μl 10%过硫酸铵和7μl TEMED，并将之灌入垂直的制胶模具中。用去离子水（或20%乙醇）覆盖直到聚合。
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在某些情况下，排除或降低凝胶中的甘油没有破坏性的影响（R.Hori，未发表）。
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2.从分离胶上将水吸去。
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3.用浓缩胶覆盖，随后插入梳子。制作浓缩胶时，将1ml50%丙烯酰胺、3.1ml凝胶缓冲液和12.5ml去离子水混合，过滤，随后加入100μl 10%过硫酸铵和10μl TEMED。
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4.将样品注射入加样孔中，在14mA下电泳，使样品进胶，并且在24mA的电流作用下进行过夜电泳。
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5.在70℃下真空干胶1.5h，并且在磷屏或膜上曝光。
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如果需要的话，凝胶可利用45%甲醇、10%醋酸固定。与固定凝胶相关的一个问题是在干胶过程中增加了碎裂的倾向。
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方案5：通过溴化氰断裂蛋白质所产生的校准梯形条带
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材料
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缓冲液和溶液
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乙腈〈！〉
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溴化氰晶体（CNBr）（在4℃下储存在罐子里）（毒性很大）〈！〉
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水（去离子）
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HCl（1mol/L）〈！〉
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3×样品缓冲液（见方案2）
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SDS（10%）〈！〉
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凝胶
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SDS-聚丙烯酰胺蛋白凝胶〔甘氨酸或N-三（羟甲基）甲基甘氨酸为基础〕
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对于SDS-聚丙烯酰胺凝胶的详细情况，请参见Sambrook and Russell 2001，Molecular Cloning 这一部分。
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特殊的设备
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化学通风
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橱磷储屏
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SpeedVac真空干燥机
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Ultrafreezer（超低温冰箱）
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方法
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1.在-70℃超低温冰箱中预冷塑料架。
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2.允许在容器内的溴化氰在化学通风橱内升至室温。
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3.用空的离心管平衡。
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4.在通风橱下，将少量晶体溴化氰加入离心管（尽可能地快，以减少吸入）。
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5.在密闭的离心管中称量溴化氰。
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6.在通风橱，加入适量的乙腈获得106mg/ml溴化氰的储存液。
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7.组合随后的反应混合物：
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10%SDS 0.75μl
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1mol/L HCl 0.4μl
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溴化氰溶液 10μl
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最后加入溴化氰启动反应。用末端标记的蛋白质和去离子水加到终体积为25μl。
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8.在室温下孵育。将反应物带到-70℃超低温冰箱中。在不同的时间点（例如：5min或者10min）取出5μl样品，并放置在-70℃超低温冰箱的架子上。
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9.在反应结束时，用真空干燥机冻干反应物。
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10.在50μl 3×样品缓冲液中重悬干燥的沉淀。对从不同时间点获得的样品在变性SDS-聚丙烯酰胺凝胶上电泳，通常采用5μl，但它取决于末端标记蛋白的特异活性。
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11.在70℃真空干胶1.5h，并将膜或磷屏曝光，以检测其断裂图谱。这个图谱应与这个蛋白质原序列的蛋氨酸位置进行比较。
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12.将水加入溴化氰储存液中作废弃处理。将称量溴化氰晶体颗粒的药勺用水浸泡过夜。
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方案6：通过酶促断裂产生的校准梯形条带
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材料
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缓冲液和溶液
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分子克隆手册：蛋白质—蛋白质相互作用
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酶和缓冲液
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位点特异性蛋白酶（要求测序级或最好质量），例如：梭菌蛋白酶（在精氨酸位置断裂）或者内切肽酶 Lys-C（在赖氨酸处断裂）。根据各自的操作手册重悬溶解。
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附加试剂
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末端标记的目的蛋白
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专用设备
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放射自显影或者磷屏图像阅读装置
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方法
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1.将1pmol（占高特异性标记反应的约3%）的末端标记蛋白质加到50μl的变性缓冲液中。
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2.在65℃下加热30min。
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3.将反应混合物转移至37℃条件下。
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4.加入2μg 梭菌蛋白酶（或者其他位点特异性的蛋白酶，如内切肽酶Lys-C）。
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5.在2、6、18、54min时，取出10μl。通过加入1μl 0.5mol/L EDTA和1μl 10mg/mlBSA终止反应，并在干冰上冰冻。在-70℃储存。
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6.将样品在N-三（羟甲基）甲基甘氨酸为基础的变性SDS—聚丙烯酰胺蛋白凝胶进行分离，以检测蛋白质水解图谱。如果末端标记的蛋白质很大，或者不需要对小片段进行高分辨率，标准SDS—聚丙烯酰胺蛋白凝胶则可以应用。加入12μl 2×SDS凝胶上样缓冲液。在90℃对每个样品加热3min。上样量为6μl。电泳直到溴酚蓝前沿到达凝胶底部的约3/4为止。
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7.在70℃ 下真空干胶1.5h。
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8.通过放射自显影或者磷屏图像阅读装置观察断裂的图谱。
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参考文献
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17 串联亲和纯化提高相互作用蛋白质的识别
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前言
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标签的选择与设计
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用于蛋白质复合体纯化及相互作用分析的最适宜标签需具备下述特征：
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1.与偶联基质高亲和性结合利于稀溶液中低丰度靶蛋白的重获。
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2.高特异性结合使与亲和介质特异性与非特异性结合物的比例得到增加。
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3.有效及特异性洗脱可以获得高含量、高特异性的靶蛋白。
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4.温和的洗脱条件能够维持蛋白质的相互作用及蛋白质复合体的结构。
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显然，这些特点在某种程度上具有矛盾性，因为如果有高亲和性相互作用存在，要同时达到有效的洗脱和/或在温和的条件下洗脱一般是很困难的。同样的，有效洗脱通常需要严格条件，但又与维持蛋白质—蛋白质相互作用是不相容的。另外，对于运载蛋白的活性来说，适宜的标签还应尽可能地接近中性，而且还应在较大范围的盐离子及去垢剂条件下进行纯化。
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为选择有效的标签进行蛋白质纯化，我们筛选了多种与特性相适宜的标签如FLAG（Brizzard et al.，1994；Sambrook and Russell 2001，Molecular Cloning 15.4～15.6页）、His（Hochuli et.al.，1998）、Strep（Schmidt and Skerra，1993；Sambrook and Russell，2001，Molecular Cloning 11.118～11.119页）、葡萄球菌蛋白A的两个免疫球蛋白IgG结合单位（ProtA，Lohman et al.，1989）、钙调蛋白结合肽（CBP，Stofko-Hahn et al.，1992）、chitin-结合结构域（CBD，Chong et al.，1997）。对于从酵母中重获低丰度运载蛋白的效率及标签的选择性（非特异背景与亲和支持物结合的水平）要进行半定量检测。补充实验表明这些标签均没有影响靶蛋白Lsm3的功能。对于我们来说，ProtA和CBP是最为有效的标签，分别具有近80%和50%的靶复合物重获率（Rigaut et al.，1999）。
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在钙存在下，CBP与钙调蛋白的结合是高效和高度特异的。而且，这种相互作用可以被撤除钙所逆转（加入EGTA；Stofko-Hahn et al.，1992）。这种温和的条件看来并不影响许多蛋白质复合体的蛋白质-蛋白质相互作用。ProtA与兔IgG的结合也是同样非常高效和特异的（Lohman et al.，1989）。然而，洗脱结合物通常需要严谨的条件（如非常低的pH），这可能会破坏蛋白质复合体的完整性，还有可能把亲和介质非特异结合物洗脱下来。因此，我们决定在运载蛋白与ProtA之间引入一个蛋白酶断裂位点，以实现在温和条件下进行特异和有效地洗脱。因为蛋白酶TEV具有高度特异性并已经商品化，同时，有效断裂活性所需条件相对温和，因而，可以被选择用于实现这一目的（见材料一节）（Dougherty et al.，1989）。预实验表明，一步纯化法并不足以从细胞总粗提物中重获高纯度的蛋白质。因此，我们结合CBP标签和带有TEV蛋白酶断裂位点侧臂的ProtA来构建TAP标签（Rigaut et al.，1999）。纯化存在于粗提物中的TAP标签蛋白包括四个主要步骤（图17.1）：
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图17.1 TAP方法的理论与实践
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1.将靶蛋白结合于IgG珠子上（图17.1A）。
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2.充分洗涤后（图17.1B），在TEV蛋白酶作用下洗脱结合物（图17.1C）。
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3.在钙存在的条件下（图17.1E），将首次洗脱物中的蛋白质结合于钙调蛋白包被的珠子上（图17.1D）。
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4.在充分洗涤后（图17.1F），再加入EGTA洗脱结合物（图17.1G）。
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值得注意的是：在这一过程中，四种不同的结合与洗脱步骤是非常特异的，因而可以使纯化靶蛋白复合物的水平得到提高。尽管对于高丰度蛋白质来说，并不一定需要上述所有步骤，但如果靶蛋白丰度很低，那么这些步骤就需要了。从理论上说，在首步纯化中结合于IgG或钙调蛋白是没有差别的。但是，由于从IgG上洗脱需要额外加入TEV蛋白酶，这样就会对亲和介质上洗脱下来的物质造成污染，所以最好是先进行IgG介质的亲和纯化。第二步亲和步骤需除去污染的TEV蛋白酶及其他非特异污染物。结果，TEV蛋白酶的断裂仅仅是除去TAP标签的ProtA部分，保留融合于靶蛋白后面的CBP。因此，ProtA最好位于运载蛋白氨基或羧基端最末端。由于这一限制，我们构建了氨基或羧基端含有CBP、TEV蛋白酶断裂位点以及逆向ProtA部分的TAP标签（Puig et al.，2001）。由于TAP标签具有可调节性，因而TAP方法在应用上是非常灵活的。的确，在某些情况下，可以选择采用CBP和TEV-ProtA片段序列组件融合于两个不同的运载蛋白的“断裂TAP标签”，纯化同时含有两个靶蛋白的亚复合物（Caspary et al.，1999）。或者，在一些时候，将它们融合到缺乏TEV蛋白酶断裂位点的ProtA序列组件上，用于去除非目的蛋白（Bouveret et al.，2000）。
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编码TAP标签序列组件氨基或羧基末端的载体已经构建完成（Rigaut et al.，1999；Puig et al.，2001）。这些序列组件的结构，包括常用限制性酶切位点的位置，见图17.2所示。值得注意的是，对于TAP标签的氨基末端，需引入另外的肠激酶蛋白酶位点，使得在第二个纯化步骤后能够更充分地从靶蛋白上除去TAP标签。
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图17.2 TAP标签的羧基与氨基末端结构
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程序纲要
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构建表达TAP标签蛋白的细胞或生物体
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在构建融合蛋白时，应当考虑怎样使带有融合标签的载体导入受体细胞或生物体以及如何调控融合蛋白的表达。因为TAP纯化实验的目的通常是为了鉴定生理状态下的作用组分，应当在天然表达靶蛋白的细胞或生物体中或在提供的最为接近的系统中表达带标签的蛋白质。这种特点在多细胞生物中相当关键，因为在不同的组织中，在不同的发育阶段，靶蛋白可能会同不同的组分发生相互作用。避免靶蛋白的过表达同样也是非常重要的。尽管这一策略经常被用于避免内源性靶蛋白与天然组分的结合，然而，靶蛋白的过度表达往往会由于天然相互作用组分本身没有过表达而导致大量游离蛋白质形成。这些游离形式存在的靶蛋白通常容易与非天然结合的组分如热休克蛋白、蛋白酶体或细胞高丰度蛋白（如翻译因子或糖酵解酶）发生结合作用（Swaffield et al.，1995，1996）。如果游离靶蛋白大大超过相互作用的组分，在纯化分离中很可能会使非天然作用的组分过量甚至掩盖了天然作用的组分。因此，最好的办法是以TAP-标签的形式将编码靶蛋白的基因替换掉。但是，这种方法并不是万能的，这些问题都应在构建融合蛋白时加以考虑。
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通常，标准的克隆技术可以用于构建适当的带有TAP标签融合靶蛋白的载体（见Sambrook and Russell 2001，Molecular Cloning，1～4章载体克隆方法）。然后，按照所提供的此特定系统最佳操作步骤将这一载体导入受体细胞或生物体中。不过，在某些情况下，还会提供绕过克隆步骤的策略。如在裂殖酵母中有一个明显的例子就是通过用一段PCR片段简单地转换一个野生型的菌株，进而将内源性的靶基因以TAP标签的形式替换掉（Baudin et al.，1993；Puig et al.，1998）。
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制备提取物
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尽管质谱技术的发展极大地提高了蛋白质鉴定方法的灵敏度，在蛋白质纯化时仍需要大量细胞。应用TAP方法，它的量主要通过比较来进行估计，利用免疫印迹反应，将靶蛋白表达水平与纯化的带有TAP标签的蛋白质表达水平进行比较（如用Mud13p、Snu71p或Lsm9p作为对照[Rigaut et al.，1999]）。可以采用各种条件制备提取物，如从细胞、组织（从转基因生物体）或全生物体。显然，任何能够增加表达靶蛋白细胞数目的步骤都会促进对它的纯化。这包括采用组织或均一培养细胞代替全生物体或者用细胞分选代替全细胞提取物。提取物制备条件应当优化靶蛋白的产量，并要可溶且不能破坏蛋白质—蛋白质相互作用。在某些情况下，这些条件往往是难以满足的，因为靶蛋白与其他结构的相互作用可能要比它们与另外一些蛋白质的作用更难被打破（如膜蛋白溶解的条件可能会破坏靶蛋白与特异性相互作用组分之间的联系）。
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为建立设计提取物制备程序的基础，通常要进行文献调研，以界定曾经用该细胞系统制备提取物或纯化相关复合物的条件。通过预实验确定蛋白质提取的最适宜条件。然而应当谨记，条件越强越能增加靶蛋白的产量却减低了相互作用组分的水平。而且，靶蛋白可能会与多种组分发生相互作用，这些蛋白质复合物会以极不相同的效率被提取出来。通常地，增加盐和/或去垢剂浓度有利于蛋白质释放，但容易破坏天然的蛋白质相互作用；而低盐和/或去垢剂浓度不利于蛋白质释放却易发生非特异相互作用。如果允许的话，我们建议模拟靶蛋白细胞内环境，并因此维持其溶解性和相互作用的潜力。但应当牢记的是，在提取过程中任何条件的改变都可能不可逆地破坏一个蛋白质的相互作用：尽管在适当的条件下相互作用的蛋白质在随后的步骤中得到恢复，相互作用组分可能发生去折叠，被修饰或以太低的浓度存在以至于难以形成一定的再相互作用。
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还应当注意的是：在制备提取物过程中，不同细胞器或不同细胞类型的成分被混合在一起，会人为造成蛋白质之间形成非天然作用的机会，还会导致蛋白的降解和变性。这应当通过减少孵育时间、降低温度和/或加入蛋白酶抑制剂来尽可能予以避免。因此，蛋白质提取最适条件会随着蛋白质的不同而不同，并且随不同的细胞类型也有差别。应当按照上文中所给出的经验来决定。免疫印迹用于检测TAP标签蛋白小量表达，为我们在预实验中小范围检验不同的提取条件提供了一个有力工具。提取物可以直接用于纯化或者额外加入甘油或以含有甘油的缓冲液透析后冻存。在一些时候，在进行纯化之前，通过离心有助于从提取物中除去不溶成分（提取物制备条件的一个例子在本章方案1中制备用于纯化酵母Lsm3蛋白的提取物中给出）。
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串联亲和纯化
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图17.1详细阐明了TAP过程的各个步骤。第一步亲和选择是以批量的形式通过将粗提物与IgG珠子混合来实现的。未结合物通过重力作用排空；非特异结合物用结合缓冲液充分洗涤而除去（图17.1B）。然后，在进行TEV断裂反应前（图17.1C），用TEV断裂缓冲液洗涤珠子（见本章方案2）。断裂后，收集洗脱液（含有TEV蛋白酶）（图17.1D），以适当的缓冲液稀释，与钙调蛋白包被的珠子进行孵育（图17.1E）。充分洗去污染物和TEV蛋白酶（图17.1F），然后用EGTA洗脱纯化的复合物（图17.1G）。在一些检测实验中，我们估计这一方法可以重获大约20%～30%起始物质的总得率。在分析前可将纯化物冻存。然而，一旦开始进行功能检测，纯化物必须保存于含有甘油或其他活性保护成分的缓冲液中。这可以通过透析或直接在洗脱物中加入所需物质（如甘油）来实现。在这里需注意的是：即使TAP过程的最后一个洗脱步骤仍会破坏靶复合物（如维持这个复合物的稳定性需要钙），尽管这可能会破坏其活性，但并不影响对该复合物的组成分析。
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用于TAP纯化的各种试剂请见材料节（本章方案2），详细步骤见方法节。关于提取物的制备，要根据不同的靶蛋白采取相应的条件（盐浓度、去垢剂等，见上面）。同样地，降低温度和处理时间以及加入蛋白酶抑制剂有助于保持蛋白质和蛋白复合物的完整性。充分洗涤步骤应当加在两次结合和洗脱步骤之间，以避免纯化组分被背景物质所污染。同理，缓冲液条件的重大改变也应当避免，因为它们会造成非特异结合于亲和基质的物质的释放，而且还可以影响靶蛋白复合物的稳定性。对于TAP方法有一个潜在的疑虑就是宿主细胞的钙调蛋白可能与TAP标签上的CBP部分相互作用并妨碍其在第二步纯化过程中与亲和介质的相互作用。尽管这在理论上是可能的，但我们在实际中却从未遇到过。不过，如果存在这个问题，那么在提取物制备过程中需加入EGTA和/或者在第一步“在IgG包被的珠上的纯化步骤”中除去内源性钙调蛋白，暴露CBP，为第二个亲和步骤做准备。
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分析纯化后物质
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从TAP纯化后重获的物质可以通过多种方法分析，包括体外检测其活性，利用电镜分析其复合体的结构形状，并通过免疫印迹检测目的蛋白质的存在（Rigaut et al.，1999；O.Puig et al.，尚未发表）。在分析相互作用蛋白质时，质谱技术被用来进行蛋白质鉴定。我们常规采用一维变性蛋白胶分离纯化后物质，以指数梯度丙烯酰胺浓度制备蛋白胶，以利于对较大分子量范围的蛋白质进行分离。在对胶的操作中要格外注意尽量避免角蛋白的污染，否则会在质谱鉴定纯化后产物时造成麻烦。以考马斯亮蓝或硝酸银对胶进行染色。在切下目的胶带进行质谱鉴定之前首先要对胶进行扫描。在质谱鉴定之前对复合物进行分离的一个好处在于能够对复合物的丰度、存在蛋白质的数量，以及它们的相对化学计量学水平进行粗略的估计。但是，在这个过程中可能会丢失物质，直接采用质谱对洗脱后物质进行鉴定可能会更敏感（Link et al.，1999）。
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对照与确证
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为了对共纯化的特异性进行对照实验，可以以未表达TAP标签的细胞提取物进行一次纯化。尽管这是一个非常重要的对照，但是它仅仅说明一个蛋白质可以通过表达带TAP标签的蛋白质纯化分离得到重获而未带表达标签的蛋白质则不能重获，并不说明这种相互作用是特异的。的确，与靶蛋白的相互作用代表着变性蛋白质之间的作用或形成了聚集。利用无关蛋白质进行多次纯化比较通常是可取的。如果相同的蛋白质重复出现于相同的纯化组分中，那么它们很可能代表着污染、细胞内高丰度蛋白质（如转录因子）或结合于去折叠多肽的蛋白质（如热休克蛋白，蛋白酶体）。不论在何种情况下，应用一种独立的方法确证通过TAP纯化分离的蛋白质与靶蛋白存在生理性相互作用是非常重要的。免疫共沉淀（见第15章）是用来进行这种鉴定的一个方法。在缺少抗体时，ProtA和CBP可被用来检测这种共沉淀。首先，一个靶蛋白带有CBP标签（或全长TAP标签），而相互作用的组分带上ProtA标签（或融合TEV断裂位点ProtA标签）。裂解表达融合蛋白的细胞，并在钙存在下，与钙调蛋白包被的珠子进行孵育。经过提取物上样、上清分离、纯化后的样品以凝胶电泳进行分离，然后通过免疫印迹检测ProtA—蛋白的融合体（Salgado-Garrido et al.，1999；Bouveret et al.，2000）。
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方案
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方案1：制备用于纯化酵母Lsm3蛋白的提取物
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材料
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缓冲液与溶液
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分子克隆手册：蛋白质—蛋白质相互作用
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外加试剂
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LSM3
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蛋白质纯化的标签
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专用设备
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法式压式匀浆器
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方法
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1.为鉴定酵母中相互作用因子（或其他感兴趣蛋白质），采用标准克隆技术在LSM3阅读框架的羧基端融合一个带TAP标签的编码序列组件，构建在低拷贝中心粒的质粒上。最终的构建结果是不能破坏关键的LSM3基因，以确保发挥其全部功能。
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2.培养2L培养物接近饱和。
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3.离心获取细胞，以水洗涤，再次重悬，在制备提取物之前-80℃冻存。
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4.以1倍沉淀体积的缓冲液A重悬沉淀细胞，4℃，以8.27MPa（1200psi）两次通过法式压式匀浆器。
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5.粗提物用2mol/L KCl储存液调整至终浓度为200mmol/L。
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6.两次连续离心，4℃（50000g，30min，随后130000g，85min）除去残渣。
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7.以缓冲液D 4℃ 透析粗提物上清3h，在用下列方案进行TAP纯化之前，-80℃冻存。从2L起始培养物获得的终体积大约是10ml。
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方案2：利用TAP方法解析蛋白质相互作用
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材料
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缓冲液与溶液
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分子克隆手册：蛋白质—蛋白质相互作用
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酶与缓冲液
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分子克隆手册：蛋白质—蛋白质相互作用
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亲和介质
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钙调蛋白亲和树脂（Stratagene 214303）
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IgG 琼脂糖（Sigma A 2909）或IgG 琼脂糖（Pharmacia 17-0969-01）
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提取物
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以表达TAP-标签蛋白的合适细胞系或细胞株制备提取物。按照如下方法，我们在进行纯化前将酵母提取物保存在20m mol/L HEPES（pH 7.9）（以KOH进行调整）、50m mol/L KCl、0.2m mol/L EDTA、0.5m mol/L DTT 〈！〉、20% 甘油，0.5m mol/L PMSF〈！〉、2m mol/L苄脒。
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专用设备
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冷室
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旋转培养器（16℃）
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Poly-Prep色谱柱（10ml；Bio-Rad 731-1550）
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摇床
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方法
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1.在密闭的纯化柱中以5mlIPP150缓冲液洗涤200μl IgG琼脂糖或IgG Sepharose珠。在冷室中旋转珠子和洗涤缓冲液5min。让柱中的液体因重力流出而清除IPP150缓冲液。
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2.通过向每10ml提取物加入50μl 2mol/L Tris-Cl（pH 8.0）、200μl 5mol/L NaCl、100μl 10 % NP-40，调整提取缓冲液浓度。
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3.加入已经平衡好的提取物（10ml）至清洗好的珠子中。关闭柱子盖子和底。在4℃下旋转2h。
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4.打开柱子（先打开盖子），除去未结合物质，使之利用重力作用引流。这部分需保留用于对照分析（如通过免疫印迹估计结合效率）。
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5.以3×10mlIPP150缓冲液洗涤柱子。仔细清洗柱壁和柱床可以有助于减低污染的水平。
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6.用10mlTEV断裂反应缓冲液在16℃平衡柱子以进行TEV断裂反应。
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7.关闭柱子的底。加入1ml断裂反应缓冲液和100单位TEV蛋白酶。关闭柱子的盖子。16℃旋转2h。
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8.除去第一个盖子，然后拔出柱底部的塞子。依靠重力作用收集洗脱液。柱床中以及柱壁上残存溶液需再加入200μl TEV断裂反应缓冲液进行洗脱。
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残留在柱上的液体可以用含有SDS的缓冲液进行洗脱，如电泳上样缓冲液1×PK（10mmol/L Tris-Cl，pH7.5，12.5mmol/L EDTA，pH8.0，150mmol/L NaCl，1%SDS），留作对照。
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9.在一个新的纯化柱中以5mlIPP150钙调蛋白结合缓冲液洗涤200μl钙调蛋白亲和树脂，在冷室中，于密闭的柱子内旋转珠子和IPP150钙调蛋白结合缓冲液5min。使之利用重力作用引流除去IPP150钙调蛋白结合缓冲液。
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10.先进行预洗脱，向每毫升洗脱液加入3倍体积的钙调蛋白结合缓冲液和1μl 1mol CaCl2以滴定含有EDTA的TEV断裂缓冲液。
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11.将平衡好的溶液转移至含有洗涤过的钙调蛋白亲和树脂的柱子中。关闭柱子盖子和底。4℃旋转2h。
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12.打开柱子（先打开盖子），除去未结合物质，使之利用重力作用引流。这部分需保留用于对照分析。
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13.以3×10mlIPP150钙调蛋白结合缓冲液洗涤柱子。
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仔细清洗柱壁和柱床可以有助于减低污染的水平。
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14.以IPP150钙调蛋白洗脱缓冲液洗脱5个200μl的组分。
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在进行变性凝胶电泳分离之前，存在于这些组分中的蛋白质可以适当的缓冲液进行透析，用于功能分析或浓缩（如TCA或甲醇-氯仿沉淀；Wessel and Flugge，1984；Ozols，1990）。
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疑难解答与局限性
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最好是通过免疫印迹对纯化的靶蛋白进行定量。这有助于找出存在问题的步骤以及设计可能的解决方案。在首次纯化中，如果能够以表达已知TAP标签融合蛋白的细胞作为阳性对照，以检查各种缓冲液和亲和物质的完全有效性，同样也是很有价值的。
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尽管TAP方法得到广泛采用，它仍然具有一些局限性。首先，必须产生表达TAP标签的蛋白。对于某些蛋白质来说，无论在其氨基还是羧基端携带标签都会影响其活性。不过，在我们的经验中，这并不常见。即使蛋白质是有功能的，如果TAP标签不被天然的蛋白复合体所接受那也会出现类似的问题。在这种情况下，我们建议试一下将表达的靶蛋白融合于TAP标签另一末端的构建方式。尽管某些蛋白质也含有一个内源性TEV蛋白酶断裂位点，会干扰纯化过程，但是，这种情况在实际中并不多见。的确，作为一个例子，在6000个酵母蛋白质中，仅有12个多肽被预测含有TEV蛋白酶断裂位点（一致性序列 ENLYFQG，Dougherty et al.，1989）。但是应当记住的是，TEV蛋白酶并不是一个限制性内切酶，如果该退化的位点能够充分曝露，那就可以被切割，而隐藏于蛋白质内部完好的位点就不易被蛋白酶所接受。靶蛋白TEV蛋白酶断裂位点存在的真实性还需要通过实验的方法来确定。
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前言
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18 逆转循环纯化蛋白质
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前言
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弹性蛋白样多肽（elastin-like polypeptides，ELPs）基于弹性蛋白产生的五肽重复序列（Val-Pro-Gly-Val-Gly）是具有环境反应性的生物聚合物，ELPs可进行可逆的相转移，称为“逆温度转移（inverse temperature transition）”（Urry，1992，1997）。在转移温度Tt以下，多肽在水溶液中具有高溶解性。但是，当温度高于Tt时，水化的多肽链疏水性折叠，聚集，形成一个独立的ELP富集相。ELP的Tt可以很容易地控制在许多不同的水平上。例如，通过控制氨基酸序列，Tt可以调整为一个覆盖很宽的温度范围。通过调节环境条件，特别是加入溶剂的类型和浓度，转移同样也可以在等同温度下触发。
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很明显，ELP融合蛋白（ELP基因片段与目标蛋白基因融合表达产物），也会产生同自由ELP相似的可逆的相转移过程（Meyer and Chilkoti，1999）。因此，ELPs的环境反应性可以很容易地通过基因融合而转移给感兴趣的靶蛋白。这是非常有用的，因为当转移被触发时，融合蛋白聚集，可以通过离心或过滤的方式获取。转移是可逆的，因此去除上清液后ELP融合蛋白可以在低于Tt温度以下在水溶液中被重新溶解。需要指出的很重要的一点是，当相转移被诱导时，融合的靶蛋白并未变性和沉淀，聚集沉淀的是ELP。对于自由的ELPs，聚集相中含有约60％水（重量比）（Urry et al.，1985），显然靶蛋白含有充足的水分来防止变性。因此，将ELP遗传标记掺入靶蛋白后提供了一个“分子手臂”来操纵靶蛋白，可以很容易地对靶蛋白进行纯化、浓缩和缓冲液置换。表18.1总结了逆转移循环（inverse transition cycling，ITC）潜在的用途。
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图18.1
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表18.1 ELP融合蛋白和ITC的应用
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作为此概念的延伸，ELP融合蛋白也可用于从溶液中捕获非共价结合的亲和结合物（D.E.Meyer and A.Chilkoti，准备中），结合以后，通过触发ELP相转移，非共价复合物可以从溶液中分离出来，这一概念有许多潜在的应用。首先，用ELP融合蛋白捕获非共价分子是一个研究蛋白质—配体相互作用的潜在的有用工具。例如，某一靶蛋白（抗体或抗体片段、抗原、受体、配体等）可以与ELP融合，用于从液相的组合库中“钓”出未知的结合物。经过捕获与纯化后，可以用质谱或其他光谱技术分析鉴定复合物结合的配体。其次，通过对自由和结合（捕获的）的结合物的定量，以浓度和时间为函数关系，从溶液中捕获标记的亲和物质也可用于确定结合平衡与速度常数。最后，用ELP融合蛋白分析非共价结合的靶蛋白也可作为竞争性免疫分析实验的基础，用于复杂混合物中分析物浓度的定量分析。
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对于上述每一项应用，ITC原理用于选择性地从溶液中提出融合蛋白或它的非共价配体复合物。图18.1A显示了ITC的方案，图18.1B显示用ITC从细胞裂解液中纯化蛋白质的SDS-PAGE胶的典型图谱。最初，ELP融合蛋白在低于Tt温度下是可溶的，通过升高溶液温度，使之高于Tt温度值，或加入盐使Tt温度低于溶液温度，或结合使用这两种方法。相转移触发后，融合蛋白聚集，可以通过离心或过滤的方式将融合蛋白与其他分子分离出来。用移液枪吸出上清或弃上清，将剩余的可溶性分子除去。纯化的融合蛋白在低于Tt温度的一定体积的缓冲液中重新溶解。重新溶解的融合蛋白通常要最后在Tt温度以下离心（或过滤），以除去任何剩余的未溶解的物质，这些物质可能是在ELP融合蛋白聚集时捕获的。可以采取再进行一次ITC纯化的方法，直到融合蛋白的纯化达到所期望的程度。
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ITC技术简单，快速，经济，不需要特殊仪器或试剂。用标准的实验室离心机和氯化钠可以在几分钟内完成分离。此外，这些优点在很宽的纯化规模范围内都能实现。对于微升规模的表达和纯化，ITC可以应用于高通量平行操作。在另一个极端，因为ITC技术避免了传统色谱分离技术的花费，所以也有可能用于工业生物处理过程中克级到千克级规模下单个蛋白质的纯化。
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程序纲要
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总述
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ITC纯化是各种分离方法中较为简便的技术。各种应用中的共同点是基于这一概念：靶蛋白与ELP基因融合后将ELP的环境敏感性传递给融合蛋白，通过改变环境参数触发ELP的逆温度相转移，使靶蛋白从溶液中被选择性地提出，典型的环境参数是溶液温度和离子组成。
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当用ELPs和融合蛋白工作时，需要记住一个简单但是重要的概念：对于一个给定的结构，没有一个单一的、固定的Tt温度与之相联系，相反，Tt温度依赖于多种因素。Tt温度是指在给定的环境条件下相转移发生的温度。为了方便讨论，除非有特别说明，所提到的Tt温度值均是指25μmol/L浓度的融合蛋白在磷酸盐（PBS）缓冲液中的温度。
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用ITC进行分离应用时，与Tt温度最相关的两个影响因素是：（1）ELP融合蛋白的浓度；（2）溶液组成（特别是离子类型和浓度）。图18.2、图18.3的例子显示了对于一个给定的ELP结构，这两个因素的影响。因为Tt温度的下降与溶液浓度的升高呈对数关系（图18.2），所以ELP浓度在100μmol/L以下具有最重要的实际影响效果。增加氯化钠浓度同样减小Tt温度，而且，通常每增加1mol/L氯化钠浓度，Tt温度减小15℃（尽管这个效果会随ELPs的带电残基的不同而变化），离子对溶液中ELP的Tt温度的影响符合Hofmerister系列（Cacace et.al.，1997），如图18.3所示，胍啶这样的离子同样可用于增加Tt温度。
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图18.2 ELP浓度对Tt温度的影响
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图18.3 离子对Tt温度的影响
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一个ELP的Tt温度同样也依赖于他的氨基酸序列和分子量，如图18.4所示。ELP的Tt温度的序列依赖性已经被Urry及其合作者们详细地研究过，他们已经发现五肽序列Val-Pro-Gly-Val-Gly中第四位残基称为“客残基”，亲水性强于Val的残基取代客残基后会减小Tt温度（Urry et al.，1991）。利用这些数据，可以通过选择客残基的类型及他们在ELP序列中的相对替换频率来设计具有特定Tt温度的ELPs（表18.2）。对于小于50个五肽长度的短ELPs来说，分子量的影响非常重要，对于高分子量的ELPs影响不大（图18.4）。在这里，不同的ELP结构用ELP[XiYj-n]来区分，大写字母表示单字母氨基酸的编码，相应的下标表示每个客残基在重复单位中的出现频率，n表示ELP五肽的数目，代表ELP的总长。例如，ELP[V5A2G3-180]代表一个ELP的重复序列是具有10个五肽的序列，含有客残基Val、Ala及Gly的比例为5∶2∶3，该ELP的总长是180个五肽。
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图18.4 ELP序列和长度对T温度的影响
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表18.2 ELP序列的例子
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具有特定序列和分子量的ELP的Tt温度也能被融合的蛋白质所影响，具有大段暴露于溶剂的疏水区的蛋白质也会减小ELP融合蛋白的Tt温度。例如，蛋白质淀粉酶抑肽（tendamistat），计算其具有53％的暴露疏水表面区域，导致Tt温度减小26℃（Meyer and Chilkoti，1999）。但是多数可溶蛋白质（在蛋白质数据库中每100个蛋白质中多于90个蛋白质）具有的暴露疏水区域都小于30％。实验观察得知，具有这种比例暴露疏水区的蛋白质融合后对ELP的Tt温度应该没有显著影响（相对于自由ELP改变小于5℃）。
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融合蛋白的构建方案
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一个典型的ELP融合蛋白基因包括三部分：（1）靶蛋白的基因；（2）一个肽连接插入序列；（3）ELP基因。通常融合基因的构建分3步。如果已经得到一个编码靶蛋白基因的表达载体，这个载体可以用合成的寡核苷酸盒（cassette）进行修饰，使之包含ELP序列插入的核酸内切酶识别序列及肽连接序列的编码。如下文方案部分所述，一个ELP基因片段能够被克隆进ELP插入位点，完成ELP融合蛋白基因的装配。如果愿意的话，最后一步可以平行进行来产生一个靶蛋白融合不同ELPs的库。
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另一种方法是，如果要研究许多不同的靶蛋白，合成一个含有ELP标记的基因表达载体更好，这样可以克隆不同的靶蛋白。首先修饰一个表达载体，在一个多克隆位点附近引入ELP插入位点和连接序列编码，然后被选用的ELP基因片段克隆进ELP插入位点。载体即可准备用于在ELP附近的多克隆位点进行靶基因库的克隆。肽连接序列可以设计为具有许多有用的特性。首先它可以在靶蛋白和ELP之间提供一段空间，如果ELP融合在折叠蛋白质的活性位点附近，这将会有助于保证靶蛋白的功能活性。第二，连接序列可以编码蛋白酶识别位点，这样经过ITC纯化后ELP可以从靶蛋白上被切除。凝血酶（thrombin），具有Leu-Val-Pro-Arg/Gly-Ser识别序列，已经被成功用于ELP融合蛋白（Meyer and Chilkoti，1999）。因子Xa蛋白酶也被用于ELP融合蛋白（McPherson et al.，1992），其他的蛋白酶可能也是有用的。最后，一个次级纯化标签（如His标签）可以加在靶蛋白与蛋白酶识别位点之间，用于切除ELP之后的靶蛋白纯化。
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没有一个清楚、合理的理由来选择是从氨基端还是羧基端构建融合蛋白，也许需要依赖靶蛋白的特性。如果已知靶蛋白表达水平高，从羧基端融合ELP也许更好（在N端融合ELP有可能会影响靶蛋白的正确折叠，在羧基端融合ELP更好是因为它是在靶蛋白的合成完成之后才翻译的）。另一方面，已发现氨基末端ELP标签会增加表达量低的靶蛋白的可溶性表达（Meyer and Chilkoti，1999）。这也许是因为氨基端ELP通过与新生靶蛋白链的疏水相互作用或空间效应阻止靶蛋白折叠中间态的分子间聚集从而帮助靶蛋白折叠。考虑到所有这些，也许最好的方法是将这两种构型都用于试验。
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ELP标签和ITC条件的选择
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ITC的实施可以通过控制ELP的氨基酸序列、ELP分子量及溶液条件（温度和氯化钠浓度）来优化融合蛋白表达和靶蛋白的分离效率，对某些应用来说这也许是很重要的，例如以最大产率为首要目标的大规模靶蛋白的生产。另一方面，已经建立了一种遗传学操作步骤，或许不是对所有的蛋白质都是最佳条件，但是应该能对较大范围内的蛋白质提供一个可以接受的分离条件。例如，在高通量表达和纯化许多不同的未知特性的蛋白质时，这一技术或许更有用。
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一个具有中等长度的ELP（约36kD），Tt温度在大约54℃（例如ELP[V5A2G3-90]）时，作为一般的应用，发现对一定范围内的靶蛋白是有效的。ELP的Tt温度足够高，可以承受由于融合入了疏水靶蛋白导致的Tt温度下调；但是，又足够低，使仅加入中等量的氯化钠（1～2M）就可将Tt温度减小30～35℃。推荐在用ITC技术纯化一个新的靶蛋白时，在最初的中试时使用这种或类似的ELP标签。
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对于低表达的融合蛋白，由于Tt温度太高或浓度太低而观察不到相转移时，可以在ITC纯化前在可溶的裂解液中掺入自由ELP。加入自由ELP后，由于浓度效应Tt温度会降低，有助于通过浓缩的方式获得聚集蛋白。完全优化ITC步骤也许需要对一个给定的靶蛋白用不同的ELP标签进行实验测试。因为已经发现靶蛋白大肠杆菌硫氧还蛋白（thioredoxin）的表达产率会随着ELP标签长度的减少而升高（Meyer and Chilkoti，1999）。通过表达培养融合入小的ELP库（例如，分子量范围在约10～35kD范围内的3或4个ELP标签）的靶蛋白可以实现在中等温度和氯化钠浓度下确定能够获得有效纯化的ELP标签的最短长度这一目标。在该质量范围低端，约90kD的ELP标签ELP[V-20]，已经被成功用于硫氧还蛋白的ITC纯化，并且，与对照品35kD的ELP标签相比，靶蛋白的产率提高了4倍（Meyer et al.，2001）。但是，带有9kD标签的融合蛋白的相转移有更复杂的温度依赖性（Meyer et al.，2001），而且某些靶蛋白融合入这种大小的标签后不能表现出逆温度转移（D.E.Meyer and A.Chilkoti，未发表）。从设计的角度考虑，因为Tt温度随分子量减小而升高，更小的标签需要掺入更多疏水性客残基以保持T温度足够低，这样ITC过程可以在不会使靶蛋白变性的条件下进行。在ELP分子量范围的高端（如，35kD的ELP[V5A2G3-90]），目前所有试验过的融合蛋白，尽管数目有限，都已经用ITC方法成功地纯化。更大的ELP标签可能也会通过限制聚集状态的靶蛋白的分子间接触而保护温度诱导聚集的可逆性。
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对于表达后的纯化，大于37℃的Tt温度是所选择的典型温度，这样融合蛋白会在培养过程中保持溶解状态，并且通过温度或裂解液中氯化钠浓度的轻微升高而触发逆温度相转移。选择这样的Tt温度是基于这样的假设：ELP在以稳定状态表达时易于产生一个更高产率的正确折叠的靶蛋白。但是，这一假设并未经过实验的验证，并且有可能低于培养温度的Tt温度会更好，因为在细胞内聚集的ELP相会保护靶蛋白避免被细胞间的蛋白酶降解。
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ITC的应用还包括目标分子与ELP融合蛋白的非共价结合。ITC条件对结合亲和力的影响也必须考虑。比培养温度稍高（高5℃或更小）的Tt温度可以仅升高有限的温度（0～5℃）和/或氯化钠浓度（0～300mmol/L）就可以使复合物从溶液中分离出来。在这种条件下由于实施ITC而引起的任何亲和力的下降都可以忽略。另一方面，温度或离子强度大的波动会引起不希望的结合平衡的漂移，会导致目标分子在被ELP聚集捕获前就被释放。
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方案
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方案1：将ELP组分融合入靶蛋白
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材料
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缓冲液和试剂
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小牛小肠碱性磷酸酶（CIAP）
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酶缓冲液
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10×连接酶缓冲液限制酶
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T4 DNA连接酶
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载体
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已被修饰的包含靶蛋白基因的表达载体，含有一个单一的用于ELP插入的限制性核酸内切酶识别位点
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含有ELP基因的载体，基因5′端有Pfl MI识别序列，3′端有Bgl I识别序列，酶切后在两端形成了3′单链GGC延伸
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专用设备
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分子克隆手册：蛋白质—蛋白质相互作用
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PCR纯化试剂盒
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方法
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ELP插入准备
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由于ELP序列的重复性，由基因寡聚产生的较大的ELP基因用PCR方法不能有效扩增。
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1.用Pfl MI和BglI完全水解约4μgELP质粒DNA。
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2.用琼脂糖凝胶提取纯化ELP片段（可用商业化的试剂盒完成），ELP基因片段的碱基对数目是所编码五肽的15倍（每个氨基酸3个碱基，每个五肽有5个氨基酸）。用30ml水洗脱，-20℃保存待用。
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提取凝胶时不要加热或旋转样品。
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载体准备
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3.用专一性切ELP插入位点的合适的限制内切酶水解约1μg表达载体质粒DNA。
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ELP插入位点是限制内切酶的识别位点，该限制内切酶是表达载体特有的，并产生了一个非回文结构的突出端与ELP插入序列相匹配（如，5′-GGC-3′）。插入位点必须定位于融合蛋白的编码框内，终止密码必须在插入位点的下游区域。与这一特别系统相适应的限制酶包括Alw NI，Bgl I，Bsl I，Bst API，Dra III，Mwo I，Pfl MI和Sfi I。引入ELP插入位点可以通过对已包含靶蛋白基因的表达载体的盒式诱变来实现。
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用琼脂糖凝胶电泳观察质粒的消化。
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靶蛋白载体被完全消化这一点非常重要，消化不完全会导致相转移时产生严重的野生型载体的背景。
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如果质粒DNA消化不完全，加入更多的酶和/或延长反应时间直到载体完全线性化。如果可以接受的话，让限制酶在65℃热灭活20min，或遵照供应商的建议。
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4.线性载体去磷酸化（如，1pmol载体用1个单位CIAP，50℃孵育1h）。
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在75℃热灭活CIAP10min，或遵照供应商的建议。
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5.纯化线性、去磷酸化的载体（如用商品化的PCR纯化试剂）。用30μl灭菌水洗脱，-20℃保存。
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连接
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6.连接反应设置：加5μl载体（约150ng），10μl纯化的插入片段（插入序列与载体的摩尔比为约5～10∶1），2μl 10×连接酶缓冲液，1μl T4DNA连接酶（lu/μl），加2μl灭菌水（总体积20μl），16℃孵育2～4h。
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7.转化入大肠杆菌细胞株（或其他宿主），推荐用非诱导recA -E.coli系。
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8.铺琼脂糖平板，用抗生素筛选，让克隆生长过夜。
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9.用PCR扩增的小的ELP基因筛选阳性克隆（因为ELP基因的重复特性，由基因寡聚产生的较大的ELP基因用PCR方法不能有效扩增），或者微量制备质粒后进行诊断酶切找大的ELP基因筛选阳性克隆。预期有50%～90％的克隆含有融合的ELP基因。
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载体的不完全消化和/或不完全去磷酸化会产生高的野生型背景。直接转化未连接的载体可用于检测限制性酶切的完全性。如果测试产生的克隆显著少于连接有ELP插入序列的克隆，那么载体的不完全消化就不是问题。在这种情况下，没有ELP插入序列载体的连接和转化可用于确定由于载体的不完全去磷酸化所产生的自连接的程度。而且，没有插入序列的克隆数目应该比连接有ELP插入序列的克隆数目要少得多。
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一般希望ELP基因插入序列的一些二聚体或三聚体（如小于300bp）要小于克隆数的10％。
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10.将编码ELP靶蛋白融合基因的表达载体转化入一个合适的表达宿主（大肠杆菌内表达推荐使用recA-）。
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方案2：从细胞裂解液中纯化ELP融合蛋白
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材料
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缓冲液和试剂
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添加缓冲液
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NaCl
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收集表达培养液，悬浮于1/20培养体积的低盐缓冲液中（如Tris或磷酸盐缓冲液，pH7～7.5，含20～150mmol/L NaCl）
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10％聚乙烯亚胺溶液（可选，见步骤3）
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方法
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1.裂解细胞，任何裂解方法都可以。尽管超声破碎会有助于分离重新溶解培养过程中形成的ELP聚集体。如果使用超声，在冰上裂解以确保溶液温度在Tt温度以下（如在低于Tt温度5℃以下）。第4章提供了一个准备细菌裂解物的方法。
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2.将细胞裂解悬液20000g，4℃离心15～20min。将上清移至新的离心管，弃去含有不溶性细胞碎片的沉淀。
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3.可选：加聚乙烯亚胺至终浓度为0.5％，温和混合，因为聚乙烯亚胺与溶液中DNA共沉淀，所以溶液颜色应该变白色。冰浴10～20min，间或轻轻晃匀混悬液。在4℃以20000g离心15～20min。将上清移至一个新的离心管中，弃沉淀。
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在诱导ELP相转移之前推荐将核酸用聚乙烯亚胺沉淀，因为裂解液中存在的核酸会在ITC的离心步骤中与ELP沉淀，特别是在高盐浓度下（如大于1.5mol/L的氯化钠）。如果省略聚乙烯亚胺沉淀步骤，加一个ITC循环仍能实现核酸的分离。
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4.升高溶液温度并／或加入氯化钠引发相转移。
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触发转移所需的溶液温度和氯化钠浓度依赖于ELP的序列和分子量、融合的蛋白及ELP浓度，目的是在离心时使Tt温度低于溶液温度3～5℃。氯化钠浓度在0.1～2mol/L范围内的Tt有效温度在25～30℃，这样在35～40℃温度下离心通常可得到好的结果。如果靶蛋白耐热，可以在更高温度下离心。但是融合ELP后靶蛋白的热变性温度会变小，这样必须注意在ITC循环时不要超过这一温度。如果在ITC过程中发现融合蛋白的不可逆沉淀，要考虑采用不同的温度和氯化钠浓度组和来避免靶蛋白变性，靶蛋白变性会从ELP相转移中分离出来。当采用一个新的结构，Tt的确切温度不知道时，缓慢增加温度和/或氯化钠浓度（如5℃或500mmol/L浓度的增幅），直到在细胞裂解液中发现相转移。如果使用固体氯化钠晶体，轻轻翻转试管使其溶解。不要使用剧烈的涡旋混合，因为ELP融合蛋白会聚集在气泡的空气—水界面上，随着上清液的丢弃而损失。
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溶液会由于ELP的聚集而变得混浊。
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在离心（步骤5）前，很重要的两点是：（1）ELP融合蛋白已经进行了相转移；（2）溶液温度等于或小于离心温度。如果这两点都达到，ELP融合蛋白将会在离心时保持聚集状态并被收获。如果是另外的情况，离心温度低于欲离心的溶液的温度，可能会有部分或全部的ELP融合蛋白重新溶解并留在上清液中。
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如果升高温度和/或加入盐后并未发现混浊现象，用SDS-PAGE确认一下蛋白质表达水平。尽管通常不需要这样做，但是，对于低表达的融合蛋白，也许有必要加入相应温度的自由ELP（如浓度为10～25μmol/L）。如果蛋白质高表达，但仍看不到混浊现象，也许需要使用Tt温度更低或分子量更大的ELP标签（见表18.2和图18.4的例子）。
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5.在高于Tt温度下，以15000g离心5～10min使聚集的ELP融合蛋白沉淀。通常在25～40℃温度范围内进行。
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6.弃上清，上清应当是清澈的。在Tt温度以下用选择的缓冲液重新悬浮沉淀。
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在第一次细胞裂解液的纯化循环中沉淀常常呈棕色或米色，但在以后的ITC工作循环中通常是半透明的。沉淀可以用1000μl加样枪使之重新溶解，将枪尖靠近沉淀，重复挤吸使溶剂推动沉淀。聚集的融合蛋白通常会粘附在离心管壁上，因此管壁应该彻底清洗，在Tt温度以下浸泡一段时间有助于重新溶解，机械性刮擦沉淀和管壁也会有效。要确保沉淀完全重新悬浮。因为存在不溶的杂质，细胞裂解液的第一次ITC循环产生的沉淀重新溶解后溶液通常是混浊的，杂质将在步骤7中被除去。但是，在以后的ITC循环中，沉淀重新溶解后溶液通常是澄清的。
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沉淀可以重新悬浮在任何期望的体积内。推荐用1/50到1/10的裂解液体积，取决于靶蛋白的表达水平。
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7.4℃，20000g离心10～15min以除去任何残留的不溶物。保留上清，弃去任何形式的沉淀。
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在第一次细胞裂解液的纯化循环中，低温离心步骤产生的沉淀通常较多，但是沉淀中一般不会包含有很大量的ELP融合蛋白。
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8.步骤4～7重复至少一次。
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如果愿意的话可以增加重复次数，但一般两次循环就可以提供高的纯化程度。
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同样要注意，在第二次循环中所用的盐浓度要更低，因为在第一次循环后ELP融合蛋白的浓度显著增加，使Tt温度降低。
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9.可选：如果在ELP和靶蛋白氨基酸序列间插入了蛋白酶识别位点，用蛋白酶与纯化的ELP融合蛋白共孵育，切去ELP标签后就可以得到自由的目标蛋白。
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ELP融合蛋白的溶解性显著大于自由的靶蛋白的溶解性。因此，要确保蛋白酶切这一步骤在自由靶蛋白溶解度以内的浓度下进行。如果蛋白质浓度太高，加入蛋白酶并切去ELP会导致新释放靶蛋白的不可逆沉淀。同样要注意的是，除非采取下一级纯化步骤，蛋白酶会保留在纯化的靶蛋白中。使用带有ELP标签的蛋白酶也许可以解决这一问题，尽管目前没有商业化，蛋白酶和切下的ELP标签可以用ITC方法从溶液中同时除去，在上清中仅留下纯化的靶蛋白。
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10.纯化的ELP融合蛋白通常在水溶液中冻存于-80℃。用一小部分来测试解冻后靶蛋白的变性情况，如果蛋白质变性，有必要保存在50％甘油溶液中存于-20℃。
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方案3：ELP融合蛋白的一般转移循环
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材料
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缓冲液和试剂
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分子克隆手册：蛋白质—蛋白质相互作用
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其他设备
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离心机和离心管
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加样枪（1000μl），带一次性枪头
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方法
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1.加入氯化钠和/或升高溶液温度以诱导ELP聚集。
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触发转移所需的溶液温度和氯化钠浓度依赖于ELP的序列和分子量，融合的蛋白质及ELP浓度，目的是在离心时使Tt温度低于溶液温度3～5℃。氯化钠浓度在0.1～2M范围内的Tt有效温度在25～30℃，这样在35～40℃温度下离心通常可得到好的结果。如果靶蛋白耐热，可以在更高温度下离心。但是融合ELP后靶蛋白的热变性温度会变小，这样必须注意在ITC循环时不要超过这一温度。如果在ITC过程中发现融合蛋白的不可逆沉淀，要考虑采用不同的温度和氯化钠浓度组和来避免靶蛋白变性，靶蛋白变性会从ELP相转移中分离出来。如果使用固体氯化钠晶体，轻轻翻转试管使其溶解。不要使用剧烈的涡旋混合，因为ELP融合蛋白会聚集在气泡的空气—水界面上，随着上清液的丢弃而损失。
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在离心（步骤2）前，很重要的两点是：（1）ELP融合蛋白已经进行了相转移；（2）溶液温度等于或小于离心温度。如果这两点都达到，ELP融合蛋白将会在离心时保持聚集状态并被收取。如果是另外的情况，离心温度低于欲离心的溶液的温度，可能会有部分或全部的ELP融合蛋白重新溶解并留在上清液中。
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溶液浓度在约1～5μmol/L或更高浓度下将会混浊，由于低于此浓度ITC可能不会有效，因此也许有必要在溶液中添加相应Tt温度的自由ELP（如添加至10～25μmol/L浓度）。
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2.在高于相转移温度的温度下以15000g离心5～10min。
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3.弃上清，将沉淀重新悬浮于所选用的冷的缓冲液中。
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沉淀可以用1000μl加样枪使之重新溶解，将枪尖靠近沉淀，重复挤吸使溶剂推动沉淀。聚集的融合蛋白通常会粘附在离心管壁上，因此管壁应该彻底清洗，在Tt温度以下浸泡一段时间有助于重新溶解，机械性刮擦沉淀和管壁也会有效。要确保沉淀完全重新悬浮。因为存在不溶的杂质，细胞裂解液的第一次ITC循环产生的沉淀重新溶解后溶液通常是混浊的，杂质将在步骤7中被除去。但是，在以后的ITC循环中，沉淀重新溶解后溶液通常是澄清的。沉淀可以重新悬浮在所选择的体积内以获得期望的浓度。
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4.在4℃，15000g离心5～10min除去残留的不溶物。保留上清，弃沉淀，在多数情况下或许看不到沉淀。然而，在每一次高温离心步骤及重新悬浮沉淀后，总保持在低温状态下离心是个好的操作习惯。
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5.如果想更多次的ITC循环，重复步骤1～4。
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结论
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用ELP融合标签和ITC方法从细胞表达裂解液中纯化重组靶蛋白是一个简单有力的方法。ITC方法摒弃了传统的色谱纯化方法，节省了相应的时间和花费。此外在最初的重组蛋白质纯化之后它还有非常广泛的生物分离应用。因为它可以用来捕获溶液中靶蛋白的专一性非共价配体，ITC也用来研究蛋白质—配体相互作用并形成了溶液竞争性免疫分析的基础。在所有这些应用中，ITC有很强的灵活性，允许为特定的靶蛋白优化使用不同的ELP标签和溶液条件，同时也有足够的普适性用于具有不同物化特性的蛋白质纯化的高通量应用。总而言之，ITC是一个新的生物分离技术，将会对生物技术和生物科学产生重要影响。
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参考文献
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19 利用体外表达克隆鉴定相互作用蛋白质
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前言
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鉴定一个蛋白质是否与其他蛋白质共存于复合体中，如果是，则鉴定出它的伴侣，这是研究任何一种蛋白质性质的重要步骤。本章阐述了一种鉴定蛋白质间相互作用的新方法。它基于近年发展起来的体外表达克隆（IVEC），可以按照每个基因编码的蛋白质功能快速系统的筛选cDNA文库。这种传统表达克隆的改进已被成功用于激酶（Stukenberg et al.，1997）、蛋白酶底物（Cryns et at.，1997；Kothakota et al.，1997；Li，1998；McGarry and Kirschner，1998）、DNA结合活性（Mead et al.，1998）、信号通路组分（Andresson and Ruderman，1998）的鉴定。如今，IVEC还未用于鉴定复合体中的相互作用蛋白质。本章阐述了这种技术的一种修饰，可以成功地鉴定特异的磷酸化丝/苏氨酸结合蛋白14-3-3（Kanai et al.，2000）的5个结合伴侣。另外，IVEC也能够为系统鉴定相互作用蛋白质的双杂交技术和生化纯化方法提供帮助。
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IVEC最早于1997年报道（Lustig et al.，1997；Stukenberg et al.，1997）。这种技术综合了表达克隆与体外实验控制反应的能力。此策略图见图19.1。第一步包括构建或购买cDNA质粒文库，其中cDNA已经被正向克隆于T7、SP6或T3启动子下游并转移入细菌（本章集中于T7启动子，尽管IVEC也已被成功用于基于SP6启动子的载体）。含有文库质粒的细菌按照30～100个克隆/板的密度铺板，从每个板上刮下克隆，小规模质粒提取（小量），构建质粒DNA池。然后每个含有30～100种不同cDNA的质粒池在35S标记的甲硫氨酸存在的条件下体外转录翻译。检测产生的标记蛋白池的特异活性，如蛋白或配体结合、特异激酶的磷酸化或特异蛋白酶的切割。一旦含有表达候选活性基因的池被鉴定出，其中编码cDNA的质粒可被再分离出来，单独再检测直到编码感兴趣蛋白质的单链cDNA被分离到。
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图19.1 体外表达克隆的策略
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这里我们阐述用于制备cDNA和蛋白质文库池的一般方法，以及一旦发现含有候选活性的池用于再分离的sib选择技术。这些方法由传统的研究设备发展而来，但容易改进后利用机器实现高通量。例如，我们阐述如何体外筛选蛋白池寻找与特异的磷酸化丝/苏氨酸结合蛋白14-3-3相结合的蛋白质。我们总结讨论了应用IVEC的可行性和在筛选相互作用蛋白质时IVEC可能优于双杂交技术的情况。
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方案
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方案1：体外表达克隆
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材料
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缓冲液和试剂
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大肠埃希氏菌DH5α或XL2-Blue
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谷胱甘肽—琼脂糖（Sigma）
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甘油（40%）
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GST-14-3-3融合蛋白
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含抗生素的LB琼脂平板（10cm）
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LB培养基
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[35S]甲硫氨酸
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质粒cDNA文库（Discovery Line预制文库，Invitrogen）
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重组Rnasin（RNA酶抑制剂）（40u/μl）（Promega）
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TNT T7偶联网织红细胞裂解物系统（Promega）
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Tris-HCl（10mmol/L，pH8.0）
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未扩增的文库和菌
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专用设备
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Eppendorf管
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离心机
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分子成像系统（Model GX-525；Bio-Rad）
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吸量器
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96孔板
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QIAprep Spin Miniprep Kit（Qiagen）
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橡胶刮棒
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SDS-PAGE装置
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方法
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阶段1：制备cDNA池
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为了在体外翻译中得到可检出量的蛋白质，得到编码有限数目独立cDNA（30～100克隆/池）的质粒池是十分重要的。虽然此步骤耗费大量时间财力，但这项单独的投资可用于约50次IVEC筛选。实际上，至少有3个实验室构建了文库，用它们筛选了多个活性后又作为合作分配给了其他实验室。
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制备cDNA池，进行体外翻译反应如前所述（Lustig et al.，1997）。我们采用商品化的人HeLa细胞的质粒cDNA文库（Invitrogen）。此cDNA文库由oligo-dT（NotI）引物反转录而成，双链cDNA被正向亚克隆于pcDNA3.1（Invitrogen）的CMV/T7启动子下游。尽管这个cDNA文库最初用于哺乳动物体内表达克隆，它在IVEC中也能很好地工作。而且鉴定出所需相互作用的cDNA之后，同样的载体可用于哺乳动物细胞的基因表达而不必再克隆。对于其他应用，购买或制备特异组织或器官的cDNA文库也是有利的。然而，在每种情况下都必须检查平均插入片段的大小和空载体比例，以确保文库的质量。在商品化的人HeLa细胞的质粒cDNA文库（Invitrogen）中，我们发现12个随机挑取的克隆中有11个含有cDNA插入质粒，平均插入片段的大小为1.2kb。
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1.要制备含有100种/池文库cDNA的质粒池，解冻一份冻存的未扩增的细菌文库，用LB培养基稀释，铺于直径10cm的含合适抗生素的LB平板（本例Invitrogen HeLa细胞文库采用氨苄青霉素）。
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铺板前知道原始文库的滴度很重要。例如，原始文库的滴度为1×107克隆/μl，那么，进行1∶106稀释，取10μl铺板可得100克隆/板。基于文库中预期存在的特定cDNA 的预期数和筛选中所需的覆盖深度计算出要准备好的平板数目。例如，我们准备了680板的cDNA池，预计含有20000种以上的总蛋白质（100克隆/板的密度在翻译时产生约30种蛋白质）。
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文献中大多应用100克隆/池的大小。但我们发现只产生约30条带，说明质粒间存在竞争，只有具备最佳Kozak序列的转录产物才能被翻译至足以检出的量。质粒池大小的滴度检测表明，理想的大小为30种蛋白。在这种较小的池中，约为25条带/池，说明池中大部分cDNA已被翻译至足以检出的浓度。因此，降低池的规模，能够增加cDNA文库的覆盖度几乎3倍。要检测30个以上的蛋白质，可以容易地在体外翻译之后合并各池。
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2.37℃孵育至菌落达到1.5cm直径（典型的需过夜至24h），用Parafilm封板存于4℃。
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要保持平板和池的数量在可操作范围内，只用100块平板进行后续流程，然后重复操作直至完成所有平板。按我们的经验，二人同时进行工作，此流程进展最好。
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3.每板加入1mlLB培养基，刮下克隆收集至微量离心管中，重悬。用1.5mlEppendorf管或96孔板，20%（v/v）甘油，-80℃存一小份已建池的菌。
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4.用离心机快速离心剩下的菌，用商品化的小量质粒提取试剂盒从100份细菌沉淀中分离质粒DNA。我们采用QIAprep Spin Miniprep Kit（Qiagen）。利用纯化的DNA，我们可以进行连续体外翻译过程，并且都能获得好的结果。用QIAprep Spin Miniprep Kit，一块10cm板的质粒产量为5～30μg，代表了300ng/起始克隆。纯化好的质粒DNA存于-20℃。有的商品化的质粒提取试剂盒不能为体外翻译提供质量合格的质粒DNA。用QIAprep Spin Miniprep Kit（Qiagen）可得最佳结果，Bio101和Promega Wizard preps也曾被成功应用。
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阶段2：制备体外标记蛋白池
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1.用偶联转录翻译系统从cDNA池直接制备蛋白池。
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我们用TNT T7偶联网织红细胞裂解物系统（Promega）制备蛋白池，其操作过程按照生产商提供的操作说明，但条件变为每一个10μl反应体系中用0.1～0.6μg池cDNA。要制备放射性标记的蛋白池，每一个10μl反应体系中含有8μCi的[35S]甲硫氨酸（10mCi/ml）（New England Nuclear）和TNT试剂盒提供的无甲硫氨酸的氨基酸混合物。
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一次翻译反应中每种反应物的用量如下表。通常准备100次反应的大量反应混合物是有利的（DNA除外）。
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分子克隆手册：蛋白质—蛋白质相互作用
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用1.5mlEppendorf管或96孔板进行体外偶联转录翻译反应。如果已准备大量反应混合物，从每个池中取1μl DNA至每个Eppendorf管或96孔板的孔中；然后加入9μl反应混合物至每管/孔。水浴或热阻断（离心管），或在杂交炉（96孔板）中，30℃温育反应90min。放射性标记的蛋白池可在冰上保存2h或-80℃保存1周时间。
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2.用10%SDS-PAGE和标准的放射自显影Model GX-525分子成像系统（Bio-Rad）曝光过夜或2～5d的传统X光片曝光来检测每个池的翻译效率（图19.2）。
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图19.2 体外翻译池示例
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结合实验示例：用IVEC鉴定新的14-3-3结合蛋白
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要研究新的14-3-3结合蛋白：
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1.每个35S标记的池与10pmol的GST珠4℃孵育2h以减少背景结合。4℃轻摇，与10pmol固定了14-3-3-GST融合蛋白的珠孵育2h。
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2.快速离心，洗珠4次。重悬于Laemmli上样缓冲液。
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3.用SDS-PAGE和Model GX-525分子成像系统检测放射性蛋白条带，分析样品。
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另外，凝胶的X光片曝光也是有价值的，因为长时间（6d）的曝光可以检测出磷屏不能检测到的条带。应用此法，鉴定出了5种不同的与14-3-3相互结合蛋白（图19.3）。
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图19.3 鉴定14-3-3结合蛋白
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阶段3：Sib选择阳性池
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一旦含有所需活性的cDNA池被鉴定出，进而再分离直到含有活性的单个cDNA克隆被分离出来（图19.4）。第一步是再转化或把含cDNA池的细菌再铺板，提供100个以上的克隆。单独的细菌在96孔板的格式中生长，板上来自不同行和列的孔被建成池，再筛选，以明确鉴定分离出的cDNA克隆。
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图19.4 从100个质粒的阳性池中分离编码与14-3-3相互作用蛋白每种质粒的策略
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1.要再分离池中的cDNA，用无菌水或10mmol/L的Tris-HCl（pH8.0）1∶100～1∶1000稀释原始DNA。取1μl用电穿孔法转化50μl感受态的大肠杆菌DH5α或XL2-Blue。文库准确的稀释倍数取决于所用细菌的转化效率。
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2.用电穿孔法转化后，加入1mlLB培养基，轻摇让转化菌于37℃恢复1h。用离心机快速离心菌体，重悬于100μl LB，全部铺于直径10cm的含合适抗生素的LB平板。按照我们的经验，平板上的典型产量为200～1000克隆。
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可选：也可将少量对应的甘油冻存菌铺于含合适抗生素的LB平板。
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3.37℃过夜后，用高压灭菌的牙签转移每个克隆少量至96孔平底板的孔中，每孔已有150μl含抗生素的LB培养基。避免孔间的交叉污染。
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4.勿摇，37℃过夜。再抽吸混匀培养物，取96孔板同一列的每孔100μl样品置于分离的细菌培养管。这会产生12份样品，对应于96孔板的12列，每份样品含有8个不同孔的细菌。每管加入2ml含合适抗生素的LB，摇几小时以获得足量用于提取质粒DNA的细菌。然后向96孔板中每孔剩余的原始培养物（每孔应余50μl）补加50μl含40%甘油和合适抗生素的LB，抽吸混匀，-80℃冻存以提供单独cDNA克隆的甘油冻存物。甘油终浓度为20%。
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5.从12列池的每池中提取质粒DNA，合成蛋白质，如上所述检测。若无阳性检出，再挑96个克隆，重复同样的流程。
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6.用上述的96孔板甘油冻存物单独制备检测8个孔中各孔的cDNA来进一步分离阳性池。可能会有孔间交叉污染；所以最终观测到的活性对验证每个cDNA的作用结果十分重要。可以在新的LB平板上将最终克隆划线，挑单克隆，验证其是否保留有所需活性。用T7寡核苷酸引物对分离到的cDNA测序，鉴定出感兴趣的蛋白质。另外，还可以用二维矩阵一步寻找每个活性cDNA（如12列池和8行池共20个池）。然而，因为一个人可能不止一次挑到阳性克隆（会弄混二维矩阵的解释），所以两步流程较少使用。
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何时用IVEC
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对于那些不能够传统的以单个生化活性分离方法进行分离的cDNA，IVEC是一种非常有效的分离方法。例如在使用IVEC之前，有效的基因筛选鉴定激酶和蛋白酶的底物是不需要的。一些实际的考虑能帮助你判断使用IVEC是否是一种正确的策略。
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1.因为仅有小池的cDNA进行表达，IVEC不能鉴定出需要文库编码的多个亚单位参与而产生的活性。为了解除这种局限性，可以加入其他的成分或天然提取物进行补充使活性产生。
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2.IVEC并不是最好的对稀少信息进行筛选的技术。对于目前使用的大量的筛选技术，限速步骤是跑SDS-PAGE胶，每天对超过50～100池的克隆（1500～3000种蛋白）进行电泳是非常困难的。因此，在好的技术产生并对文库进行规范化操作之前，饱和性筛选是不现实的。对于小的基因组（如病毒、酵母和蠕虫），编码cDNA的每种质粒定位于不同的孔中，可以提前排列这些克隆，使之最终分池以简化翻译。这样的文库一经制备，既可进行快速地饱和地IVEC筛选。
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3.目前，至少有三种互补技术鉴定相互作用的蛋白质，它们都具有各自的优缺点。在鉴定相互作用的蛋白质时，蛋白质纯化是一项非常有利的工具。蛋白质纯化的一些优点是，不必设想结合条件，并可以分离出整个天然的复合物。用生化的方法纯化蛋白质有一定的技术难度，而分离基因，表达它们的蛋白质需要多步纯化，如对多肽进行测序以及分离cDNA，这常常是很麻烦的。然而，我们已经注意到近来的一些技术进展如利用抗原决定簇标记蛋白质、质谱以及基因组/表达序列标签的测序计划，这些新技术可以大大简化这些操作步骤中的一些环节，从而使得直接纯化蛋白质复合物成为一项非常有吸引力的技术。
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双杂交技术通过直接鉴定相互作用蛋白质的基因在鉴定蛋白质—蛋白质之间的相互作用方面引起了一场革命。双杂交技术被广泛应用的第二个原因是该技术已经成熟并可以在多数的实验中应用。IVEC也具有上述的两种优势。实际上，两种技术可以互补，因为双杂交技术的一些不足之处正是IVEC的强项。首先，因为细胞的区域化，一些重要的相互作用不一定在酵母的核中发生。IVEC的相互作用在没有产生区域化的膜的胞质溶液中进行。其次，双杂交技术不能鉴定需要两种以上多种蛋白质参与的相互作用。如早先提到的，体外反应的可操作性使在实验中加入蛋白质和小分子成分变得非常容易。再者，双杂交技术很容易产生假阳性，它必须利用这种相互作用方法进行确证，而这种方法正是IVEC筛选的基础。最后，多细胞生物的蛋白质在芽殖酵母核中不能进行合适的翻译后修饰。在网织红细胞溶液中表达的蛋白质可以进行正确地折叠，翻译后修饰的方式与在内质网中相似。因此，对多细胞生物系统来说，较于双杂交技术，IVEC中的相互结合在实际上可以在更多的生理浓度和条件下产生。
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14-3-3结合磷酸化蛋白。因为14-3-3的“饵”蛋白必须进行合适的翻译后修饰，因此，鉴定与它相互作用的蛋白质是一个很难用典型的双杂交技术进行筛选的实例。在此处描述的筛选中，我们依赖网织红细胞溶液中的激酶对翻译后的蛋白质库进行正确的磷酸化。
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参考文献
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20 用蟾蜍卵提取物修饰重组蛋白
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前言
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总则
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几乎每种蛋白质都进行翻译后修饰，而这种修饰会显著影响蛋白质的基本功能特性。一般地说，翻译后修饰分为三种类型：加工、化学修饰和键合形成复合物。加工包括对较长、非活性多肽前体（激素原）的水解，最终裂解产生成熟的活性分子。化学修饰具有多效性，这能改变蛋白质活性（二硫键的形成、磷酸化）、修饰位点（脂肪酸酰化、糖基化和磷酸化）和（或）稳定性（乙酰化、磷酸化）。类似地，两种或两种以上蛋白质的复合物可以显著地影响蛋白质的活性[例如，细胞周期蛋白使依赖细胞周期蛋白激酶（cdk）的活性增强]、定位（例如，背负核运输）或稳定性（例如，泛素介导降解）。
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在这些翻译后修饰中，蛋白质间的相互作用尤其重要。也就是说，蛋白质与其他蛋白质频繁相互作用导致其最终的生物学功能变化。例如，通过激活关卡激酶（Chk1）对Cdc25有丝分裂磷酸化酶的磷酸化最终改变了其在亚细胞的定位，但是这是通过改变Cdc25与蛋白质多次键合的能力来实现的。简而言之，Chk1激酶对Cdc25的磷酸化是严格限定在丝氨酸残基上，此点成了14-3-3蛋白质家族成员的一个结合位点（Peng et al.，1997；Kumagai et al.，1998b）。与14-3-3蛋白质结合对保持诱导关卡G2蛋白的抑制是重要的，但并不能改变Cdc25磷酸化酶在体外的活性。然而，14-3-3蛋白质确实抑制了Cdc25与输入蛋白-α（importin-α）的结合，大大减少了Cdc25的核输入（Kumagai and Dunphy，1999；Yang et al.，1999）。因此，化学修饰Cdc25（磷酸化）最终下调了Cdc25的活性，但如此之结果是通过平衡从细胞核到细胞质的移动造成的，是通过多个与Cdc25结合的蛋白质作用的结果。
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用细胞提取液作为模型系统
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重组细菌诱导或昆虫细胞sfg-诱导的蛋白质常常缺乏许多天然蛋白质分子的特征，或许就是由于缺少一种或多种具有功能意义上的翻译后修饰所致。由于对细菌表达蛋白的处理过程较为容易且成本较低，发现并定义其在真核细胞上的修饰是有可能的。为此，在细胞粗提液中对细菌进行孵育已经成为一种大量生产重组蛋白的方法，这样便可确定在重组真核蛋白上的修饰情况。例如，与生理有关的磷酸化和结合蛋白经常可以通过细胞粗提液在体外检测出来。在细菌或昆虫细胞中生产的重组周期蛋白D和cdk4亚单位在体外不能有效地进行装配，但是可以被增殖的哺乳细胞的裂解液激活（Kato et al.，1994）。哺乳细胞裂解液似乎是提供了两种组分：一个是装配因子，它能稳定周期蛋白D和cdk4的复合物；另一个是cdk激活酶（CAK），它是通过对cdk4上一个保守的苏氨酸残基的磷酸化来促进复合物的形成（Kato et al.，1994）。人的cdk2的晶体结构揭示出类似的苏氨酸残基位于一个结构环上，阻塞了基质结合的缝隙（De Bont et al.，1993），因此，在此残基上的磷酸化可能会改变这个禁止环的几何结构以及稳定活性构象，从而实现重要蛋白质与蛋白质之间的相互作用。类似地，细胞粗提液已经被用来鉴定与重组蛋白结合的、具有生理功能的蛋白质。例如，周期蛋白/依赖细胞周期蛋白激酶抑制剂p27Kip1可以通过周期蛋白E/依赖细胞周期蛋白激酶2亲和色谱，从生长停滞的细胞裂解液中分离，但不能从增殖细胞裂解液中分离（Polyak et al.，1994）。这种差异的结合方式是由于周期蛋白D在增殖细胞中的高水平表达，而且p27Kip1隐藏在增殖细胞中周期蛋白D/依赖细胞周期蛋白激酶4和6的三元复合物中，因此，不能与周期蛋白E/依赖细胞周期蛋白激酶2相互作用（Polyak et al.，1994；Reynisdottir et al.，1995）。
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为了能普遍应用，必须寻求一种重组蛋白质补救/修饰模型，从不同的细胞途径，广泛地研究蛋白质相互作用。随着基因组计划的完成，有一点十分清楚，那就是在所有脊椎动物中都明显存在着蛋白质结构和酶作用途径的进化守恒。我们一直用蟾蜍卵细胞作为我们补救/修饰模型的原材料。蟾蜍卵母细胞和卵细胞已经被用来研究青蛙、老鼠和人所保守的一批重要进化途径。例如，被注入哺乳动物RNAs的蟾蜍卵母细胞会表达、装配，并能将功能性的哺乳动物离子通道和神经递质插入蟾蜍的膜中，它强有力地支持了在这些生物种类中蛋白质之间相互作用具有保守性的论点（Goldin，1991）。蟾蜍卵提取物也被用来研究一系列生物学问题，包括DNA机理、蛋白质加工和运输，以及细胞增殖和死亡（表20.1）。在保留的蛋白质之间的相互作用中，所有这些途径是很多的。因此，蟾蜍细胞是研究重组蛋白补救/修饰模型的一种具有代表性的好材料。与哺乳动物细胞裂解液比较，青蛙卵细胞提取液具有重要的优点。因为，该提取液成本低、易于制备、浓度高，而且这许多优点已被证实（表20.1）。最后，除了作为修饰体系所具有的普遍适用性外，只有卵细胞适合于细胞周期分析。
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表20.1 用蟾蜍卵提取物对保守的多细胞动物进化途径的研究
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在鉴定依赖细胞周期磷酸化和结合蛋白时，多细胞动物卵母细胞/卵细胞提取液也被证明具有很高的价值。例如，一种分裂促成熟因子（MPF）的方法就是利用裂殖酵母p13suc1亲和色谱从海星卵母细胞提取液中抽提（Labbe et al.，1989）。海星CAK也同样能被检测，并能按依赖周期蛋白的方式，根据其激活蟾蜍cdc2能力被纯化（Fesquet et al.，1993）。最近，利用裂殖酵母p13suc1亲和色谱，活化的促后期复合物（APC）或环化体（cyclosome）已从蛤卵母细胞中被分离出来（Sudakin et al.，1997）。最后，蟾蜍卵提取物已被用于揭示与生理有关的结合蛋白和（或）大量重组蛋白的特异性磷酸化。在细胞粗提液中存在的特异性磷酸化以及磷酸化普遍存在性确实可以证明细胞裂解液具有使重组蛋白质磷酸化的能力。另外，由于很多蛋白质是按依赖细胞周期方式磷酸化的，所以，建立一种能够在体外和细胞周期中评价这种修饰的方法非常具有实用性。
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蟾蜍卵提取物模型系统
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蟾蜍卵提取物是一个评价重组蛋白依赖细胞周期磷酸化的重要体系。蟾蜍卵提取物可获取于暂时停止的有丝分裂或间期细胞，因此，可以使依赖细胞周期修饰的研究顺利进行。由于细胞周期机制的保守性，对来自任何真核宿主的细胞周期调节蛋白的、具有生理意义的修饰都可用蟾蜍进行研究。例如，在蟾蜍卵提取物中，海胆（Murray and Kirschner，1989）和蛤（Swenson et al.，1986）中的周期蛋白、裂殖酵母中的p13suc1（Dunphy and Newport，1989）和果蝇中Cdc25（Kumagai and Dunphy，1991）都发挥着相关的生理功能。
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程序纲要
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蟾蜍卵提取物的制备
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蟾蜍卵提取物提供了一个温和的生化体系，这种体系具有多种形式（Murray，1991）。为了修饰重组蛋白，我们主要利用停滞细胞静止因子的卵细胞提取液。通过细胞静止因子（CSF-Cytostaticfactor）的作用，停滞细胞静止因子的卵细胞提取液停止在中期。在加入钙离子后，停滞细胞静止因子提取液可以被诱导完成一个细胞周期。每一个体外细胞周期是由染色体解凝、核被膜形成、半保留DNA复制、染色体凝聚、核被膜分解和染色体分离组成。由于停滞细胞静止因子提取液停止在减数分裂Ⅱ的中期，它们并不是真正处在有丝分裂的状态。然而，在许多情况下，减数分裂的中期就等于有丝分裂，这种微小的差异并不影响重组蛋白的修饰。因此，停滞细胞静止因子提取液和加钙离子后的停滞细胞静止因子提取液常被用来激活细胞有丝分裂和细胞间期状态。为了确保细胞间期提取液不回到有丝分裂状态，在钙离子加入之前，首先加入蛋白质翻译抑制剂，即环己酰亚胺。因为，没有周期蛋白质B的合成，这些提取液不会进入细胞有丝分裂状态。在整个细胞培养过程中，为了明了和简短之目的，我们称停滞细胞静止因子提取液为有丝分裂期（M-phase），而将加钙离子后的停滞细胞静止因子提取液叫做细胞间期。
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纯化的重组蛋白也需要制备，这可通过多种策略实现。因为在本书的其他章节中（第4章）包括了重组蛋白的制备，而且必须根据各自的需要进行，故在此不再赘述。从这些实验角度出发，可方便地表达我们关注的、带有融合标签［例如，六元组胺酸、谷胱甘肽-S-转移酶（GST）或麦芽糖结合蛋白］的蛋白质，以便促进纯化和再分离。另外，如果能获得特异性抗体，人们就可以通过免疫沉淀方法回收蛋白质（见第5章）。在下面概述的特例中，我们在一个被杆状病毒感染Sf9昆虫细胞中表达了带有氨基酸终端为六元组胺酸标签的重组蛋白Xcdc6，并通过Ni-琼脂糖色谱对其进行了纯化（Coleman et al.，1996）。同时，也用细菌中表达的GST标记的蛋白质对键合和磷酸化进行了研究。
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重组蛋白的修饰和再分离
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在这一章的最后，将给出详细的修饰方法。简而言之，重组蛋白质的修饰就是在23℃条件下，将重组蛋白在蟾蜍卵提取物中孵育30min。一般来说，我们加入1体积纯化的重组蛋白（0.5～1mg/ml）到9体积的提取液中。在某些情况下，当重组蛋白与亲和胶键合后，它也能被修饰，尽管有时亲和胶会从立体结构上抑制这种修饰。因此，利用蛋白质与亲和胶键合需要靠经验确定。接着，我们用4体积的缓冲液稀释含有纯化的重组蛋白的提取液，并通过短暂的离心使其澄清。在4℃，用亲和基质孵育上清30min。最后，对键合在基质上的重组蛋白进行离心分离、洗涤和分析。
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图20.2 在细胞周期中蟾蜍Cdc6蛋白被差异修饰
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作为一个特殊的例子，我们发现在有丝分裂期内源性的Xcdc6蛋白比细胞间期显示出较慢的电泳迁移（图20.2A）。为了表征这种修饰，我们希望修饰足够量的Xcdc6蛋白，以便进行后面的分析。为此目的，在Sf9昆虫细胞中，对全长的Xcdc6蛋白进行过量制备，并使其带有六元组胺酸标签，通过Ni-琼脂糖色谱对其进行了纯化，达到近乎纯品（Coleman et al.，1996）。为了修饰洗脱的重组蛋白质，在23℃，在有丝分裂期或间期卵细胞提取液中，我们孵育了洗脱的重组蛋白。然后，用Ni-琼脂糖球形填料对六元组胺酸标记的蛋白质进行再分离和洗脱，并用SDS-PAGE对其进行分析（图20.2B）。在这个例子中，纯化的重组蛋白Xcdc6的分子量为61kD（图20.2B，泳道3），与内源性蛋白质一致。当内源性蛋白质在有丝分裂期被修饰后，显示相对比较迟缓的迁移（图20.2A，泳道2）。重组蛋白在有丝分期提取液中被修饰后也显示出类似的、较慢的迁移（图20.2B，泳道4）。如下面详细讨论，有丝分裂期的修饰可以完全归结为磷酸化。在对照实验中，孵育在间期提取液中的重组蛋白Xcdc6的相对迁移没有显著改变（图20.2B，泳道5）。不管是在有丝分裂期或是在细胞间期提取液中孵育，未包括重组蛋白的其他对照实验揭示出一个重要的Ni-琼脂糖相互作用物，其分子量为51kD（图20.2B，泳道1和2）。对51kD Ni-琼脂糖相互作用物仍未鉴定出结果（见图20.2B）。对有丝分裂期修饰的一个显而易见的解释为Xcdc6蛋白的磷酸化是依赖细胞周期方式进行的。为了确证这个结论，我们对M期蟾蜍卵提取物中的重组Xcdc6蛋白进行了修饰，并用碱性磷酸酶（图20.3A）或λ磷酸酶（图20.3B）处理，发现在任何情况下，一旦用磷酸酶处理，高磷酸盐式的电泳迁移增加。值得注意的是磷酸酶处理后的蛋白质的迁移率与内源性细胞间期蛋白质的迁移率相同（图20.3A）。另外，电泳迁移率的增加对磷酸酶抑制剂矾酸盐是很灵敏的（图20.3B）。总之，这些结果表明一方面在细胞M期Xcdc6蛋白分子量依赖细胞周期的变化完全是磷酸化的结果；另一方面重组蛋白可以与体内一致的方式，在细胞M期卵细胞提取液中进行磷酸化。
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图20.3 在有丝分裂期卵细胞提取液中磷酸化的Xcdc6蛋白
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修饰评价和修饰蛋白的利用
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从生理意义上，确定一个重组蛋白修饰后是否具有生物学功能的一个有效和重要的步骤是对修饰进行分析。例如，Hunt和合作者发现CAK从细菌中分离出来时，其催化亚单位没有活性。但是，将CAK浸泡在蟾蜍卵提取物中，其活性被激活（Poon et al.，1993）。因此，评价这种修饰时需要对蛋白质在提取液中孵育前后进行比较。从一种生理意义上，知道重组蛋白可以被修饰后，人们就可以定义修饰。修饰的检测在很大程度上取决于所用的技术。检测技术包括对从球形填料上洗脱的蛋白质生物活性的检测到做SDS-PAGE电泳。在上述例子中，后面的研究发现蟾蜍提取液介导的CAK蛋白质活化是由于磷酸化所致（Poon et al.，1994）。
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另外，如果人们要找到一种特异性结合蛋白，可用SDS-PAGE电泳对亲和色谱纯化的蛋白复合体的组分进行分析，然后染色。与所关注的重组蛋白迁移不同的蛋白质迁移带的存在，表明蛋白质复合体已经形成。蟾蜍细胞初提液已经使许多那样的结合蛋白的鉴定变得容易进行，只是在抽提实验中要用到一系列的“诱饵”，包括：裂殖酵母p13suc1 （Dunphy and Newport，1989）、Cdc25 磷酸酶（Crenshaw et al.，1998；Kumagai et al.，1998a）、CRM1核输出因子（Yang et al.，1998）、输入素（importin）（Yang et al.，1999）、Pin1 丙基异构酶（Crenshaw et al.，1998）、周期蛋白B（Yang et al.，1998）和周期蛋白E（Yang et al.，1999）。人们可以通过几种方法增加检测结合蛋白的灵敏度。最普遍的方法就是针对一个已知的或推测的蛋白质，采用其抗体，通过免疫印迹方法进行检测。更一般的方法是对键合在诱饵上的蛋白质进行生物素酰化（例如，用Amersham 生物素酰化）。在转移到一个膜上后，可用辣根过氧化酶（HRP）-链霉抗生物素蛋白染色检测生物素酰化的蛋白质。用果蝇收割蛋白（drosophila reaper protein）作为诱饵，这种方法已经成功地用于蟾蜍细胞程序性死亡调节剂（Scythe）的检测（Thress et al.，1998）。通过对键合在收割共轭球形填料上蛋白质的生物素酰化，将蟾蜍细胞程序性死亡调节剂检测后，研究人员将纯化的方法扩展到考马斯亮蓝染色的水平，以便进行微量测序。这种方法强调了蟾蜍体系的另一个优点，即用最少数量的青蛙可以很容易获得大量的提取液（克级）。
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一般常用两种方法分析磷酸化修饰。第一种方法是在放射性ATP存在下，将蛋白质在一种提取液中孵育，然后进行放射自显影分析，检测磷酸化的含量。因为仅仅是检测的磷酸化的蛋白质，所以这种方法不需要电泳迁移率的变化。另外，由于加入的放射标记物的量有限，而提取液中含有毫摩尔浓度的内源性ATP，因此这种方法不能制备出易于检测的产量。第二种方法是利用35S，建立在电泳迁移率变化的基础上的一种方法。通过在提取液中对35S标记的重组蛋白（例如，在含有35S蛋氨酸的网状细胞体系翻译）进行孵育，可以检测随时间变化时磷酸化的程度（迁移距离变化）。例如，第二种方法可以对Cdc25（Kumagai and Dunphy，1992）和裂殖酵母Weel（Tang et al.，1993）的磷酸化结构域进行快速作图。
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对Xcdc6蛋白，我们可以SDS-PAGE电泳检测有丝分裂期特异性的修饰（磷酸化）。为了查明在有丝分裂期哪个残基被磷酸化，我们使用了基质辅助激光解吸/离子化飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）。这种技术提供了一种有利条件。它能快速地从复杂混合物，比如从蛋白酶水解物中获得低至皮摩尔肽的准确分子量信息。另外，当比较磷酸化肽和非磷酸化肽时，由于质量会增加80D或80D的倍数（HPO3分子量），所以用基质辅助激光解吸/离子化飞行时间质谱很容易检测磷酸化的肽。
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在12章已详细阐述MALDI-TOF-MS技术。简而言之，在SDS-PAGE和染色后，切割细胞有丝分裂期（63kD）和细胞间期（61kD）Xcdc6蛋白带，进行脱色和干燥，然后，对含有衍生Xcdc6 蛋白的胶条进行还原和烷基化，并用胰蛋白酶进行水解。提取产生的肽段并做MALDI-TOF-MS分析（Shevchenko et al.，1996）。所有MALDI-TOF-MS光谱都是在Voyager DE飞行时间质谱上获得（PerSpective Biosystems）。操作条件为延迟离子化萃取线性方式。用Protein Analysis Worksheet（PAWS）软件分析所得数据，对实验测定质量与理论质量进行匹配，再将观察的质量值与预测的质量值比较，首先是未磷酸化的肽，然后是单磷酸化的肽。为了确定哪个位点是可能的磷酸化位点，我们需要建立严格的标准来检验我们的方法。首先，我们鉴定从处理的Xcdc6蛋白所酶解的肽的质量峰，其大小与单磷酸化肽一致；其次，我们验证只有磷酸化的肽存在于有丝分裂期处理的Xcdc6蛋白水解物中，而非磷酸化的肽只在细胞间期处理的Xcdc6蛋白水解物中发现。如图20.4所示，只有符合这些严格判断标准的、质量发生变化的峰才在该质谱图中显示。通过实施这些严格判断标准，鉴定的肽才可能是在细胞有丝分裂期符合化学计量学意义的磷酸化以及在细胞间期的完全非磷酸化。
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图20.4 Xcdc6蛋白磷酸化位点的MALDI-TOF-MS肽质量图谱
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有丝分裂谱图中的几个质量峰值得注意。相对于细胞间期谱图中的质量峰，它们的质量位移了80.0D（±0.3）（图20.4，峰1～6）。由于MALDI-TOF-MS分析本身是非定量性质的，所以无需对细胞间期和细胞有丝分裂期肽相对峰高不相等感到吃惊。重要的是细胞有丝分裂期位移峰所对应的胰蛋白酶水解肽中都含有一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基（表20.2）。事实上，在推定的磷酸化位点中有四个含有S/P或T/P残基，它们是几种有丝分裂激酶优先识别的共有位点（表20.2：肽4a、4b、5和6）。另外，在这些已经鉴定的磷酸肽序列中，有几个磷酸肽序列是重叠的（表20.2：肽2、3、4b和5），强调了它们可能具有合理的磷酸化位点的资格。液相色谱—电喷雾离子化串联质谱（LC-MSMS）也能够证明了这一点（S.Seeholzer and T.R.Coleman，在准备中）。
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表20.2 Xcdc6磷酸化肽的质谱鉴定
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综上所述，蟾蜍卵提取物代表一种对重组细胞进行修饰的十分有效的体系。最重要的是用这种体系研究的许多蛋白质修饰都与生理功能相关。如上概述，这些修饰包括磷酸化和相关蛋白质的结合。在所述的实验中使用重组蛋白，人们可以最大量地获得修饰蛋白。有了这些修饰蛋白，人们就可以方便地对其进行分析，以便研究生物活性、结合蛋白之间的相互作用或化学修饰的存在。另外，在上述引用的特殊例子中，蟾蜍卵提取物以化学计量的方式对蛋白质进行磷酸化是可能的，这非常有利于分析。最后，卵细胞提取液的制备方法已经完整地建立起来了。包括从提取液的制备到蛋白质的磷酸化，所有步骤仅需半天的时间。
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对照
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蟾蜍卵提取物非常适合于进行依赖细胞周期修饰的研究。通过比较细胞M期提取液与细胞间期提取液对重组蛋白的修饰能力，一个最直接的要求就是特异性。换句话说，蟾蜍卵提取物体系用于细胞循环修饰常常需要建立内对照，即在M期和间期提取物中平行地孵育一个预期的蛋白质。例如，当Xcdc6在细胞有丝分裂提取液中而不是在细胞间期提取液中孵育时，电泳迁移率差异显示Xcdc6被过磷酸化（见图20.2B）。相反，当Cdc25在细胞间期提取液中而不是细胞有丝分裂提取液孵育时，Cdc25优先与14-3-3蛋白质结合（Kumagai et al.，1998a）。基本的对照实验包括只用亲和球形填料处理提取液以便评估共纯化蛋白质的本底水平。例如，在使用Ni-琼脂糖填料，Xcdc6存在和不存在时我们都注意到一个重要51kD结合蛋白（见图20.2B的图注）。同样地，如果要用抗体免疫沉淀方法从提取液中重新分离重组蛋白，用非特异性的对照抗体进行平行免疫沉淀是至关重要的。
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根据所用的试剂，与平行对照球形填料结合的共纯化蛋白质的数量和强度会使后续的分析变得艰难，但是这些困难可通过一系列的方法予以克服。一个重要的考虑就是在任何键合反应中限制亲和球形填料的用量。更确切地说，这些树脂的结合容量一般是很高的。用小的树脂量（＜10μl），常常有利于高亲和性相互作用（例如，标记重组蛋白），而其代价则是低亲和性、非特异性的内源性蛋白的相互作用。也可以在实际孵育重组蛋白前，用对照的球形填料预处理提取液（4℃，0.5h）。用这种方法，可在进行任何修饰之前，使内源性的、与基质结合的蛋白质的提取液变成澄清溶液。同样地，也可用浓的蛋白质混合物（例如，胎牛血清，0.5h，4℃）预处理亲和球形填料，以阻止非特异性相互作用（Yang et al.，1999）。最后，要根据各个用途，制备特异性的球形填料。例如，在使用Ni-琼脂糖填料情况下，我们发现咪唑的存在对重新分离重组蛋白Xcdc6是至关重要的。在咪唑浓度＜60mmol/L时，大部分六元组胺酸标记的蛋白质都与Ni-琼脂糖亲和。我们发现咪唑浓度为50mmol/L时，再次分离重组蛋白Xcdc6时，会显著减少内源性青蛙蛋白质与Ni-琼脂糖结合而不降低重组蛋白Xcdc6亲和力。类似的方法是在亲和缓冲液中使用低浓度的EGTA（0～10mmol/L）以减少非特异性的亲和，但不螯合色谱柱上的镍离子（Kumagai and Dunphy，1995）。因为在变性剂（例如4～8mol/L脲）存在下，六元组胺酸会与Ni-琼脂糖结合，所以也可用这些试剂洗脱Ni-琼脂糖而减少非特异性的内源性青蛙蛋白质的结合。当然，这些处理方法只能用于分离非常稳定的复合物或共价修饰的融合蛋白标记物。另一种方法是将融合标签结合到一种诱饵上。例如，最近用重组Chk1蛋白与谷胱甘肽-S-转移酶（GST）和六元组胺酸标签融合，鉴定出Claspin是Chk1激酶一种重要的调节剂（Kumagai and Dunphy，2000）。在此两步法中，在装有键合Chk1-GST-His6蛋白质的Ni-琼脂糖球形填料的色谱柱上，Chk1结合蛋白可以从细胞间期提取液中分离出来。然后，用咪唑将这些蛋白洗脱，再与谷胱甘肽—琼脂糖结合，最后进行SDS-PAGE分析。两个独立的亲和纯化步骤的应用减少了非特异性结合。不幸的是不存在万全之策。但是，为了在每次使用中减少非特异性相互作用，有必要依靠经验决定必需的预防措施。
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方案
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方案1：卵提取
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材料
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缓冲液和溶液
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分子克隆手册：蛋白质—蛋白质相互作用
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分子克隆手册：蛋白质—蛋白质相互作用
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专用设备
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贝克曼TL超速离心机（或相应设备）和摆动吊式转子（TLS-55）
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尽管其他离心机及转子相结合也可达到12000g，但我们认为这种转子的性能（约2ml）最适于提取产物。
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临床用离心机
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水平或摆动吊式转子（贝克曼microfuge E），能适用于装载长形试管（8mm×28mm，0.5ml）的离心管（贝克曼）
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方法
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1.雌性青蛙（如，蟾蜍）很容易得到，蟾蜍非常适合于在实验室存活（蟾蜍养殖见Wu和Gerhart 1991年的综述），通常，在含有30mmol/L的NaCl，16～22℃的自来水中养殖，喂以小红鳟鱼（Purina）或蟾蜍饲料（Nasco）。
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2.最适用的是卵生3～14d的小雌蛙，在其背淋巴囊用23口径注射针，每只注射溶入0.5ml无菌水的孕母马血清促性腺激素75u。
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3.在提取前12～14h，每只青蛙注射溶入0.8ml无菌水中的绒毛膜促性腺激素以诱导排卵，注射后，将每只青蛙分离养殖于含25g NaCl的5L水中，一般注射2～3只，并选来源于一只青蛙的高质量卵。
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但是，所谓“高质量卵”并无准确的定义，只是其外观和大小十分均匀，而且从上面看去，在黑色的动物极处有一个清晰的白点（雌性原核，或胚泡）。通常，来自同一个蛙>95%的卵是均匀的，少数不标准的卵缺少稠密性，且能容易地用转移器或巴斯德移液管移走。大白“雪球”卵需要除去。偶尔，青蛙也产“带柱”形卵，他们通常首尾相接，而且一般质量很差。一只青蛙产足够量的卵（20～50ml凝胶状）一般可提取1～2ml提取物，一般用新鲜的提取物做实验，因为整个提取过程只需1h，如果冷冻就会失活。
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4.在约200mlMMR中洗卵2～3次，在这个过程中用移液管取走碎屑以及非标准的卵。
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5.配制约200ml2%半胱氨酸（pH7.8），缓缓弃去MMR并加入约50ml半胱氨酸溶液，混匀，倾析，加约100ml新鲜的半胱氨酸溶液，充分混匀。这时卵的胶衣几乎看不见了，而卵的体积浓缩了两倍。当由于胶衣被去除而使卵紧裹在一起时，我们称卵是脱胶的，尽量弃去半胱氨酸溶液，使卵紧密，（5min），最后用约50ml半胱氨酸洗卵，并弃去溶液。
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6.用约200mlMMR分别洗卵2～3次。
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7.用约200mlCSF-XB分别洗卵4次。
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8.将巴斯德移液管端口切断并制成一个钝的管口。用这种仪器，可以最大程度地减少物理损伤，将卵移至摆动吊式长颈微量离心管中，为减少缓冲液的进入，将钝头插入卵中，充满移液管。
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9.用移液管移走所有的CSF-XB。
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10.每一管卵中，加入0.5mlCSF-XB，其中包含6.6μl细胞分裂抑制素B储备液以及2.2μl蛋白酶抑制剂储备液。
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11.用封口膜将管的顶端封住，轻轻翻转几次混合。
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12.将这些管子放置到一个自制的装置中，这个装置是可以放两只微管，并有可开启的盖，一个在另一个上面，插入一个折帽，14ml的管子（如，Falcon2059）。微管形成一个基座，使装有卵的管子能稳固地呆住。
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13.将卵放入临床离心机分三个步骤：
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设置3（约1300r/min），15s；
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设置5（约2000r/min），60s；
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设置7（约3000r/min），30s。
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14.用移液管移走上面的缓冲液，此时卵还未裂解。
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15.在12000g压力下破碎卵，10min 16℃，用离心机离心，使卵破碎，而不是匀浆，产生致密的胞浆提取物，使卵黄以及色素污染物最少。
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16.继续离心。管内将分三层：上层：黄色脂层；中层：胞浆；下层：卵黄及色素粒。用21口径的针插入3ml微量注射器，慢慢吸出中层（胞浆），将针插在胞浆与卵黄层的分界面，注意在介面上的淡黄色亚层，由于这个亚层中含有许多可以形成核的膜，因此将它与胞浆分离十分重要。
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17.将提取物移入延长的0.5ml试管，在摆动吊式转子配接管中，4℃下14000g离心2min，这种离心除去卵黄及脂类污物。
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18.用单边剃须刀切掉脂层底沿管的上端，以除去脂类污物，用巴斯德移液管吸出提取液，小心避免吸入卵黄。
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19.称量胞质，加入能量混合液（1/19体积，20×储备液），这是CSF-阻断的M期提取剂。
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20.加入放线菌酮（100μg/ml）至M期提取液，放在冰浴中备用（至少6h）。
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21.准备介面提取物（0.2～0.5ml，依实验量而定），23℃条件下在0.5mmol/L CaCl2中培养15min。
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方案2：修饰、再分离和评价
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材料
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缓冲液和溶液
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分子克隆手册：蛋白质—蛋白质相互作用
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色谱体系
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分子克隆手册：蛋白质—蛋白质相互作用
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凝胶
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分子克隆手册：蛋白质—蛋白质相互作用
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方法
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1.准备及纯化所感兴趣的重组融合蛋白（见第5章）。
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2.准备蟾蜍CSF-阻断“M期”以及分裂期卵提取物（见“卵提取”一节）。
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3.孵育重组蛋白在M期或分裂期卵提取物30min 23℃（一般180μl提取物含蛋白20μl）。
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4.用5倍体积的HBS稀释卵提取物。
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5.在临床用离心机上全速离心（3000 r/min）2min。
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6.旋转键合重组蛋白和磁珠4℃，1h。
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由于是六元组胺酸标记重组蛋白，我们发现加入咪唑（＜50mmol/L），可以很大程度地减少非特异性蛙蛋白与Ni-琼脂糖的键合（见正文）。
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7.用400μl HBS将键合蛋白混合物反复悬浮洗涤。
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8.用临床离心机全速离心15s。
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9.重复这一操作3次以上。
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10.移出尽量多的液体，注意留下尽量多的完整珠粒。
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11.加SDS填充缓冲液（15μl）并煮沸4min。
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12.上样于非连续SDS-PAGE梯度胶。
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13.用新制的考马斯亮蓝染色
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我们发现用新制染色液对质谱分析非常有利，因为它能确保脱色完全，类似的，用高着色物（见Bio-Rad）可以改善随后的质谱分析。
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14.用胶脱色液1在室温脱色1h。
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15.倒出胶，并重复步骤14。
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16.用胶脱色液2在室温脱色，将胶储存于胶储存缓冲液中。
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方案3：质谱
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材料
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缓冲液与溶液
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分子克隆手册：蛋白质—蛋白质相互作用
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生物分子胰酶溶液
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20μg/μl测序级猪胰酶（Promega）溶于25mmol/L碳酸氢铵〈！〉。
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专用设备
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质谱仪
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微量离心管
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离心机
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方法
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1.从胶上准确切下感兴趣的点，并切割成约0.5mm3的小块。
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2.在0.5ml脱色液中室温脱色过夜。
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3.弃去上液，另加0.5ml脱色液室温脱色2～3h。
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4.弃去脱色液，将胶片在0.2ml乙腈中脱色5min左右，弃去乙腈。
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5.重复步骤4。
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6.真空离心脱水胶片直到干燥。
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7.加100μl还原缓冲液室温孵30min。
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8.离心，并弃去DTT溶液。
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9.加入烷基化缓冲液，室温孵化胶片30min。
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10.离心，并弃去碘乙酰胺溶液。
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11.用0.2ml乙腈使胶片脱水，如步骤4和5。
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12.加0.2ml50mmol/L碳酸氢铵使胶粒至泡胀。
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13.离心，弃去碳酸氢铵溶液。
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14.如上方法，用乙腈脱水。
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15.真空离心干燥胶片。
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16.新鲜准备Promega胰酶25μg在1ml冰浴25mmol/L 碳酸氢铵中。
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17.加入最少量体积的胰酶（10～30μl依胶体积大小而定），使胶重泡胀，此步保持在冰中进行。
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18.离心，弃去多余的酶溶液，加少量体积的碳酸氢铵，确保它能完全覆盖胶片。
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19.30～37℃孵育过夜。
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20.加一体积的提取液提取肽段，收集上清于单独的石英玻璃管中。
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21.再用一体积的提取液重复提取，与上液混合，在第二次提取中，用50%甲醇或异丙醇提高疏水性肽段回收率。
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致谢
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感谢Coleman实验室的 Drs.Eric Moss和Sarach Fashena等人对我们的帮助以及对手稿的精心校对，本工作由ACS IRG和NCI CA-06927基金，以及NIH拨款的GM-58924基金共同组成的宾夕法尼亚公共基金资助。同时感谢The V基金的支持，以及Dr.Anthony T.Yeung 的 Fox Chase癌症中心的生物技术设备中心的支持。
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21 采用λ阻遏物融合技术分离和鉴定自组装结构域
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前言
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尽管有多种生物化学方法用于研究蛋白质—蛋白质相互作用，但酵母双杂交系统（Fields and Song，1989）已成为利用遗传分析对蛋白质间发生物理相互作用进行分析的一种选择。这种方法不仅简便，而且可用于研究大量的相互作用（综述，见Uetz and Hughes，2000）。然而，有许多理由可以说明为什么在大肠杆菌中类似的遗传分析方法同样是有用的（Hu et al.，2000）。首先，大肠杆菌的转化效率比酵母高，可以构建更复杂的文库。其次，细胞中的内源性蛋白对分析结果会有影响。而大肠杆菌的细胞背景中，这种影响不太容易发生。第三，酵母双杂交系统需要对猎物和诱饵都进行核定位，而在细菌系统中不需要，因为细菌中缺少细胞核。直到最近，还没有具备这些优点的细菌双杂交系统。然而在过去的几年里，已经有几家实验室对细菌双杂交系统进行了描述。本书第25、26和30章描述了两种新的细菌系统。别处对其他细菌系统进行了归纳（Hu et al.，2000）。
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本章描述了一种基于融合到噬菌体λ阻遏物氨基端DNA结合域的系统，这个系统已用于检验一种更为专一的蛋白质—蛋白质相互作用：自组装到同型寡聚体里。许多蛋白质自组装形成寡聚体，在研究单基因产物时，对寡聚化结构域进行检测和描绘已成为结构和功能分析的一个标准组成部分。当缺少一种分析蛋白质正常功能的方法时，基于融合蛋白的遗传方法为描绘和鉴定寡聚化结构域提供了一种方便的途径。尽管酵母双杂交系统可检测到一些同型相互作用，但对于蛋白质组的筛选可能会漏掉一些相互作用（Hu，2000；Newman et al.，2000）。
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λ阻遏物的活性同时依赖于氨基端的DNA结合域和羧基端的寡聚化结构域（Pabo et al.，1979）。去掉羧基端的结构域会减弱DNA结合域的活性并使阻遏物失活（图21.1）。可是，当异源寡聚化结构域被融合到氨基端结构域时，阻遏物可重新具有活性（Hu et al.，1990）。自从1990年阻遏物融合系统被发明以来，它已被证明是一种便于使用的研究体内蛋白质寡聚化作用的遗传工具。噬菌体λ阻遏物融合系统已被广泛用于在大肠杆菌中研究来自各种生物的蛋白质的寡聚化特性。采用阻遏物融合技术已成功地鉴定了以下来源的蛋白质寡聚化结构域：细菌蛋白质（Amster-Choder and Wright，1992；Turner et al.，1997；Kennedy and Traxler，1999；Jakimowicz et al.，2000），真菌蛋白质（Hu et al.，1990；Strauss et al.，1998；Nikolaev et al.，1999），植物蛋白质（Edgerton and Jones，1992；Gonzalez et al.，1997；Palena et al.，1997），昆虫蛋白质（Gigliani et al.，1996）和哺乳动物蛋白质（Lee et al.，1992；Romano et al.，1998；Tan et al.，1998）。阻遏物融合系统的一个特点是它可以区分出二聚体和较高程度的寡聚体（Zeng and Hu，1997）。系统的这种特性可用于去除筛选系统中的蛋白质聚集体。
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图21.1 λ阻遏物融合作为一种工具用于研究蛋白质寡聚化作用
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阻遏物融合系统的用途已不仅限于鉴定单一的蛋白质。它还用于挑选瓦解相互作用（Park and Raines，2000），设计肽抑制物（Jappelli and Brenner，1996），鉴定需要辅助因子、翻译后修饰、或寡聚化作用分子信号的蛋白质（Fiedler and Weiss，1995；Qin et al.，2000；Rashkova et al.，2000）。此外，跨膜片段相互作用已在体内被检测出（Leeds and Beckwith，1998），这为研究不溶性蛋白相互作用开辟了新途径。最后，文库方法包括挑选高亲和性的肽配体（Zhang et al.，2000）和通过挑选发现新的由酵母和大肠杆菌编码的自组装肽（Jappelli and Brenner，1999；Zhang et al.，1999）。
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阻遏物融合以及其他用于研究蛋白质—蛋白质相互作用的遗传方法都具有局限性：一种遗传检测方法只能提示一种物理相互作用，然后再用生物化学方法对可能存在的相互作用进行确定。就像任何遗传方法一样，阻遏物融合技术对于某些相互作用无法鉴定，例如那些对于正确组装所必需的翻译后修饰。因此，阻遏物融合技术应当被看作是对目前正在使用的大规模双杂交筛选方法（Fromont-Racine et al.，1997；Ito et al.，2000；Uetz et al.，2000）和其他生物化学和遗传学方法的一种补充，而不是替代它们的方法。
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程序纲要
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文库的构建
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载体
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用于鉴定自组装结构域的阻遏物融合载体是多拷贝质粒，可克隆插入到下游的目的片段，以及位于λ阻遏物的DNA结合结构域读码框中的片段。鉴定自组装结构域时，融合蛋白的组成性表达需要处于低水平。因为当氨基端DNA结合结构域处于过量表达时可发生二聚化，从而使噬菌体转染即使在缺少羧基端结构域时也具有免疫性（Sauer et al.，1990）。
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我们实验室中拥有三代阻遏物融合载体。图21.3显示了它们的不同点。我们所使用的所有抗氨苄青霉素质粒都是pZ 150的后代（Zagursky and Berman，1984），pZ 150是pBR322的衍生物，带有一个M13单链（ss）DNA起点，便于M13介导的转导（Vershon et al.，1986）。编码阻遏物融合的区域位于pBR322中Eco RⅠ和Eco RⅤ位点之间。融合蛋白在顺时针方向上被转录；在克隆位点下游有一个来自T7ф10噬菌体基因的转录终止子。这些质粒在tet 基因的Bam HⅠ和Sal Ⅰ之间还包含一个缺失，去除了一些限制位点。
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图21.3 阻遏物融合载体的重要特征
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在原始载体pJH391里（图21.3B）（GenBank检索号AF316554），融合蛋白从一个最小的lac UV5启动子处表达。位于Eco RⅠ位点和阻遏物编码序列起始点之间的654 bp包含起动子区域、一个lac操作子和来自lac Z的Shine-Dalgarno序列。在启动子区域中不含有CAP结合位点。使用pJH391构建的质粒必须用于含有lac Iq等位基因的菌株中，这种菌株可以过量表达lac 阻遏物。基础渗漏表达水平足够表现出免疫（阻遏物阳性）表型。
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在pJH391质粒中，插入片段可以在SalⅠ和Bam HⅠ位点之间被克隆。由于这个质粒被设计成适合于一种特殊的编码GCN4亮氨酸拉链的人工基因盒，所以不包含多聚接头。pJH391在Sal Ⅰ和Bam HⅠ之间包含一个“填充”片段，以便于这些酶切后DNA的纯化。注意，终止密码子一定要设计在插入片段的下游端；对载体的通读可导致依赖于读码框额外多肽的大量增加。
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一种基于pJH391的试剂盒已被广泛使用，并且已被成功地用于研究许多不同的寡聚化作用结构域。1977年，我们发明了第二代载体（图21.3C）。最主要的区别在于用一个被称为P7107的弱的组成型启动子代替了lac UV5（Zeng et al.，1997）。pXZ240（GenBank 检索号为AF316555）除了启动子被替换外，与pJH391完全一样，也在cI起始点的上游引入了一个惟一的Xba Ⅰ位点。在没有IPTG时，P7107好像在表达融合蛋白时比lac UV5的基础表达水平更低；启动子的实际差别还没有被量化。对于建立一种用于检测以阴性为主的二聚化作用的体内方法，这种低水平表达是很重要的（Zeng et al.，1997）。然而，pJH391载体更易于表达弱的寡聚体，并且仍被选作用于研究特殊基因产物的寡聚化作用的载体。
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为了从一个特定的基因中鉴定出寡聚化作用结构域，人们通常构建一系列具有不同末端位点的载体，然后通过筛选来检测阻遏物活性。当分离到具有活性的融合时，重要的是要判明阳性结果是由于自组装才表现出阻遏物活性，而不是由于宿主或载体的一个突变（如上游启动子或质粒拷贝数突变）简单地提高了融合蛋白的表达水平。对于我们获得的第一代和第二代载体，阳性结果的确认是通过先挑选分离出插入片段，再进行克隆。然而，对于大量的克隆，再次克隆是很麻烦的。目前我们正在检测一种第三代载体，它可以用快速的方法检测出依赖于插入的表达（图21.3D和图21.4）。这些载体在DNA结合域和DNA插入片段之间的103位处包含一个琥珀突变。最终的琥珀突变中包含从1—102位残基的λ阻遏物，这个片段在大肠杆菌中已表现稳定（Parsell et al.，1990）。正如图21.4所示，如果阻遏物阳性依赖于插入的编码结构域的自组装，那么它也应当依赖于琥珀突变所造成的抑制。这可以利用M13介导转染阻遏物（supF；LM58）和非阻遏物（sup 0；LM59）菌株来鉴定。
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图21.4 采用无义抑制检测依赖型插入
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我们的第三代质粒含有多克隆位点，适应不同的DNA片段。克隆位点盒包含Sal Ⅰ、Sma Ⅰ、Sph Ⅰ、Bst BⅠ和Bgl Ⅱ的识别位点。除了可用相同的酶来切割DNA外，这些位点还可适用于多种黏性末端和平末端。质粒pLM99（GenBank 检索号：AF308739）、pLM100（GenBank 检索号：AF308740）和pLM 101（GenBank 检索号：AF308741）属于第三代阻遏物融合质粒，它们都带有这种克隆位点盒，只是所在的读码框不同。
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当使用设计的PCR片段或合成的克隆位点盒来造成一个插入时，很容易控制读码框并确保在插入片段的末端有终止密码子。当插入随机的DNA片段时，重要的是防止从载体序列开始翻译，这可能带入偶然的相互作用序列。因此，在多克隆位点之后是在三种读码框中均出现的一系列终止密码子。
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第三代质粒在DNA结合域中也含有突变，这样可以提高它激活PRM启动子（Bushman et al.，1989）和FLAG抗原决定标签的能力，FLAG抗原决定标签位于接头内，位于阻遏物结构域和插入片段之间。第三代质粒从P7107启动子处开始表达融合蛋白。然而，序列中一个额外的缺失增加了这些质粒的拷贝数；因此，表达水平可能在某种程度上比第二代质粒高。
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目前，我们正在发展第四代载体。这代载体将具有一些其他特点，便于从任何大规模文库中筛选鉴定自组装结构域。尤其是，我们计划将过量表达和纯化特性构建到这种融合载体中，以满足生物化学的鉴定。载体中还将包括位点专一的重组序列，便于将插入片段转到其他种类的载体中（Walhout et al.，2000）。例如，它可用于将一个在阻遏物中筛选鉴定出的组装结构域转到一个适当的真核细胞的表达载体中，在那它可能产生一个显著的阴性表现型（Herskowitz，1987）。
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对载体的挑选取决于所侧重的问题。lac UV5的高表达水平有利于发现弱的寡聚化作用结构域。例如我们已发现，尽管GCN4亮氨酸拉链（解离常数为纳摩尔）在lac UV5和P7107中被转录时都表现出阻遏物活性，但C/EBP亮氨酸拉链只在lac UV5启动子控制下表达时才有阻遏物活性。可是，lac UV5启动子的活性太强，不能用于阴性为主的方法中，在文库中挑选有活性的克隆时，使用lac 启动子可导致由于lac I突变造成的假阳性。
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插入
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限制性片段或PCR产物一般用于发现特定基因中的寡聚化作用结构域。对于非常小的结构域，如亮氨酸拉链，通常采用DNA合成的方法产生整个插入片段。当采用合成的DNA片段时，可以在片段中设计方便的限制位点，这样便于将来研究突变。有几种计算机程序可用于识别在序列中哪些地方可以引入限制位点而不改变编码序列。我们使用一个基于网络的程序Seqsearcher（Reidhaar-Olson et al.，1991），网址在http：//tofu.tamu.edu/seqsearch/。
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对于整个基因组的研究，我们只使用从生物体中得到的部分消化的基因组DNA，它们只有少量或没有内含子。但从原理上，PCR产物或cDNA也可作为插入片段的一个来源。对于基因组范围的研究，构建高质量的质粒文库对于筛选的成功是至关重要的。由于寡聚化作用结构域可位于一个蛋白质的任何部位，所以许多融合由于移码或插入方向错误可能没有功能。因此，一个有高度代表性的文库不仅必须包括每一个基因，还要尽可能在每个基因中包含多种不同的融合末端位点。我们用限制性酶Cvi TI*对基因组DNA进行部分消化，Cvi TI*的识别序列为～NGCN。这种酶可以给出一个DNA片段的准随机分布，得到的DNA片段可用于鸟枪法测序（Fitzgerald et al.，1992；Gingrich et al.，1996）。Cvi TI*酶切产生平末端，可被克隆到阻遏物融合载体的Sma Ⅰ位点中。
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大肠杆菌菌株
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原则上，很多大肠杆菌菌株可用作阻遏物融合载体的宿主。对于第一代载体，必须使用带有lacIq等位基因的菌株。如果要使用M13介导的转导，那么菌株必须是F+。在实践中我们发现，不同菌株在对照质粒的行为中存在着细微的差别。例如，使用报告原噬菌体似乎可以略微降低阻遏物活性；一些在等基因的非溶原性细菌中产生免疫的结构在溶原性细菌中也变得敏感。相反，一些商业化菌株，包括XL-1 Blue的衍生物，允许我们的一些阴性对照（缺少二聚化结构域）表现出它们好像是有免疫性的。这表明不同实验室的菌株在质粒拷贝数或超螺旋上是有差别的。此外，一些菌株含有未被注释的突变，这些突变可以影响它们对于λ或Φ80的敏感性。我们建议，当使用第一代和第二代载体时选用AG1688菌株。第三代和第四代载体需要一个琥珀阻遏物来获得全长融合；在这种情况下，我们建议对于这些阻遏物，融合载体选用JH787作为宿主。但要注意这些菌株有两个缺点。第一，它们都没有商业化的感受态细胞。第二，AG1688为endA+，即从这些菌株得到的质粒要进行去蛋白化，以防止由于核酸内切酶活性造成的DNA丢失。
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挑选和筛选
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有两种方法用于检测大肠杆菌中阻遏物的活性：噬菌体免疫测试和报告构建体（图21.5）。表达阻遏物融合的菌株可在有噬菌体存在的环境中生长，菌株的这种能力可用于挑选或筛选。当检测少量特殊的构建体时，通常采取筛选的方法。有几种简单的方法用于筛选。交叉条法在一块平板上用噬菌体λ贯穿划一条细线，称为“死亡线”。之后各被检验物各自以适当的角度以一条单独的线穿过噬菌体线。平板培养5～6h至过夜。所有的被检测物都将生长到噬菌体线附近；只有那些恢复了阻遏物寡聚化作用的被检测物才能生长穿过死亡线，而那些敏感的细胞，当它们到达噬菌体线时将停止生长。单个的克隆也可以用检验噬菌体λ平板效率来检测。可以采用几种方法。最严格的方法是仔细滴定菌株上噬菌体的量。一个检验几种检测物的简便方法是，将噬菌体稀释液点在软琼脂上的菌苔表面。挑选噬菌体免疫性的方法是，将细胞涂布在接有λKH54和λKH54h80噬菌体的平板上。KH54突变是在cⅠ处有一个缺失，这个突变可以防止噬菌体形成溶原（一个溶原是一个细菌细胞，在它的染色体中整合有一个原病毒；由于λ溶原表达λ阻遏物，并且对超转染噬菌体具有免疫，溶原显示假阳性）。h80噬菌体采用TonB蛋白作为表面受体，而λ通常识别细菌外膜蛋白Porin家族成员Lamb。假阳性可能产生于受体菌的突变，突变导致细菌表面产生供噬菌体附着的受体。因此，通过采用两种受体专一性不同的噬菌体混合物，可以将宿主中由于受体基因突变造成的假阳性降低到最小程度。
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图21.5 阻遏物功能的简单免疫测试
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阻遏物活性也可以用许多报告构建体来检验，在这些构建体中放置了一个可筛选的或可挑选的标记，这个标记受λ操纵子控制。操纵元（O）融合，即将lac 基因置于λ阻遏物的控制之下，曾用于阐明λPR和PRM的调控机制（Maurer et al.，1980；Meyer et al.，1980；Meyer and Ptashne，1980）。例如，λ202是一种噬菌体，它包含受λPROR驱动的lac Z。在这种噬菌体中，OR包含一个OR2-突变，这个突变使野生型阻遏物和邻近的OR1和OR2操作子位点协同被去除。我们还构建了操纵元融合，在这个融合中cat-lac ZY融合受控于λPL启动子。在含有这个报告子的菌株里，阻遏物活性的丧失可以用对氯霉素（cat）的抗性来挑选或筛选。对这个报告子的抑制，应用于下文描述的筛选策略中，以确认全长融合。此外，β-半乳糖苷酶在含有报告子的菌株中的水平可以通过酶学方法来测定。可是，尽管被抑制的和未被调节的水平存在着大约10倍的差异，在一个有活性的阻遏物存在的情况下，酶量仍超过了使X-gal培养基上的菌落显出蓝颜色的水平。
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如上文所述，基于报告子负调控的挑选还存在问题。当一个表达阻遏物融合的质粒被导入到一个细胞中时，这个细胞已经表达报告基因，并且已达到去除阻遏的水平。如果报告基因的产物是稳定的，那么它的水平只有通过细胞生长和分裂造成的稀释作用才会降低。这种表型滞后意味着在进行挑选之前文库需要扩大。对于基于激活报告子的挑选则没有这个问题，因为在基础活性之上的一个小的增加是容易挑选的，尽管需要几代才能达到稳定。λ阻遏物除了作为阻遏物之外，它在PRM启动子上还作为一个激活物（Meyer and Ptashne，1980）。尽管这种活性应当有用，但它还没有被广泛地用来检验阻遏物融合。注意，表型滞后问题不适用于噬菌体挑选，因为噬菌体的启动子在阻遏物融合被表达之前是不存在的。
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图21.6给出了利用第三代载体从基因组文库中挑选和筛选候选物的流程图，说明如何将对噬菌体的挑选和报告子的构建结合起来。如前所述，对候选物的最初挑选是为了找出对噬菌体转染的免疫性。将阳性候选物挑入微量滴定板的小孔中，加入培养基培养，制备M13转导贮备液。M13转导贮备液用于在微滴定板中对抑制物（supF）（LM58）和非抑制物（sup0）（LM59）菌株做平行转导实验，这两种菌株带有λPL-cat-lac Z报告子噬菌体。转导物被放到含氯霉素的平板上，筛选对药物的敏感性，结果显示cat 的表达已被抑制。一个理想的菌株在不含抑制物培养基中具有氯霉素抗性，而在含有抑制物培养基中对氯霉素敏感，它的寡聚化作用取决于插入片段。
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图21.6 从基因组文库中挑选自组装结构域流程图
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最严格的测试是要求这个菌株可以同时抑制噬菌体转染和报告子的作用。尽管许多阻遏物融合在这两种筛选中都能发挥作用，但其他的抑制物只能对噬菌体转染或对于报告子起作用。造成这些差异的原因还不清楚。这可能反映了在噬菌体转染时协同结合到多个操作子，而报告子反映对单个操作子的结合。
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自组装结构域的鉴定
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从基因组文库中分离出的自组装结构域可以通过DNA测序和数据库搜索被鉴定出来，DNA测序和数据库搜索可以找出自组装结构域在基因组中相对应的ORF。采用高通量的方法提取质粒（Marra et al.，1999），DNA序列可从两端获得。我们使用两个引物：cI引物（5′-AGGGATGTTCTCACCTAAGCT-3′），沿顺时针方向阅读，开始位置位于接头区域中抑制物DNA结合结构域和插入片段之间。另一个引物是T-Φ（5′-CTCAGCGGTGGCAGCAGCCAA-3′），沿逆时针方向阅读，开始位置位于T7基因10转录终止子处。从两端测序对于鉴定嵌合插入或蛋白间隔以外的肽是非常重要的。我们使用BLAST（Altschul et al.，1997）程序将阳性克隆定位到特定的开放读码框（ORF），使用WebBLAST（Ferlanti et al.，1999）软件包将BLAST搜索的结果组织起来。
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寡聚化状态的检测
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阻遏物融合技术还可作为一种遗传方法用于区别二聚体和更高程度的寡聚化（图21.7）（Zeng and Hu，1997）。这种方法通过比较两种菌株来实现。第一种菌株（JH607）包含两个λ抑制物操作子序列，两个序列的结合亲和能力不同：近处的低结合亲和力操作子标为“弱”，远处的高结合亲和力操作子标为“强”。第二种菌株（XZ970）只含有近处的低结合亲和性操作子。只有当近处的操作子被占据时报告基因才被抑制。图21.7C表示β-半乳糖苷酶法在亮氨酸拉链二聚体、三聚体和四聚体模型中如何定量区分lac Z的表达。只有三聚体和四聚体可以在含有两个操作子的菌株中，由于DNA结合的协同作用有效地抑制了lac Z报告基因。除了许多λ抑制物突变体和亮氨酸拉链，抑制物系统的这种扩展方法已被用于检测其他细菌蛋白质（Liu et al.，1998；Xia and Uhlin，1999），这表明其他寡聚体在该系统中有类似表现。
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图21.7 用于区分二聚体和更高程度寡聚体的遗传学方法
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方案
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方案1：λ阻遏物融合
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材料
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缓冲液和溶液
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分子克隆手册：蛋白质—蛋白质相互作用
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分子克隆手册：蛋白质—蛋白质相互作用
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大肠杆菌菌株，噬菌体和质粒
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分子克隆手册：蛋白质—蛋白质相互作用
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分子克隆手册：蛋白质—蛋白质相互作用
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分子克隆手册：蛋白质—蛋白质相互作用
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抗生素氨苄青霉素（200mg/ml），用水溶解
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分子克隆手册：蛋白质—蛋白质相互作用
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专用设备
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适用于96孔微量滴定板的离心机（Sorvall RC-5B型，转子SH-3000，或类似转子）
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热循环机（Baxter Scientific公司，H2025-1A型）
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培养箱（37℃）
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96孔盘转印器（96针；Boekel公司，140500型）
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无菌牙签
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水浴（50℃）
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方法
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λ噬菌体贮备液的制备
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λKH54和λKH54h80可同时用于挑选和筛选有活性的阻遏物融合。噬菌体先经噬菌区纯化，然后用于大量制备贮备液。
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第一天：
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1.将3～5mlMC1061放在胰蛋白胨培养液中过夜培养。
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许多其他的菌株可用于培养噬菌体λ，但我们喜欢用一种F-菌株来制备贮备液，以避免可能发生的M13污染。最好使用新鲜的过夜培养物，培养物可在室温保存并使用几天。
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第二天：
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2.将胰蛋白胨软琼脂熔解并保温在50℃。在加入细胞前将琼脂冷却到约50℃，这一点很重要。如果琼脂过热，细胞将被杀死。预先在室温条件下准备三块直径100mm的胰蛋白琼脂板。胰蛋白胨琼脂和软琼脂比LB培养基效果好。
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3.用TM缓冲液准备噬菌体贮备液的一系列10倍稀释物，使最终浓度达到100～500pfu/ml。准备3支13×100mm试管，管中装有100μl MC1061过夜培养物和100μl 最后三个稀释度的噬菌体培养液。在室温下放置20min，使噬菌体吸附到细胞上。
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4.使用一支5ml的一次性吸液管，向每支试管中快速加入3ml熔解的软琼脂。不要将琼脂、细胞和噬菌体混合。因为混匀起到相反的作用，它将气泡带入软琼脂中。
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5.立即将软琼脂倒入到一块平板上，并来回倾斜，使软琼脂布满平板表面。不要做得过分；软琼脂很快会凝固。
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6.37℃保温过夜。
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第三天：
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7.如前所述，准备好胰蛋白琼脂和胰蛋白胨软琼脂。检查培养箱中的平板，找出一个分离效果好的噬菌区。选取一个单独分开的噬菌区，用一支灭过菌的吸液管取噬菌区。将吸液管斜着插到琼脂板底部，然后将吸液管中的琼脂转移到0.5mlTM缓冲液中。加入一两滴氯仿，混匀，然后放在冰上几分钟，使噬菌体从琼脂中扩散出来。
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8.向两支试管中分别加入0.2ml上述混合液，小心不要接触到氯仿。简单混匀一下，让氯仿蒸发掉。用第三支装有0.2mlTM缓冲液的试管作为对照。
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9.向每支试管中加入0.1mlMC1061细菌过夜培养物。然后如前所述，预热，加软琼脂，涂板。
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10.在37℃培养，直到涂有噬菌体的平板上长出噬菌斑。
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在噬菌斑之间应该还能看到非常小的菌苔。跟踪观察未被感染的菌苔的发展变化，有助于比较涂实验板和对照板。这种观察应在5～8h进行。不要让培养物过夜，否则滴定值将会降低。
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11.向每个发生溶菌的平板加5mlTM缓冲液。放在黑暗中4℃过夜，使噬菌体得到稀释。
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第四天：
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12.将液体从平板转到一个无菌的带盖旋钮试管中。从每个板中可得到略少于5ml的液体。再加入几滴氯仿以杀死仍然存活的细胞。
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13.用同样的方法滴定噬菌体贮备液。期望的滴定值为109～1010pfu/ml。
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采用交叉条法（Cross-streak Assays）进行筛选
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交叉条法是一种用于检测某特殊融合免疫状况的快速简便的方法。当一个融合构建好后，这是第一个要做的测试。
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14.用记号笔在一块LB 氨苄青霉素平板的底面画两条相距约1cm的直线。一条线标为KH54，另一条标为imm21c（或imm434c）。
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15.用一支0.1ml的吸液管、一根无菌棒或一个接种环，沿着相对应的线在平板上涂大约5～10μl噬菌体。
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16.用牙签挑取一个克隆的新鲜培养物，从距KH54线约2cm的地方开始画一条线，穿过两条噬菌体线。
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17.在37℃培养6h或过夜。敏感的细胞在第一条线处死亡。有免疫力的细胞将穿过第一条线，但穿不过第二条线。任何能同时通过两条线的细胞都缺失λ阻遏物，或者它是一种非大肠杆菌污染物。
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在挑取菌落时，手用力的大小将使结果有很大的变化。最好较早对平板进行检验，因为到后来具有抗性的细胞可以通过线条。在做免疫测试时，建议使用AG1688或JH787作为宿主。
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采用斑点免疫测试法（Spot Immunity Tests）进行筛选
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涂板效率可以通过将噬菌体平行滴定在含阻遏物融合的菌株和不含阻遏物融合的菌株上进行测定。斑点滴定是一种检测大量候选菌落的快速方法；用较少的平板也可进行斑点滴定。
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18.对于每一个候选物，选取一个新鲜的克隆，接种到2ml含有氨苄青霉素的LB培养基中，放在37℃生长8h。为了得到最佳的重复性，这个时间不要变动太大。
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19.将50μl培养物与2ml胰蛋白胨软琼脂混合。用吸液管将软琼脂涂在一块预热好的LB氨苄青霉素板上。常规下，每块100mm的平板涂三或四种不同的被检物。
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20.在菌苔上点2～3μl经TM稀释的λKH54。稀释度为107pfu/ml，105pfu/ml和103 pfu/ml。当有很大被检物时，使用多通道吸液管操作。
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21.经过37℃过夜培养，未显出任何噬菌斑的菌株被认为是有免疫性的，表现为澄清或混浊噬菌斑的菌株被认为是敏感的。我们发现，有些菌落每天的表现不同。
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M13介导的转导
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M13介导的转导是一种在F+细胞间转移M13单链DNA质粒的简单、快速、廉价的方法。这种方法可用于检测插入依赖（见下）或用于向报告菌株转移质粒，例如从寡聚程度较高的菌株中区分出二聚体菌株。
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22.将含有cI+融合质粒的细胞克隆，放在LB氨苄青霉素中培养过夜。再制备这种细胞克隆的接受菌株。做法是：在上述过夜培养物中补加适当的抗生素，再接种另一种细胞克隆，过夜培养。
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23.将20μl过夜培养物与2 ×1011pfu噬菌体M13混合至0.1ml。
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24.在37℃保温10min。向混合物中加入2ml2× YT培养液，然后在通风条件下再生长8h或过夜。
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25.取部分培养物放到微离心管中，离心10min。
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26.将含有M13介导噬菌体的上清液转移到一支新的试管中，在60℃条件下保温15min，杀死残存的细胞。
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经巴氏法灭菌的噬菌体贮备液可在4℃条件下保存数月至数年。
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27.将50μl接受菌株的过夜培养物和5μl各自的cI+融合M13介导贮备液混合。
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28.37℃保温30min。
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29.将每种转导物5μl点在含有氨苄青霉素的平板上。斑点干后，从斑点处用牙签为每个克隆画出一条线。第二天，长出的菌落还要经过再次分离，得到单一菌落。
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对pLM99-101文库的挑选和筛选
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阻遏物融合可用于研究含有寡聚化作用结构域的蛋白（Jappelli and Brenner，1999；Zhang et al.，1999）。下面的方法进行了重要改进，可在有较少背景信息的情况下发现许多寡聚化作用结构域（L.Marifio-Ramirez and J.C.Hu，未发表）。使用标准的分子生物学方法构建文库（见Sambrook and Russell，2001，Molecular Cloning）。分离寡聚化作用结构域需要至少106个独立的克隆。挑选时建议使用JH787作为宿主。
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1.免疫克隆的挑选：使用LB-氨苄青霉素-卡那霉素平板，每块平板中含108pfu的λKH54和λKH54h80。将108含有融合文库的JH787涂于板上。文库可不经扩大就用于挑选；这可以增加独立克隆的数目。但免疫克隆的涂板效率将会降低，因为在转化和阻遏物融合蛋白达到稳定状态之间存在着滞后。37℃保温过夜。
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2.为每个文库准备三个或更多个96孔板，加入0.15ml2× YT-氨苄青霉素-卡那霉素和25mM柠檬酸钠。柠檬酸钠螯合二价阳离子，使λ噬菌体能够在挑选平板上生长。将免疫克隆接种到孔中。在37℃条件下生长16h。
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后面的实验中仍使用96孔板，以便于操作。
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3.将5μl M13 rv-1辅助噬菌体（约108pfu）和5μl免疫克隆的过夜培养物混合。37℃保温10min。加入0.15ml2× YT。37℃生长6h。
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4.在65℃条件下热处理20min，杀死细胞。1000 g离心平板15min。将平板置于4℃保存，平板中含有96种M13转导噬菌体贮备物。
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5.对于M13在LM58和LM59上的转导，将5μl M13转导噬菌体和50μl LM58和LM59的过夜培养物混合（每种菌株使用各自不同的平板）。37℃保温30min。用96孔板转印器将转导物转移到15 × 150mm LB-氨苄青霉素平板上。37℃保温过夜。
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6.用96针转印器从LB-氨苄青霉素平板上转印到LB-氨苄青霉素-氯霉素平板上。37℃保温过液。
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阳性克隆在LM58中对氯霉素敏感，而在LM59中对氯霉素有抗性。估记有大约50%的阳性克隆是由于插入造成的。
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7.使用LM58转导克隆制备甘油贮备物，向LB-氨苄青霉素平板过夜培养物中加入甘油至12%，-70℃冰冻保存。
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致谢
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感谢Hu实验室的成员和Debby Siegele对手稿提出的重要建议。本综述得到了国家科学基金会（MCB-9808474）、Robert A.Welch基金会（A-1354）和Advanced Research Program of the Texas Higher Education Coordinating Board（Award 999902-116）的资助。L.M.得到Fulbright/Colciencias/IIE奖学金支持。
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22 基于膜的酵母双杂交体系
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前言
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有许多的生物化学和遗传学方法用来鉴定和研究蛋白质相互作用，然而，毫无疑问，酵母双杂交体系已经成为检测和分析蛋白质—蛋白质相互作用的一种开创性方法（Fields and Song，1989）。双杂交体系是一种体内测试，用来检测在天然构象状态下的蛋白质—蛋白质的相互作用（Chien et al.，1991）。在这种分析方法中，转录因子的DNA结合域（BD）一般是和靶蛋白X融合在一起，而它的转录激活域（AD）是与蛋白质Y融合的。这些双杂交蛋白BD-X和AD-Y在含有报告基因的酵母株内是共表达的，报告基因需要有基因表达的转录完全激活子的活性。如果蛋白质X和蛋白质Y能联在一起，就形成了一个功能转录因子，最后导致报告基因的表达。通过选择表达的报告基因检测转录因子的活性是鉴定能发生相互作用蛋白质的基础。
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酵母双杂交体系的局限性
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虽然酵母双杂交体系是一种鉴定新的蛋白质作用子的方便而有力的技术。但因为这种方法不能应用于所有蛋白质而受到了限制：（1）例如，用这个体系分析转录因子就很困难，因为转录因子用作诱饵，经常会组成性地激活报告基因的转录。（2）有时因嵌合域引导形成空间位阻或局部非折叠状态，诱饵和陷阱的融合表达会导致转录激活功能的丧失。（3）在高等真核生物里，很多蛋白质都要经历广泛的翻译后修饰，这对它们行使其正确的功能很重要。这些蛋白质的相互作用依赖于翻译后修饰，如糖基化、二硫键的形成和磷酸化，但是这些修饰不可能在核内发生。（4）用于酵母双杂交体系的融合蛋白必须被转运到核内并在核内能够正确地折叠。这就会导致一些问题，对于很多种蛋白质，像膜停泊蛋白或带有细胞器定位序列的蛋白质，核并不能代表这些蛋白质发生折叠、维持稳定、与其他蛋白质相互作用的正确细胞器。
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非传统的酵母双杂交体系——研究膜蛋白相互作用的工具
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有研究表明：40%的蛋白质（包括许多重要的药物受体）停靠在脂双层内，不能进入核内（Goffeau et al.，1996）。因为膜蛋白的相互作用在细胞功能和生物反应中占有很重要的地位，所以，对这些过程的了解需要鉴定和研究与我们感兴趣的蛋白质发生相互作用的新的蛋白质。虽然有一些成功的例子，由于以上的原因，传统的酵母双杂交体系不适合于研究这些蛋白质。尽管，在酿酒酵母中，哺乳动物细胞中翻译后修饰对蛋白质相互作用的重要作用（如酪氨酸磷酸化、糖基化和双硫键的形成等）没有体现出来（Chervitz et al.，1998），但某些膜蛋白还是以局部的细胞内或细胞外结构域形式被成功地表达，而且能和它们的配体作用。正确的胞外受体—配体相互作用已经在生长激素和催乳激素作用中得到阐明（Ozenberger and Young，1995）。在这一研究中，酵母双杂交体系被证明起作用了，因为用作诱饵的胞外域包含有整个关键的配体结合决定区域。以血小板衍生生长因子受体胞质域作为诱饵，Keegan和Cooper发现它能够与SHPTP2作用，并能磷酸化SHPTP2，SHPTP2是一种广泛表达的含SH2结构域的酪氨酸磷酸酶，磷酸化的SHPTP2能与信号蛋白Grb7相互作用（Keegan and Cooper，1996）。最近，传统的酵母双杂交技术被用来鉴定与ErbB2受体相互作用的新蛋白质（Borg et al.，2000），仅用ErbB2胞质域C-端9个残基作为诱饵，就鉴定出了一个新的PDZ蛋白ERBIN（与ErbB2相互作用的蛋白质），该蛋白质是一种上皮细胞受体连结子。
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如前述，在一些例子中，传统的酵母双杂交体系成功地应用于膜蛋白的研究，但是，这些例子是很有限的，并不能用于所有的跨膜蛋白，诸如要经历翻译后修饰（糖基化、磷酸化等）的膜蛋白、含有膜内配体结合域的受体或需要通过在各自跨膜域间发生相互作用而寡聚化的跨膜蛋白。为了解决这些问题，已经设计了几种策略来研究发生在酵母核外的蛋白质相互作用。
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Sos招募系统（SRS）是由Aronheim等建立的（图22.1），其基础是激活人Sos转位到它在细胞质膜内叶的活性位点上（Aronheim et al.，1997）。诱饵蛋白与hSos融合表达，陷阱通过一个豆蔻酰化的信号序列靶向膜。相互作用的融合蛋白将Sos招募到膜上，并刺激酵母Ras上鸟苷酸发生交换，这样就挽救了一个温度敏感突变体。用这个系统已经鉴定出了c-jun功能通路的新的调节物（表22.1）（Aronheim et al.，1997），但这个系统已经被Ras招募系统（RRS）（Broder et al.，1998）和反式RRS所改进（Hubsman et al.，2001）。
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图22.1 Sos招募系统（SRS）
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表22.1 检测酵母中膜蛋白相互作用的新体系
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最近，报道了一种新的方法，是利用G蛋白信号通路来检测以非变性形式表达、并靶向膜的蛋白质的结合特性（图22.2）（Ehrhard et al.，2000）。在这个系统中，待检测的一个蛋白质与G蛋白βγ亚基融合，另一个蛋白质靶向膜。两个蛋白质的相互作用导致Gβγ亚基的扣留，从而使G蛋白信号转导解除。这个系统已经在突触融合蛋白1、成纤维细胞生长因子受体和神经元Sec1各自的相互作用的重建中得到成功的应用（表22.1）。
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图22.2 基于G蛋白的系统
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近来，我们发展了一种新的遗传学方法用于酿酒酵母膜蛋白相互作用的体内检测（Stagljar et al.，1998；基本试剂和方法，见Stagljar and te Heesen，2000）。与前述的系统相比较，我们的系统更灵活，可以用来研究两个膜蛋白或膜蛋白与胞质蛋白间的相互作用。这种策略（图22.3）应用了裂解泛素法，检测一种重建的裂解泛素的体内过程（Johnsson and Varshavsky，1994a，b）。泛素是一种小的保守的76个氨基酸的蛋白质，参与蛋白质的降解（Hershko and Ciechanover，1992）。泛素分子附着到细胞蛋白质上意味着靶蛋白要被降解掉。泛素特异蛋白酶（UBPs）专门识别这个靶蛋白的泛素部分的折叠构象，并在泛素C-端（Gly-76）残基和受体蛋白的第一个氨基基团的连结处剪切连结的泛素—蛋白质，然后被释放的蛋白质被26S蛋白酶体（一种ATP依赖的多亚基蛋白酶）降解。当泛素被剪切成C-端（Cub）和N-端（Nub）结构域后，两个结构域都不能介导泛素功能的发生，然而，如两个结构域同时表达，就会重构成反式激活的泛素。但是，氨基端结构的等位基因（NubG）不能介导这种功能性的相互作用，而且，由于NubG和Cub间亲和性的降低，这两个结构域不能重新构建得到活性的泛素（Johnsson and Varshavsky，1994a）。需要指出的是：真核生物里，泛素融合体会很快被UBPs在泛素—多肽连结体泛素段的最后一个残基后边剪切掉。在采用泛素系统研究蛋白质相互作用时，为了防止剪切的蛋白质被蛋白酶体降解，要避免不稳定的氨基酸残基如亮氨酸或精氨酸在受体蛋白的氨基末端出现（Varshavsky，1996）。
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图22.3 基于膜的酵母双杂交体系示意图
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基于膜的酵母双杂交体系得益于上述的技术来检测和研究膜—蛋白质相互作用。图22.3描述的策略是将感兴趣的膜诱饵蛋白（Y）与Cub融合，在其后连上人工转录因子PLV（蛋白质A，LexA和VP16），将可能的相互作用蛋白质（X）与NubG融合，蛋白A的引入是因为它方便了用免疫球蛋白（IgG）抗体对融合蛋白的免疫生物学检测。如果诱饵Y和陷阱X发生了相互作用，就重构了有功能的裂解泛素分子，导致蛋白质裂解剪切并释放出转录因子PLV，PLV激活报告基因（Stagljar and te Heesen，2000）。
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作为一种模式系统，酵母内质网膜蛋白被应用于此。Wbp1和Ost1p代表寡糖转移酶蛋白复合体的两个亚基。Alg5蛋白也定位在内质网膜上，但它不与寡糖转移酶相互作用，特异的体内相互作用能在Wbp1和Ost1p间检测到，而不能在Wbp1和Alg5间检测到（Stagljar et al.，1998）。此外，基于膜的裂解泛素体系已成功地阐明了酵母内质网α，1，2-甘露糖酶和Re1p间相互作用（M.Massaad，S.te Heesen，and A.Herscovics，未发表）。另外，我们目前的合作研究表明这个体系可以应用于异源的跨膜蛋白如植物蛋白质，例如，我们发现了植物SUT蛋白和它们的亚结构域间会发生生理作用（A.Reinders et al.，出版中）。
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最近，Laser等报道了基于裂解泛素法的相似的分析方法，用此鉴定了与转录调节因子Gal4p和Tup1p相互作用的蛋白质（表22.1）（Laser et al.，2000）。他们发展的这个技术已经用来筛选定位在细胞胞浆中的发生相互作用的蛋白质。在这个体系里（图22.4），Gal4蛋白与Cub域融合，其后连的是报告蛋白RUra3p（作为第一个氨基酸的精氨酸被UBPs识别），陷阱与Nub域融合，Gal4融合体与陷阱的相互作用使RUra3p被剪切，释放的RUra3p很快被蛋白质降解的N-末端通路所降解，导致尿嘧啶营养缺陷，表现出对药物5-氟乳清酸（5-FOAR）的抗性。他们指出，该体系能通过体内重建Gal4p/Gal80p和Ssn6p/Tup1的复合物来检测转录因子之间的相互作用。
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图22.4 变通的裂解泛素体系
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基于膜的酵母双杂交体系应用展望
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筛选与NubG融合的cDNA库
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基于膜的酵母双杂交体系最主要的应用可能是鉴定与和Cub-PLV域融合的给定的膜靶蛋白相互作用的蛋白质。一般的，文库主要是通过将有机体的或组织的所有cDNA与NubG域的N-端或C-端融合而构建的。来自酵母、果蝇、线虫、小鼠和人的oligo（dT）和随机引物cDNA文库正在构建中，它们是大小选择的文库，仅包含小的蛋白质结构域（DUALSYSTEMS BIOTECH，私下交流。）。
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酵母S.cerevisiae膜蛋白相互作用的基因组范围的分析
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一些原核和真核生物基因组的全部测序引发大规模的对基因表达（功能基因组学）的研究和最近发展起来的蛋白质组研究。大规模开展蛋白质—蛋白质相互作用研究以完成详尽的蛋白质相互作用图谱也已经显示诱人的前景。因为酵母双杂交体系能鉴定相互有物理联系的蛋白质对，而且它具有操作简单、灵敏、高流通量等优点，所以，在基因组范围的探测方法里，它已经超越了其他方法。最近，Stan Field研究组启动了基因组范围的双杂交筛选：利用酵母群矩阵和机器人来系统地鉴定S.cerevisiae 蛋白质相互作用（Uetz et al.，2000）。因为双杂交作用发生在核里以激活转录的，膜蛋白可能被错误折叠而产生无意义的作用。为此，我们针对膜蛋白发展的泛素融合策略对标准的双杂交试验是一个很好的补充（J.Miller et al.，未发表）。用基于膜的酵母双杂交体系进行基因组范围的筛选策略如图22.5所示。
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图22.5 应用基于膜的酵母双杂交技术大规模分析酵母中膜蛋白的相互作用
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理论上，这种方法对用任何生物的全部的预测开放阅读框作大规模的生物学筛选是一种很有用的技术，这样系统的、高流通量的研究膜蛋白的策略将会加强我们对酵母和其他真核生物蛋白质相互作用的认识。
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基于膜的酵母双杂交筛选与药物设计
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与膜蛋白—蛋白质相互作用在细胞功能中的重要性相一致，许多人类疾病（包括各种癌症和神经退行性疾病（表22.2.）是因为发生了特异的蛋白质—蛋白质联系或相联系蛋白质失去联系而发生的，所以，膜蛋白相互作用被认为可能是重要的药物作用靶点。因此，这种蛋白质—蛋白质相互作用可以被作用蛋白质一方的顺式作用突变或反式作用分子如一些小分子或解离的肽抑制。为了选择可消除蛋白质—蛋白质相互作用的药物和突变体，科学家建立了反向双杂交系统（Vidal et al.，1996）。将URA3作为毒物报告基因，相互作用的蛋白质被抑制会导致URA3基因表达的丧失，从而细胞能够在含有药物5-FOA的平板上生长。我们的基于膜的酵母双杂交体系可以与反向双杂交策略结合来筛选肽库或小分子库，它们对两个膜蛋白的相互作用的阻止使酵母得到选择性的生长（图22.6）。在反向膜双杂交体系中，膜蛋白X与Y的相互作用对酵母细胞是毒性的，因为一种毒物标记（例如URA3和CYH2）被用作报告基因（DUALSYSTEM BIOTECH，未出版）。此方法应该可以鉴定两个相互作用——缺陷等位基因的膜蛋白和分离能抑制膜蛋白X与Y相互作用的肽或小分子。
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表22.2 与疾病发生有关的各种膜蛋白举例
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图22.6 基于膜的反向酵母双杂交体系
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基于膜的酵母双杂交体系的优点和缺点
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基于膜的酵母双杂交体系相对传统的酵母双杂交系统有以下几种优点：（1）此体系可以研究两个膜蛋白的相互作用和一个膜蛋白与一个胞质蛋白的相互作用；（2）任何一种跨膜蛋白都可以作为诱饵，能使与待检膜蛋白融合的相互作用模块（Cub-PLV-NubG）定位在细胞质内；（3）此系统可以应用于任何真核生物，而且目前正应用于哺乳动物宿主（DUALSYSTEMS BIOTECH，私下交流）（但是，基于酵母的系统有许多优点，包括转化的容易性，质粒再获取的方便性和可以用营养标记直接选择）；（4）因为它以剪切的人工转录因子的可渗透性为基础，所以不需要核定位信号；（5）小的泛素结构域的应用有很大的好处，因为小的泛素结构域削弱了相互作用蛋白质之间的空间位阻。
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基于膜的酵母双杂交体系不能测试所有的膜蛋白相互作用，它不能应用于多次跨膜的蛋白质和N-端和C-端不在细胞质的跨膜蛋白。另外，如果要将此体系用于研究哺乳动物膜蛋白相互作用，就必须考虑到一个哺乳动物中确保蛋白质进入膜的信号序列与其他哺乳动物和酵母的是不同的。一般的，许多哺乳动物的信号序列在酵母中没有功能，所以应该被酵母信号肽序列代替，如来自于酵母STE、SUC2和CPY的蛋白质的信号序列可以将感兴趣的异源蛋白导向酵母膜上。但也有例外，在有些情况下哺乳动物蛋白质可以以自己的信号肽在酵母中表达（例如，Montero-lomeli and Okorokova Facanha，1999）。最后，这种系统难以应用与哺乳动物表面受体（如IGFI受体或T细胞抗原受体），因为它们依赖于多个亚基的组合来方便最适配体结合和行使信号功能（C.Buerki and I.Stagljar，未发表）。
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总之，一种检测膜蛋白相互作用的体内遗传学体系可能成为研究膜蛋白相互作用的主要技术，也可能成为发展新的基于蛋白质—蛋白质相互作用治疗方法的一项有用技术。
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致谢
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我们要感谢Alcide Barberis博士对原稿的审阅，感谢Zuercher Krebsliga、EMDO基金、Walter Honegger 基金、Bonizzi-Theler 基金、瑞士国家基金（批准号：31-58798.99）和Gebert Ruef 基金对本项目的资助。我们还要感谢Ulrich Huebscher教授的支持。
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参考文献
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23 β-半乳糖苷酶互补实验对活细胞中蛋白质间相互作用的检测
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前言
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鉴定蛋白质之间的相互作用对充分了解信号传导通路以及细胞的生理和病理过程有着非常重要的作用。下述的β-半乳糖苷酶（β-gal）互补实验可以鉴定活细胞中蛋白质间的相互作用（Rossi et al.，1997，2000；Blakely et al.，2000）。简而言之，此实验将两个待测的可能相互作用的蛋白质分别与两个互补的β-gal的缺失突变体形成融合蛋白，并在细胞中表达。当待测蛋白质相互作用时，两个β-gal的突变体相互补充重新获得β-gal的酶活性。β-gal互补法有以下四种优点：（1）直接，在蛋白质相互作用的位点产生可检测到的信号，不需激活报告基因；（2）由于酶对底物的高效催化作用，此实验敏感性高；（3）不需过表达相关蛋白质，蛋白质在生理表达量的水平即可检测到它们的相互作用；（4）因为可以运用多种底物检测β-gal的活性。此方法既可以在单个活细胞中定量地检测β-gal的活性，也可使用高通量的筛选技术检测β-gal的活性。
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多种生物化学方法可以证实两种蛋白质之间的相互作用，最常用的方法是蛋白质经免疫共沉淀后进行免疫印迹实验。尽管这些生物化学实验已被证实是有效的，但对于某些蛋白质，它们在细胞破碎后进行免疫共沉淀时，蛋白质之间的相互作用消失不能形成原有复合物，这些方法是不适用的。虽然在细胞破碎前可通过化学交联的方法稳定这些复合物，但交联的方法可产生一些人为的蛋白质复合物，它们通过化学交联而非蛋白质之间的相互作用产生。目前，酵母双杂交系统是鉴定蛋白质之间新的相互作用的最有力的方法（Fields and Song，1989；Bai and Elledge，1996）。但此系统中涉及的蛋白质必须在酵母的细胞环境中能够相互作用，并能够进入细胞核内激活报告基因。
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在一个理想的鉴定蛋白质间相互作用的系统中，需要当蛋白质相互作用时就产生可检测到的信号，并且这种信号是特异的，可直接地或在增加某些简单的步骤如加入底物后在其产生的区室中进行检测。最好这些信号在活细胞中可检测到或者细胞破碎后他们仍然存在。近年来，一些技术的发现和改进逐渐达到这种要求。荧光共振能量转移技术（fluorescence resonance energy transfer，FRET）通过用荧光标记两个待测蛋白，在体外研究蛋白质间的相互作用（Adams et al.，1991；Gadella and Jovin，1995；第10章）。但是将足够浓度的荧光标记的蛋白质引入细胞中以达到可检测的浓度是非常困难的，从而制约了此方法的应用。一种改良的FRET技术涉及到融合蛋白的表达，将一对相互作用的蛋白质中的每一方与荧光蛋白如绿色荧光蛋白（green fluorescence protein，GFP）融合。通过选择两种不同的GFPs，使用FRET技术可以分析两种融合蛋白的相互作用，但目前尚需进一步观察此方法是否适用于研究多种蛋白质之间的相互作用（Miyawaki et al.，1997；Pollok and Heim，1999）。另一种非FRET技术通过检测两个缺失突变体能否互补形成有功能的蛋白质来研究融合蛋白之间的相互作用。检测二氢叶酸还原酶（dihydrofolate reductase，DHFR）的互补已用于在哺乳动物细胞中鉴定蛋白质之间的相互作用，但此系统仅适用于无内源性DHFR表达的细胞中，它可通过定量实验——非酶促的结合实验或非定量实验——酶促反应进行。下面详细介绍的细菌β-gal的互补实验，可在多种细胞中鉴定蛋白质之间的相互作用，它可通过酶促反应产生放大信号，经多种方法进行定量检测，且此过程不需要过表达相关蛋白质。
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背景
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内顺反子β-gal的互补现象首先是由Jacob和Monod观测到的。两个失活细菌β-gal的突变体，它们分别缺失不同的重要结构域，相互靠近后，通过共享残留的有功能的结构域，构成有活性的酶。β-gal的互补作为细菌中分子克隆的标记（蓝/白斑筛选）已使用了几十年，它的实验基础是在宿主菌中表达β-gal的缺失突变体（ΔM15），它可与载体质粒表达的一个肽片段（α-肽）互补，但当克隆的cDNA片段插入α-肽的编码序列中后，α-互补现象消失。在哺乳细胞中已使用三种互补肽成功地进行了β-gal 的互补（图23.1）：Δα，与在细菌中使用的ΔM15相似，在近N-端缺失了一段氨基酸（11—41位氨基酸）；Δω，在788位氨基酸处开始缺失，蛋白质C-端的氨基酸缺失；Δμ，在蛋白质的中间部位缺失了一段氨基酸（49—601位氨基酸）（Mohler and Blau，1996）。氨基端（α）和羧基端（ω）是β-gal的重要的结构域，是形成有功能的酶所必需的结构域（Villarejo et al.，1972；Jacobson et al.，1994）。Δω是“α的供者”（与细菌β-gal互补中的α-肽同源但比其略长）；Δα是“ω的供者”；Δμ虽然同时具有α和ω，但没有位于蛋白质中间对酶活性非常重要的支架结构。这三种突变蛋白中的任何两个在同一细胞中表达时可形成有功能的β-gal（Mohler and Blau，1996）。尽管天然的β-gal以同源四聚体的形式形成有功能的酶形式，但目前尚未明确证实在哺乳细胞中是否需要八个突变体蛋白形成有功能的酶复合物。
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图23.1 β-gal缺失突变体的示意图
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哺乳动物细胞中的β-gal互补实验首先用于研究成肌细胞分化过程中细胞的融合现象（Mohler and Blau，1996）。每种β-gal的缺失突变体分别在不同种群的成肌细胞中表达，当不同的两种成肌细胞群共培养在诱导分化的环境中，它们融合形成多核的合胞体或肌管，这时可观察到β-gal的互补现象。对β-gal活性的检测为定量地研究成肌细胞的融合提供了一种简单的方法，也使快速研究遗传突变的作用以及成肌细胞分化的培养条件成为可能（Charlton et al.，1997）。
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通过构建含有β-gal缺失突变体的融合蛋白，可以检测到两种融合蛋白中非β-gal那一部分蛋白质的相互作用（Rossi et al.，1997）。在同一细胞中共表达两种或三种β-gal的缺失突变体可出现β-gal的互补现象，但与Δα或Δω和Δμ互补相比，Δα和Δω互补后，产生的酶活性较低（Mohler and Blau，1996）。在研究蛋白质相互作用的β-gal互补实验中，所感兴趣的蛋白的相互作用应由待测蛋白质完成，而非由两种β-gal的突变体相互作用产生；因此，在此实验中选用一对具有最弱的互补能力的β-gal突变体Δα和Δω分别构建融合子。在此系统最早的实验中，Δα和Δω分别与雷帕霉素结合蛋白FRAP和FKBP12连接形成融合蛋白（Rossi et al.，1997）。在缺乏雷帕霉素时，β-gal的活性非常低，加入雷帕霉素后，β-gal的活性明显升高。β-gal的活性与雷帕霉素的加入量正相关，并在待测时间内持续增加（图23.2左）。
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图23.2 β-gal融合蛋白互补的动力学变化依赖于融合蛋白中非β-gal蛋白部分
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运用β-gal互补实验也可以定量地分析膜受体的二聚化（Blakely et al.，2000）。将Δα或 Δω与表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF）受体的缺失突变体相连形成融合蛋白，并在细胞中表达，加入EGF后，β-gal的活性增加。在初期，与雷帕霉素结合蛋白的相互作用相比，β-gal活性的增加速度较快，但在1h内增加8倍后，β-gal的活性进入平台期，推测膜受体二聚化的形式与此过程相似（图23.2右）。因此，β-gal活性的动力学变化反应了在融合蛋白中非β-gal部分的蛋白质相互作用的动力学变化。β-gal互补实验还可用于研究以前无法用生化方法进行的，对抗EGF受体的抗体在受体二聚化时所起作用的研究。而且，在此实验中需要的含受体的融合蛋白表达量不必超过正常细胞中内源性受体的表达量。
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β-gal互补实验除了可以检测胞质蛋白之间或细胞膜蛋白之间的相互作用，还可以检测细胞质和细胞膜蛋白之间的相互作用（如，TGFβ受体和FKBP12；T.S.Wehrman et al.，未发表）。因此，β-gal互补实验可以检测三种类型的蛋白质之间的相互作用，而这些相互作用是多数信号转导途径中重要的组成部分（图23.3）。
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图23.3 β-gal互补实验可以检测处在细胞质中的和位于细胞膜上的蛋白质之间的相互作用
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β-gal互补实验还可用来证实蛋白质之间的相互作用并定性分析已知的相互作用。多种实验能用来检测β-gal的活性，这更增加了此方法的应用范围。最值得一提的是使用β-gal的氟化基因底物通过流式细胞实验在单个活细胞中检测β-gal的活性和运用高通量的实验技术通过化学发光实验在微量滴定板上对成百份样品中β-gal活性的检测。可以对β-gal的活性进行简单快速的检测，使此实验能够检验多种因素的效果（如诱导剂、抑制剂、浓度、抗体、细胞背景）。β-gal互补实验可通过高通量的筛选方法寻找影响蛋白质相互作用的诱导剂和抑制剂（如受体的激动剂和拮抗剂），并可以作为“哺乳动物细胞双杂交”筛选新的相互作用。
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程序纲要
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构建和表达融合蛋白的策略
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尽管我们最初进行的实验是将β-gal缺失突变体与待测蛋白的羧基端相连，但后来我们发现至少对细胞质中的雷帕霉素结合蛋白来说，β-gal缺失突变体在融合蛋白的任一端对互补的结果无任何影响（T.S.Wehrman et al.，未发表）。对于膜蛋白来说，只有将β-gal缺失突变体置于融合蛋白的羧基端，互补现象才能在胞质中发生。使用PCR和标准的克隆技术可将待测蛋白质正确地插入β-gal缺失突变体的编码框中。
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使用逆转录病毒作为载体使融合蛋白的表达简单易行。我们使用的两种逆转录病毒的载体分别含有Δα或Δω的序列，病毒的长末端重复序列（viral long terminal repeat，LTR）调控Δα或Δω的转录（图23.4）（Rossi et al.，1997，2000；Blakely et al.，2000）。内顺反子核糖体进入位点（intracistronic ribosome entry site，IRES）和药物的抗性标记位于β-gal缺失突变体的下游。将待测蛋白质插入β-gal缺失突变体后，我们可以按照产品的说明书，使用FuGENE6（Roche Molecular Biochemicals，Indianapolis，Indiana）将含有逆转录病毒载体的质粒瞬时转入Phoenix-E包装的细胞系中。尽管有时使用磷酸钙的方法可以得到更高的转化效率，但可能由于FuGENE6无毒副作用，使用FuGENE6可持续得到较高的病毒滴度。病毒的上清可以立即用于感染靶细胞，也可以冻存于-70℃，但这会使病毒的滴度略微降低。尽管许多细胞系的感染效率几乎达到百分之百，但只有使用载体中的选择标记才可全部去除未感染的细胞。
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图23.4 β-gal互补使用的载体图谱
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尽管可以用两种载体（Δα和Δω融合子）同时感染细胞，但我们常常选择次第性地感染细胞。因为对于今后的某些实验，我们需要将相互作用的蛋白质中的一种进行变换，拥有仅表达一种载体的细胞是非常有用的。而且，如果融合蛋白的表达有困难，尤其融合蛋白在大小上相似时，单一载体在细胞中表达使我们很容易找出哪个融合子存在缺陷。选择性杀死未感染的细胞应使用低浓度的抗生素如G418或潮霉素，因为高浓度的筛选将会导致融合子的过表达。
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检测β-gal活性的方法
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化学发光法检测β-gal
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化学发光法是一种最快速最简单检测大量样本中β-gal活性的方法。简而言之，将细胞铺在板上并用诱导待测蛋白质相互作用的试剂处理细胞。将gal筛选试剂加入细胞后，当有活性的β-gal存在时延长光子的产生（“发光”动力学而不是“闪光”动力学）。样本产生的光可被发光计测量。如果需要，细胞可以铺在96孔板上，这是一种允许使用高通量筛选仪器的形式。这种形式极大简化了此实验，因为细胞可以在同一块板上铺开，并进行实验。如果没有使用微板的发光计，样本必须转入试管中，使用试管的发光计进行测量。
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此实验中使用的微量滴定板的型号应是生产该发光计的厂家推荐使用的型号。对多数的仪器，微量滴定板应是一种白板，有白色的（不透明）或透明的底部。然而对一些仪器，它们特定使用黑板。尽管最理想的是使用不透明的板，如果实验者不能方便地得到未汇合的均匀铺放的培养物，也可使用允许他们在显微镜下观察的透明板。如果在一个孔中化学诱导产生成千的光单位，而它们与阴性对照孔或未被诱导的孔相近，荧光可从这个孔通过透明的底部流入附近的孔中，并在其他孔可检测到。
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我们使用Tropix TR717型微板发光计，下述我们曾经测试过的一些仪器：EG&G Wallac Berthold LB96V（它与Tropix的仪器几乎相同），Turner Designs Reporter，和EG&G Wallac Plus，它们质量也不错（目前使用的型号是MicroBeta Trilux；MicroBeta与自动注射器联合可能降低了它的灵敏度）。与别的仪器花不到2min测量一块板相比，MicroBeta的一个缺点是它需要花5～10min测量一块板。一些仪器的灵敏性不高，当β-gal的活性检测不到时应考虑到这个因素。
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流式细胞法检测β-gal
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使用流式细胞仪检测β-gal的氟化基因底物—荧光蛋白双-β-D-半乳糖吡喃糖苷（fluorescein di-β-D-galactopyranoside，FdG）的产物，可在单个活细胞中测量β-gal的活性。这对检测一群细胞中β-gal活性的改变从而确定克隆得到的细胞群能否获得单一的反应是有意义的。而且，同化学发光实验一样，FdG实验是一种定量实验，可用于研究相互作用的动力学和量效关系。荧光激活的细胞分类仪（fluorescence-activated cell sorter，FACS）可用来分离细胞中的亚群或克隆具有某种预期反应的细胞。
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这里给出的实验方案以Nolan等人（1988）发表的方法为基础，并为检测大量的样本进行了适当修改。运用此方法，在几小时内可以对200个样本进行测量。如果仅分析少许样本，在半小时内可完成此实验。实验中使用到的FdG底物是非细胞透性的，必须使用低渗休克将其导入细胞中。有活性的β-gal分裂产生自由的荧光素，它不能通过质膜只能停留在发生β-gal互补的细胞中。经分析后，多数细胞仍可存活并能重新进行培养。在显示活性均相改变的细胞群或克隆中，每个样品荧光的平均数可以可靠地反映蛋白质之间的相互作用。
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X-Gal和荧光X-Gal法检测β-gal
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X-Gal实验是一种简单显色反应，它不需要特殊的仪器。在有活性的β-gal，底物5-溴-4-氯-3-吲哚 β-D-半乳糖吡喃糖苷（X-Gal）和铁氰化钾缓冲液存在时，可通过显微镜在固定的细胞中观察到蓝色沉淀形成。这个实验不是定量实验，也不很敏感，但如果诱导的互补现象十分明显（超过未诱导的活性大约5倍以上时），可用此实验来检测β-gal互补（Rossi et al.，1997）。
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因为X-Gal实验的产物可以平息荧光，这样就产生了荧光X-Gal实验。通过此方法可在有别的蛋白质被免疫荧光标记的细胞中检测β-gal的活性（Mohler and Blau，1996）。此实验中，偶氮染料、固红紫LB与X-Gal或5-溴-6-氯-3-吲哚 β-D-半乳糖吡喃糖苷（5-6 X-Gal）联合，在有活性的β-gal存在时，形成荧光沉淀。荧光X-Gal实验比X-Gal实验敏感，但与X-Gal实验相似的是它们不是定量实验，并需固定细胞。
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方案
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方案1：逆转录病毒的准备与靶细胞的转染
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材料
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缓冲液和试剂
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Dulbecco修饰的Eagle培养液（DMEM），高葡萄糖配方（450g/L）
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胎牛血清（FBS；HyClone）
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1，5-二甲基-1，5-二氮十一亚甲基聚溴化物（8mg/ml）（1000×）溶于水，滤膜过滤灭菌（Sigma）
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载体
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分子克隆手册：蛋白质—蛋白质相互作用
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质粒和细胞
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分子克隆手册：蛋白质—蛋白质相互作用
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专用设备
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带有微板载体的Benchtop离心机
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方法
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1.使用FuGENE6将含有逆转录病毒载体的质粒瞬时转入Phoenix-E包装的细胞系中（这里简要介绍此过程，强力推荐阅读下列产品的说明书）。
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a.在转染的前一天，将培养在含有450g/L葡萄糖（高糖配方）和10%FBS的DMEM中的1.5×106到2×106 的Phoenix-E 细胞接种在60mm的培养皿中（或在转染的当天接种3×106 的细胞）。转染时50%～80%细胞发生汇合。
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b.在微量离心管中按所给的顺序将下列成分混合：不含血清的DMEM，6μl的FuGENE6（首先旋涡震荡储存管，再直接将试剂加入培养液，不要沿管壁加入试剂），2μl的质粒DNA。总体积应为100μl。轻弹管壁，混匀管中的各成分；不要旋涡震荡微量离心管。室温孵育15～30min。对多板或不同大小的板，按比例改变体积。
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c.按顺时针方向向培养Phoenix-E 细胞的培养皿中加入100μlFuGENE-DNA混合物。最初不需要改变培养液或使用无血清培养液。
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2.孵育过夜（18～24h），用2～4ml含10%的FBS的DME（高糖）给细胞换液。
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3.转染至少30h，换液至少6h后，从培养板上移出培养液（病毒上清），用0.45μm的注射滤头抽滤。
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4.在病毒的上清中加入终浓度为8μg/ml的1，5-二甲基-1，5-二氮十一亚甲基聚溴化物，或将其立即冻存于-80℃。
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5.将未汇合的靶细胞生长的培养皿中的培养液弃除，更换为充足的含有1，5-二甲基-1，5-二氮十一亚甲基聚溴化物的病毒上清液覆盖培养皿的表面。如果靶细胞在Phoenix-E培养液中不能存活，将Phoenix-E培养液与靶细胞的培养液1∶1或以更高的倍数稀释。
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6.参考步骤：为了增加病毒的感染效率，可使用带有微板载体的Benchtop离心机（Beckman GC-6离心机或同等的离心机）将生长靶细胞的培养板（直径大于100mm）以2500r/min离心30min。
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将培养板小心地放在微板载体的中心，平衡转子。用封口膜将培养板封口将其“绑”在载体的中心。
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7.参考步骤：在转染后的6～12h到72h持续的从包装细胞搜集逆转录病毒，将搜集到的上清进行另一轮的感染或立即冻存于-80℃。
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8.加入逆转录病毒6h后细胞换液；若为了提高感染效率，加入另一份上述含1，5-二甲基-1，5-二氮十一亚甲基聚溴化物的病毒上清液。如果必需，3h后可进行第三轮的感染。
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尽管离心和多轮感染可以增加感染效率，但因可使蛋白质过表达，在细胞中不希望有多拷贝的逆转录病毒。为了确保多数细胞感染了单拷贝的病毒，转化效率在15%时是最理想的。因此，病毒的上清必须被稀释。可以使用任何一种逆转录载体表达的β-gal，GFP或任一种容易观察的指标检测感染效率。然而完成这里介绍的许多实验不依赖于病毒精确的滴度。
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9.在最后一轮感染的24h后，给靶细胞换上含有相应浓度抗生素的培养液筛选感染细胞。未感染细胞死亡需要的时间与使用的细胞系有关。在整个实验过程中，靶细胞应持续培养在含选择性抗生素的培养液中，以避免融合蛋白表达性状的丢失。
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方案2：化学发光法检测β-gal的活性
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材料
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缓冲液和试剂
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流程1中使用的细胞
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Gal-筛选试剂（Tropix）
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磷酸盐缓冲液（PBS）
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专用设备
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微板发光计
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在微板发光计中使用的板（96孔）
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方法
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1.实验的前一天将细胞以10000/孔的密度接种于96孔板中，培养在100μl相应的培养液中（适用于C2C12或C2F3小鼠的成肌细胞的细胞数）。进行实验时细胞应处于未汇合生长状态。
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2.用相应的诱导或改变待研究相互作用的试剂处理细胞。一般情况下，每组处理3个孔或4个孔。
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3.在处理的末期，弃除孔中的培养液，按照产品说明书准备的Gal-筛选试剂（使用之前底物立即与室温平衡的Gal-筛选缓冲液B以1∶25稀释），将其与1×PBS按1∶1稀释后，向每个待测孔中加入200μl。
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产品说明书并不推荐弃除培养液，但因为要进行动力学分析，如果一些孔中细胞换液的时间点不同，则必须弃除培养液。弃除培养液可轻微提高信号与背景的比率。Gal-筛选试剂另外与1×PBS按1∶1稀释则为了补偿弃除培养液后造成的变化。
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4.将板在26～28℃孵育45min到1h。也可以在室温放置较长的一段时间使Gal筛选反应进入平台期。
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5.用微板发光计对板进行读数，测定1s内或仪器使用的一段合适的时间内每孔的计数。
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6.用相应的软件分析数据。
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方案3：流式细胞法检测β-gal的活性
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材料
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缓冲液和试剂
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二甲基亚砜（Sigma）
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荧光蛋白双-β-D-半乳糖吡喃糖（FdG，Molecular Probes）
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含有5%胎牛血清（FBS）的磷酸盐缓冲液（PBS）
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碘化丙锭（10mg/ml溶于水）〈！〉
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专用设备
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有支持5ml试管适配器的Benchtop离心机
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流式细胞仪
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自动移液器 P-1000
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聚苯乙烯的试管（5ml圆底；Falcon 2058）
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方法
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1.在实验的前一天将在合适的培养液中培养的细胞以一定的密度接种于24孔板中，进行实验时，细胞应处于未融合状态（对于C2C12或C2F2成肌细胞，50000个细胞稀释在0.5ml培养液中接种于每孔内）。
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2.用合适的诱导或改变待研究相互作用的试剂处理细胞。一般情况下，每组处理3个孔或4个孔。
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3.在处理的末期，从孔中弃除培养液，并用PBS洗一遍。
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4.加入两滴胰酶，孵育（室温或37℃）5min或直到多数细胞从培养板的边缘敲落。
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5.在每孔中加入1ml的PBS+5%FBS。运用移液器 P-1000或同等的仪器粉碎细胞的悬浮液，冲洗每孔的底部将所有的细胞移出。将细胞的悬浮液移入5ml适用于流式细胞仪的干净的聚苯乙烯试管中（Falcon 2058）。
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6.在Benchtop离心机中，以1500r/min的转速离心5min，积聚细胞。
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7.将试管中上清倒出（如果可能当试管仍在离心机中时将整个离心机适配器的桶与试管一起反转）。在试管仍处在反转的位置时，将每个管口残留的液体拭去。
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Beckman卖一种插入物，可加在支持5ml试管的适配器上，当适配器反转时可防止试管滑出。
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8.在每个管中加入100μl PBS+5%的FBS。旋涡震荡重悬细胞（将整个离心机的适配器桶与所有试管一起震荡）。
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9.将100μl 二甲基亚砜加入含100μg FdG的小瓶中制备成100×的底物储存液。用消过毒的去离子水稀释适量的底物。
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制备好以后，储存液可在-20℃中避光保存几周。
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10.在每管细胞中加入100μl的底物（低渗性休克）。室温孵育3min。
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11.在每管中加入2.0～2.5ml冰预冷的PBS+5%的FBS+1μg/ml碘化丙锭，使FdG的摄入停止。以1500r/min的速度离心5min积聚细胞。
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碘化丙锭是一种荧光物质，可以在死细胞中聚集。因此，有碘化丙锭荧光的细胞应排除在数据分析和资料之外。
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12.反转试管轻轻地将大部分上清倒掉。如果可能当试管仍在离心机中时将整个离心机的适配器的桶与试管一起反转。不要摇动试管或使试管口吸附的液体流出。将试管保持在垂直位置将整个离心机适配器的桶与试管一起漩涡震荡。充足体积的液体应留在试管中使细胞重悬并用于流式细胞仪的分析（约200μl）。
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13.将试管放在冰上，用流式细胞仪分析细胞。
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方案4：X-Gal实验检测β-gal的活性
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材料
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缓冲液和试剂
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二甲基甲酰胺（Sigma）
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氯化镁（MgCl2）〈！〉
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多聚甲醛（4%）溶于PBS
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铁氰化钾（K3Fe（CN）6）〈！〉
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亚铁氰化钾（K4Fe（CN）6）〈！〉
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X-Gal（Sigma）
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方法
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1.将细胞以未汇合生长的密度铺在组织培养皿或盖玻片上。
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2.用相应的诱导或影响待研究相互作用的试剂处理细胞。
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3.用与预冷的（4℃）溶于PBS的4%的多聚甲醛固定细胞4min。PBS洗两次，共5min。
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4.置备底物：将X-Gal的储存液（40mg/ml，溶于甲基甲酰胺，-20℃避光保存）在含5mmol/L 的K3Fe（CN）6，5mmol/L的K4Fe（CN）6和2mmol/L的MgCl2的PBS中稀释至终浓度为1mg/ml。
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5.在细胞中加入X-Gal（体积盖过细胞）。37℃孵育过夜（β-gal的活性很高时，可以缩短孵育时间；应在显微镜下监测反应的进程）。
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6.在显微镜下检测培养皿或盖玻片上的蓝色细胞。
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方案5：荧光-X-Gal实验检测β-gal的活性
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材料
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缓冲液和试剂
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4'，6-双脒基-2-苯吲哚 二羟盐酸水合物（DAPI；Sigma）〈！〉
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固红紫LB（Sigma）
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多聚甲醛（4%）溶于PBS〈！〉
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5-6 X-Gal（Fluka）
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专用设备
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落射荧光显微镜
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方法
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1.将细胞以未汇合生长的密度铺在盖玻片上。
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2.用合适的诱导或影响待研究相互作用的试剂处理细胞。
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3.预冷的（4℃）溶于PBS的4%的多聚甲醛固定细胞4min。PBS洗两次，共5min。
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4.如果细胞必须用抗体和荧光X-gal作免疫荧光标记时，应在此步完成所有的免疫荧光标记，并在4℃操作。
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5.准备底物：用PBS稀释储存液，将固红紫LB的储存液（50mg/ml溶于甲基甲酰胺，保存于-20℃。在此浓度底物不能完全溶解）稀释至终浓度为100μg/ml，5-6X-Gal的储存液（50mg/ml溶于甲基甲酰胺，保存于-20℃。暴露在光线下，溶液的颜色将由弱的蓝色变为黄色，但不影响活性）稀释的终浓度可高至25μg/ml（如果β-gal的活性强可降低5-6 X-Gal的浓度）。用0.45μm的注射式滤头对底物进行抽滤去除沉淀。
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6.向细胞中加入稀释的固红紫LB和5-6 X-Gal的混合液（液体量要足以盖过细胞）。37℃孵育60～90min。
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7.在室温下用PBS洗30min。
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8.参考步骤：用PBS稀释DAPI至终浓度为100ng/ml，在室温下孵育10min染核，随后用PBS洗两次，共5min。
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9.在PBS 中固定盖玻片，封口。
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10.落射荧光显微镜的FITC或TRITC滤镜检测荧光X-Gal的斑点。对弱的信号，FITC滤镜有更好的信号背景比，但较强的信号能发生熄灭。因此，荧光X-Gal的斑点最好使用TRITC滤镜进行观察。
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问题解析
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在一些实验中，最初，在表达融合子的细胞中当待测蛋白无相互作用时，β-gal的活性很低，当加入促进相互作用的诱导剂后，β-gal的活性成倍升高。然而在另外一些实验中，不出现诱导作用或诱导作用很低。较低的β-gal的活性伴随缺乏诱导可能由于其中的一个融合子不能适当地表达融合蛋白。组成型的β-gal的基础活性可能是由于一个或两个融合子过表达造成的。
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·检测不到β-gal的活性
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如果检测不到β-gal的活性，必须确认融合子是否正常表达。使用β-gal或融合蛋白中非β-gal部分的抗体，通过对细胞提取物进行免疫印迹可以很好地解决这个问题。如果观察到有相应大小的能进行免疫反应的蛋白质，说明这个融合蛋白是表达的。无免疫反应的印迹带提示此融合蛋白不表达，免疫反应的条带分子量较小说明蛋白质很可能在错误的氨基酸位点终止。这些错误也可通过对融合蛋白的cDNA进行测序找出。因为β-gal已有商业性抗体，因此即使无法获得融合蛋白中非β-gal部分的抗体，仍可进行免疫印迹实验。使用抗β-gal的抗体，我们已经成功地对哺乳动物细胞中表达的β-gal的融合蛋白进行蛋白质免疫印迹。混合使用下列的抗体可以得到最好的免疫印迹的结果：Calbiochem（La Jolla，California）抗β-gal单克隆抗体（OB02-100）；Sigma（St.Louis，Missouri）抗β-gal的多克隆抗血清（G4644）；Sigma抗β-gal的单克隆抗体（G6282）；每种抗体1∶1000稀释。如果能够获得好的非β-gal蛋白的抗体，我们建议检测融合蛋白质时应加上多肽的标签。
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·检测到β-gal的基础活性
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理想的可诱导的蛋白质之间的相互作用在无诱导剂或配体时β-gal的活性极低。如果β-gal具有基础活性，可进行一系列步骤降低非诱导的β-gal的活性。首先，避免β-gal融合子的过表达是非常重要的。此系统最显著的优点是信号经过酶促反应放大，因此不需要过表达β-gal的融合子（Blakely et al.，2000）。使用过量高浓度的抗生素对细胞进行筛选会导致蛋白质的过表达。例如，C2C12细胞处于G418的1mg/ml的筛选浓度下或潮霉素的300μg/ml的筛选浓度时，我们可以检测到蛋白质有较高水平表达，尽管这个浓度是药物对此系细胞筛选所需的最小浓度。使用逆转录病毒的载体需限制每个细胞中融合子的拷贝数，这可避免融合蛋白的过表达。为了保证每个细胞仅转入一个拷贝的融合子，根据泊松分布，必须稀释病毒的滴度，使仅15%的细胞受到感染。
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当β-gal的活性在未诱导时有较高的水平或不能达到较好的诱导（少于几倍的增加），以FdG为底物通过流式细胞仪检测细胞群中β-gal的活性是很有帮助的（Blakely et al.，2000）。未诱导时在细胞群中β-gal的活性如果不均一（既可观察到高活性也可观察到低活性的细胞），需分离出有低背景活性的亚细胞群或可诱导的细胞克隆。但是必须保证在筛选β-gal活性低的细胞群时不要筛选到β-gal的活性不可被诱导的细胞群。否则，需要将融合子重新导入细胞，按上述步骤降低拷贝数和融合蛋白的表达。
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·β-gal的活性不能达到较好的诱导
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细胞不能被诱导时，使用流式细胞仪检测细胞群的性质仍是非常有用的。在实验数量较大的实验中，低诱导性可能由于细胞群中仅有一小部分对诱导反应。FACS可用来筛选β-gal活性高诱导性的细胞群，但仅使用这个标准可产生具有β-gal基础活性的细胞群。最理想的是，细胞能够持续地筛选，从而得到在无诱导剂时β-gal的活性很低，加入诱导剂后β-gal的活性增加的亚细胞群或细胞克隆（Blaely et al.，2000）。尽管FACS可以简化这个过程，此程序仍可简化为仅仅将大量的细胞铺在板上，筛选β-gal的活性可被诱导的克隆。
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·检测到膜蛋白β-gal的基础活性
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在我们的实验中，如果融合蛋白均为膜蛋白，β-gal很可能具有基础的活性。我们推测这种现象是由于与相同表达水平的胞质蛋白相比，膜蛋白限制在膜表面的二维空间内，在互补时具有较高的有效浓度。幸运的是，膜蛋白可以有另一水平的筛选方式，如利用抗体检测待测蛋白的胞外区或利用FACS通过胞外区结构域标签筛选表达融合蛋白的活细胞（Blaely et al.，2000）。因此，可同时使用荧光素的荧光筛选β-gal活性，在二抗以不同波长的荧光素标记后，用待测蛋白质的抗体检测融合蛋白的表达，这样此方法除了能筛选在无诱导剂（配体）存在时具有低β-gal活性的细胞，还可挑选出不能表达融合蛋白的细胞。我们还发现使用具有很长的胞内结构域受体全长构建融合蛋白时，很大的一个问题是在未诱导时β-gal的活性很高。在一些情况下，缺失受体使β-gal的突变体靠近受体的跨膜区可以通过降低未诱导时β-gal的基础活性提高诱导后β-gal活性增加的倍数。对一些受体，如EGF的受体，缺失受体可以阻止配体诱导的受体的内吞。
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·上述问题解决后仍不能检测到β-gal的活性
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在一些情况下，β-gal的活性检测不到或者很难纠正。待测蛋白加在β-gal的突变体上后，显然可以抑制一些已存在的相互作用。在另一些情况下，相互作用可以发生，但是β-gal的突变体所处的空间位置不能发生互补。利用多肽接头增加相互作用的蛋白质与β-gal突变体之间的距离可以促进互补的发生。对细胞质蛋白来说，将β-gal突变体从融合蛋白的一端移到另一端可增加互补的发生。尽管对于大多数我们用此系统鉴定的具有相互作用的蛋白质来说，没有明确的方法证实在β-gal位于融合蛋白的哪一端效果更好。然而，对两种已知具有相互作用的蛋白质来说，可在体外构建一系列的融合蛋白，对它们进行选择以得到最好的效果。
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24 双杂交系统研究胞内蛋白质和单链抗体的相互作用
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前言
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应用酵母双杂交系统检测胞内单链抗体与抗原相互作用
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图24.2
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为研究sFv-抗原相互作用，诱饵质粒含有克隆在LexA DBD阅读框的抗原蛋白基因，猎物质粒编码sFv-VP16融合蛋白，转化到酵母L40菌株（MATa his3Δ200 trp1-901 leu2-3112 ade2 LYS2：：［4lexAop-HIS3］）（Vojtek et al.，1993）。此菌株整合了HIS3和LacZ报告基因，在他们的上游均有8个或9个LexA操纵子，转化子在YC-HLUW板培养。Leu和Trp作为选择标志。在缺失（省却）组氨酸的培养板上检测存在相互作用的转化子克隆，同时定量β-半乳糖苷酶活性判断其作用强度。相互作用的真阳性克隆首先要有两个报告基因的表达，而在下列对照组中应没有报告基因的活性：（1）sFv的猎物质粒空载体，显示sFv与LexA DBD无作用；（2）含对照基因（例如层粘连蛋白Laminin）的质粒，对照蛋白应与猎物质粒表达的sFv无作用，它显示sFv只与靶蛋白有结合而与其他蛋白质没有作用；（3）含靶蛋白的诱饵质粒和空猎物质粒，表明诱饵和VP16AD的表达不能导致报告基因的活化；（4）含靶蛋白的诱饵质粒和不含猎物质粒在加入亮氨酸L的培养基中培养，表明是否LexA-靶蛋白融合表达本身会激活报告基因表达；（5）含sFv猎物质粒菌株中在加入色氨酸（W）的培养基中培养，阴性结果表明排除了sFv与报告基因上游DNA无本底结合作用；（6）猎物质粒与对照组sFv和靶蛋白的诱饵质粒无作用，说明sFv不结合靶蛋白，因而，细胞在缺失组氨酸H的培养基上不生长，也无β-半乳糖苷酶活性。
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如果可能的话，应有一个阳性对照转化组，用sFv/靶蛋白对，它们应该在酵母双杂交中有相互作用发生，或者，含LexA-VP16表达质粒能应用于产生报告基因活性，在LexA-VP16转化子中报告基因的表达通常比实验检测到的LexA融合蛋白和sFv-VP16融合蛋白相互作用要强。
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应用酵母双杂交系统筛选单链抗体文库
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为了筛选细胞内与靶蛋白结合的新型sFv，先构建好诱饵质粒，把蛋白质cDNA克隆到pBTM116载体上LexA DBD阅读框，质粒转化L40酵母菌，在YC-UW板培养，表达诱饵蛋白的转化子采用Western-blot分析，诱饵融合蛋白的表达可用靶蛋白的抗体或市售LexA抗体检测，诱饵融合蛋白本身不会导致激活报告基因表达，然后，将诱饵菌株涂布在YC-HUW培养板，转化子不能在缺失组氨酸H的培养板上生长。
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使用猎物载体pVP16*的两个克隆位点使得大多数现存的sFv文库基因更容易被克隆，sFv文库基因mRNA可以从人或小鼠的脾脏细胞、外周血淋巴细胞提取（Coloma et al.，1992；Marks et al.，1991），用mRNA作为模板合成单链cDNA，用PCR扩增出重链和轻链的可变区，设计的引物应该使免疫球蛋白可变区能在序列未知的情况下直接扩增出来（Coloma et al.，1991），重链可变区和轻链可变区的连接有两种方法：重链可变区的3′ 端和轻链可变区的5′ 端之间通过外接一段序列连接起来。连接序列上面具有一段重叠的序列，它编码连接子（linker）肽。另一个方法是先纯化重链和轻链可变区片段再用相同的引物对（含有内切酶位点）克隆到表达载体中，重链区位于连接子肽的5′ 端，轻链区位于连接子的3′ 端。用于酵母双杂交筛选的文库可以用噬菌体载体在这两个酶切位点插入。
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本系统成功的筛选工作是采用Schiestl等，1989；Hill等，1991；Gietz等，1992和Mount等，1996的大规模醋酸锂转化方案，应用其他双杂交系统的实验也表明小规模转化方法对于筛选相互作用蛋白质也很有效（Golemis et al.，1996）。为检测初始转化效率，可将包含诱饵和猎物双质粒的转化子在不同的稀释度下，涂布在缺失组氨酸和色氨酸（YC-LUW）的培养板上，剩余的转化子涂布在缺失外加组氨酸（YC-HLUW）的培养基上；由LexA操纵子控制的组氨酸基因只在诱饵蛋白与sFv相作用的情况下转录，组氨酸阳性转化子通常在2～3d后形成克隆，挑取阳性克隆平行点在两块YC-HLUW培养板上，1～2d后用滤膜法（Breeden et al.，1985）或者覆盖法（Gleeson et al.，1998；Golemis et al.，1998）分析β-半乳糖苷酶活性。
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进一步鉴定转化子，需要从双阳性克隆中提取sFv猎物载体转化到大肠杆菌，因为诱饵质粒和猎物质粒均含有氨苄抗性，质粒DNA需要用内切酶消化分析以鉴定sFv-pVP16*含有SfiI和NotI位点插入序列。筛选到的特异sFv再按上述步骤鉴定它和相应抗原的相互作用，只有包含抗原诱饵质粒和筛选获得的sFv质粒的转化子才能在缺失组氨酸的培养基上生长而且显示β-半乳糖苷酶活性。
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双诱饵酵母双杂交系统一步法鉴定两种不同的单链抗体-抗原相互作用
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最初的酵母双杂交系统已经经过修改并在许多步骤上进行了优化，相互作用蛋白质陷阱由Gyuris（1993）建立，在加入第二诱饵进行扩展（Serebriiskii et al.，1999），该质粒编码第二诱饵-DBD（cI）融合基因能结合在另一套报告基因的上游，因此能在同一细胞中检测一种猎物蛋白同另外一个诱饵之间的相互作用。这个第二诱饵可以是除靶蛋白外的任何其他蛋白质，或靶蛋白的突变体，或第一诱饵的相关蛋白质。为研究sFv结合位点，可以用两个切短的突变子蛋白作为两个诱饵，另外双诱饵系统使得对两个诱饵蛋白的文库筛选工作同时进行，节省时间和试剂。
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双诱饵相互作用蛋白陷阱系统的另一版本见图24.3（未发表）。在一个酵母细胞中表达两个不同的诱饵蛋白，其一为LexA DBD融合蛋白，其二为cI-DBD融合蛋白。它们各有不同的报告基因，前者为LEU2和LacZ，后者是LYS2和GUS（葡萄糖苷酸酶）。有实验表明B42 AD不适合应用于sFv抗原相互作用分析，但一个氨基端VP16-sFv融合蛋白对报告基因有很强的激活作用，所以大量抗体都表达在VP16融合蛋白的羧基端。比较上述第一个酵母双杂交系统，猎物融合蛋白在启动子Gall下可诱导表达，保证了酵母细胞内大量抗体文库的高表达。
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图24.3 经过修改的双诱饵酵母双杂交系统用于研究sFv和蛋白质相互作用
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双诱饵表达质粒（见图24.4），诱饵1的载体pHybLex/Zeo含有LexA DBD，其下游有多克隆位点和Zeocin标志基因，利于在细菌和酵母中选择培养；诱饵2质粒包含细菌λ质粒的cI DBD和下游的多克隆位点卡那霉素基因，利于在细菌中选择培养，还有HIS3基因利于酵母细胞的选择培养，猎物质粒pYesTrp经过改造构建，用VP16替代B42 AD，下游插入SfiI和NotI克隆位点，以方便sFv基因的插入，它含有TRP1标志基因利于在酵母中转化选择培养，氨苄青霉素的抗性基因利于在细菌中的转化培养。双报告基因质粒pLacGus编码LexA操纵子融合lacZ和cI-操纵子融合的GUS两个报告基因。酵母S.cerevisiae 菌株SKY48（Matα ura3 trp1 his3 6lexAop-LEU2，3cIop-LYS2）含有编码lexA操纵子融合LEU2和cI-操纵子融合的LYS2两个报告基因（Serebriiskii et al.，1999）。
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图24.4 双诱饵双杂交系统中，诱饵1、诱饵2、修饰的猎物质粒和双报告质粒图谱
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本系统能应用于检测sFv和抗原在细胞内的相互作用，在转化以后细菌首先涂布在含葡萄糖/Zeocin，缺失组氨酸、色氨酸和Ura的培养板上，以选择双诱饵、猎物和双报告基因表达的转化子，猎物蛋白表达受半乳糖苷酶启动子的控制，可以将细菌转移到含半乳糖的培养基上选择培养，培养基通过缺失亮氨酸或赖氨酸选择第一报告基因的活性。阳性克隆平行转移到两块缺失亮氨酸和赖氨酸的板上平行培养，一天后用滤膜法或者覆盖法分别检测β-半乳糖苷酶或GUS的活性。需要采用单诱饵细菌的双杂交系统作为对照组，诱饵融合蛋白和VP16-sFv融合蛋白不能激活报告基因的表达，另外，sFv和cI或LexA的交叉作用活性也需要检验。
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在文库筛选中双诱饵的细菌转化株SKY48细胞含有报告基因质粒pLacGUS及两个诱饵质粒，诱饵蛋白的表达可以通过采用诱饵、LexA和cI的特异抗体Western-blot鉴定，同时，还需要检测诱饵融合蛋白本身是否激活报告基因的转录。大规模或小规模的转化都可使用。转化效率通过将转化子细菌进行1∶10连续稀释并涂布在YC-UWH+Zeo板上测定，获得转化子后猎物蛋白的表达可通过将转化细菌转移到半乳糖液态培养基中诱导，然后一定体积的细菌培养液分别涂在含Zeocin缺失UWH，含Zeocin缺失Leu，含Zeocin缺失Lys的培养板上培养，Leu+和Lys+的克隆分别检测β-半乳糖苷酶和GUS的活性。
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双阳性克隆中的猎物质粒DNA可通过猎物、诱饵和双报告基因质粒上的选择标志容易地获得（Golemis et al.，1998）。
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哺乳动物细胞双杂交系统评价单链抗体和蛋白质在胞内的相互作用
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25 利用蛋白质片段互补策略研究蛋白质相互作用和文库筛选
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前言
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确定新基因功能的第一步就是在一个合适的体系中寻找与之相互作用的基因产物。研究一个蛋白质与其他蛋白质的特异性相互作用是其功能研究的一个组成部分，所以研究一个新基因功能的最好方法就是研究它与其他基因产物之间的相互作用。这就是酵母双杂交体系能取得非凡成就的理论基础。酵母双杂交目前已成功用于研究基因产物间特异性的相互作用或为寻找相互作用蛋白质进行基因组范围的筛选（Fields and Song，1989；Evangelista et al.，1996；Dress，1999；Uetz et al.，2000；Walhout et al.，2000）。
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用双杂交筛选蛋白质—蛋白质的相互作用存在的主要问题是它只能在一个固定的体系——酿酒酵母的细胞核中进行检测，而且筛选的结果必须在合适的细胞、组织或器官模型中用其他分析方法进行生理相关的验证。尽管这一方法适用于任何筛库策略，但如果将筛库和验证整合为一步实验来完成则效果会更好，它会及时对筛选到的蛋白质进行生理相关性验证并立即消除假阳性的相互作用。带着这一挑战性的想法，我们实验室发展了蛋白质片段互补分析（PCA）技术。这一技术中，一个酶的基因被合理地分为两个部分，融合蛋白是用两个可以互相结合的蛋白质构建的，每个蛋白质分别连接在两个不同的酶片段上，两个互相结合的蛋白质的融合催化了酶片段的结合，同时可检测重建酶的活性。我们证明PCA方法有以下特点：（1）它可以检测任何细胞类型的体内和体外蛋白质—蛋白质相互作用；（2）它可以检测出蛋白质—蛋白质相互作用的亚细胞定位；（3）它可以检测出由生长发育、不同营养状况、环境因素或激素介导的蛋白质—蛋白质相互作用；（4）它可以检测这些细胞中蛋白质组装时的动力学变化情况；（5）它可以筛选任何细胞类型中的蛋白质—蛋白质相互作用。
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除了以上描述的特点外，PCA还有其独特的优点使之适合于分子间相互作用的筛选。（1）PCA不是一个单独的分析而是一系列分析，因此可以根据所选择的细胞类型决定所选用的分析步骤。（2）PCA分析比较便宜，除了特定的分析材料和技术上的需要外，并不需要专用的试剂。（3）PCA可以进行自动化分析，支持高通量筛选。（4）PCA是在酶的原子结构水平上进行设计的，因此在设计探针片段上有很大的灵活性，可用于控制分析的灵敏度和严谨性。（5）PCA可以根据用于检测蛋白质相互作用的不同的酶灵活采用不同的手段进行检测，包括优势筛选、荧光分析或比色分析。根据不同的检测手段，我们已经发展了6种不同的PCA策略。这里我们将讨论发展最为完善的PCA，用于检测蛋白质相互作用的酶为鼠的二氢叶酸还原酶（mDHFR），加上一些其他分析所用到的酶包括TEM β-内酰胺酶、绿色荧光蛋白（GFP）、新霉素磷酸转移酶和潮霉素B磷酸转移酶。
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程序纲要
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基本概念
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图25.1 两种可供选择以完成互补的策略
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酶的选择和PCA的设计方法，以前已经对其进行了详细讨论（Michnick et al.，2000），这里我们只综述它最基本的思路。多肽本身已经包含了所有使之自动折叠为一个稳定、特定的三维结构的必要的化学信息（Anfinsen et al.，1961；Gutte and Merrifield，1971；Anfinsen，1973）。理论上，折叠反应可以由两个拼接后含有正确顺序的全部序列的肽的相互作用来完成。这一可能性已经被Richard（1958）、Taniuchi和Anfinsen（1971）的经典实验所证实。实际上，使蛋白质发生正确折叠并不容易。它的驱动力是疏水效应，而疏水力同样可驱动其他非特异性的聚合。但如果添加足够多的可溶性寡聚结构域，使之有效浓度增加就可使正确的折叠进行下去（Johnsson and Varshavsky，1994；Pelletier and Michnick，1997；Pelletier et al.，1998）。如果多肽片段正确折叠后生成有活性的酶，而且它的活性可在体外检测到，那么该酶活性的重建就可用来检测寡聚结构域的相互作用（图25.1A）。这是一个双重选择的方法。它不只单纯依靠相互作用可能性，而且需要肽在空间上能正确地组装成酶，其结果是或者完全折叠或者完全未折叠，因此它提供了一个非常特异的检测蛋白质相互作用的方法。PCA的探测蛋白被分成两个片段，在没有异源提供的催化力使之具有二聚化功能的情况下，它就不能自动地与其互补片段折叠成一个有功能的完全蛋白。这些特点使PCA策略区别于自然情况下发生的互补和酶亚单位间的低亲和力结合，有时这种较弱结合也会发生自发的组装，如图25.1B所示。
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总的来说，PCA方法并不只凭一个报告酶活性来下结论，它还有许多不同的分析方法。问题不决定于哪种方法应当被使用，而是决定于哪个方法或哪套方法可以有效地解决一个特定的问题。表25.1列出了PCA的优点和应用，图25.2展示了PCA策略的过程。一些情况下，特定的PCA可被用于不同的模式中。如，DHFR PCA可被用于简单的存活选择分析中，也可在荧光分析中使用，以定量检测蛋白质相互作用，确定蛋白质相互作用的细胞定位（Remy and Michnick，1999，2001）。另外，β-内酰胺酶分析可作为一个非常灵敏的在体内和体外定量检测蛋白质相互作用的体系，不像DHFR和GFP只能测定由底物变化为有色或荧光产物的持续变化过程。但是，需要说明的是将酶底物作为检测信号并不能保证所得到的信噪比一定比固定的荧光报告因子（如GFP或将带有荧光的甲氨蝶呤连接到DHFR上）效果好。信噪比的强度依赖于荧光团量子化效率、细胞对荧光团的保持力、所选择的细胞特性及细胞器对荧光团的保持力。如除了酶学反应的信号放大过程外，DHFR荧光分析只需要1000～3000个重建的DHFR分子就可以将阳性信号从背景中区分开。
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表25.1 蛋白质片段互补分析（PCA）及其应用
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图25.2 蛋白质片段互补分析（PCAs）
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DHFR蛋白质片段互补分析（PCA）
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根据DHFR蛋白质片段互补分析（PCA）我们已经在哺乳动物细胞中开发出两种分析方法：一种是存活选择分析，另一种是荧光分析（Remy and Michnick，1999）。存活选择DHFR PCA分析的过程是，细胞同时表达分别融合到蛋白质或肽上的DHFR（F［1，2］和F［3］）互补片段，如果蛋白质发生了相互作用，在没有核苷的培养基上，就可以存活。在不含有DHFR活性的细胞中（如CHO-DUKX-B11），检测其体内重建的DHFR活性可通过在缺少核苷的培养基上的存活选择进行。另一种隐性选择的方法可以在含有DHFR活性的细胞中进行，因为由含有1个或更多突变点的DHFR PCA片段重组的DHFR可以抵御抗叶酸药物甲氨蝶呤（MTX）的毒性。将细胞在没有核苷的培养基上培养，通过其对甲氨蝶呤的抗性可进行筛选。存活DHFR PCA 方法是一个非常灵敏的分析方法。在哺乳动物细胞中，能否在限定的条件下存活只决定于重组的DHFR分子的数量，现已经证实每个细胞中只要含有25个DHFR分子，就可以存活（Remy and Michnick，1999）。因此，该方法的分析水平极其灵敏，即使蛋白质表达水平非常低时也能被检测到。我们也证实了一个含有相互作用的克隆的细胞即使被稀释至106个细胞中后也能被检测到。所以，这种方法对简单的、其目的只是用于回答蛋白质是否发生相互作用的筛选程序非常有用。特别对筛库，一个简单而有效的分析非常重要。
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第二种方法，荧光DHFR PCA分析是通过检测连接到重建的DHFR上的fMTX而完成的。这一分析的过程是融合到蛋白质或肽上的DHFR互补片段将会与fMTX发生高亲和力的结合（Kd=540pM），结合比例为1∶1。通过这一复合物fMTX将被保留在细胞中，而未被结合的fMTX将很快转移出细胞（Israel and Kaufman，1993；Kaufman et al.，1978）。此外，将fMTX连接到DHFR会使荧光团的数量增加4.5倍。理论上，连接fMTX并重建DHFR可通过荧光显微镜、荧光激活的细胞分选（FACS）或分光光度计进行检测（Remy and Michnick，1999，2001；Remy et al.，1999）。需要强调的是，尽管fMTX与DHFR有很强的亲和力，但它并不参与将两个表达的PCA片段诱导折叠为DHFR分子。这是因为融合的寡聚化结构域的结合，促使DHFR片段的折叠，才产生fMTX的结合位点。因此，通过测定保留在细胞中的fMTX分子数目而确定复合物的数目，是对形成蛋白质复合物的直接测量，而并不依赖于fMTX的结合（Remy and Michnick，1999，2001；Remy et al.，1999）。荧光分析的其他应用是确定相互作用在细胞中的定位，如图25.3所示。这一特点与GFP PCA的分析方法相同。它们是惟一的能判断在活细胞中蛋白质相互作用所发生的亚细胞定位。这里仅描述了用fMTX作为DHFR重组的探针的实验步骤。但现在已有商品化的其他MTX连接的荧光探针，可能其应用比fMTX更简单（见方案4的步骤5）。
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图25.3 用DHFR PCA确定蛋白质复合物在细胞中的定位，并对蛋白质相互作用进行定量研究
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以新霉素和潮霉素B为基础的PCA
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尽管DHFR存活PCA采用了一个合适的MTX抗性突变，而使之可以在几乎任何细胞类型中应用，但有人可能会考虑到嘌呤合成途径的混乱可能会产生不良影响。这里提到的另外两种PCA存活方法同样可应用于任何细胞中。氨基糖苷磷酸基转移酶［APH（3′）-Ⅲa］和潮霉素B磷酸基转移酶［APH（4）-Ia］基因是分别具有新霉素和潮霉素B的抗性基因，在稳定筛选哺乳动物细胞系时通常作为主要的选择标志物。新霉素、卡那霉素及类似的化合物，如G418，在真核和原核生物中都能抑制蛋白质的合成。如G418是一个氨基糖苷抗生素，在真核生物细胞中通过阻抑80s核糖体的功能而阻止蛋白质的合成（Bar-Nun et al.，1983；Eustice and Wilhelm，1984）。细菌的氨基糖苷磷酸基转移酶可以通过磷酸化作用而使这些抗生素失活。潮霉素B，另外一种氨基糖苷抗生素，被报道能阻抑移位（Cabans et al.，1978；Gonzalez et al.，1978）并导致错误的翻译（Singh et al.，1979）。潮霉素B磷酸基转移酶基因同样具有对潮霉素B的抗性，它通过编码一个激酶使抗生素磷酸化而失活。我们根据APH（3′）-Ⅲa和APH（4）-Ia发展了两种PCA，可在任何细胞类型中作优势筛选分析。实验过程将在下面的新霉素和潮霉素B存活分析中详细讲述（方案8）。
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TEM β-内酰胺酶 PCA
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TEM β-内酰胺酶符合所有PCA策略的主要标准，是一个很好的候选方法。首先，它相对较小，是单基因，其结构和功能都很清楚，能很快表达，而且对真核和原核生物都没有毒性。另外，它是一个细菌酶，在许多标准的大肠杆菌菌株基因组中缺失。在真核生物中并不存在β-内酰胺酶的直系同源和旁系同源。因此，β-内酰胺酶可被广泛应用于真核生物细胞和许多原核生物细胞中而没有任何内源背景。第二，该分析是基于酶催化的化学反应，而使产物快速聚集。这种酶学的放大反应使相对较弱的分子间相互作用也可被观察到。最后，这一系列分析在许多模式下可同时进行也可连续地进行，包括体外光吸收分析、体内荧光分析或细菌存活分析。
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已经有两种底物被认为能在β-内酰胺酶PCA分析中起到很好的作用。第一个是头孢菌素硝基噻吩（cephalosporin nitrocefin）（O’Callaghan and Morris，1972），这一底物可用于体外的比色分析。β-内酰胺酶的kcat/km为1.7×104mM-1s-1。底物的转变用肉眼就可很容易地观察到，底物在溶液中为黄色而产物却为宝石红色。水解率的定量检测可用任何一款分光光度计，测量492nm下红光吸收值来确定。但这一分析现在只应用于全细胞裂解液，因为硝基噻吩并不是膜透性的。底物CCF2/AM可做体外荧光分析（图25.4）（Zlokarnik et al.，1998），尽管它并不像硝基噻吩一样是一个很好的底物（kcat/km为1260mM-1s-1），但因CCF2/AM含有丁酰基、乙酰基和乙酰氧基甲酯，可以使之扩散到质膜内。一旦CCF2/AM进入细胞中，胞浆中的酯酶可以催化酯的水解，使之释放多聚阳离子（4个阳离子）产生β-内酰胺酶的底物CCF2。CCF2带有负电荷，会被细胞捕获。香豆素供体和荧光受体对间会发生荧光共振能量转移（FRET）共价连接到头孢菌素母核上。香豆素供体在409nm处被激发在447nm处发射荧光，发射光波长处于荧光受体的激发光范围内（最大在485nm左右），在535nm处发射绿色荧光。当β-内酰胺酶催化底物的水解时，荧光部分就会作为自由巯基释放。在409nm处激发香豆素供体，在447nm处发射蓝色荧光，而荧光受体会被自由的巯基所淬灭。
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图25.4 用CCF2/AM作β-内酰胺酶PCA分析的荧光底物
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PCA研究的控制标准
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为了确保片段互补不自发进行，对任何一对发生相互作用的蛋白质都需要有一系列的条件控制。这些控制包括：
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1.没有相互作用的蛋白质。如果某个蛋白质不能与待测的两个相互作用的蛋白质中的任何一个发生相互作用，而仅作为PCA伴侣时就不应该有PCA反应；也不应该单独过表达该蛋白质而与已知的蛋白质相互作用发生竞争。
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2.伴侣蛋白介导的突变。对一个蛋白质进行点突变或缺失突变会破坏蛋白质的相互作用，同样也会抑制PCA反应。这是最重要的控制方法，用来验证观察到的PCA效应是由两个蛋白质的特异结合产生的。
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3.竞争。通过在另外一个载体中同时过表达另一个相互作用的蛋白质而且并不融合到互补PCA片段上，使PCA反应消失。
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4.片段交换。无论蛋白质连接在哪一个PCA片段上，寡聚化结构域的相互作用都会发生。
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在细菌体内应用DHFR PCA方法库对库筛选相互作用的蛋白质
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用Ile114突变改变选择严谨性
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DHFR两个片段的作用表面大部分由片段［3］的疏水β-片层编码组成，也包括片段［1，2］的β-延伸部分。我们设计了突变Ile114Val，Ile114Ala，Ile114Gly，以期从序列的设计上降低侧链的体积，根据高度保守的鸟类的酶结构，这些序列正位于界面的片段上但远离酶活性位点（Volz et al.，1982）。我们假设这些突变通过破坏界面的疏水接触而降低片段的结合效率，所以它们的效果是逐渐增加的（Val>Ala>Gly）。实际上，在预定的融合中，突变削弱了表达重建的mDHFR细菌的生长。均相二聚的GC4N卷曲螺旋提供了二聚化功能，但在生长率上，Val突变株与Ile的野生型没有显著差异。但与Ala突变株相比生长率降至2/5（在液体培养基中定量），Gly突变株根本就没有生长（Pelletier et al.，1998）。因此，突变影响的程度与侧链的体积有关。
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我们设想用突变片段在最大程度上重建细菌生长率，这对相对较稳定的并具有异源特异性的相互作用蛋白质的筛选很重要。因此，相互作用蛋白质间的稳定性增加应该促进不稳定的mDHFR的重建。为了验证这个假设，我们从半随机库中筛选了卷曲螺旋的相互作用蛋白质。当用到Ile114Ala突变时，很快我们观察到选择的严谨性增加了50倍。用卷曲螺旋的相互作用蛋白质方法的特点与用更高要求的方法选择更稳定的蛋白质对的特点相一致，用规定的异源二聚体比用野生型片段的筛选要求更高（Pelletier et al.，1999；Arndt et al.，2000）。因此，野生型和Ile114突变产生了不同的选择严谨性，因为mDHFR片段界面的不稳定性被一些更稳定和更专一性的相互作用蛋白质所补偿。Ile114Val突变同样也可用于选择策略，而且在野生型和Ila114Ala突变之间也需要一个中间严谨性的突变。理论上，Ile114Gly突变也可产生结果，但需要更高的选择严谨性。但使用这个突变时我们试用了许多蛋白质对，至今还没有观察到酶活。可能是因为在这个突变中界面上受到了太大的干扰，而不能使片段重建。
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代谢竞争的应用
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用相同的试剂通过功能选择鉴定出效果最好的酶是一个非常困难的过程。我们在选择达到最好的重建mDHFR效果时应用了这种方法。因为DHFR转变是全细胞生长所必需的，所以对DHFR活性的限制程度决定了细胞生长率。在混合生长的克隆中，每一个克隆中的mDHFR都是由不同的相互作用蛋白质对重建的，越有效的蛋白质相互作用越需要高的DHFR转变率，使这个克隆的生长率增加。因此，在液体培养基中，收集到的生长最快的细菌，表达的蛋白质对的相互作用效果最好。我们从半随机库中通过分析代谢竞争筛选卷曲螺旋蛋白对实验的结果已经验证了克隆的生长率与蛋白质对相互作用的稳定性和专一性之间的联系（Pelletier et al.，1999；Arndt et al.，2000）。我们发现优势克隆很快集中。实际上，我们从中选择了2.0×106个克隆，在最后阶段中（P12）出现了一个优势克隆，其序列覆盖了卷曲螺旋蛋白对序列的82%。该方法产生的卷曲螺旋的特点与其他方法（如选择比代谢竞争前更加稳定的蛋白质对的方法）产生的卷曲螺旋蛋白对的特点相一致，因为它大大增加了异源专一性。
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方案
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方案1：细菌DHFR PCA存活分析
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材料
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缓冲液和试剂
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氨苄青霉素（100μg/ml）IPTG（1mmol/L）〈！〉
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卡那霉素（50μg/ml）
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含有最少M9的培养基和富含M9的培养基（LB肉汤）
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甲氧苄氨嘧啶（1μg/ml）（Sigma）
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载体和细菌
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细菌表达载体pQE-32（Qiagen）
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大肠杆菌菌株BL21含有1acIq质粒pREP4（Qiagen）
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专用设备
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培养细菌的有盖培养皿
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方法
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1.将两个分别融合有X-F（1，2）和Y-F（3）的DHFR片段的pQE-32细菌表达载体共转化到BL21细菌细胞中，其中X和Y是两个特定的目标蛋白。为了达到最大的转化效率，将细菌进行电激。然后立即将细菌放入LB肉汤30～45min，孵育，并用低M9培养基洗1次，以减少复杂的营养物质。
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2.将洗好的细胞平铺在选择培养基上，选择培养基中含有低M9培养基、琼脂+1μg/ml甲氧苄氨嘧啶、1mmol/L IPTG、100μg/ml氨苄青霉素、50μg/ml卡那霉素。在30℃孵育平板。孵育24～28h后观察克隆。可直接挑选克隆，单独进行DNA序列扩增。
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方案2：在体内进行库对库的筛选相互作用蛋白质：细菌中进行代谢竞争选择
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材料
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缓冲液和试剂
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氨苄青霉素（100μg/ml）
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IPTG（1mmol/L）〈！〉
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卡那霉素（50μg/ml）
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含有最少M9的培养基和富含M9的培养基（LB肉汤）
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甲氧苄氨嘧啶（1μg/ml）（Sigma）
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载体和细菌
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细菌表达载体pQE-32（Qiagen）
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大肠杆菌菌株BL21含有1acIq质粒pREP4（Qiagen）
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专用设备
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培养细菌的有盖培养皿
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方法
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1.将细菌存活实验中生长的克隆（见方案1；X和Y对应于两个设计肽库）刮入少量培养基中。孵育，并在250r/min摇动10min以分散团块。一部分将用于选择，另一部分铺板，用以一步筛选中产生的单克隆的序列分析（阶段0，或P0），剩余部分以15%甘油冻存于-80℃。
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2.根据（a）现有的活细胞数量和（b）竞争中应存在的特异性克隆的数量，计算选择培养基的体积（见上述）并收集筛选用的细胞。
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举例：如果OD600的数值表示所使用的是4×108活细胞/ml那么就应存在4×105特异克隆，则每次每个克隆（平均数）必须用1ml该液体，或用20ml液体除以因子20来代表每一个克隆。竞争选择的起始OD值为0.001，培养基体积为20ml。测定获得克隆的OD值以合适体积的培养基孵育。
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3.培养细胞至OD600位于0.1和1.0之间。取1等份试样（阶段1，或P1）加入新鲜培养基中孵育，再次计算代表的克隆数量。取出一部分用于单克隆分析，剩余部分冻存于-80℃。每一部分的终浓度不得超过1.0，因为细胞密度过高会导致培养基中复杂的代谢物浓度过高，细胞得不到DHFR而影响繁殖。我们通常获得在1到4阶段的细胞，这时其OD值大约为0.5。克隆可直接挑取，进行单个扩增、DNA测序。
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我们发现在第一或第二阶段之间，培养物的OD值不低于0.001。否则，在抗生素保持有效的时间内细菌不能生长。但是，在随后的一个阶段我们将OD值降至0.0005或0.0001，使克隆快速繁殖。原则上，如果产生的克隆数比较少，竞争选择可以在很小的体积中进行。但我们也可以用较大的体积来直接进行DNA测序和限制性分析。如果认为小体积很重要，那么每一阶段的产物可以铺板进行扩大培养，产生的克隆可用于分析。
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方案3：哺乳动物细胞DHFR PCA存活分析
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材料
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缓冲液和试剂
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腺苷（Sigma）
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脱氧腺苷（Sigma）
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滤过的胎牛血清（FBS）（10%）（Hyclone）
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脂质体试剂（Life Technologies）
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含有最少营养物质的培养基：不含核（糖核）苷和脱氧核（糖核）苷的培养基（α-MET）（Life Technologies）
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胸（腺嘧啶脱氧核）苷（Sigma）
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胰岛素-EDTA（Life Technologies）
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专用设备
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克隆环（Scienceware）
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培养板（6孔和12孔的组织培养板）（Corning Costar）
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方法
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相互作用蛋白对的进一步分析
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5.用克隆环通过胰蛋白酶消化（作用）（胰岛素-EDTA）将每个相互作用蛋白质分离出3～5个克隆，并让它们单独生长。
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6.用免疫印迹（Western blot）或DHFR PCA荧光分析选择表达最好的克隆（见方案4）。利用甲氨蝶呤的抗性对表达的基因进行扩增，如果结果好，会得到表达量增加的克隆（Kaufman，1990）。
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7.用DHFR PCA荧光分析（方案4）对稳定表达融合有DHFR互补片段的相互作用的蛋白质的克隆进行功能验证。
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方案4：哺乳动物细胞DHFR PCA荧光分析
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材料
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缓冲液和试剂伯
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乐公司的蛋白质分析试剂（Bio-Rad）
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Cosmic小牛血清（Hyclone）
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二甲基亚砜（DMF）〈！〉
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DMEM（Life Technologies）
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Dulbecco’s磷酸盐缓冲液（PBS）（Life Technologies）
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荧光连接的甲氨蝶呤（fMTX）（Molecular Probes）〈！〉
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Geltol 水性封固剂（Immunon）
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脂质体Plus试剂（Life Technologies）
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含有最少营养物质的培养基：不含核（糖核）苷和脱氧核（糖核）苷的培养基（α-MET）（Life Technologies）
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胰岛素-EDTA（Life Technologies）
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细胞
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COS
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CHO DUKX-B11
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载体
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pcDNA3.1哺乳动物细胞表达质粒（Invitrogen）
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专用设备
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Black microtiter plates（96孔）（Dynex no.7805，VWR Scientific）
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微型盖玻片（18mm，no.2）（VWR Scientific）
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显微镜载玻片（玻璃，25mm×75mm×1.0mm）
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Microtiter plates reader（PerKin-Elmer HTS7000 Series BioAssay Reader）
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培养板（12孔组织培养板）（Corning Costar）
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方法
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荧光显微镜
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瞬时转染细胞：
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1.转染24h前，将COS细胞（这一分析可用任何其他细胞系）分散于12孔培养板的18mm圆形盖玻片上，每孔至少含1×105个细胞，培养基为DMEM并含有10%的Cosmic小牛血清。
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荧光DHFR PCA分析是一种应用广泛的分析方法，理论上可应用于任何细胞类型或生物体。这个分析已经在许多哺乳动物细胞系、植物细胞和昆虫细胞中应用。
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2.根据使用指南中的方法用脂质体将含有PCA融合的相互作用蛋白质的哺乳动物细胞表达质粒（pcDNA3.1，Invitrogen）瞬时转染细胞。
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DHFR PCA融合的最好定位是：蛋白质A- DHFR ［1，2］+蛋白质B-DHFR［3］或DHFR ［1，2］-蛋白质A+蛋白质B-DHFR［3］，其中的蛋白质A和B是待测的相互作用蛋白质。我们在待测的两个蛋白质和两个DHFR片段（都用于融合）之间插入了10个氨基酸的多肽链接头，氨基酸序列为（Gly-Gly-Gly-Gly-Se）2-DHFR ［1，2］相对应于鼠的DHFR的1—105位氨基酸，DHFR［3］相对应于106—186位氨基酸。我们用的DHFR ［1，2］中在31位上含有一个突变，苯丙氨酸突变为丝氨酸（F31S），使重建的DHFR具有对甲氨蝶呤（MTX）的抗性。我们通常用pcDNA3.1作为哺乳动物细胞表达载体（Invitrogen）。
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3.第二天，更换培养基加fMTX于细胞中，终浓度为10μmol/L。
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1mmol/L fMTX储液配制方法：将1mg fMTX溶于1mlDMF中。为了促溶，将液体在37℃孵育15min，每5min混匀一次。避光-20℃保存。
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稳定细胞系：
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为使CHO DUKX-B11细胞（或其他细胞系）稳定表达PCA融合的相互作用蛋白质，将细胞分散于12孔培养板的18mm盖玻片上，每孔至少含2×105个细胞，培养基为α-MEM并含有10%滤过的FBS。第二天加fMTX于细胞中，终浓度为10μmol/L。
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4.用fMTX在37℃孵育细胞22h，撤离培养基，并用1×PBS清洗细胞。在37℃于培养基中重新孵育15～20min，洗掉未结合的fMTX。撤离培养基，在冰上用预冷的1×PBS清洗细胞4次。最后，将水溶性的培养基滴在载玻片上，并在其上面盖上盖玻片。
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融合到蛋白质或肽上的DHFR互补片段在细胞内表达并重组后将会与fMTX发生高亲和力的结合（Kd=540pM），结合比例为1∶1。通过这一复合物fMTX将被保留在细胞中，而未被结合的fMTX将很快转移出细胞。
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5.用荧光显微镜观察活细胞。
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到目前为止，所有的报道都是用活细胞（Remy and Michnick，1999，2001；Remy et al.，1999）。尽管细胞可以被固定，但观察到的荧光会显著降低。
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显微镜观察必须在清洗步骤后30min内完成。如果阴性对照（用fMTX处理的未转染细胞）中荧光过高，应改变清洗程序。
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添加fMTX和选择清洗程序时必须要十分注意。重要的参数包括：添加fMTX的时间，每次清洗过程的温度，清洗的次数和每次清洗的时间，清洗步骤和检测步骤之间的时间间隔。过少的清洗会使背景过高，无法与阳性结果区分开。检测结果同样会因为平铺细胞的方式和细胞类型的不同而变化。总之，正如其他的荧光显微镜分析过程一样，改变细胞的形态或荧光的定位都会使结果发生或好或坏的变化。对稳定的细胞系来说，荧光的强度也要依赖融合蛋白的表达水平而定。
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6.fMTX的荧光很快会消失（15s内）；因此在拍摄图像前不要花费太多的时间扫描细胞。而且，一旦检测到绿色荧光蛋白，就应该在0.5～4s内曝光拍摄细胞图像。
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其他荧光染色剂——连有MTX的荧光染料近来已有商品化产品出售，但其结果还有待于进一步验证。用这些染料时，上样的条件及细胞清洗的步骤还需要进一步优化。与Alexa Fluor-、BODIPY-和Texas Red-MTX相连的染料由Molecular Probes Inc.公司出售。尽管它们与荧光素相比产生的荧光团数量较低，但他们产生的荧光持续时间较长，因此细胞可在较长的时间内被观察。
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流式细胞计数分析
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做FACS时准备细胞的方法与做荧光显微镜时准备细胞的方法相同，除了在步骤4最后一次用1×PBS清洗细胞后（这里只洗两次），细胞要小心地用胰蛋白酶消化（胰岛素-EDTA），重悬于500μl预冷的1×PBS，FACS分析前在冰上放置30min。数据可由FACS分析器进行收集，需要氩激光在488nm处激发，通过525nm带宽的滤波器发射荧光，进行记录。
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荧光测定分析
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荧光测定时准备细胞的方法与做荧光显微镜时准备细胞的方法相同，除了在步骤4最后一次用1×PBS清洗细胞后（这里只洗两次），细胞要小心地用胰蛋白酶消化（胰岛素-EDTA）。平板放在冰上，并加入100μl预冷的PBS，全细胞悬浮液转移到96孔板上，荧光测定分析前，放于冰上。这一分析可以在任何荧光微滴定平板数据读取器上进行，我们使用的是荧光模式下Spectra MAX GEMINI XS（Molecular Devices）Reader。fMTX的激发和发射波长分别为497nm和516nm。最后，数据转化为细胞裂解液中的全蛋白浓度（伯乐蛋白质分析仪）。
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方案5：GFP PCA荧光分析
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材料
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缓冲液和试剂
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伯乐蛋白质分析试剂
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Cosmic小牛血清（Hyclone）
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DMEM（Life Technologies）
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Dulbecco’s磷酸盐缓冲液（PBS）（Life Technologies）
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Geltol 水性封固剂（Immunon）
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脂质体试剂（Life Technologies）
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胰岛素-EDTA（Life Technologies）
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专用设备
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Black microtiter plates（96孔）（Dynex no.7805，VWR Scientific）
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FACS分析仪
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荧光显微镜设备
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微型盖玻片（18mm，no.2）（VWR Scientific）
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显微镜载玻片（玻璃，25mm×75mm×1.0mm）
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微滴定板计数器（PerKin-Elmer HTS7000 Series BioAssay Reader）
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培养板（12孔组织培养板）（Corning Costar）
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方法
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所有用于DHFR PCA荧光分析的程序都与GFP PCA的分析方法相同，除了在GFP PCA分析中不用fMTX，而且没有清洗步骤。因为折叠后的重组蛋白有自发的荧光，所以清洗程序在GFP PCA分析中并不重要。
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方案6：体外β-内酰胺酶PCA比色分析
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材料
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缓冲液和试剂
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Cosmic小牛血清（Hyclone）
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DMEM（Life Technologies）
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Dulbecco’s磷酸盐缓冲液（100mmol/L）（Life Technologies）
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Fugene 6转染试剂（Roche Diagnostics）
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Nitrocefin（10nmol/L）（Becton Dickinson Microbiology Systems）
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胰岛素-EDTA（Life Technologies）
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质粒和细胞
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COS或HEK 293细胞
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pcDNA3.1哺乳动物细胞表达质粒（Invitrogen）
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专用设备
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微滴定板计数器（PerKin-Elmer HTS7000 Series BioAssay Reader）
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培养板（12孔组织培养板）
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培养板（96孔）（Corning Costar）
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方法
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1.转染24h前，将COS细胞或HEK 293细胞（这一分析可用任何其他细胞系）分散于12孔培养板中，每孔至少含1×105个细胞，培养基为DMEM并含有10%的Cosmic小牛血清。
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2.根据使用指南中的方法用Fugene 6转染试剂将含有PCA融合的相互作用蛋白质与β-内酰胺酶相连的哺乳动物细胞表达质粒（pcDNA3.1，Invitrogen）瞬时转染细胞。
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β-内酰胺酶 PCA融合的最好定位是：蛋白质A- BLF ［1］+蛋白质B-BLF［2］或BLF［1］-蛋白质A+蛋白质B-BLF［2］，其中的蛋白质A和B是待测的相互作用蛋白质。我们在待测的两个蛋白质和两个β-内酰胺酶片段（都用于融合）之间插入了15个氨基酸的多肽链接头，氨基酸序列为（Gly-Gly-Gly-Gly-Ser）3-BLF［1］相对应于TEM-1β-内酰胺酶的26—196位氨基酸，BLF［2］相对应于198-290位氨基酸。我们通常用pcDNA3作为哺乳动物细胞表达载体（Invitrogen）。
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3.转染48h后，用预冷的PBS清洗细胞3次，并将细胞重悬于300μl预冷的PBS，置于冰上。将细胞于4℃离心30s，倒掉上清，并将细胞重悬于100μl 100mmol/L预冷的PBS（pH7.4）中（β-内酰胺酶反应缓冲液）。
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4.将细胞样品在干冰/乙醇中冷冻10min并于37℃水浴保温10min。按此方法再反复冻融两次。4℃离心5min（10000g），去除细胞膜和细胞碎片。收集全细胞裂解液的上清并于-20℃储存待分析。
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5.在96孔分析板上进行分析。为检测β-内酰胺酶活性，在每孔中加入100μl 100mmol/L的PBS（pH7.4），78μl水，2μl 10mmol/L Nitrocefin（终浓度为100μmol/L）。最后，加入20μl未冻的细胞裂解液（步骤4）（缓冲的终浓度为60μmol/L）。
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这一分析可用任何型号的微滴板读取器。
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我们使用的是PerKin-Elmer HTS7000 Series BioAssay Reader，测定时吸收波长设定为492nm。
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方案7：体内β-内酰胺酶PCA酶活分析
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材料
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缓冲液和试剂
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CCF2-AM：1mmol/L 贮液于DMSO中〈！〉
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Cosmic小牛血清（Hyclone）
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DMEM（Life Technologies）
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Dulbecco’s磷酸盐缓冲（PBS液）（Life Technologies）
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Fugene 6转染试剂（Roche Diagnostics）
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正常盐溶液
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140mmol/L NaCl
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5mmol/L KCl〈！〉
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2mmol/L CaCl2
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10mmol/L HEPES
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6mmol/L蔗糖
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10mmol/L葡萄糖（pH 7.35）
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生理盐溶液
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10mmol/L HEPES
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6mmol/L蔗糖
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10mmol/L葡萄糖
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140mmol/L NaCl
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5mmol/L KCl〈！〉
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2mmol/L MgCl2
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2mmol/L CaCl2（pH 7.35）〈！〉
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胰岛素-EDTA（Life Technologies）
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质粒和细胞COS或HEK 293细胞
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pcDNA3.1哺乳动物细胞表达质粒（Invitrogen）
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专用设备
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荧光显微镜设备（见下面步骤7的注释）
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盖玻片（5mm）
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微滴定板计数器（PerKin-Elmer HTS7000 Series BioAssay Reader）
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培养板（12孔组织培养板）（Corning Costar）
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白色微滴定板（96孔）（Dynex no.7905，VWR Scientific）
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方法
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体内酶分析
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6.用生理盐溶液清洗细胞2次。将细胞重悬于同样的溶液中，并将1×106个细胞平均分散于96孔荧光白板中。
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这一分析可用任何型号的微滴板读取器，我们用的是荧光模式下的Spectra MAX GEMINI XS（Molecular Devices）reader。蓝色荧光在409nm处被激发，在465nm处发射。
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荧光显微镜
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7.用生理盐溶液清洗细胞2次。在显微镜下直接观察细胞。
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我们用倒置Nikon Eclipse TE-200（objective plan fluor 40×dry，数字为0.75）荧光显微镜观察活的HEK 293或COS细胞。图像由数码冷CCD（-50℃）照相机拍摄，型号为Orca-Ⅱ（Hamamatsu Photonics；曝光1s，binning为2×2，digitalization 14 bits，1.25MHz）。光源为Xenon 灯DG4型号（Sutter Instruments）。发散滤波器通过发散滤波器转换器进行转换（model Quantoscope）（Stranford Photonics）。图像可由Silicon Graphics O2计算机上的ISee软件进行观察（Inovision Corporation）。下面所选择的滤波器为：滤波器#31016（Chroma Technologies）；激发滤波器：405nm（可通过20nm的波带）；Dichroic Mirror：425nm DCLP；激发滤波器#1：460nm（可通过50nm的波带）；激发滤波器#2：515nm（可通过20nm的波带）。
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方案8：新霉素和潮霉素B存活分析
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材料
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缓冲液和试剂
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F-12培养基（Life Technologies）
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胎牛血清（FBS）（Hyclone）
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G418（400μg/ml）
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潮霉素B（250μg/ml）
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脂质体试剂（Life Technologies）
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胰岛素-EDTA（Life Technologies）
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质粒和细胞
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CHO细胞
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pcDNA3.1哺乳动物细胞表达质粒（Invitrogen）
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专用设备
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克隆环（Scienceware）
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培养板（6孔和12孔的组织培养板）（Corning Costar）
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方法
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相互作用蛋白质对的进一步分析
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5.用克隆环通过胰蛋白酶化（作用）（胰岛素-EDTA）将每个相互作用蛋白质分离出3～5个克隆，并让它们单独生长。
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6.用免疫印迹（Western blot）选择表达最好的克隆。进行扩增，如果结果好，用任何标准的实验方法，会得到表达量增加的克隆。
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||
26 基于cAMP信号级联的一种细菌双杂交系统
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前言
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以细菌腺苷酸环化酶为基础的双杂交系统原理
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我们开发的细菌腺苷酸环化酶为基础的双杂交（BACTH）系统基于Bordetella pertussis 的AC毒素催化结构域两个互补片段之间的功能互补（Karimova et al.，1998），Bordetella pertussis是百日咳的病原体（见框中与Weiss and Hewlett，1986；Ladant and Ullmann，1999）。
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BORDETELLA PERTUSSIS 的腺苷酸环化酶。
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B.pertussis是百日咳的病原体，分泌各种各样的毒素，其中一种钙调蛋白激活的腺苷酸环化酶（CyaA）是此微生物一个主要的致病因子。此毒素由毒性细菌分泌并有进入真核细胞的能力，在真核细胞中被真核蛋白钙调蛋白（CaM）激活，合成超生理量的cAMP，接着改变了细胞的生理状态（评论见Weiss and Hewlett，1986；Ladant and Ullmann，1999）。
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CyaA毒素由cyaA 基因编码，是一个1706残基长的双功能蛋白质，赋有AC和溶血活性（Glaser et al.，1988）。催化结构域位于前400个氨基酸，羧基端的1306残基负责毒素与真核细胞的结合和它进入这些靶细胞。另外，分子的羧基端有在生物膜上形成阳离子选择性通道的能力。CyaA羧基端部分表现几种特性，这些特性是被称作RTX（repeat in toxin）的细菌溶细胞素家族的特征，RTX的原型是E.coli 的α-溶血素（Ladant and Ullmann，1999）。
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我们利用了此酶的两个特点：
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1.AC产生一种调控分子cAMP，在E.coli 中是基因转录的一个多效性调节子。在E.coli 中cAMP是一种关键的信号分子（见下面的框中），能结合转录激活子CAP（分解代谢物激活剂蛋白）。cAMP-CAP复合体控制许多基因的表达（Ullmann and Danchin，1983），包括与糖类分解代谢如乳糖和麦芽糖有关的基因（lac或mal）（图26.1，下面部分）。和Cya+细菌相比，内源腺苷酸环化酶（cya）缺陷的E.coli 菌株不能发酵这些糖类。在指示培养基或选择培养基上可以很容易的区分Cya-和Cya+细胞（Ullmann and Danchin，1983；Miller，1992）。
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图26.1 细菌双杂交系统的原理
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cAMP，E.coli 中基因表达的一个多效性调节子
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1965年Makman和Sutherland在E.coli 细胞中鉴定出cAMP，在1968年Ullmann和Monod发现能克服分解代谢物阻抑。进一步研究cAMP在E.coli 中的作用机制导致了cAMP受体蛋白的发现，也称作分解代谢物激活剂蛋白（CAP），由crp 基因编码；还鉴定了编码腺苷酸环化酶的cya 基因，该酶负责cAMP合成。随后发现cAMP-CAP复合体通过结合几种分解代谢基因或操纵子转录起点附近的位点促进分解代谢操纵子基因表达并激活它们的转录。CAP是一个二聚体，209个残基的每个单体有一个cAMP结合位点。CAP二聚体和两分子cAMP形成的复合体的晶体结构被Steitz和同事们解析（Schultz et al.，1991）。CAP有一个模块结构：氨基端结构域结合cAMP，羧基端结构域带有一个螺旋—转角—螺旋结合DNA的基序。在E.coli 中cAMP-CAP通过结合位于RNA聚合酶（RNAP）结合位点上游专一的DNA位点，激活超过100个启动子的转录。转录激活和CAP与RNAPα亚单位间的相互作用有关（评论见Ullmann and Danchin，1983；Kolb et al.，1993；Busby and Ebright，1999）。
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2.AC催化结构域有两个互补片段构成的模块结构，都是催化活性所必需的。AC催化结构域由B.pertussis的cyaA 基因前400个密码子编码（Galster et al.，1988）。在它的激活剂——真核蛋白钙调蛋白（CaM）存在时表现高催化活性（kcat=2000～5000s-1），激活剂不存在时表现残留但可以检测到的活性（kcat=1～2s-1）（Ladant et al.，1989）。催化结构域有一个模块结构：含有两个互补的片段T25和T18，最初通过有限蛋白酶解研究鉴定（Ladant et al.，1988）。T25和T18片段在体外能结合CaM形成完全激活三元复合物形式。T25（1～224残基）带有催化位点，而T18（225～399残基）含有主要的CaM结合结构域。两个片段对重建一个完全活性的酶都是必要的（图26.1A）（Ladant et al.，1989）。
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在E.coli 中AC的催化结构域是有功能的。虽然像大多数的原核生物一样，此细菌并不产生钙调蛋白，不过AC残留的不依赖于CaM的活性足以催化cAMP合成。因此在一个E.coli 的cya 菌株中表达时，AC能产生Cya+的表型（图26.1A）（Ladant et al.，1992）。
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当两个AC片段T25和T18在E.coli的cya 中作为分离的实体共表达时，它们不能相互识别，也不能重建一个有功能的酶（图26.1B）（Karimova et al.，1998）。但是当T25和T18片段融合到能相互作用的多肽或蛋白质时，这些嵌合多肽的异源二聚化导致功能互补，因此合成cAMP（图26.1C）（Karimova et al.，1998）。表达能异源二聚化嵌合蛋白的细菌将表现容易检测的Cya+表型。
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程序纲要
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杂合蛋白的表达载体
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蛋白质相互作用的遗传筛选需要共表达两个杂合蛋白。为此目的，两个相容的质粒必须在同一受体cya 细菌中增殖，一个表达T25融合蛋白而另一个表达T18融合蛋白（图26.3）（Karimova et al.，1998，2001）。
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图26.3 示意图表示表达杂合蛋白的质粒pT25、pKT25、pUT18和pUT18C
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1.编码T25片段的有两个载体。pT25是低拷贝质粒pACYC184的衍生物，表达氯霉素抗性选择标记；pKT25是低拷贝质粒pSU40的衍生物，表达卡那霉素抗性选择标记。两个质粒都编码在一个lac 启动子转录和翻译调控下的T25片段（包含B.pertussis 的cyaA 基因前224个密码子）。在T25的3′端有一个多克隆序列，用于在T25羧基端构建符合读框的融合蛋白（图26.3）。
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2.类似地，编码T18片段也有两个载体pUT18和pUT18C。两个质粒都是pUC19的衍生物，表达氨苄青霉素抗性的选择标记。它们编码在一个lac 启动子转录和翻译调控下的T18片段（cyaA 基因225—399编码），与pUC19多克隆序列的读框相符。在pUT18中，多克隆序列在T18开放读框的上游，而在pUT18C中，多克隆序列在T18开放读框下游。因此，同一异源多肽既能被融合到T18的氨基端，又能融合T18的羧基端（图26.3）。
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编码目的蛋白的基因通常用适当的引物PCR扩增，并用标准的分子生物学的技术亚克隆到BATCH载体上（Sambrook et al.，1989；Sambrook and Russell 2001，Molecular Cloning，第8章）。载体和重组质粒在标准的E.coli 的K12菌株如XL1-Blue，DH5α，HB101等30℃增殖。一般根据制造者的说明用QIAprep Spin小量制备系统纯化质粒DNA（QIAprep Miniprep Handbook，1999）。
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细菌菌株
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用BACTH系统测定体内的蛋白质相互作用使用不同的E.coli 的cya 菌株，DHM1（F-，recA1，endA1，gyrA96（Nal），thil，hsdR17，spoT1，rfbD1，glnV44（AS），cya -857）和BTH101（F-，araD139，galE15，galK16，rpsL1（Str），hsdR2，mcrA1，mcrB1，cya-99）。两个杂合蛋白间的功能互补在BTH101中比DHM1中稍微更有效。虽然我们发现杂合蛋白间的互补效率可能差别很大，原则上其他已知的E.coli 的cya菌株也可以用于试验，与使用的cya 菌株的背景有关（可能因为杂合蛋白的稳定性差异）。
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试验细菌的转化
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用标准的CaCl2技术（Sambrook and Russell，2001，Molecular Cloning，pp.1.116～1.118）或电穿孔法（精确的方法见Sambrook et al.，1989，Sambrook and Russell，2001，Molecular Cloning，pp.1.119～122，16.54～16.57）转化BTH101和DHM1细菌。要准备感受态细胞，首先重新划线菌株到MacConkey/麦芽糖或LB-X-gal培养基上，选择一个新鲜的Cya-菌落（在这些培养基上是白色表型）接种液体前培养基。可以用表达T25和T18融合蛋白的质粒同时转化感受态细胞，特别是想在指示培养基上测定功能相互作用时（见下面）。另外在文库筛选时，应该首先用一种类型的质粒（编码诱饵杂合蛋白）转化E.coli 的cya 细胞，然后用这些细菌制备感受态细胞以增加第二次转化的效率，能最大化共转化子数目。
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筛选相互作用子
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测定两个特定的杂合蛋白间功能相互作用，最容易和最快的方法是把共转化子涂到指示培养基上。在30℃培养24～72h后Cya+菌落能被检测到，依赖于功能互补的效率。注意功能互补在37℃不如30℃有效，可能是因为在高温时杂合蛋白更不稳定。
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可用两种类型的指示培养基（Miller，1992）；见材料部分中准备这些培养基的精确方法。
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1.LB-X-gal培养基：在E.coli 中，编码β-半乳糖苷酶的lacZ 基因的表达受cAMP/CAP正调控。因此在含有发色底物X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖吡喃糖苷）的丰富Luria-Bertani（LB）培养基上表达相互作用杂合蛋白的细菌将形成蓝色菌落，而表达不相互作用蛋白质的细胞将保持白色。应该在培养基中加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）增加β-半乳糖苷酶的表达。
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2.MacConkey培养基：AC缺陷的细菌不能发酵乳糖或麦芽糖：它们在含有乳糖或麦芽糖（1%）的MacConkey指示培养基上形成白色菌落，而Cya+细菌在这些培养基上形成红色菌落（添加糖的发酵导致培养基的酸化，染料酚红表现颜色的变化）。如果杂合蛋白相互作用，在MacConkey/麦芽糖上菌落应该是红色表型，如果没有相互作用发生所有的菌落应该是无色的。
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选择表达相互作用杂合蛋白的细胞
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在一群非相互作用的多肽中，鉴定可能与特定的诱饵蛋白相互作用的多肽，用一种筛选方法是最方便的。因为Cya+细胞是Lac+，它们能在乳糖作为惟一碳源的基本培养基上生长。因此，表达相互作用杂合蛋白的细菌能在一个标准合成的培养基上［M63（加维生素B1）加入0.4%乳糖］选择。在用目的质粒转化后，应该用M63培养基洗细胞至少3次，用于去除在转化步骤中的所有痕量丰富培养基。在一个M63/B1/乳糖平板上（加适当的抗生素）能铺高达106细胞。30℃培养5～8d后会检测到Lac+菌落的生长。也能在培养基中加入X-gal底物以利于早期检测Lac+菌落。实际上，生长的Lac+菌落有两种不同的类型：表达相互作用杂合蛋白真正的阳性细胞和由于内源突变（一般是启动子上调）获得Lac+表型的假阳性细胞。后者的发生频率是10-7～10-8。
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方案
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方案1：功能互补的数量测定
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材料
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细菌菌株〈！〉
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DHM1（F-，recA1，endA1，gyrA96（Nal），thil，hsdR17，spoT1，rfbD1，glnV44（AS），cya -854）
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BTH101（F-，araD139，galE15，galK16，rpsL1（Str），hsdR2，mcrA1，mcrB1，cya -99）
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BACTH载体
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载体的构建见Karimova等的报道（1998，2001）。
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T18融合蛋白的表达载体：pUT18，pUT18C
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T25融合蛋白的表达载体：pT25，pKT25
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生长培养基
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分子克隆手册：蛋白质—蛋白质相互作用
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分子克隆手册：蛋白质—蛋白质相互作用
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其他试剂
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牛血清白蛋白（BSA）
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二甲基甲酰胺（DMF）〈！〉
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N-乙氧基-羰基-2-羟乙基-1，2-二氢喹啉（EEDQ；Sigma）
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HEPES-Na（pH7.5）
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O2′-单琥珀酰-3′：5′环磷腺苷酸（O2′-Suc-cAMP；Sigma）
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NaCl（100mmol/L）
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Na2CO3（0.1mol/L，pH9.5）〈！〉
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Na2CO3（1mol/L）
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ONPG
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5′对硝基苯磷酸
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放射免疫测定或ELISA试剂盒
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甲苯〈！〉
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方法
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分析测定
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β-半乳糖苷酶测定用指数生长细胞或过夜培养物（详见Karimova et al.，2000）。
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1.每2～3ml细胞悬液加入一滴甲苯和一滴0.1%SDS溶液透化处理细菌。
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2.涡旋管10s，放入一个振荡器中，用棉花轻轻塞住让甲苯蒸发，37℃30min。
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3.加入一份透化处理的细胞（0.1～1ml）到测定培养基PM2缓冲液中，到终体积2ml。
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4.28℃平衡管，每管加入0.5ml底物ONPG（用PM2缓冲液溶为4mg/ml，不加β-巯基乙醇）开始反应。在产生了足够的黄色后，加入1ml1mol/L Na2CO3溶液终止反应。
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5.每管纪录420nm光密度值。反应线性上升到吸光度1.6。
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420nm的读数合并了邻硝基酚和细胞碎片光散射的吸光度。如果用小体积的细胞悬液并且420nm读数高于0.3，后者可以被忽略。低吸光度时，在600nm测同一反应混合物的吸光度，光散射可以用校正因子OD420-1.5×OD600以校正来补偿光散射。用邻硝基酚在pH11用摩尔吸收系数5计算酶活性。1u的β-半乳糖苷酶活性相当于28℃每分钟水解1nmol的ONPG。结果通常用u/mg干重细菌表示。用600nm读数得出，1mg干重细菌相当于约2×109细菌/ml。其他方法见Sambrook等（1989），Sambrook和Russell（2001），Molecular Cloning，pp.17.97～17.98和Miller（1992）。
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用ELISA测量cAMP
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1.用cAMP-BSA偶联物（见下面）覆盖ELISA板，用BSA封闭非特异的蛋白质结合位点。
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2.加入煮沸的细菌培养物，接着加入用50mmol/L HEPES（pH7.5）、150mmol/L NaCl，和含有10mg/mlBSA 的0.1% 吐温-20（HBST缓冲液）稀释的兔抗cAMP抗血清。4℃温育过夜，然后用HBST洗板。
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3.加入偶联了碱性磷酸酯酶（AP）羊抗兔的IgG，30℃温育1h。
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4.漂洗然后加入5′-对硝基苯磷酸显示AP活性。
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用LB培养基稀释已知浓度的cAMP建立标准曲线，用标准曲线计算cAMP浓度。
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准备cAMP-BSA偶联物如下
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1.加入75μl用DMF溶的100mg/mlEEDQ溶液到500μl用100mmol/L HEPES-Na（pH7.5）溶解的O2′-Suc-cAMP溶液中。
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2.室温温育45min，然后加入500μl BSA溶液（用200mmol/L HEPES-Na，pH7.5溶解为1mg/ml）。
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3.室温温育过夜，然后用10mmol/L HEPES-Na（pH7.5）、100mmol/L NaCl透析混合物。
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4.用覆盖缓冲液（0.1mol/L Na2CO3，pH9.5）稀释透析液5000～10000倍（用实验确定最佳的稀释度）用于覆盖，ELISA板的每个孔中加入50μl。
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测定cAMP的商品化的放射免疫测定或ELISA试剂盒可从很多制造商处购买。
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结论
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我们和不同的研究组分析了大量的不同的肽或蛋白质间的多样的相互作用（Karimova et al.，1998，2000；Moreno et al.，2000），使该系统得到了验证。此系统对于研究蛋白质结构与功能的关系和鉴定一个特定多肽的可能的伴侣是有用的。这是一个容易使用的遗传系统：检测两个多肽间的体内相互作用只需要几个遗传的构建，在几天内就能得到结果。一旦两个杂合蛋白相互作用，然后可能用此系统在分子水平上鉴定蛋白质—蛋白质相互作用的界面。我们证明此系统能用来鉴定一个特定相互作用的关键氨基酸残基（Karimova et al.，2001）。鉴定这样的突变可能会阐明特定相互作用的分子基础以及提供研究蛋白质—蛋白质结合生理含义的实验工具。
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此技术的一个可能的缺点是，在一些情况下，尽管真正相互作用的杂合蛋白能表达，但菌落却表现Cya-表型（称作假阴性）。因为功能互补依靠AC片段间的空间接近，可能在特定的情况下，由于多肽移植到T25和T18引起的空间紧张能减少甚至消除重建复合体的AC酶活性（例如如果融合的T25和T18在空间上离得太远以至于不能正确相互作用）。确实我们观察到，融合到不同的T18片段末端的同一个相互作用的多肽杂合蛋白的互补效率有很大的不同（Karimova et al.，2001）。因此，两个杂合蛋白没有功能互补不一定表示两个蛋白质不能结合。事实上，所有的双杂交方法都有这点内在的局限性。将来的工作会对此系统的柔性和耐受性有更多的了解。
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我们期待着这个细菌双杂交系统能成为酵母双杂交系统好的补充工具，能在功能基因组学中鉴定一个基因组范围规模的基因产物间的相互作用网络中得到应用。也应该在药物开发和鉴定能干扰特定的蛋白质—蛋白质相互作用的复合物的高通量筛选组合文库中得到应用。
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参考文献
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27 肽适配子与蛋白质功能和蛋白质网络系统研究
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前言
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从随机肽库中选取的肽已成为研究蛋白质功能、鉴定和选取有效新药靶标的重要手段，其重要性体现在大量肽分子可使许多特定功能蛋白在活体状态下失活。例如，肽与靶蛋白分子特异结合而阻碍靶蛋白分子同其他分子的相互作用。操作上可将活体状态控制表达这些肽或者直接注射导入细胞使功能蛋白性状消失，使用此类反向遗传学方法研究这些目的蛋白基因失活的表型后果对研究目前已有成千上万基因在他们的功能无法阐明情况下是极为重要的，其中大量的基因需要通过他们编码蛋白质相互作用发生的生物学过程去阐述各自性质，这就需要将蛋白质网络中某一重要成员失活从而摧毁它与其他成员间的联络，而研究工具之一就是近年来许多研究中初见成效的肽分子。
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现在选取肽适配子时有两种方案：其一是从随机肽库中遴选出促进某种生物学性质表达或增强性状表现的肽（Caponigro et al.，1998；Geyer et al.，1999；Norman et al.，1999；Blum et al.，2000）。在这些研究中这类肽因为扰乱某些生物学过程被冠以干扰剂（Perturbagen）的名称（Caponigro et al.，1998）。其二是从相互作用中直接选取与靶蛋白结合的肽类，这类特异蛋白结合肽称为“适配子”（aptamer）（Colas et al.，1996）。“干扰剂”和“适配子”的界定并不明确，因为有的适配子可以是干扰剂，反之也一样。例如有些肽适配子可以阻碍其目标靶蛋白的功能而可用作显性活化干扰剂；有的干扰剂在其相互作用结合的靶蛋白被阐明时可被认为是肽适配子。在细胞内发现肽干扰剂的靶蛋白往往是可以实现的，本章将讨论如何选取用作干扰剂的肽适配子，重点介绍应用酵母双杂交系统鉴定、阐明肽适配子。
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肽适配子作为表型分析试剂
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了解一个基因或其蛋白质功能最有效的方法之一是研究存在此基因突变产生功能丧失的某种器官，需要构建基因突变子的某些遗传学模型。功能丧失突变子的研究仅限于少数模型生物体系，包括酵母、果蝇、线虫以及难度较大的小鼠和培养脊椎动物细胞系。另一个获得功能丧失突变子的方法是将一试剂导入一个野生型细胞或生物体而显著抑制某基因功能，由基因失活产生的表型通常可模拟功能丧失性状（Herskowitz，1987）。
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近年来，相继产生了几种有效的研究方法，如反义核酸、核酶、RNA干涉或RNAi（Izant et al.，1984；Cech，1987；Zhao and Pick，1993；Fire et al.，1998），在存活细胞中表达或者直接导入这些试剂的目的就是减弱或消除某一特异靶蛋白的表达，反义RNA或反义核酸通过碱基互补方式与相应基因mRNA作用从而抑制靶蛋白的表达（Izant et al.，1984），RNAi则是通过导入双链RNA分子引起细胞内同源mRNA快速和全面降解（Fire et al.，1998；Carthew，2001）。其作用可以从一种组织蔓延到另一组织甚至随着繁殖传代而保持（Fire et al.，1998；Grishok et al.，2000）。尽管这些手段在某些应用中体现出其优势，但要在时间和空间上控制某种基因使其表达失活仍有一定困难。
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像RNAi和反义技术的核酸类抑制剂的目标是使生物学通路中个别基因成员特异失活，往往产生功能完全丧失或零突变表型，因此它可以指明基因在此通路上其产物所具有的功能；可是有时某种蛋白质本身常产生多种生物学功能，它在某通路或复合体中的作用常通过与一种或几种其他蛋白质相互关联而完成，而任何其中的一种关联将是此蛋白质整个生物学功能的一部分，因此分析每一蛋白质与其他蛋白质相互作用对了解其在通路或复合体中的作用很重要。蛋白质个体相互作用的功效可用阻断两个蛋白质关联同时不妨碍蛋白质与其他相互作用的试剂来阐明，例如肽适配子（见图27.1），肽适配子作为蛋白质相互作用阻遏物能特异结合在蛋白质表面封闭蛋白质分子间相互作用部位，在了解蛋白质的功能上比消除整个蛋白质表达的研究方法能提供更详细的信息。
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图27.1 蛋白质和肽适配子作用示意图
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在研究细胞间蛋白质之间相互作用中有两类适配子：肽和RNA。RNA适配子能特异识别并结合另一类分子如蛋白质（Ellington and Szostak，1990）。同抗体分子或肽适配子相似，一个RNA适配子也能作用于靶蛋白而抑制其功能，这类抑制型RNA适配子（iaRNA）在胞内研究蛋白质功能很有应用前景。具有肽适配子的优点和作用特点，同时能在胞内表达（Shi et al.，1999）。但肽适配子具有另外一个特点：比RNA分子能在更大范围的亚细胞部位和靶蛋白作用，同样能以融合表达方式在胞内表达（Colas et al.，2000）。
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应用酵母双杂交系统选取肽适配子
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通过酵母双杂交系统选取的肽适配子具有高度特异性，能应用于细胞中靶定某些蛋白质和研究蛋白质之间的相互作用。酵母双杂交系统最初是设计用于从cDNA文库中寻找已知蛋白质的其他可能相互作用蛋白质分子（Fields and Song，1989；Chien et al.，1991）。在双杂交系统中，靶蛋白为“诱饵”，与酵母转录因子如Gal4或细菌转录因子LexA的DNA结合域DBD融合在细胞内表达，文库中未知相互作用的蛋白质则和转录因子的活化结构域AD融合表达，文库蛋白质和诱饵蛋白的作用将导致报告基因表达。报告基因通常是一个营养缺陷型标志，如酵母细胞的LEU2、HIS3、URA3或LYS2等。表达此类报告基因的酵母可在缺乏相应营养成分的培养基上生长。大多数双杂交系统还用第二报告基因，其表达可以通过定量测定，如LacZ或绿色荧光蛋白（GFP）。因此双杂交系统同样可以用于从随机肽库融合表达于AD基因中筛选和诱饵蛋白结合的肽分子（Yang et al.，1995；Colas et al.，1996）。
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其他检测蛋白质相互作用的方法也能用于筛选肽适配子（Smith，1985；Bunker and Kingston，1995；Roberts and Szostak，1997；Broder et al.，1998；Karimova et al.，1998；Joung et al.，2000；Zhang et al.，2000），但他们不具备酵母双杂交独有的特点：（1）检测系统中各组分性质明确，容易操作；已广泛应用于各cDNA文库的筛选，各种筛选方案均已成熟，能应用于肽库筛选。（2）特别是用于细胞内环境相互作用分析，各蛋白组分在细胞内表达比起体外分析更接近胞内环境的各种可变性，因此是正常胞内环境下蛋白质直接作用的肽适配子筛选的最佳选择。（3）大多数双杂交系统便于估测肽适配子与靶蛋白的亲和性，报告基因表达水平与DBD和AD之间亲和相互作用能力直接相关（Estojak et al.，1995）。（4）双杂交系统中报告基因的敏感性范围完全满足肽—蛋白质相互作用各亲和力的检测。（5）酵母筛选的胞内相互作用肽对真核细胞没有毒性，能进一步应用。
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Fields等（Yang et al.，1995）最先应用双杂交系统筛选随机肽库，首先将Gal4的AD和16个氨基酸的随机肽库基因融合表达，诱饵蛋白R6基因与Gal4的DBD融合，采用HIS3和LacZ双报告基因，然后从约3×106个转化子中选取了与R6蛋白相互作用的6条肽，使报告基因最强表达的肽与纯化重组Rb蛋白的作用亲和性随后通过合成肽与蛋白质表面等离子解析方法检测，测得亲和力为13～23μmol/L Kd（Yang et al.，1995）。这6条肽都有L×C×E的相同序列结构花色，与发现的其他细胞或病毒中Rb蛋白作用蛋白相似，表明可以通过比较获得的肽序列从蛋白质数据库中鉴定相互作用蛋白质成员。
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几乎同时，Brent等（Colas et al.，1996）建立了一套新的双杂交技术，将肽适配子表达在一分子平台上，即以环状（loop）线性肽形式表达于大肠杆菌硫氧还蛋白TrxA表面，TrxA是一个约11.6kD的球状可溶性蛋白质（Holmgren，1985），它的活性中心含两个半胱氨酸由Gly-Pro连接，通过将两个二硫醇还原逆转氧化反应。有人报道，在两个半胱氨酸中间插入多肽表达不会改变此酶的溶解性和稳定性（Lu et al.，1995），因此插入活性中心在TrxA蛋白表面表达外源肽在构象上应该是受约束且被限制的从而不影响具有一定刚性结构的活性中心的备完整功能。而后来实验证明在TrxA表面表达的肽能和其他蛋白质在胞外有很好的结合能力（Lavallie et al.，1993；Lu et al.，1995）。Brent和同事们认为TrxA可作为一个分子平台在细胞内产生构象约束肽分子，于是建立从TrxA-肽适配子库中筛选细胞内的特异蛋白质作用结合适配子。他们构建了随机20个氨基酸的肽库通过天然RsrⅡ酶切插入TrxA的两个半胱氨酸中表达，能产生109以上丰度的20肽库。
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为了检测TrxA-肽库能否被用于双杂交系统来分离高亲和特异性的肽适配子，Colas 等（1996）在人Cdk2融合LexA表达的酵母细胞中导入这一TrxA-肽库进行双杂交实验，从6×106转化子中分离获得14个与LexA-Cdk2相互作用的TrxA-肽适配子，通过将获得的适配子菌株与其他LexA菌株或Cdk2同源蛋白表达菌株交配实验证实了获得的适配子与Cdk2有高亲和性，分析显示6条肽适配子与Cdk2的亲和力Kd值范围为38～112nmol/L。
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上述实验可获得如下结论：（1）肽适配子和其他Cdk，包括与Cdk2具有66%同源性的Cdk1都没有相互作用，它们的结合特异性在其他靶蛋白的实验中获得了验证（Kolonin et al.，1998；Kolonin et al.，2000；Fabbrizio et al.，1999；Butz et al.，2000）。Ras蛋白的TrxA-肽适配子甚至能分辨由于等位突变产生相差一个氨基酸的变异蛋白（Xu et al.，1997）。（2）随机肽库含有丰富的对靶蛋白的结合识别序列信息，上述14条适配子互不相似，各代表14个不同的识别结构单元，也提示Cdk2蛋白的识别结构单元由约5个以上氨基酸构成。由4个氨基酸组成的识别单元在文库中呈现的几率是十万分之一（10-5），每个这种结构单元在6×106随机肽库中将筛选得到10次（个），5个以上氨基酸的结构单元肽筛选获得的频率将小于百万分之一（10-6）。（3）Cdk2适配子比上述pRb的适配子与其靶蛋白结合具有更高的亲和力，说明TrxA-肽库中因为肽构象约束而排除了构象高级结构识别，可能具有更好的亲和性。（4）TrxA-肽库中含有靶蛋白识别结构单元中新的在自然状态下不存在的结构。14条Cdk2的肽适配子与许多自然Cdk相互作用蛋白质没有明显相似性，另一个佐证是，在E2F结合6条TrxA-肽适配子中，1条显示与E2F结合蛋白有相似性（Fabbrizio et al.，1999），8条胞周素J（Cyclin J）的TrxA-肽适配子与Cyclin J几个结合蛋白没有相似性（Kolonin and Finley，2000）。
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显然这种结构单元多样性是上述6条pRb肽适配子所没有的，可能由于两种双杂交系统中的差异造成，TrxA-肽库和靶蛋白的相互作用蛋白质结构上无相似性（Butz et al.，2000），可以说TrxA-肽库和靶蛋白的相互蛋白质间极少具有同源性，似乎因为TrxA肽的构象被约束而限制。需指出的是，TrxA肽模拟抗体的识别表位采用的是E.coli 原核表达、胞外分析（Lu et al.，1995）检测。所以，TrxA-适配子双杂交筛选似乎不利于发现胞内同源结合蛋白。
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肽适配子有胞内抑制分子间相互作用分析的潜在应用价值，其应用研究尚需进一步开展。近年来使用TrxA-肽适配子双杂交筛选系统取得令人鼓舞的成果。Colas等的研究表明，Cdk2适配子在体外竞争性抑制Cdk2活性，对Cdk2结合抑制作用呈现底物依赖性（Colas et al.，1995），这条肽适配子在Saos-2细胞中表达时抑制了细胞进入分裂周期，当在果蝇胚胎细胞表达时体现眼发育障碍，这是Cdk2活性受到抑制后的性状表型（Kolonin et al.，1998；Cohen et al.，1998）。另外，E2F转录因子的一个Trx-适配子成功阻止了E2F和DNA的结合，推测E2F不能和DP1蛋白形成杂合二聚体造成（Fabbrizio et al.，1999）。将此适配子注射入或在成纤维细胞中表达也抑制了E2F依赖的转录，抑制细胞进入周期分裂；果蝇Cyclin J的一条TrxA-适配子在体外实验中表现出抑制与Cdk2的相互作用，当注射入果蝇胚胎细胞时，阻止了细胞进入分裂周期增殖（Kolonin et al.，1998）。尽管以上的研究都缺乏证明肽适配子阻止蛋白质分子间相互作用的证据，但都清楚表明了利用TrxA-适配子去研究探测蛋白质的功能的可行性。为了充分发挥适配子的这种作用，必须要筛选到最高亲和力的适配子。除此以外，还需建立检测适配子干扰蛋白质间相互作用分析方法，这些工作将在下一节内容重点介绍，讲述的目标主要是修饰后的双杂交系统。
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双杂交系统中应用的随机肽库
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酵母双杂交系统中有几种不同的文库构建（Colas et al.，1996；Yang et al.，1995；Butz et al.，2000），构建新的文库相对简单些，主要是修饰而已，例如可以扩大肽的数量，采用不同版本的双杂交系统，或者引进新的平台以利用肽适配子的选取。在酵母细胞中构建表达随机肽库的一些方法彼此相似，都采用了噬菌体展示系统的构建策略（Colas et al.，1996；Scott and Smith，1990）。通常首先合成所需氨基酸数量的NNK三联密码子的重复序列寡核苷酸，N可以是A、C、G或T中的任何一种，而K则选择G或T。在密码子的第三位采用G或T是为了减除UAA或UGA终止密码子出现而保留UAG终止子，在随机寡核苷酸序列的两侧有几个或多个限制性酶切位点的已知序列，合成的单链文库再用3′端的已知序列引物引导Klenow酶延伸生成双链DNA，在限制性酶切以后，连接入载体，转化入大肠杆菌（E.coli）。两端固定序列的设计既要注意随机肽表达按NNK位密码子单元生成氨基酸，还要注意采用两端不同的酶切位点或不对称酶切位点的内切酶，如RsrⅡ。
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Ma等采用了另一种方案（Ma et al.，1987），利用酵母细胞对DNA双链缺口修复机制在体外酶切文库DNA和质粒，共转化酵母细胞，通过胞内修复连接产生含文库序列的转化子，图27.2介绍了这一策略在TrxA载体pJM1（Colas et al.，1996）的肽库构建方法。文库中随机寡核苷酸序列两侧的固定序列含有与载体克隆位点两旁相同的一段20～40个碱基，利用与两侧序列互补引物PCR可扩增文库序列，将PCR产物和线性化质粒（例如RsrⅡ线性化的pJM1）混合，混合物用于转化酵母菌，产生的转化子中将有80%～90%含有文库扩增产物的重组子，其主要特点是因为随机文库已经构建在酵母菌中，便于直接应用筛选各种诱饵蛋白的相互作用肽。
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图27.2 缺口修复产生随机多肽编码序列的克隆法
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构建或筛选文库之前需考虑的另一个问题是，是否用分子平台技术。应用TrxA和其他平台分子的结果都显示，获得适配子在细胞内保持稳定，在体外实验中保持可溶性（Colas et al.，1996；Norman et al.，1999；Abedi et al.，1998）。但肽适配子的稳定构象能提供它们与靶蛋白分子的结合能力（Ladner，1995），这样一个肽在结合靶蛋白时可能采取了一个或极少几个构象折叠形式，自由构象的肽适配子比构象约束的肽采取这些折叠形式将需要更大的熵耗。相似的结果显示：TrxA提呈平台获得的Cdk2和E2F肽适配子，与靶蛋白的结合能力比对应的自由折叠构象肽适配子的亲和力高出10～100倍（Colas et al.，2000；Fabbrizio et al.，1999），令人不解的是，平台技术获得50多个TrxA-适配子中，无一例在肽编码区存在终止子，因为应该在文库中有半数以上适配子序列有终止信号，在AD-TrxA融合表达产物应导致切短的羧基端肽产生，其构象不受限制。这似乎说明，构象约束的肽适配子比自由折叠的肽适配子在筛选相互作用中更胜一筹。
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构建肽库需考虑的另一个问题是文库的大小，即肽链长度和包含肽类的数量或者说序列多样性。对自由折叠肽适配子的研究表明在肽链长度上作为一个结合结构单元可以很小（Yang et al.，1995），上述TrxA-融合随机肽获取的相互作用结构单元应大于4个氨基酸。有人会想，如果将肽长度延长一点，在随机库中某种适配子出现的几率将很小。事实上，从104～105不同肽文库中也成功筛选到适配子，最小长度并不比4个氨基酸大。迄今使用了TrxA-平台肽长度有16或20个随机氨基酸（Colas et al.，1996；Butz et al.，2000），这些研究表示16个氨基酸长度的肽对特异性相互作用已足够。
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经常引用的一般文库设计规则是，文库应该由尽可能多的独立克隆所组成，噬菌体构建的组合肽库用于双杂交系统能含有107～109单一克隆，这比理论上全部可能的组合肽数量低很多，因为对于16或20肽库应含有6.5×1020或1.1×1026条之多，尽管这样107～109的16肽或20肽已经含有各种靶蛋白结合的适配子足够多的序列多样性。例如，我们的经验以及其他研究均显示，20肽的文库TrxA体成分子平台含有某一特定靶蛋白的特异肽适配子达十万至百万分之一的几率（10-5～10-6）（Colas et al.，1996；Kolonin et al，1998；Fabbrizio et al.，1999）（Finley未发表）。而且筛选到的一些适配子对靶蛋白都有抑制作用。来自E6蛋白的适配子从约2×106 TrxA-肽库中选取17条，其中2条表现出对培养细胞E6的抑制作用（Fabbrizio et al.，1999），针对细胞周期蛋白的多条适配子中至少有4条能抑制细胞进入分裂周期（Kolonin and Finley，1998；Kolonin et al.，2000；Cohen et al.，1998），这一结果与构象约束肽库中选取的靶蛋白干扰剂的结果，以及发现的有作用效果的肽适配子出现频率相似（Caponigro et al.，1998；Geyer et al.，1999；Norman et al.，1999）。
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筛选随机肽库的双杂交策略
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Brent及其同事构建的TrxA-肽库（Colas et al.，1996）是筛选LexA相互作用适配子的，应用了双杂交系统的相互作用陷阱分析（Gyuris et al.，1995），DBD为LexA，AD是一个E.coli 表达的酸性多肽，AD在TrxA的氨基端，AD-TrxA融合蛋白在酵母GAL1启动子下表达，其表达可受葡萄糖的抑制而受半乳糖的诱导激活，这样在文库筛选中便可使用葡萄糖和半乳糖来鉴定阳性转化子，减少假阳性出现，同时也使得那些对酵母有毒性的适配子得以选出，尤其有利于筛选酵母来源蛋白质的适配子，报告基因之一是LEU2基因，它要求在不含亮氨酸的培养基中生长，另一个是E.coli 的LacZ。多种不同的HIS2和LacZ报告基因被制备用于区别转录活化强弱的不同敏感性；各有数目不等的上游LexA结合位点或操纵子（Golemis et al.，1995—2000），因为报告基因的活化水平与相互作用亲和能力高低相关（Estojak et al.，1995），因此相互作用亲和力高低在筛选过程中可通过报告基因的敏感性判断和选择。
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几个相似的LexA双杂交文库筛选系统可参阅（Kolonin et al.，2000；Golemis et al.，1999—2000；Finley et al.，1997—2000），这些方案都是为筛选cDNA库设计的，但用于随机肽库筛选同样有效。我们使用的方案中（Finley et al.，1997—2000）DBD和AD蛋白分别表达两个单倍体酵母株，通过交配可使两者在同一细胞表达。首先，AD文库转化到酵母细胞，转化子分装冻存。将LexA基因与靶蛋白基因融合表达于另一酵母株，再和冻存的AD文库菌株交配。为了方便，AD文库中含有LEU2报告基因，而LexA菌株则含有LacZ报告基因，两株细菌混合在富养培养基中培养过夜使其交配（例如YPD板），结合产生的单个二倍体细胞便含有两种融合基因和两个报告基因。将二倍体酵母涂布在半乳糖培养板上使得AD-TrxA肽表达，在同时不含亮氨酸培养基中可选择到表达LEU2的克隆，Leu+克隆在涂布到含X-gal的琼脂板以分析LacZ基因是否表达。最终，Leu+LacZ+克隆需通过将其涂布到葡萄糖或半乳糖的培养基中以确认AD融合表达导致的报告基因活化；Leu+LacZ+表型应该依赖于半乳糖剂量。余下几个步骤则是针对验证AD融合的肽与LexA融合靶蛋白作用的特异性，需将阳性克隆提取出AD融合质粒，再导入到正常酵母中和几种表达LexA的菌株交配检测。
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这一程序在肽库筛选时尚可优化，它与采用cDNA文库策略上有差异。首先，用肽库筛选是为了获得多条相互作用肽，而不是所有可能的肽，如cDNA库所要求的那样，这一点可用于全过程的流水操作，例如操作过程的阳性细菌由于转化等原因丢失均可忽略。另外，在cDNA文库筛选中使用的冗余质粒（相同序列）菌株的减少方法在肽库筛选中不需考虑，因为所有的克隆在典型的肽库中是惟一的，或者极少重复子或冗余阳性酵母克隆。第三，在大多数应用中，选择肽适配子的目标是为了发现靶蛋白结合最高亲和力的适配子，其敏感性不需要像筛选cDNA文库那么强，同时为鉴定所有可能的相互作用肽而需考虑亲和性。为获得高亲和性的肽适配子，应该使用最小敏感性的报告基因。在LexA系统中，只选择一个染色体LEU2报告基因和一个上游LexA启动子，于EGY191菌株中，还有一个染色体整合的单拷贝LacZ报告基因（Golemis et al.，1999—2000）。在培养板加X-gal以检测LacZ活性，其用量也可减少到1/4用量，使得容易区分强阳性克隆。
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肽适配子获取方法改进
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图27.3 选取肽适配子简图
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基于以上考虑，克隆和鉴定肽适配子的流程可作修改从而更加高效，如图27.3，方法的前一部分与cDNA文库筛选相互作用蛋白质基本相同，有报告基因表达的克隆大都是阳性，应检测半乳糖诱导作用，然后将肽编码基因用在其上下游约20～40个碱基的引物扩增出来，再克隆到一新的AD载体中，通过缺口修复方法可以节省文库筛选过程大量时间，即用细菌克隆酵母质粒。PCR产物直接与线性化载体混合转化酵母细胞，产生的转化子应确认相互作用特异性以及产生的表型：成群的转化子可转移到培养板培养，同DBD质粒菌在YPD板上交配，特异性适配子应与靶基因DBD相互作用而不与其他基因DBD发生作用（图27.3，特异性交配），从而决定选择特异性强的适配子用于继续分析，例如蛋白质相互作用干扰等，详见下面章节。
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调节子和干扰子分析法
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如图27.4，有三种基于双杂交基础上检测蛋白质相互作用干扰现象的分析方法，它们都使用含相互作用两个蛋白质共转化质粒的菌株（图27.4中X，Y），这一菌株同适配子表达菌株交配，改变报告基因同时检测基因的启动表达，肽适配子和两蛋白质之一的抑制蛋白竞争结合引起两相互作用蛋白质间作用减弱或消失的情况可通过报告基因活性降低来检测，图27.4中A和B两种方案可称之为调节子分析法，因为肽适配子（或者其他分子）能强化或减弱蛋白质X和Y之间的相互作用，可通过报告基因活性的增或减来反映其作用方式。
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方法一（图27.4A）特别适合于相互作用蛋白质（X与Y）仅有一个或极少的情形（Kolonin et al.，2000），图中显示分析用DBD-X株克隆的肽适配子，通过构建了相互作用蛋白质X和AD的融合基因（X-AD），和它的作用蛋白质与DBD融合（Lex-Y）基因的菌株，和表达肽适配子的菌株交配后产生的二倍体用于分析报告基因活性降低，从而判断X-Y相互作用被干扰的效果。此方法不需另外构建肽适配子克隆，适配子表达菌株同当初筛选建立的表达肽菌株是一样的，据需要也可采用图27.2相同的编排方式，因此可以筛选大量的适配子而且检测速度快。
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图27.4 干扰型肽适配子的选择策略A，B，C三种方法概览
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方法二（图27.4B）比较适合研究存在多个相互作用蛋白质的靶蛋白，所有这些相互作用均被肽适配子所选定。共携带DBD-X和AD-Y的转化菌株a接合细胞，与只表达肽适配子的无AD基因载体菌株α接合后，AD-Y与肽适配子竞争结合X蛋白使报告基因LEU2/LacZ表达减弱。肽适配子编码基因可通过扩增后与线性化质粒共转化到无基因的菌株中（图27.2），本方法需要这一步多余的克隆步骤，而其优点则是靶蛋白载体为已知，它与DBD融合表达质粒也已知为有效DBD诱饵载体，AD-Y文库质粒也是成功从cDNA库筛选出的相互作用蛋白质基因，无需克隆分析，建立此方法的菌株和质粒都可以得到（Finley et al.，1997—2000）。
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在有限的DBD-X与AD-Y相互作用蛋白对的系统中，研究干扰子和调节子较为方便，为庞大的蛋白质组提供蛋白质相互作用综合性的图谱，显示模式遗传学体系或人体细胞内蛋白质相互作用关系成为迫切需要（Evangelista et al.，1996；Fromont-Racine et al.，2000；Ito et al.，2000；McCraith et al.，2000；Stanyon and Finley，2000；Uetz et al.，2000；Walhout et al.，2000），甚至在较小的研究体系中，相互作用的数量也成千上万，如此浩大的相互作用数据对蛋白质功能的阐明就要求高效和准确的适配子制备方法以干预研究这些相互作用。
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在方法三（图27.4C）中，我们刻意将干扰子分析和克隆步骤结合起来，以利于选出特异抑制AD融合靶蛋白相互作用的肽适配子，依据分别融合在两个DBD基因的双诱饵蛋白的杂交系统（Jiang and Carlson，1996；Xu et al.，1997；Serebriiskii et al.，1999），同时参考了逆向双杂交系统的思路，使抗蛋白质相互作用得以选择（Vidal et al.，1996），能用于同时检测相互结合和干扰结合作用，不同DBD 识别的各自启动子与报告基因融合，使得正负选择压力均可施加到酵母细胞。在显示的图例中，Lax操纵子启动URA3表达，而Tet操纵子则融合在LYS2和LacZ上游；构建表达相互作用X和Y蛋白对，将Lex-Y和AD-X分别融合在一起；X和Y发生相互作用激活URA3基因，此菌株如与Tet DBD-随机肽的表达菌接合交配，在二倍体转化子中，Tet-肽与X发生作用因此将抑制Y与X的相互作用，这一过程导致一套报告基因LYS2和LacZ的表达而同时抑制了另一报告基因URA3的表达。双诱饵杂交系统便利于直接检出针对一种蛋白质而不是其他蛋白质的多个肽适配子，甚至还能侦检识别不同异型的蛋白质如等位基因突变产生的变异子蛋白（Xu et al.，1997）。
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竞选高效作用的肽适配子
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上面已经提到，筛选特异结合靶蛋白适配子的几率是10-5～10-6，然而这些肽适配子是否能作为如此敏感而高效作用的工具产生明确的生物学效应，是另外一个应注意的问题，显然在筛选获得的肽适配子中就存在抑制蛋白质相互作用的一类。从106～107丰度肽库中筛选出的适配子之间互不类似，表明属于靶蛋白多个结合表位的适配子成员，它们对干扰特异蛋白质相互作用有很好的效果。为鉴定这类变异子，Colas等建立了适配子突变体文库以鉴定结合特异性稍有差异的适配子（Colas et al.，2000）。
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对编码肽适配子的DNA序列修饰后的文库可用突变PCR和酵母缺口修复机制构建（图27.5），对20肽在一个残基互有差异的情况有19种变异序列，因而有380条突变适配子序列，制备这样380个克隆，较容易操作，而且只需一次缺口修复转化，挑选克隆进行铺板培养，再加入DBD融合子质粒的菌株进行接合，很容易证明各适配子对蛋白质结合亲和性以及特异性；外加一个检测筛选适配子作用效果的步骤，进而对变异适配子的基因进行测序验证，最后鉴定肽适配子的结合结构单元并确定其位置大小。
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图27.5
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检验肽诱导表型的特异性
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在细胞内应用显性性状试剂需解决一个问题，即证实已观测到的表型产生于特定基因靶分子，虽然某一适配子肽在体外或酵母细胞内表现出很高的特异性，将这一适配子注入真核细胞或在细胞内表达与其他蛋白质之间是否存在相互作用则不易弄清楚，可是有几种实验方法能认定特定肽适配子诱导产生的表型来自靶蛋白的活化。一，生物化学相互作用分析，如免疫共沉淀，分析在细胞内导入的适配子肽与靶蛋白的相互作用。二，构建变异的适配子肽与靶蛋白相互作用消失导致的相互作用产生的表型的逆转（Blum et al.，2000）（图27.5）；反过来通过构建表达突变靶蛋白的方法也可分析此适配子肽与突变蛋白相互作用的消失、抑制。三，肽适配子诱导表型的抑制，通过表达靶蛋白或注射入靶蛋白造成显示肽适配子在胞内特异识别靶蛋白（Kolonin and Finley，1998；Blum et al.，2000）。而需要在确定靶蛋白过表达本身不会明显地影响表型而不会与表型抑制作用混淆，注意可能的风险是过度表达靶蛋白可能会结合肽适配子，将减弱它与其他蛋白质相互作用的抑制功效。四，在一种适配子结合其靶蛋白干扰靶蛋白与第二蛋白质相互作用时，另一种特异结合第二蛋白的肽适配子可根据实验中干扰、减弱相同的相互作用效果筛选，如果这两条适配子产生的表型性状相同，便可认为它能阻止相同的蛋白质相互作用。五，如果一个肽适配子在细胞内干扰某种相互作用，非靶蛋白的过表达导致相互作用减弱可以视为抑制肽适配子诱导的表型性状。在图27.1中，如果Cdk2适配子阻止了Cdk2-Dap蛋白的相互作用，产生的异常的S期表型应该能被Dap蛋白的过表达遏制，因为Cdk2适配子并不结合Dap蛋白，Dap的表达不应与Cdk2适配子的另一未知相互作用蛋白质竞争结合。
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结论
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反向遗传学手段从克隆基因开始分离、获得突变子，通常需要较长时间和人力，而且不一定对所有的基因都能成功。随着基因组计划和双杂交相互作用图谱的绘制，越来越多的未知功能基因被克隆，迫切需要研发一些全新而高效的技术方法帮助确定这些基因的功能。肽适配子应用于体内干扰蛋白质相互作用具有潜在应用前景，可以为研究未知基因功能提供有力帮助。肽适配子导致某些蛋白质功能的抑制能证实蛋白质之间关联，这些手段特别有利于分析蛋白质之间相互作用图谱，阐明胞内蛋白质之间相互调节的网络关系，产生于某个蛋白质的相互作用或功能抑制作用的性状也可佐证蛋白质的功能、蛋白质之间的相互作用，以及发现新的药物作用靶蛋白。酵母双杂交系统对获取构象约束肽适配子，在体内、胞内产生效应的适配子有良好的应用前景，修饰双杂交系统对成功选定和确认高效肽适配子将更加有效，并将在大规模的细胞功能基因组、蛋白质组学的研究中发挥重要作用。
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1 了解蛋白质相互作用的意义
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详细说明
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蛋白质控制和调节细胞中诸多的生命活动。尽管有一些蛋白质主要以单体的形式发挥作用，但确有很大一部分蛋白质，即使不是大多数蛋白质，却是通过与别的配体分子结合或作为一个大的生物复合体中的一部分来参与细胞中的生命活动。因此，了解细胞的功能必须从在孤立情况下和在与别的蛋白质分子相互作用的情况下两个层次上来认识蛋白质的功能。细胞处于不断的变化过程中，因而使得对细胞功能研究更加复杂。内源性的和外源性的信号都能诱使细胞的形状、分裂状态、生活能力、代谢和别的一些内在特性发生变化。对这些信号解释和应答要求细胞中蛋白质的组成和细胞内蛋白质间的作用方式发生变化。细胞功能分析复杂性的另一个成因是所有细胞都是不相同的。对于单一物种如人类，肝细胞、淋巴细胞和神经细胞都含有不同类型的蛋白质，对同样的外界刺激所引起的反应也是不一样的。即使同一类型细胞，如B淋巴细胞，不同的物种间（从人到实验室老鼠到原鸡）的蛋白质组成和功能模式都有很显著的差异，这是由密码子的简并性和不同蛋白质间的表达水平差异造成的。因此，所有的这一切都会造成细胞功能的高度复杂性。
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获得蛋白质不同方面的信息，对了解这种复杂性是非常有用的。对任何给定蛋白质，这些信息包括以下几个方面：（1）蛋白质结构和序列特点，包括其明确结构模式，这些信息可用于按照功能分类和推测蛋白质间相互作用的模式；（2）蛋白质进化过程和保守的序列，这有利于确定一些关键的残基；（3）蛋白质的表达谱，包括产生该蛋白质的细胞的类型和丰度，以及在细胞进程或在生长因子动态变化过程中做出反应时蛋白质表达谱的变化；（4）蛋白质在细胞内定位，及与它相关联的细胞器或结构；（5）蛋白质翻译后修饰的方式（磷酸化、泛素化、乙酰化等）；（6）以及了解与其相关联的其他细胞的蛋白质。实际上，上述前5个方面的信息决定了该蛋白质第6个特征，即表明相关功能的蛋白质存在于瞬间或是以复合体的形式存在。对一个蛋白质相互作用谱的认识是最终了解细胞中该蛋白质的功能最重要的一步。第一部分中的第2章和第3章——蛋白质相互作用研究的生物学过程——集中讲述了目前在细胞的信号传导、人类遗传学/药物基因组学的一些话题，并举例说明对蛋白质相互作用分析方法已经作为这些学科的组成部分。
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为提供上述信息，所用的技术可分为三类。第一类，目标是鉴定与某个感兴趣的蛋白质相互作用的所有可能的蛋白质。在这种情况下，为了在一个大的范围内进行筛选，暂时不予考虑生理学方面的重要性。第二类，与所关注蛋白质有相互作用的蛋白质已经被鉴定出来，接下来的目标是详细描述其生物功能及相互作用对其功能的影响，即确立生理学上的意义。在这种情况下，在尽可能接近的胞内条件下研究其相互作用是非常关键的。第三类，已经鉴定出存在的相互作用且在生理状态下得到了验证和合理的解释。在这种情况下，目标是设计一些高通量的方法能够鉴定出一些按照人们所期望的方式调节这种相互作用的关键因子。没有一个技术适用于所有的这些领域；然而组合这些技术，就可能取得大的进展。本书所描述的技术都针对于上述三个领域。尽管完整地描述研究蛋白质相互作用的技术包括其起源和原理已经超出了本书的范围。Phizicky和Fileds（1995）提供了一个关于这方面的极好的参考文献出处，同时还详细讨论了一些参数的设置，这些参数在决定该项技术的检测能力方面是至关重要的，即在测定特定蛋白质间相互作用方面是至关重要的。最后，尽管我们已经描述在蛋白质相互作用领域里广泛的兴趣和研究进展，但是由于篇幅的限制，我们并没有涉及这个领域里每种可能的技术。例如，一些传统的生物化学方法，如柱共纯化技术（column copurification）和差速离心技术，还有恒温滴定热量测定技术和一些新发展起来的技术，也都被省略掉了。
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接下来将介绍上面所提的各个部分，本书将从四个方面来介绍这些方法。
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第2部分——已经应用于鉴定和表征蛋白质间相互作用的一些标准技术——提出了6种分析蛋白质相互作用的方法，这些方法已经得到了广泛的认可，已应用于分子生物学、生物化学和微生物领域，而且在许多实验室都得到了验证。第4章描述了在体外应用GST-融合蛋白的“pull down”法和“far western overlay”法。接下来在第5章描述了免疫共沉淀所需要的补充方法。第6章详细讨论了在建立适用于蛋白质关联实验时，所遇到的一些问题。第7章是基于在转录水平上的酵母双杂交方法。第8章详细描述了运用噬菌体展示技术高通量鉴定蛋白质间具有高亲和力相互作用。第9章描述了利用经典的遗传学的方法来鉴定蛋白质间存在的相互关联，它们是基于蛋白质在功能上的相互作用。
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第3部分——鉴定和表征蛋白质间相互作用生物物理学方面的方法——与之相对应，这些技术都基于生物物理学和细胞生物学方面的基础。第10章和第11章讨论了FRET和FRIM技术，它们能对在固定细胞中的蛋白质间相互作用或存在于活细胞内蛋白质间实时相互作用进行原位分析，这些方法提供了惟一检测方式，能用于检测由于生物刺激而引起的蛋白质相互作用变化。质谱是蛋白质组分析中的基本工具：第12章描述了运用这一技术研究多组分复合物中特定蛋白质间相互作用的问题。最后，在第13章（原子力显微镜）、14章（Biacore）、15章（QCM生物传感器）详述了检测存在于蛋白质间或在有些情况下存在于蛋白质与小分子配体间特定的作用力的方法。
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第4部分——最新进展及其他方法：综述了一些简单的操作步骤——是用来描述一些新的技术，大部分是最近才发展起来的。它们或是在第2和第3部分描述的一些核心技术的创造性的延伸或是一些只能用于分析蛋白质间相互作用的方法。尽管在这一部分中主题繁多，它们可分为几个小部分。第16章描述的蛋白酶指纹技术，该技术是体外检测蛋白质间存在相互作用的补充技术，在体外运用生物化学的方法检测相互作用的蛋白质间是否存在实质性接触。第17～20章是与GST融合蛋白的“pull down”和免疫共沉淀技术相关的一些方法，描述了一些体外基于与感兴趣的目标蛋白质有物理结合的蛋白质纯化技术。第21～27章主要介绍了不同种类的双组分系统——在细菌、酵母和哺乳动物的细胞中——应用于在不同部位表达的蛋白质，如细胞核、细胞质和细胞膜。尽管引起这些体系的发展起初的概念无可争辩称为双杂交系统和细菌α-互补技术，但是真正检测蛋白质相互作用的模式是不同的，每种方法在检测不同类型的蛋白质时有各自的优点。第27章，描述了对蛋白配体的扫描检测，包括相互交叉的两部分，从最初研究蛋白质本身存在的相互作用到利用蛋白质相互作用技术发展一些工具，能用于调节体内蛋白质间相互作用。第28章描述了渐增截断（incremental truncation）；第29章描述了催化抗体（catalytic antibodies）；第30章描述了蛋白质的集束化（protein bundling），并提出一些可能对解决这些问题有价值的替代方法。第31章和32章描述了高通量，适用于快速筛选存在相互作用蛋白质对的方法。
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最后，在这本书的最后一部分章节里是预测性的，假设我们已经开始获得所有蛋白质所有全部信息及它们的功能，我们能够创造性的将这些信息模块化，或者用别的方法应用这些信息。因此，在第33和34章主要描述一些计算方面的工具以及一些整合性方法，它们可以用来提高和组合前面所提到的那些技术。第35章描述了在基因治疗方面尚处于实验阶段的一些尝试，利用蛋白质间相互作用作为工具通过合成可调控转录系统来调整生物系统。这些方法在接下来的几年中将被广泛的应用，实现对基因功能的微调（例如，Gardner et al.，1998，2000；Elowitz and Liebler，2000）。
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背景
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随着人类基因组测序计划的成功实施，以基因组学为特征20世纪90年代催生了一系列的“组学”概念，包括转录组学（Velculescu et al.，1997），代谢组学（Tweedale et al.，1998）和与这本书密切相关的蛋白质组学（Wasinger et al.，1995）。截止到2001年中，运用“proteomics”的不同名称，在Medline里共检索到超过1000篇文献，其中90%以上出自于近两年。这些工作的目的都是为了完整和系统地描述某种生物体DNA、RNA和蛋白质的信息，并且了解这些组分的动态变化。这些工作要求规模很大，而且已经被认为开启了21世纪生物学研究的一种新的方法。与这些整体性分析方法相比，在Medline中用“蛋白质”进行检索，在近两年里发现超过400000篇文献。除了与整体性分析表达和功能相关以外，这些文献中经常包含内在的机理性研究，包括蛋白质产生、修饰、相互作用、单个独立蛋白质的功能及小的蛋白质复合体功能。基于这个比例（1000∶400000），可以清楚地看到，尽管整体性分析方法具有很大的应用前景，了解单个蛋白质活性还是具有很大价值的，或者说科学的价值还是建立在以前的即将被取代的范例上。于是，与这本书直接有关的一个问题被提出来了：2002年运用现有的技术研究单个蛋白质间相互作用的价值是什么？
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从根本上来说，生物学家首先想知道的是我们是什么以及我们是怎么产生的；接下来的便是我们与极其复杂的生物圈间的关系；第三个问题是我们应该采取什么措施延长寿命和提高生活质量。尽管科学发现的目的集中于解决这三个问题，可是在历史上却形成各种完全不同的思想方法来达到这个目的，这些方法可以分为两类：系统分析（演绎法）和机理阐述（归纳法）。对演绎法感兴趣的科学家经常关注于综合大量观察到的结果。例如，植物学家和动物学家直接收集有关现存的植物群和动物群亲缘关系证据。在这个基础上，进化生物学家再加上对化石记录的深入研究，推断出生物体怎样从简单的生命形式进化到复杂的生命形式。与历史上远古综合分析法相比，后启蒙运动时代（post-Enlightenment）生物科学机构试图更巧妙地探明这个认识自然的策略，即通过观察自然现象形成假说，并检测这些特定的假说。例如，有目的的制造一个杂交豌豆品种，观察这些杂交品种的性状来决定两对相对特征性状的遗传特点。由此孟德尔建立了“孟德尔定律”，引发了遗传学发展。随着现代分子生物学规则的出现，一些新的观点把生物体作为一种机器。与之相比较，一些早期的描述和观察世界的方法失去了吸引力。生物体依赖于一些生物分子——核酸、脂、糖和蛋白质的活动来控制一些关键的生物体功能，如遗传、日常活动和对疾病的识别。
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尽管系统分析（非假说驱动的）和机械论（假说驱动的）的方法有时的描述是相反的，但由于它们互相补充，从而使认识更加准确。没有丰富的数据库，就失去了实验的根基或对实验的解释，同时也就没有严格的表述和对假设的检测，堆积的数据只作为信息而存在，不能够形成知识，或从更理想的角度上说，形成学问。从历史的角度看，“组学”的研究属于系统论者的直系后裔，但最终需要同机械论者一道，确定它们的重要地位。通过整合系统的和机械的分析方法，在接下来的十年中，我们将开始获得对人和其他生物体组成和功能更加合理的解释，从而在上述前两个基本问题上获得进展。
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剩下第三个问题：怎么提高生活的质量？回答这个问题不可避免地需要将第三个因素加入到上述所提及的采集知识的过程中，那就是产生可操作生物系统的科学。尽管生物工程与认知获取知识为惟一目的的“纯科学”相比缺少挑战性，因而有时被忽视，但实事上生物工程学家与所谓的纯科学家之间也可以以某种特定的方式进行交流。因为这个学科的目标是分解和操作生物体系，所以，生物工程必须首先通过本书介绍的这些方法来研究自然界存在的调控机制。对自然界存在的调控机制的理解以两种方式产生转化：一种方式是采用自然存在的生物物质作为工具，达到可应用的目的。在这本书里描述的许多蛋白质—蛋白质相互作用的系统就来源于此。第二种方式就是确定生物调控系统中的那些关键控制点，并建立特异的方法从头来特异干扰它们，从而达到人们所期望的效果。后者是应用科学家，包括基因治疗的研究者、药物基因组学的研究者和临床医生的梦想。拥有诸多的工具并且尽可能多的检测蛋白质间相互作用，将促进这一目标的实现。2001年以蛋白质为目标的抗肿瘤药物Gleevac（Druker et al.，1996）是第一个通过合理化设计来达到治疗目标的成功的先例。随着我们对生物体基本组成材料的深入理解，下一个十年我们对这种有创造性的开发充满了希望。
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在这种背景下，这本书有三个基本的目的。第一，是介绍一些在分析蛋白质间相互作用方面现行的基本观点。第二，列举了许多种研究蛋白质间相互作用的方法，指出这些方法的应用范围，同时还指出这些方法在识别和操作蛋白质间相互作用方面的交互影响。第三，也是最具应用性的，这本书所包含的各章提供了不同的蛋白质间相互作用研究技术的明确和详细的操作步骤。遵循“分子克隆”系列的传统，应该指出的是一种技术在历史发展过程中的特定时期及最适宜的应用中才最具实际意义。参与写作的许多作者也期望给予一些这方面的说明。
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未来的一个主要挑战是在考虑大的整个生物体功能的同时对某种感兴趣的蛋白质进行定向研究，同时还需要通过单个测试试验对整个生物体功能进行仔细的验证。这个研究过程与蛋白质相互作用的研究极为符合。希望通过本书的介绍，能够满足实验室工作者的实验研究需要，同时使人们对蛋白质相互作用研究领域有更广泛的兴趣并对其意义有更多的认识。
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28 用渐增截断方法产生蛋白质片段文库
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前言
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蛋白质片段化和结构域交换，是研究蛋白质中结构域间和结构域内，以及亚结构域相互作用的有效方法。建立在经典的蛋白质片段互补方法（Ulman et al.，1967；Kato and Afinsen，1969）上的蛋白质片段化，已被用于生物物理学研究，特别是在阐明蛋白质折叠机制方面（Tasayco and Carey，1992；Ladurner et al.，1997）。最近，使用蛋白质片段重组方法的蛋白质工程得到普及（综述见Lutz and Benkovic，2000；Ostermeier and Benkovic，2000）。
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各种蛋白质片段化方法都得到成功实施。在蛋白质水平，靶酶通常都被化学的或蛋白质分解的方法水解。这些片段化方法相对简单，却产生了复杂混合物，需要对各产物进行大量的纯化和鉴定。尽管可通过将产物“文库”限制在十几个或几个来解决这一问题，但对于更易接近的靶结构区，如表面凸环，所产生的水解偏向性问题则不容易得到解决。
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另外，蛋白质片段可通过遗传学方法生成。采用合理设计，专一的PCR引物可以放大预先决定的基因片段，这样，通过克隆并转化合适的表达宿主，就可以分离得到目的蛋白质片段。虽然这种方法对于单个基因十分有效，但很快发现它用于多片段研究则是很费力的。另外选择什么样的片段进行研究取决于有效的结构信息。相反，渐增截断法则可以在缺乏详细的结构信息的情况下，快速生成完整的并能编码靶蛋白所有可能片段的基因文库（Ostermeier et al.，1999c）。需要特别指出的是，如果构建的文库数目太大，就需要一种遗传选择系统或高通量筛选方法对文库进行分析。
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渐增截断方法有许多不同的应用（Ostermeier et al.，1999a）。首先，可以建立单基因的氨基端或羧基端截断文库。这种蛋白质片段在确定序列与结构和功能间关系（Jasin et al.，1983），包括检测蛋白质—蛋白质相互作用的相应区域方面很有用处。另外，这种文库成员的随机配对可用于确定以非共价结合形成功能蛋白的蛋白质片段（Ostermeier et al.，1999c）。这种方法用于蛋白质片段互补也可作为将单体蛋白转变成异源二聚体的策略。最后，渐增截断可用于建立两种基因片段间的综合融合文库（Ostermeier et al.，1999b）。这种方法已应用于蛋白质工程，特别是在生成低同源性基因间的融合文库方面。
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程序纲要
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基本概念
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渐增截断是一种建立含有一种基因或基因片段的每个单碱基对缺失突变的组合文库的方法。如图28.1所示，渐增截断的底物为线性双链DNA。这种底物由闭合环状的质粒DNA经限制性酶消化得到，产生的末端为平端或5′突出端，而对应末端为4个碱基的3′突出端可保护载体其他部分免受降解。具有3′到5′外切酶活性的外切核酸酶III（ExoIII）以3′凹端或平钝端为底物产生截断片断，但它不能消化4个碱基的3′ 突出端（见表28.1）。另外，可以用α-磷酸硫代（phosphothioate）核苷酸将5′突出端补平形成保护性末端（Putney et al.，1981）。
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表28.1 商品限制性内切酶产生的4碱基3′突出端对ExoIII消化的抗拒作用
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图28.1 渐增截断一般流程图
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构建渐增截断文库的关键步骤是在ExoIII消化过程中按时取样。在整个DNA消化过程中不断取小份样品，并在低pH的高盐缓冲液中终止反应。选择的温度和缓冲条件要能使水解速率和取样速率达到平衡。例如，如果ExoIII的速率控制在每分钟10个碱基，每20s取小份样品，则对每份样品的平均截断数量为3.3个碱基。ExoIII是以一致的和同步的速率消化DNA（Wu et al.，1976），由于截断片断的长度存在标准差，它是截断碱基平均数的0.22倍（Hoheisel，1993），因此产生的DNA中含有起始DNA的每一种可能的截断形式。伴随ExoIII 的不断切割，产生的单链DNA末端被一种单链核酸酶（通常为绿豆核酸酶）消化去除，然后用DNA聚合酶补平。下面步骤取决于文库的使用目的。
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文库三种可能的应用如图28.2所示。当应用于单基因时（图28.2，左），含有3′截断文库的载体必须在所有三种阅读框架上载有终止密码，这样在连接时，与文库连在一起可终止蛋白质片段的翻译。另一方面，含5′截断文库的载体需要一个起始密码，在连接时与文库的5′末端融合。如图28.2（中）所示，可在同一基因（A）的两个交叠片段的相反方向或对两个不同基因（B和C）进行截断。在不同质粒中的两个文库可以同时转入相同的细胞，随机将两个截断文库的成员匹配在一起。最后，如图28.2的右首框所示，命名为ITCHY文库的5′和3′片段融合文库，可以从基因B和C制备。
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图28.2 组合的渐增截断文库
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渐增截断用载体的描述
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为进行渐增截断设计的载体示于图28.3。单基因、异源二聚体或融合文库可分别用适合氨基端片段和羧基端片段的载体pDIM-N2和pDIM-C8来制备。载体pDIM-N5只用于制备融合文库。这些载体突出的特点包括：（1）在pDIM-N2和pDIM-C8中含有不同的抗生素抗性基因和复制起点；（2）含有一个f1噬菌体复制起点，使载体DNA可能通过装配到噬菌体，从而有效转移到E.coli；（3）具有独特的限制酶位点，用于克隆所要截断的DNA；（4）具有独特的限制酶位点，用于构建渐增截断用载体；（5）具有独特的限制酶位点，用于获得渐增截断融合文库（ITCHY文库）；（6）含有基于lac的启动子，用于表达融合蛋白。
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图28.3 用于渐增截断的载体
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方案
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方案1：渐增截断
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材料
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缓冲液和溶液
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分子克隆手册：蛋白质—蛋白质相互作用
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分子克隆手册：蛋白质—蛋白质相互作用
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分子克隆手册：蛋白质—蛋白质相互作用
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酶
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分子克隆手册：蛋白质—蛋白质相互作用
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其他设备和试剂
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氨苄青霉素
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琼脂糖凝胶电泳系统（TAE缓冲液）
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氯霉素〈！〉
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在15℃，22℃，30℃，37℃和72℃的加热器
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试剂盒（Qiagen Midi Prep kit）
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方法
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阶段1：制备质粒DNA
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对渐增截断来说，最重要的是制备无单链切口的质粒DNA。Exo III能够从双链DNA中的单链切口处消化，留下单链缺口。这些单链缺口会被绿豆核酸酶消化，因而不利于对整个质粒进行随机缺失。
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我们通常使用的是商品质粒制备试剂盒，从E.coli 菌株DH5α中提取pDIM-N载体的质粒DNA。对pDIM-N载体来说，我们发现切口分子的比例和质粒DNA的总产量极大程度上依赖于生长条件。然而，如果遵循下面细胞生长方案，我们通常可得到切口DNA小于10%的pDIM-N和pDIM-C载体。要获得高产量的超螺旋DNA，可使用下面的生长条件：
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1.接种含载体的DH5α于25ml试管中的10mlLB培养基，其中含有0.2%葡萄糖和适宜的抗生素（对pDIM-N2和pDIM-N5为100μg/ml的氨苄青霉素；对pDIM-C8为50μg/ml的氯霉素），37℃生长过夜。
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2.对pDIM-N2，用2ml过夜培养物接种到100ml2×YT培养基，其中含2.0%葡萄糖和100μg/ml的氨苄青霉素，于500ml摇瓶中37℃生长过夜。对pDIM-C2，用10ml过夜培养物接种到500mlLB培养基，其中含50μg/ml的氯霉素，于2L带障板的（baffled）摇瓶中37℃生长过夜。
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3.用标准试剂盒（Qiagen Midi Prep kit）提取质粒DNA。质粒DNA的典型产率，对pDIM-N2和pDIM-N5为约1μg/ml，对pDIM-C8为0.2μg/ml。
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足够纯的无切口DNA难以获得，从切口质粒DNA中纯化无切口DNA的方法包括CsCl-溴化乙锭梯度（Sambrook et al.，1989），酸酚抽提（Zasloff et al.，1978），或用酶消化去除切口DNA（Gaubatz and Flores，1990）。另外，用T4 DNA连接酶处理切口DNA也应该可以修复切口。
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阶段2：制备截断用DNA
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在制备渐增截断用的无切口DNA时，要考虑的另一个重要因素是限制酶的消化，它使DNA线性化以用于截断。供应商提供的限制酶可能有核酸酶污染。另外，在酶∶DNA比例较高时，限制酶可能有单链切口活性。因此，我们建议采用完全消化DNA所必需的最小量的限制酶来消化DNA，并且避免使用易于产生星迹活性（star activity）（降低或改变专一性）的酶切条件（见生产商的产品说明）。
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我们在消化闭合环状的pDIM-N载体时，1μg DNA用1.5单位Xba I和1.5单位Nsi I或Pst I，在生产商推荐的缓冲液中37℃消化1.5～2h。消化pDIM-C载体时，1μg DNA用15单位Sac I和20单位Xho I，在生产商推荐的缓冲液中37℃消化1.5～2h。Sac I和Xho I难以消化超螺旋DNA（New England Biolab，2000），因此需要高水平酶活单位。
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需要注意的是，一些4个碱基的3′突出端并不完全耐受ExoIII的消化。表28.1列出了能产生4个碱基的3′突出端的商品化酶，并给出了这些3′突出端是否耐受Exo III的作用。各生产商对3′端是否抗Exo III的结论不同，取决于确定末端抗性的标准（多数4个碱基的3′突出端是很弱的Exo III底物），以及在有不明确碱基的位点情况下待测位点的准确序列。保护DNA不被消化的一种替代方法是用α-磷酸硫代（phosphothioate）核苷酸将5′突出端补平（Putney et al.，1981）。
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1.用适宜的限制酶于100μl总体积37℃消化10 μg质粒DNA。
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2.1.5～2h后，用生产商推荐的条件热灭活酶，再用50μl醋酸铵和0.3ml乙醇通过乙醇沉淀纯化DNA。
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3.用100μl EB缓冲液溶解DNA沉淀。样品可在-20℃存放几个月。
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可替换的方法是用500μl PB缓冲液终止限制性消化，然后按QIAquick方案纯化DNA。
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阶段3：渐增截断
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单基因截断和异源二聚体文库
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当单独截断5′和3′基因片段时，必须分别引入起始和终止密码子。对3′截断片段终止密码必须与文库融合。由于不知道截断基因末端的阅读框架，要采用含有三种阅读框架的系列终止密码。对于其中两种框架，将引入1～3个在原始蛋白中不存在的羧基端残基；但对第三种框架则没有引入额外的残基。与此相似，对5′ 截断片段也不知道何种阅读框架会提供正确的起始密码，因此，只有1/3的文库阅读框架正确并能产生有意义的羧基端蛋白质片段。
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如图28.4所示，终止密码三连子和起始密码子都可在限制酶消化后暴露出来。用Nsi I消化pDIM-N2，接着去除3′单链突出端，暴露出的序列5′-TAACTAGCTAA-3′含有用于同截断基因融合的所有三种框架的终止密码子。在此情况下，3′突出端是利用具有3′到5′外切核酸酶活性的Klenow DNA聚合酶在无dNTPs条件下去除的。接下来加入dNTPs，越过前述Nsi I酶切形成的平端，将所有截断片断的DNA末端补平。先用Nco I消化pDIM-C8，再用Klenow DNA聚合酶和dNTPs将5′单链突出端补平，暴露出用于同截断基因融合的一个ATG起始密码子。随后，在稀释条件下将两个文库连接环化，这样有助于分子内的连接，并用于转化E.coli。
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图28.4 截断文库与终止或起始密码子的融合
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方法A：制备单基因的或用于异源二聚体的渐增截断文库
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14.用90μl EB缓冲液将截断的DNA从QIAquick柱上洗脱。
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15.限制酶消化：对于pDIM-N2，加10μl 10×Nsi I缓冲液，1μl 100×BSA和15单位的Nsi I。对pDIM-C8，加10μl 10×NEB1缓冲液，1μl 100×BSA和18单位的Nco I。
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16.37℃孵育2h。
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17.加0.5mlPB缓冲液。
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18.按QIAquick 实验方案操作。
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19.用82μl EB缓冲液将DNA从柱上洗脱。
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20.将管平衡在37℃。
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21.Klenow处理：对于pDIM-N2，加10μl Klenow缓冲液，37℃孵育3min，再加10μl dNTP混合物，37℃孵育5min。对pDIM-C8，加10μl dNTP混合物和10μl Klenow缓冲液并于37℃孵育5min。
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22.72℃孵育20min灭活Klenow缓冲液。
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23.冷却到室温，加0.4ml连接酶缓冲液。
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24.在室温下孵育≥12h。
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25.用250μl醋酸铵和1.5ml乙醇通过乙醇沉淀来浓缩。
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26.转化到所要的宿主。
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方法B：用pDIM-N2和pDIM-C8制备融合文库
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经绿豆核酸酶处理并用QIAquick柱按厂商说明纯化后的DNA，用Klenow DNA聚合酶和dNTPs补平。通过热变性使酶失活，再用Nsi I消化DNA获得pDIM-N2，以便将已构建入pDIM-C8中的截断文库插入其中。Nsi I消化后的DNA进行琼脂糖凝胶电泳，分离所需长度的DNA，其中包括插有截断文库的pDIM-N2和pDIM-C8中的截断文库。我们用电洗脱方法从琼脂糖上回收DNA，再通过乙醇沉淀及在20μl或更小体积中连接，获得了最大的文库。
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14.用72μl EB缓冲液从QIAquick柱上洗脱截断的DNA。
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15.将管平衡在37℃。
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16.Klenow处理：加10μl dNTP混合物和10μl Klenow缓冲液，37℃孵育5min。
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17.72℃孵育20min灭活Klenow缓冲液。
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18.限制酶消化：加10μl 10×Nsi I缓冲液，1μl 100×BSA和15单位的Nsi I。
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19.37℃孵育2h。
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20.72℃孵育20min。
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21.通过琼脂糖凝胶电泳，从pDIM-N2 的消化物中提取大片段，从pDIM-C8消化物中提取小片段。
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我们在创建大的文库时，采用S&S Eleutrap电分离系统（Schleicher & Schuell，Keene，New Hampshire 03431）通过从凝胶条上洗脱DNA，再用醋酸铵进行乙醇沉淀浓缩到17μl水中，结果非常理想。
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22.连接：
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17μl DNA
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2μl 连接缓冲液
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6Weiss单位的T4 DNA连接酶
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23.在15℃下孵育≥12h。
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24.转化到所要的宿主。
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方法C：用pDIM-N5制备融合文库
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在此变更方法中，DNA经绿豆核酸酶步骤和用QIAquick柱纯化后，用Klenow DNA聚合酶和dNTPs处理以完全补平截断的基因。热变性使酶失活后，用Nsi I 消化DNA 以分离同步化的截断文库。不需要凝胶纯化即进行连接将使两个文库的成员随机融合，产生ITCHY文库。
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避开凝胶纯化步骤节省了时间并增加了后续连接反应的DNA产量。但它的代价是不能只选择那些所需大小范围内的截断片断，而这些截断片断（1）可能在某些应用中很重要，（2）消除了少量由于初始材料中存在少量切口DNA或由于其他原因而产生的截断副产物。
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14.用72μl EB缓冲液从QIAquick柱上洗脱截断的DNA。
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15.将管平衡在37℃。
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16.Klenow处理：加10μl dNTP混合物和10μl Klenow缓冲液，37℃孵育5min。
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17.72℃孵育20min灭活Klenow缓冲液。
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18.限制酶消化：加10μl 10×Nsi I缓冲液，1μl 100×BSA和15单位的Nsi I。
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19.37℃孵育2h。
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20.72℃孵育20min。
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21.乙醇沉淀后溶于17μl水中。
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22.连接：
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17μl DNA
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2μl 连接缓冲液
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6 Weiss单位的T4 DNA连接酶
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23.在15℃下孵育≥12h。
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24.转化到所要的宿主。
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对渐增截断的控制
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Exo III在截断反应中的作用效果如何，通过简单的对照实验即可获知。在消化过程中，通过将反应体系放大一倍而采样时仅取出通常的样品体积，则在最后一格时间点取完后仍剩余一半的体积。将后者在另外的管中终止，然后如通常一样采用绿豆核酸酶消化和并进一步纯化。发生最大截断的DNA大小可通过琼脂糖凝胶电泳进行分析，以判断截断是正常还是超过了所需要的长度。为了更准确地确定截断DNA的大小，或者如果截断长度与质粒的大小相比太小，那么在电泳前先将截断DNA用限制酶消化可能会有用处。需要记住的是，由于截断长度的标准差的变化是截断长度的0.22倍，因此截断DNA可能会在电泳胶上形成拖尾。
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文库多样性的确认
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转化到适合的宿主菌株后，鉴定渐增截断文库多样性的最简便快捷的方法是对随机挑选的克隆进行PCR，使用的引物与截断范围以外区域互补。放大产物的大小通过琼脂糖凝胶电泳确定。另外，可以随机挑选文库成员，从中提取质粒DNA进行限制酶切分析。
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表28.2 渐增截断技术的可能应用
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结论
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上述总结的方法学为研究蛋白质相互作用提供了多种机会。另外，它也可以对已知蛋白质的性质进行修饰和改变，以及在组合文库的范围内产生新的活性。表28.2给出了渐增截断技术的可能应用范围。
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参考文献
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29 蛋白质家族的新成员——催化抗体
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前言
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抗体在经典上被定义为由免疫系统产生的、能够结合抗原分子从而引发免疫应答的一类蛋白质。抗体的大多数天然抗原是蛋白质，而且抗体和抗原之间的作用力很强，据报道其Kd值在0.01～10 nmol/L 之间（Karush，1978）。根据这一概念，抗体与其他分子特异性结合的功能和酶的功能相似，其区别在于抗体不能催化其结合底物的化学反应。对于大多数抗体而言，这个观点是正确的。然而，1946年Linus Pauling在考虑酶的催化功能时，首次提出酶的活性中心是紧密结合于底物的“紧张结构”（即酶以过渡态结构为靶标），而不是结合于底物分子的基态（Pauling，1946）。根据这一假设，酶和底物之间的结合能对降低反应的活化能起着十分重要的作用，从而催化了化学反应。以此为依据，Jencks在1969年提出设想，如果在一个抗半抗原的免疫反应中，产生针对目的反应过渡态的稳定类似体的抗体，那么这个抗体可能具有酶的活性（Jencks，1969）。实际上，这个预言在1986年第一个抗半抗原单克隆催化抗体获得时就被证实了（见后），并且被称为“抗体酶”（“抗体酶”abzymes来源于“抗体”antibody和“酶”enzyme这两个词）。目前，已经获得的人工单克隆抗体酶能催化100多种不同的化学反应，并且在几种疾病的患者血清及健康母亲的乳汁中也发现了许多天然抗体酶。
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从蛋白质—蛋白质之间相互作用的调节角度来看，特别是在细胞外信号传导的研究中，抗体酶可以在选择性地修饰和消除某些相互作用的蛋白质方面发挥独特的作用。例如，到目前为止，能够识别靶蛋白特定序列并能引发特异性裂解的蛋白酶是比较有限的。这些“限制性的内蛋白酶”包括凝结因子Xa（Nagai and Thogersen，1987）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶和钙蛋白酶（对此讨论，见Wang，2000），它们识别和裂解一个或多个细胞靶蛋白上的短肽序列。因为可以制备针对不同靶序列的（即更有选择性的）抗体酶，就能对任何表面表达的蛋白进行特异性的切割和修饰。理论上说，给定合适的起始半抗原，就能生产针对任何感兴趣的靶蛋白序列的抗体酶，从而精确控制细胞信号的传导。实际上，1988年已生产出第一个酰胺催化抗体，它对底物的催化速度比未催化反应快250000倍（Janda et al.，1988）。从此，许多科学家便开始开发抗体酶作为小分子或蛋白质调节剂的能力。这篇文章综述了在这方面的主要工作，并介绍了有关天然多克隆抗体酶的重要问题。
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人工抗体酶的设计和潜能
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1985年首次发表了制备针对过渡态类似物的单克隆催化抗体的通用方法和利用这些抗体来加速化学反应的报告（Schochetman and Massey，1985）。一年后，两个研究小组首次制备出了具有催化活性的单克隆抗体，它们是针对类似于过渡态的半抗原对硝基苯磷酸胆碱（Pollack et al.，1986）和单芳基磷酸酯（Tramontano et al.，1986a，b）。从那以后，有许多抗体酶的报道，抗体酶催化的反应类型有酰胺和酯的水解，环化反应（参见Janda et al.，1993；Li et al.，1994，1996；Wentworth et al.，1998），脱羧作用（参见Smiley and Benkovic，1994；Barbas et al.，1997；Hotta et al.，2000），内酯化反应（Napper et al.，1987），过氧化反应（Ding et al.，1998），光化学的胸腺嘧啶二聚体的裂解，双分子酰胺键的形成，以及许多其他不能被已知酶催化的反应。有文章还描述了抗体酶在针对蛋白质方面表现出的其他一些特殊功能，包括形成环状肽链（Smithrud et al.，2000），催化蛋白折叠中的肽基—脯氨酰顺反异构化作用（Ma et al.，1998），以及奇特的裂解细菌蛋白Hpr（Liu et al.，1998）。有的抗体酶还和通常的酶一样，其活性需要共作用因子的参与（Iverson and Lerner，1989）。最近，发表了很多有关人工抗体酶的综述（参见Lerner and Tramontano，1987；Stewart and Benkovic，1993；Suzuki，1994；Martin and Schultz，1999，其中的参考文献对相关的反应有进一步的详细阐述）。
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近15年来，人工抗体酶技术不断发展，不仅在生产具有特殊性质的抗体方面有了快速的进展，而且在修饰抗体酶靶向特异性的策略上也不断出新。修饰抗体酶的抗原结合特异性已成功地通过体外遗传学手段实现，如定点突变、基因选择或筛选（如采用噬菌体展示技术等，详见第8章）。另外，还能够通过对纯化的抗体直接进行选择性的化学修饰，包括将催化基团直接导入抗体的结合区。关于这些进展的文章有：Ersoy等（1999），Gao和Paul（1995），Miller等（1997），Roberts等（1994），Stewart等（1994），及其引用的当时的参考文献。这些进展应用后，一些人工抗体酶的底物特异性（和／或作用特异性）可以达到甚至超过具有相同催化作用的酶（Gouverneur et al.，1993；Barbas et al.，1997；Janda et al.，1997），抗体酶的活性机理也变得更加明了（参见Thayer et al.，1999和以下的讨论）。
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天然催化抗体
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抗体固有催化活性的质量控制标准
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由于抗体能够和其他的蛋白质形成复合物，而且抗体介导的催化作用有时反应速率较低，因此，证明一个Ig具有的催化活性不是来源于具有相同特异性的“传统”酶的污染是十分重要的。例如，如果抗体的转化率kcat是1min-1，这也许是抗体中混有0.002%转化率为5×104min-1的酶。Paul等（1989）在第一篇有关天然抗体酶的文章中应用一套严格的质量控制标准，得出哮喘病人血清中IgG对VIP的水解活性是其固有性质的结论（综述，见Paul，1998）。我们注意到这些标准在评价人工生产的抗体酶的性质时也是有用的。Paul及其合作者提出的最重要的质量控制标准如下：
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1.IgG电泳均一（在银染的SDS-PAGE凝胶上）。
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2.纯化的抗体Fab片段保持VIP水解活性。
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3.催化活性完全被抗IgG抗体偶联的琼脂糖凝胶吸附，并能用低pH的缓冲溶液从吸附剂上洗脱。
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4.抗体酶能被抗IgG的抗体免疫沉淀，溶液中的催化活性从而消失。
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5.证明具有水解VIP活性的抗体仅存在于50％哮喘病人，而不存在于健康对照组。
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6.证明在pH2.7条件下对IgG进行凝胶过滤，不会导致抗体酶活性的丧失，因为在此条件下任何非共价结合的蛋白质复合物都会解离（“酸性冲击”），而且酶活性所在的组分相当于凝胶分离中150 kD的IgG。
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7.抗体酶水解VIP的Km值较低（38nmol/L），证明其对底物的高亲和性与多数抗体抗原复合物的Kd值类似。
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8.测定IgG水解VIP的底物特异性与其他已知的蛋白酶不同。
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这些对抗体酶固有催化活性的严格检查指标已被不同研究组修改后采用，作为检测天然催化抗体的基础。由于这个领域的不断发展，我们和其他研究组又加入了一些其他的控制条款到这个标准中。例如：
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1.证明抗体的催化活性不仅能在极低的pH条件下通过凝胶过滤后得以保持，而且在其他能有效解离非共价结合复合物的极端条件下也能保持。这些条件包括使用pH 10～11的强碱性缓冲溶液，或者是含有5mol/L硫氰酸盐或6mol/L氯化胍的中性缓冲液（Kit et al.，1995；Nevinsky et al.，1998）。
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2.一种实验模型已被用来分析分离的有效性，含有均一的抗体酶和具有相似特异性酶的混合物，在极端条件下通过蛋白质A琼脂糖凝胶色谱和凝胶过滤后，抗体酶能从外加的酶中有效分离出来（参见Andrievskaya et al.，2000；Vlassov et al.，1998a，b）。
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3.在温和条件下（1mmol/L巯基乙醇和4mol/L尿素）将免疫球蛋白的轻链和/或重链解离，再用亲和层析色谱分离，测定分离的轻链和/或重链的催化活性，能够为抗体的固有催化性质提供很好的证据（Kanyshkova et al.，1997；Buneva et al.，1998；Nevinsky et al.，1998，2000）。
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4.抗体具有酶活性的直接证据还可以通过采用一种亲和修饰的方法来获得。在这个方法中可以证明，底物的活性类似物是与抗体酶而不是与可能的污染蛋白共价结合（Buneva et al.，1994；Kit et al.，1995；Kanyshkova et al.，1997；Nevinsky et al.，1998，2000；Semenov et al.，1998）。
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5.抗体作为催化剂存在的更有力的标准是在有相应底物的凝胶中原位检测抗体以及其Fab片段的催化活性（Kanyshkova et al.，1997；Barbnovskii et al.，1998；Buneva et al.，1998；Semenov et al.，1998；Andrievskaya et al.，2000）。例如，健康母乳中IgG及这一IgG的Fab片段在非还原条件下用含DNA的凝胶分离，水解 DNA的活性组分被证明同时存在于IgG和Fab的条带中（图29.1）（Buneva et al.，1998）。同样的结果在研究水解RNA活性时也被证实（Andrievskaya et al.，2000）。原位检测在还原SDS-PAGE中分离的IgG轻重链催化活性有时能作为这些评判标准的补充。对于有些抗体酶，在含DNA的凝胶中只有单独的抗体轻链或重链显示水解 DNA的活性（Kanyshkova et al.，1997；Baranovskii et al.，1998；Andrievskaya et al.，2000）。然而，这一标准不是普遍适用的，当某些其他的免疫球蛋白被还原后，凝胶分析显示H链和L链分离后没有DNA水解活性（Semenov et al.，1998；Nevinsky et al.，2000）。
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图29.1 原位凝胶分析乳IgG（1，3，5，6道）和其Fab片段（2，4道）的DNAase活性
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这些试验与Paul最初的评判标准结合在一起，提供了充分的证据支持天然抗体酶对多种反应有催化作用。其中的一些实验尤其是原位观察抗体、其Fab片段和其分离的轻、重链所诱导的催化活性，是最为严格且毫无争议地说明了观察到的催化活性是由抗体产生的而不是由污染蛋白引起的，这为以后对抗体酶活性的结构和功能分析提供了基础。
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高催化活性的天然抗体酶的分离
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抗体酶是抗体中的一部分，它是用与一般抗体类似的实验方案纯化和处理获得的（Harlowand Lane，1998）。抗体分离的标准方案第一步是要将由多种免疫球蛋白组成的总抗体组分分离出来，这些免疫球蛋白对各种抗原具有不同的亲和力，抗原种类包括蛋白质、核酸或其他能与抗体紧密结合的物质。第二步是制备针对单个天然抗原的抗体。所有这些抗体是多克隆的，可能含多种多样不同的免疫球蛋白分子，其中抗体酶和其他不具有催化活性的抗原结合性抗体混在一起。不同患者的全部抗体组分是不同的，而不同的抗体组分与其固相化配基的亲和力相差好几个数量级（Kit et al.，1995；Ievinsky et al.，1998）。为简化纯化过程，一般只纯化对目的底物亲和力最高的抗体。
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纯化天然抗体酶的第一步是在较粗略的条件下在蛋白A琼脂糖凝胶上用含有抗IgG、抗IgM、抗IgA抗体的吸附剂进行亲和层析。通常，这一步应产生性质均一的抗体，可采用SDS-PAGE（银染）或Western Blot（免疫探针）检测，确保有效除去了与抗体非特异性结合的蛋白质。下一步是通过DEAE纤维素色谱，并将抗体制备物置于pH2.6溶液中孵温1h以分解非共价结合复合物，接着在用相同酸性缓冲溶液平衡的Toyopearl HW-60吸附剂上进行凝胶过滤（Kit et al.，1995；Nevinsky et al.，1998和其中参考文献）。这些步骤能够最大限度地减少制备的抗体酶中含有任何污染蛋白的可能性。然而，我们注意到这一纯化过程中的缺点是低pH可能会破坏有些抗体酶的催化活性。最后一步是催化抗体制备物在其固相化的底物（蛋白质、核酸、核苷酸等）偶联的吸附剂上进行亲和层析，这样通常就会分离得到不同的、具有相当显著差异的单特异性催化抗体组分。例如，人乳中的sIgA在ATP琼脂糖凝胶上的亲和层析证明，这些sIgA对ATP有不同的亲和力（图29.2）。常常有些片段需要在破坏非常稳定的免疫复合物的条件下（3mol/L NaCl，3mol/L MgCl2）才能被洗脱（Nevinsky et al.，1998），这一步富集了与底物有强结合能力的抗体。
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图29.2 具有酪蛋白激酶活性的人乳sIgA在ATP琼脂糖凝胶上的亲和层析
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理想的话，在抗体酶纯化的最后一步就能将抗体酶从有同样特异性但无催化活性的抗体中分离出来。但目前还没有这种方法的报道。结果，所有已报道的多克隆抗体酶都是具有相同特异性的有催化活性和无催化活性抗体的混合物。由于这个原因，多克隆抗体酶的相对特异的活性都被低估了，特别是当用亲和层析方法分离的、与给定底物具有高亲和力的抗体酶部分只占整个抗体制备物的1%～5％时更是如此（G.A.Nevinsky et al.，未发表）。
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抗体酶机制的研究
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若将抗体酶作为生物操作的工具来发展，就必须详细地了解抗体酶活性的结构基础。尽管多克隆抗体酶的研究提供了有关抗体潜在催化活性的重要信息，但结构研究需要纯化的、单一的和高浓度的物质。因此，这些研究需依赖于单克隆抗体或者是重组抗体。已有大量的催化抗体被用于作为理解催化基础的模型来分析，这些工作简要总结如下：
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第一个报道的多克隆抗体酶——水解VIP的抗体酶（Paul et al.，1989），被用来作机理分析。VIP抗体酶的轻链在细菌中表达、纯化后，发现其具有独立的催化活性（Gao and Paul，1995；Tyutyulkova et al.，1996）。后来，将这个轻链的VL结构域通过一个14氨基酸短肽与其天然的VH结构域相互连结，形成单链FV结构，单链FV对底物的基态具有更强的亲和力。从这些和其他的数据，推断出了抗VIP抗体的催化模型：主要的催化残基位于VL结构域，VH结构域的其他残基与高亲和底物结合力有关（Sun et al.，1997）。
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分子模拟显示VIP水解抗体酶的轻链上有丝氨酸蛋白激酶样的活性位点存在。重组轻链抗体的水解活性受到丝氨酸蛋白酶抑制剂的抑制，但不受其他类型蛋白酶的抑制剂影响，这一结果可以证明上述假设。丝氨酸蛋白酶机制得到进一步的证实，是通过将一个框架区残基Asp l（Gololobov et al.，1999）和两个互补决定区（CDR）的残基Ser-27a和His-93（Gao and Paul，1995）进行定点突变后，催化活性就丧失了。这些残基形成了一个与丝氨酸蛋白酶上类似的催化三联体。这些突变只特异性地影响催化活性，而不影响结合活性。在Ser-27a或His-93上的突变对轻链与底物基态的亲和力几乎没有影响。相反，Ser-26单突变或His-27d/Asp-28双突变则表现出KM值升高（约10倍）和转换率增加（约10倍）。因此，就有两类参与催化作用的轻链氨基酸残基：催化所必需的残基和参加与VIP结合并间接限制酶/底物转换率的残基。据已知，所有这三个关键的催化残基（Ser-27a、His-93、Asp-1）存在于成熟VL的胚系相应位置，然而成熟的和胚系的VL序列差异仅在于远离催化位点的4个氨基酸不同（Gololobov et al.，1999）。成熟的和胚系的抗体轻链只有很小的动力学常数的差别。这些数据表明VIP水解抗体的催化活性是由胚系的VL基因编码的，但有可能通过体细胞的多样化和轻链与合适的重链配对而增强其活性（综述，参见Paul，1998；Gololobov et al.，2000）。
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另一深入研究的系统是有酯酶样活性的催化抗体。这类抗体酶Fab片段晶体结构分析表明，其配基对硝基苯基酯是同时与抗体酶的轻链和重链上的氨基酸残基一起相互作用（Golinelli-Pimpaneau et al.，1994）。在抗体的催化中心，2个酪氨酸模拟了丝氨酸蛋白酶的氧阴离子结合孔。在一系列的研究中，比较了胚系和亲和性成熟的Fab抗体酶与底物硝基苯膦酸酯结合力的变化（Patten et al.，1996；Wedemayer et al.，1997a，b）。有趣的是，二者的结合性质是不同的，胚系抗体酶在与半抗原结合后构象发生很大变化，而亲和性成熟的Fab是通过锁钥机制结合的。这些构象变化使抗体酶与底物的亲和力提高约104倍，复合物离解率则降低。这些研究将被应用于由详细的结构知识指导的体外突变，以获得改进的新型抗体酶，能裂解那些有生物学意义的蛋白质。
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结论
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越来越多的数据表明催化性抗体酶在免疫防御、调节和自身免疫功能障碍中是重要的调节剂。需要不断地对抗体介导的催化反应进行研究，主要是对实验免疫和自身免疫性疾病以及对抗体和其亚单位催化机制的研究，才能知道抗体酶在这些生物现象中起多大的作用。从技术角度上看，重要的是对人工抗体酶和天然抗体酶进一步研究，以便理解其结构与功能的关系，制备出有治疗应用价值的定制的催化剂。因为某些抗体的催化活性是一种天然功能（Gololobor et al.，1999），事实上制备针对任何靶多肽的特异性催化剂都是可能的，然后再通过体外或体内亲和选择来进行改进。催化抗体的X光结构越多，就会提供越多的答案来回答一个抗体究竟是如何催化一个酶样的反应的。改进策略包括类似于酶中的氨基酸重排列（Zhou et al.，1994），以及完全不同于那些酶在自然进化中的氨基酸重排列（Charbonnier et al.，1995）。抗特异型抗体途经可以用抗体酶模拟许多有用的酶（Kolesnikov et al.，2000）。抗体酶技术可以用来分离适用于对主要疾病进行被动免疫治疗的有效催化剂。例如，可卡因水解抗体酶已被制备出来，也许能为解决毒品成瘾问题提供一个新颖的方法（De Prada et al.，2000）。能够裂解人类免疫缺陷病毒（HIV）gp120蛋白的抗体酶可用于AIDS的治疗（Paul et al.，2000）。通过对抗体酶的理性设计，使其具有独特的和新颖的功能，能够对表面蛋白进行选择性的裂解，就有希望对体内蛋白质—蛋白质之间的控制达到前所未有的水平。
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30 通过核糖体展示进行蛋白质—配体相互作用的体外筛选和进化
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前言
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核糖体展示的原理
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蛋白质筛选的前提是基因型（RNA，DNA）与表型（蛋白质）的偶联。在核糖体展示中，这种联系是通过核糖体复合物的体外翻译完成的，该复合物由mRNA、核糖体以及正确折叠并仍然连接在核糖体上的新生肽组成（图30.1）（Hanes and Plückthun，1997）。
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图30.1 核糖体展示的原理
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编码特定目的蛋白的DNA文库（如抗体scFv单链片段文库）经体外转录，纯化的mRNA可用于体外翻译。由于已从DNA文库的蛋白质编码序列中去除了终止密码子，因此体外翻译时核糖体停止于mRNA的3′末端，导致mRNA—核糖体—编码蛋白三重复合物的形成（图30.1）。蛋白质可以在核糖体上正确折叠，这是因为在其C末端通过基因工程的方法融合了一个间隔区，它能够使目的蛋白在核糖体隧道之外折叠。通过高浓度的镁离子和低温可以使核糖体复合物保持稳定。体外翻译后，核糖体复合物可以直接用于配体的筛选，这些配体可以固定在某一固体表面或在溶液中（溶液中结合的核糖体复合物接着可以被链霉亲和素包裹的珠子捕获）。在数次洗涤步骤中，未结合的复合物被除去。利用EDTA能够使核糖体复合物解离的原理，可以将筛选获得的复合物中的mRNA洗脱下来。将mRNA纯化，反转录，然后经PCR扩增。在接下来的PCR扩增中，采用适当的引物重新引入T7启动子和SD序列。新形成的DNA文库可以直接用于下一轮的筛选或用于放射免疫实验（RIA），也可以克隆到载体上用于测序或大规模地表达筛选获得的结合物。经过一轮核糖体展示，结合物的富集率一般可达100～1000倍（Hanes and Plückthun，1997）。
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核糖体展示的应用
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核糖体展示最早被用于筛选靶蛋白的肽类配体（Matteakis et al.，1994；Gersuk et al.，1997）。该方法经我们实验室进一步改进后用于整个功能蛋白的展示，而且要求这些蛋白质能够正确折叠并仍然与核糖体相连（Hanes and Plückthun，1997）。在一模式系统中，应用抗体的两个截然不同的scFv片段，通过核糖体展示的五轮选择循环，特异scFv的富集率比非特异scFv提高了109倍，平均每轮富集率为100倍（Hanes and Plückthun，1997）。另外，用来源于免疫鼠脾脏的核糖体展示文库，筛选和进化与Gcn 4p突变肽结合的scFv片段，亲和力可达40pmol/L（Hanes et al.，1998）。
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后来，研究表明应用核糖体展示有可能从头制备具有新特异性的抗体。起始于人源组合抗体库HuCAL（Knappik et al.，2000），通过核糖体展示筛选与进化可以获得亲和力达pmol/L的胰岛素结合物（Hanes et al.，2000）。在核糖体展示的PCR扩增循环中，所有筛选得到的抗体都堆积了许多突变，抗体的亲和力与最初抗体库相比也提高了40倍。在针对非寻常DNA结构（鸟嘌呤四元DNA）的抗体筛选时，结果表明应用核糖体展示可以获得高特异性的抗体（Schaffitzel et al.，2001）。筛选获得的抗鸟嘌呤四聚体抗体被用于纤毛虫Stylonychia lemnae 巨核的体内标记，首次证实生理系统中存在鸟嘌呤四元DNA（Schaffitzel et al.，2001）。
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核糖体展示还能被用作起始于单一蛋白质的体外进化方法。事实上，将核糖体展示与易错PCR及DNA 改组联合应用可以将scFv与其抗原的亲和力提高30倍至pmol/L水平（Jermutus et al.，2001）。此外，核糖体展示可用来提高scFv片段的稳定性，方法是在连续数轮的体外翻译过程中增加DTT的含量（Jermutus et al.，2001）。采用这种策略，使筛选的抗体在10mmol/L DTT存在下可以保持恰当的折叠，这与胞浆的还原环境相当，此时二硫键通常不易形成。这些例子提示，核糖体展示能够成为一种常规的快速的内在抗体（能够用于胞浆的抗体）制备方法。最后，通过在“自杀底物”抑制剂存在下的核糖体展示筛选，活性β-内酰胺酶比其失活突变体优先得到富集，提示核糖体展示还能用于酶的筛选（P.Amstutz et al.，未发表资料）。
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在下述方案中，我们描述了用大肠杆菌S30提取物作为体外翻译系统的核糖体展示筛选方法。然而，需要提及的是，真核体外转录系统如兔网织红细胞裂解物和麦胚裂解物同样能用于核糖体展示（Gersuk et al.，1997；He and Taussig，1997；Hanes et al.，1999；He et al.，1999）。
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程序纲要
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用于核糖体展示的构建组分
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核糖体展示构建组分（图30.2）的几个特征对蛋白质的高效展示是至关重要的。在DNA水平，组分中需要有T7启动子以增强体外转录，产生mRNA。在mRNA水平，组分中应含有核糖体结合位点，紧接其后是编码将要展示的蛋白质（文库）序列。紧接蛋白质文库序列是一个与之阅读框架相融合的间隔序列。间隔序列的C末端将新生蛋白连接在核糖体上并维持蛋白质的结构部分在核糖体隧道之外，使蛋白质能够正确折叠并与配体相互作用。成功应用的一个间隔序列是来源于M13丝状噬菌体的基因Ⅲ，覆盖130—204氨基酸序列（SwissProt P03622）。另外，大肠杆菌基因来源的tolA 或tonB 也能用做间隔区。对tolA 来说，用其130—204氨基酸序列（SwissProt JV0057）；对tonB，用其62—289氨基酸序列（SwissProt PO2929）。开放阅读框架刚好延长到作为转录模板的DNA末端，没有终止密码子。因为终止密码子会导致蛋白质的释放，核糖体复合物因此会解离。
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图30.2 核糖体展示的构建组分
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核糖体展示构建组分中mRNA的两端必须含有茎环结构。已知5′和3′末端的茎环结构能够稳定mRNA，在体内外防止RNase的降解（Hajnsdorf et al.，1996）。茎环结构的存在是十分重要的，特别是在大肠杆菌核糖体展示系统中尤为如此。因为大肠杆菌的20种RNase中，至少有5种与mRNA的降解有关（Hajnsdorf et al.，1996），而且它们几乎全部存在于用于体外翻译的S30提取物中。将来源于T7噬菌体gene 10的5′端茎环结构（表30.1）和来源于T3噬菌体早期终止子的3′端茎环结构稍作修饰产生一个阅读框架（表30.1）后引入核糖体展示组分中，可将核糖体展示的效率提高约15倍（Hanes and Plückthun，1997）。
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核糖体展示构建组分的制备
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通过连接或装配 PCR的方法可以完全在体外容易和快捷地制备核糖体展示组分，而且还具有在转化步骤中不丢失文库多样性的优点。作为例子，我们描述了起始于scFv文库组分的构建。我们采用gene Ⅲ蛋白的C末端区域作为间隔区。该间隔区可通过Sfi Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切pAK200载体（Krebber et al.，1997）获得。
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天然来源的或人工合成的scFv文库的制备方法已在其他地方描述（Krebber et al.，1997；Knappik et al.，2000）。为了完成PCR扩增，DNA文库的N末端和C末端必须是固定编码区域。在我们的构建物中，编码序列起始于一个检测蛋白质表达的FLAG标签。构建好的文库经过PCR扩增。如果文库中事先没有限制性酶切位点，那么应该使用一个在N末端能引入Nco Ⅰ酶切位点的引物（如SDA引物）和另一个能在scFv文库终止密码子前的C末端引入Sfi Ⅰ酶切位点的引物。经Sfi Ⅰ酶切消化后，用制备凝胶电泳纯化编码文库的片段。编码gene Ⅲ间隔区的DNA必须事先经SfiⅠ切割，同样经制备凝胶电泳纯化，然后在连接反应中加入的量至少是DNA文库片段的两倍。连接产物直接经PCR扩增，所用引物为SDA和T3te（表30.1）。通过制备凝胶电泳或PCR纯化试剂盒纯化PCR产物以除去非特异寡核苷酸。进行第二次PCR时使用的引物为T7B和T3te（表30.1）。
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另外，装配 PCR也可用于制备核糖体展示的构建组分。与连接方案相比，装配PCR优点是操作相对快捷和容易。然而，由于连接更有效，所以在克隆非常复杂的文库到核糖体展示格式中时，不提倡用装配 PCR的方法。对使用gene Ⅲ间隔区的装配 PCR来说，编码gene Ⅲ蛋白C末端的间隔区是从质粒pAK200（Krebber et al.，1997）经引物Gene-ⅢAB（含有一个编码DNA文库3′末端的5′突出端）和T3te扩增出来的。与此同时，使用引物SDA和ABrev扩增scFv文库。两种PCR产物都需经凝胶电泳纯化。要完成装配PCR，需在反应体系中加入等摩尔的scFv文库DNA和gene Ⅲ间隔区。为了获得组装的文库gene Ⅲ融合产物，在最初的几个循环中不使用任何引物。在最后的10～15个循环中加入引物SDA和T3te到装配 PCR反应中，以扩增所需要的核糖体展示构建组分。
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可以直接从大肠杆菌集落中扩增出tolA和tonB 间隔区。为此，用牙签挑取少量集落（任何大肠杆菌菌株皆可；我们通常使用SB536；Bass et al.，1996），然后转移到分别含有引物tolA fwd/tolA rev或tonB fwd/tonB rev的标准PCR反应混合物中。经过30个PCR循环，会出现一条非常清晰的条带，该DNA经凝胶纯化后可以直接用于装配 PCR。当然，这些间隔区也能够从含有间隔区的质粒上扩增或切割下来。
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PCR产物的质量对核糖体展示来说是非常关键的。因此，必须用分析级琼脂糖凝胶电泳检查PCR产物只含有一条预期大小的强的DNA条带，而没有弥散或其他副产物。因为后两者都能降低核糖体展示的效率。DNA的浓度应不少于20ng/μl。
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体外转录
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PCR产物（含有T7启动子，核糖体结合位点，融合了间隔区的DNA文库）在T7 RNA聚合酶存在下可以直接用于体外转录（Pokrovskaya and Gurevich，1994）。按给出的方案，1～2μg PCR产物模板在200μl转录反应体系中，经2～3h可以得到约0.1mg的mRNA。转录获得的mRNA可用LiCl沉淀纯化接着用乙醇沉淀。
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用大肠杆菌S30细胞提取物进行体外翻译
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对于大肠杆菌体外翻译系统，从大肠杆菌MRE600细胞（Wade and Robinson，1996）中制备S30提取物可以按下述方案进行，该方案是基于Chen和Zubay（1983）以及Pratt（1984）的方法改进而成的。特别强调的是，如果要展示的蛋白质中含有二硫键，那么在所有展示缓冲液中都要去除还原性物质DTT和β巯基乙醇。用于核糖体展示的大肠杆菌系统需要按照Pratt（1984）的方法进行优化，主要考虑Mg2+和K+离子的浓度、所使用的S30提取物的量以及翻译的时间（Hanes et al.，1999）。蛋白质的合成遵循一个饱和曲线，大约在30min后达到平台（Ryabova et al.，1997）。与此同时，mRNA也在不断地降解。因此，存在一个最佳时间，此时可用于筛选的完整mRNA—核糖体—蛋白质复合物的浓度达到最大。对用做大肠杆菌核糖体展示的体外翻译来说，这个最佳时间点通常在翻译起始后的6～10min之间。但是对每一批次S30提取物来说都还需要优化。我们发现，尽管大多数蛋白质在体外低温情况下都更能有效折叠，但是至少对抗体的scFv 片段来说，含有功能性蛋白质的核糖体复合物更多的是当反应温度达到37℃时获得的，这也许是大肠杆菌提取物中的分子伴侣活性引起的。这里需要提及的是，对于分子量＞70000的大蛋白质的合成并不十分有效，这是由于翻译的提早终止引起的（Ramachandiran et al.，2000）。
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实现高效核糖体展示的一个重要前提是去除10Sa-RNA。作为一种监督机制，10Sa-RNA与蛋白质的释放和降解有关，该蛋白来源于缺少终止密码子的mRNA（Keiler et al.，1996）。要抑制这种降解机制，可以在体外翻译反应中加入一种名为anti-ssrA（表30.1）的反义寡核苷酸，使其结合10Sa-RNA的mRNA部分。
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表30.1 用于核糖体展示的寡核苷酸
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对于含有二硫键的蛋白质的翻译来说，具有一种氧化环境是十分重要的。因此，为了形成二硫键，翻译反应中不能存在有DTT（Ryabova et al.，1997）。然而，在体外转录过程中，还原剂的存在对T7 RNA聚合酶的稳定性是必需的。因此，体外转录和无细胞翻译是在两个分开的步骤中完成的，这当中需要分离和纯化mRNA。蛋白质二硫化物异构酶（PDI），作为一种真核伴侣分子能够催化二硫键的形成（Freedman et al.，1995），将抗体片段的核糖体展示效率提高3倍（Hanes and Plückthun，1997）。
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亲和筛选
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已终止并被稀释过的翻译混合物可以直接用于筛选实验。亲和筛选应在50mmol/L镁离子存在及冰浴下进行。在此条件下，核糖体复合物至少可以稳定保存10d以上（Jermutus et al.，2001）。
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在某一特殊实验中，如果大肠杆菌蛋白质或翻译混合物中的其他成分出现问题，可以用蔗糖垫层超速离心的方法纯化核糖体复合物（Matteakis et al.，1996）。已终止的翻译混合物经过超速离心，核糖体复合物会形成沉淀，因此可将它与存在于上清中的游离蛋白质及小分子化合物分开。凝胶过滤是一种较温和的分离复合物的方法（P.Amatutz，未发表资料）。凝胶过滤柱可以有效地将核糖体复合物与游离蛋白质及小分子化合物分离。凝胶珠子的分离范围可以选择在5×104～2×107 D 之间（CL-4B Sepharose，Pharmacia），此分离范围的柱床体积应是上样体积的４倍。通过一个非常简单的实验就可以确定含有核糖体复合物但不含游离蛋白质的洗脱组分（见后面叙述）。
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对亲和筛选来说，靶蛋白可以固定在一个固体表面。该方法承担的风险是，由于靶蛋白与塑料表面的疏水作用，有可能使靶蛋白在塑料表面部分变性，此种情况下筛选获得的抗体不能识别靶蛋白的天然构像。我们发现，在溶液中的筛选背景（非特异结合）相对较低。在溶液中筛选，配体必须是生物素标记的，并且用链霉亲和素包被的磁珠捕获核糖体复合物。配体应含有一个3nm的与生物素结合的连接臂，这样配体仍然能够接近核糖体展示的蛋白质并且不会被链霉亲和素结合口袋遮掩。为了避免筛选出链霉亲和素的结合物，建议在每一轮核糖体展示之后交替使用链霉亲和素包被的磁珠和亲和素琼脂糖捕获配体。
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为了减少背景信号，防止核糖体复合物与塑料表面非特异结合，筛选应在无菌、去生物素的脱脂牛奶（1%～2%）和0.25%（W/V）肝素存在下进行。另外，肝素还能抑制核酸酶。经过数轮洗涤步骤，大部分未结合的或弱结合的核糖体复合物被除去。用含有EDTA的缓冲液解离核糖体复合物能够回收结合复合物中的mRNA，因为EDTA能够螯合稳定核糖体复合物所需的镁离子。通过解离复合物的方法回收mRNA的优点是不必破坏蛋白质—配体的相互作用，因此高亲和力的结合物可以像低亲和力的结合物一样高效洗脱。
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核糖体复合物解离以后，分离mRNA，用引物T3te（表30.1）进行反转录，然后用引物SDA（表30.1）和T3te进行PCR扩增。第一次PCR的产物经制备型琼脂糖凝胶电泳纯化后可以用作第二次PCR扩增的模板。第二次PCR扩增所使用的引物是T7B（表30.1）和T3te。产生的PCR产物可以直接用于下一轮核糖体展示，或用于放射免疫实验，或通过NcoⅠ和SfiⅠ将其克隆到表达载体中。
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特异结合物是否得到了富集可以通过在非特异表面（也即不加抗原）上的筛选（背景对照）来控制。如果特异性结合物的DNA文库得到了富集，那么核糖体展示筛选后有抗原存在下的PCR信号应该比较强。
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通过适应筛选压力剪切分子
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亲和性基本上是由解离速率决定的，因为结合速率属于一个相对较窄的时相（Schwesinger et al.，2000及其文中相关文献）。为了获得非常高的亲和性，解离速率型筛选被成功地应用（Hawkins et al.，1992；Yang et al.，1995；Boder and Wittrup，1997；Chen et al.，1999；Jermutus et al.，2001）。理论上，人们可以用非常少量的抗原，但是实际上，这种策略往往不成功，原因在别的文献中已有叙述（Plückthun et al.，2000）。在解离速率型筛选过程中，翻译形成的核糖体复合物首先与生物素标记的抗原平衡。所用的标记抗原浓度基本上应该使所有具有结合位点的复合物都被结合。反应平衡以后，加入远远过量的竞争性的非标记抗原，使每一个从相应标记的抗原上解离的复合物都被竞争性的抗原捕获，而不能与链霉亲和素包被的磁珠结合。复合物与竞争性抗原的孵育时间与仍然结合标记抗原的复合物平均亲和性之间存在简单的相关性。
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此类型的筛选不但可以为了亲和性而进行，而且还能考虑文库的许多其他物理化学特性。如果靶蛋白含有活性必需的二硫键，如scFv片段，为了靶蛋白的稳定性，筛选可以在还原状态下进行（Jermutus et al.，2001）。随着淘洗过程中DTT浓度的不断增加，数轮核糖体展示后，进化分子的稳定性也会得到加强。依照此原理，只要核糖体复合物能够保持稳定，在有机溶剂、去污剂或其他条件下靶蛋白的稳定性筛选是可以想像的。
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从筛选到进化
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核糖体展示最初是作为一种高效的体外筛选方法而建立的（Hanes and Plückthun，1997），通过5轮筛选富集率可达109。该方法完全在体外进行，这就使其能够在不同轮回的筛选之间很方便地完成进一步的随机化步骤。存在于原始方案中的内在多样性，包括所有筛选轮回中近百次PCR循环，确实引入许多突变，特别是当使用非校正Taq 聚合酶时更是如此（Hanes et al.，1999）。通过易错PCR及DNase Ⅰ 改组可以大大加强这种效果（Cadwell and Joyce，1992；Stemmer，1994；Zaccolo et al.，1996）。这些随机化步骤都是在RT-PCR之后进行的。
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在易错PCR过程中引起的序列随机化是一种很成熟的引起基因突变的方法。突变的产生既可以通过在PCR反应中加入锰离子实现（因为锰离子可以降低大多数聚合酶的保真性），也可以通过掺入dNTP类似物如8-氧代-鸟苷或dPTP完成（Zaccolo et al.，1996）。这会引起第二条链合成时发生碱基错配，继而导致该部位的突变。由于随机化的程度依赖于锰离子和dNTP类似物的浓度，因此随机化的程度能够被控制。值得一提的是，引入的突变数量不但依赖于所使用的聚合酶，或者在PCR过程中的添加剂浓度，而且还依赖于PCR扩增步骤的次数。
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DNase I改组是引起基因突变和重组前面选择轮回产生的突变的一种高效方法（Stemmer，1994）。由于它能离散突变（否则这些突变在物理上是相连的）并能随机地重组它们，因此应该考虑保证不要累积太多有害的突变。
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通过亲和筛选获得的mRNA库经反转录以后，再经PCR扩增直至在分析型琼脂糖凝胶电泳上呈现一条很强的条带。DNA经凝胶纯化，然后用DNase I消化，使获得的片段大小在50～150bp之间。在孵育一定时间以后，很有必要取出少量样本在琼脂糖胶上分析消化的程度，同时应将剩余的样本快速冷冻。该监控步骤能确保获得的片段不要太小，小片段不但不需要而且还会造成装配困难。消化的片段经琼脂糖凝胶和小片段回收试剂盒分离纯化。获得的片段接着通过一种含有吐温-20或类似去垢剂但不含有引物的特殊PCR组装到一个全长的构建组分中。用琼脂糖凝胶分离此全长条带，并通过正常PCR将它扩增到核糖体展示构建组分中去。易错PCR和DNase I 改组两种方法的联合应用保证了高度的随机化，同时也降低了有害突变为妨碍有益突变效果的风险。
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DNA文库和单克隆的RIA分析
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利用RIA可以检测文库中是否有特异结合物的存在。在RIA实验中，由于体外转录时掺入了[35S]甲硫氨酸，因此放射性标记的蛋白质与固定化配体的结合可以被定量。翻译的时间通常为30min左右，此时蛋白质合成达到平台期（Ryabova et al.，1997）。翻译终止后，可以加入游离的配体进行抑制试验，或将翻译混合物直接转移到含有固定化配体的微孔板中。
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必须设置多种对照实验：应当检测文库编码的蛋白质与非特异表面（如牛奶包被的表面或中性亲和素包被的表面）的结合。同样，RIA实验须同样在含有或不含有作为竞争剂的游离配体的存在下进行。如果有特异结合，在特异表面上的RIA信号应该强于对照表面，而且特别重要的是，作为竞争剂的游离配体能够抑制这种结合。
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如果情况确实如此，说明与靶子结合的文库得到了明显富集。为了鉴别每一个结合物，将文库DNA通过Sfi Ⅰ和Nco Ⅰ限制性酶切位点克隆到表达载体中并做进一步鉴定（图30.2；表30.1）。将单克隆的质粒DNA按照实验方案在体外转录，获得的单克隆mRNA用于RIA以鉴别特异结合物。富集的DNA文库还可以克隆到所表达的蛋白质上有多肽检测标签的质粒中，这样就能够用ELISA（酶联免疫吸附实验）的方法纯化和进一步分析结合物，避免在RIA中使用放射性。
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核糖体展示的优化
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首先应该用一个明确的、已知的模式系统来建立和优化核糖体展示。模式蛋白，如抗体 scFv片段，在核糖体展示中应当明确地与其配体结合。与非特异表面相比，在包被有配体的表面上应有富集。正如上面提到的，体外翻译时要优化镁离子和钾离子的浓度、提取物使用的量以及翻译的时间（Pratt，1984）。对每一批新制备的大肠杆菌S30细胞提取物都需要优化这些参数。为了确定最佳的离子浓度，最方便的是体外翻译一些活性测定比较简单的酶，如β-内酰胺酶或萤火虫荧光素酶。此时，可以很容易监控在不同条件下蛋白质的产生情况。建议首先优化Mg2+离子的浓度，然后将此浓度在所有其他实验中贯穿使用。
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为了确定最佳翻译时间（此时存在的功能性核糖体复合物的量最多），必须用编码模式蛋白（如抗体）的核糖体展示构建组分进行体外翻译和亲和筛选。在37℃孵育不同时间后，终止体外翻译反应。将所有反应液用于已固定化于某一表面的相应配体的亲和筛选。亲和筛选后，洗脱的mRNA既可以用于RT-PCR，也可以用于Northern 杂交。Northern 杂交在检测量上有微小差别的mRNA时更灵敏。在Northern 杂交时，可以用地高辛标记的探针来监控和定量分离的mRNA，该探针能与mRNA构建组分（Anti-SDA，表30.1）特异性地退火。图30.3所示的是在进行核糖体展示过程中所有步骤之间的联系。
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图30.3 核糖体展示步骤流程图
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方案
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方案1：通过连接制备核糖体展示构建组分
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材料
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缓冲液，溶液及试剂
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dNTPs，每种20mmol/L（Roche Diagnostics）
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二甲基亚砜（DMSO）（Fluka）〈！〉
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寡聚核苷酸SDA，T7B，T3te，Gene-ⅢAB，ABrev（见表30.1）
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QIA快速凝胶提取试剂盒（Qiagen）
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Tris-HCl（10mmol/L，pH8.5）
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生物分子
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Sfi Ⅰ/Nco Ⅰ酶切的编码蛋白的DNA文库片段，如scFV抗体库（150ng，约 2×1011个分子）
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Gene Ⅲ间隔区经SfiⅠ/HindⅢ酶切后的片段
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T4DNA连接酶（Roche Diagnostics）
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Taq 聚合酶（GIBCO BRL）
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专门设备
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琼脂糖凝胶电泳装置
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热循环仪
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方法
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通过连接法的制备
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1.用Hind Ⅲ和Sfi Ⅰ消化载体pAK200（Krebber et al.，1997），然后通过琼脂糖凝胶电泳和QIA快速凝胶试剂盒纯化编码gene Ⅲ间隔区的481bp的片段。
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2.用Sfi Ⅰ和Nco Ⅰ消化编码文库的质粒，并经琼脂糖凝胶电泳纯化之。
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3.用10个单位的T4DNA连接酶将150ng编码DNA文库的片段与3倍量的gene Ⅲ间隔区，16℃连接过夜。
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4.按mRNA纯化和RT-PCR方案（方案6）中步骤5描述的方法，用引物SDA和T3te进行PCR扩增。用5～10μl连接混合物作为50μl PCR反应体系的模板。程序为：首先94℃4min，然后进行5个循环的94℃30s，37℃30s，72℃2.5min，接着用同样的参数再进行15～20个循环，但是退火温度由37℃变为50℃，最后72℃延伸10min。
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5.用琼脂糖凝胶抽提法纯化PCR产物，然后用它进行第二轮PCR，引物为T7B和T3te（见mRNA的纯化和RT-PCR方案的步骤7，方案6），通常进行12～16个循环。
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通过装配PCR制备核糖体展示的构建组分
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1.用引物Gene-IIIAB和T3te从载体pAK200中PCR扩增gene III编码蛋白的C末端结构域，用引物SDA和ABrev扩增DNA文库。
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2.用琼脂糖凝胶抽提法纯化PCR产物，然后用等摩尔的每种DNA进行装配PCR，程序如下：首先94℃4min，然后进行5个循环的94℃30s，50℃30s，72℃ 2.5min，接着加入引物SDA及T3te，再进行12个循环的94℃30s，45℃30s，72℃2.5min。
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3.用琼脂糖凝胶抽提法纯化适当大小的PCR产物，然后用引物T7B和T3te进行最后一轮PCR，以引入T7启动子（见mRNA的纯化和RT-PCR方案的步骤7，方案6）。
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方案2：体外转录及mRNA的纯化
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材料
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缓冲液及溶液
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分子克隆手册：蛋白质—蛋白质相互作用
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分子克隆手册：蛋白质—蛋白质相互作用
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生物分子
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RNasin（40 u/μl，Promega，Madison，Wisconsin）
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T7RNA聚合酶（New England Biolabs，Massachusetts）
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专门设备
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凝胶电泳装置
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加热器
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台式微量冷冻离心机
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方法
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1.要进行体外转录反应，冰浴中融解并混合下列试剂：
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40μl 5×T7RNA聚合酶缓冲液
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28μl NTPs（各50m mol/L）
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8μl T7RNA聚合酶
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4μl RNasin（40u/μl）
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75μl 无RNA酶的水
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45μl PCR模板（来自方案1）（0.5～1μgDNA）
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——
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200μl
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37～38℃孵育2～3h。
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2.进行mRNA纯化，混合下列试剂：
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200μl 体外转录混合物
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200μl 无RNA酶的水
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400μl 6mol/L LiCl
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——
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800μl
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冰浴30min。
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3.4℃，14000r/min，离心20～30min，弃上清液，用500μl 70％乙醇漂洗沉淀。
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4.沉淀干燥后，重悬于200μl无RNA酶H2O，4℃，14000r/min，离心5min。
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5.180μl上清液中加入18μl 3mol/L NaAc，500μl乙醇（97％），冰浴30min。
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6.14000r/min，4℃，离心20～30min。
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7.用500μl 70％乙醇漂洗沉淀，空气中干燥，然后重悬于40μl无RNA酶水中。
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8.mRNA浓度的测定：
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a.260nm测定OD 值（1 OD260=40μg/ml）。
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b.进行分析型琼脂糖凝胶电泳（1.5%）：冰浴下，加入10μl RNA变性缓冲液于1μg mRNA中，并于70℃孵育10min。冰上冷却，加入2μl凝胶上样缓冲液，用含1mol/L异硫氰酸胍的1.5%琼脂糖凝胶电泳分离，电极缓冲液为TBE。
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可以调节转录反应的规模。然而，应当注意DNA文库的多样性是保守的，因此使用的DNA模板数量应比文库的多样性高出几倍。
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方案3：大肠杆菌S30细胞提取物的制备
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材料
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缓冲液及溶液
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分子克隆手册：蛋白质—蛋白质相互作用
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生物分子
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大肠杆菌菌株MRE600（Wade and Robinson，1966）
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专门设备
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带挡板摇瓶（5L）
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透析袋（截留分子量6000～8000 D）
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弗氏压碎器
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冷冻离心机
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细菌培养摇床（25℃，37℃）
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方法
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1.将大肠杆菌MRE600在100ml不完全丰富培养基中37℃振摇培养过夜。
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2.次日，加10ml过夜培养物至1L不完全丰富培养基，于5L带挡板烧瓶中37℃培养。
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3.培养至OD550=1.0（相当于指数生长期早期），4℃，3500g离心15min，收集细胞。
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4.弃上清，用预冷的S30缓冲液（50ml/L培养物）漂洗沉淀。
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细胞沉淀可于-80℃或液氮中保存约2d。
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5.冰浴中融解细胞沉淀，再用S30缓冲液漂洗1次。
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6.称量细胞沉淀，以1.27ml缓冲液／1g湿细胞的比例将沉淀重悬于预冷的S30缓冲液。
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7.将细胞通过预冷的弗氏细胞压碎器1次（6000psi）以裂解细胞。
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若多次通过弗氏细胞压碎器会降低细胞提取物的翻译活性。
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8.立即将裂解的细胞4℃，30000g离心30min。
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9.将上清转移至一干净离心管，再次4℃，30000g离心30min。
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10.转移第二次离心上清至一干净烧瓶，每6.5ml提取物加入预孵育混合物1ml，25℃缓慢振摇1h（注意不要产生泡沫）。
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此时，所有内源性mRNA的翻译已经终止，并且细胞提取物中的核酸酶将会降解内源性的mRNA和DNA。
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11.将S30细胞提取物转移至透析袋，冷室中对50倍体积预冷S30缓冲液透析3次，每隔1h更换一次透析液。
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12.将提取物4℃，4000g离心10min。分装上清液（100～500μl），液氮中冷冻，然后贮存于-80℃。
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提取物可保存数月而不丧失活性。融化后可再一次冻存。但是，如果冻融超过两次，活性便开始丧失。
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方案4：体外翻译
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材料
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缓冲液及溶液
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分子克隆手册：蛋白质—蛋白质相互作用
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生物分子
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大肠杆菌S30细胞提取物（见大肠杆菌S30细胞提取物的制备方案）
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文库mRNA（1μg/μl）（见体外转录及mRNA纯化方案）
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蛋白质二硫化物异构酶（22μmol/L）（牛PDI）（Sigma）水溶液
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专门设备
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加热器
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台式微量冷冻离心机
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方法
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1.冷冻所有溶液并在冰上依次混合下述翻译反应液：
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14.3μl 无RNA酶水
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11μl 谷氨酸钾（2mol/L）（见下面注释）
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7.6μl 乙酸镁（0.1mol/L）（见下面注释）
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1.1μl 甲硫氨酸（200mmol/L）
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2μl Anti-ssrA寡核苷酸
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22μl 冰冷的预混合液Z（移液前在冰上解冻并涡旋震荡）
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40μl 大肠杆菌S30提取物
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2μl PDI（如果目标蛋白库存在二硫化物）
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10μl 文库mRNA（10μg），使用前融化，剩余的立即冻存
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——
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110μl
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为了达到最佳翻译条件，可试用以下条件：对于每一批新的S30，在110μl反应体系中，加入11～15mmol/L乙酸镁，180～220mmol/L谷氨酸钾和20～50μl S30提取物。
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2.37℃下，以最佳反应时间进行翻译（通常为6～15min）。
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3.用440μl冰冷的WBTH终止翻译，短暂涡旋混合，并轻轻置于冰上。
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4.4℃，14000g离心翻译混合物5min，然后将上清液转移到一个新的冰冷的试管中。
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方案5：亲和筛选
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材料
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缓冲液及溶液
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分子克隆手册：蛋白质—蛋白质相互作用
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分子克隆手册：蛋白质—蛋白质相互作用
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生物分子
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固定在琼脂糖珠子上的亲和素（Sigma）
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生物素化的配基与游离配基
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链霉亲和素磁珠（Roche Diagnostics）
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专用设备
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磁铁
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微孔板条或微孔板（Nunc）
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淘选试管（Nunc）
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摇台或摇床
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方法
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固定靶蛋白的筛选
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重要的是缓冲液，微孔板，吸头在使用前须在冷室平衡温度。
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1.400ng配基溶于100μl PBS中，在微孔板中4℃包被过夜。
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2.用PBS将包被的微孔板孔洗1次，然后用含4%脱脂奶的PBS封闭1h。同时，封闭几个未包被的微孔板孔作为对照。
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3.用PBS洗3次，再用WBT洗2次。
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4.加入250μl冰预冷的WBT，置于冰上。
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5.亲和筛选前，去除微孔板孔中的WBT。
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6.在体外翻译混合物（见体外翻译方案）中加入冰冷的无菌脱脂牛奶（WBT溶液）至终浓度为2%（W/V），然后加200μl至每个用配体包被和脱脂奶封闭的孔中。
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7.在冷室中轻轻振摇微孔板1h。倾去翻译反应物，用WBT洗5遍。
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8.加入200μl冰冷的洗脱缓冲液EB，冰上放置5min并轻轻振摇。洗脱出的mRNA须立即纯化（见mRNA纯化和RT-PCR方案的步骤1）。
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备选方案：在溶液中的筛选
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1.用含4%（W/V）奶粉的PBS封闭5ml淘洗试管1h，并来回颠倒旋转。
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2.用PBS洗3次后再用WBT洗3次，最后用WBT充满。
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3.用前，1ml无菌的12%脱脂奶粉与100μl 链霉亲和素包被的磁珠在室温下来回颠倒旋转1h，以去除无菌牛奶中的生物素。用磁铁分离磁珠并弃之，将牛奶移至一新试管，冰上保存。
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4.用冰预冷的WBT洗100μl链霉亲和素包被的磁珠4次，并重悬于100μl冰预冷的WBT中。
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5.清空免疫试管，加入60μl无菌、已去除生物素的脱脂奶，终浓度为1%～2%。
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6.加入体外翻译混合物（见mRNA纯化和RT-PCR方案）及10pmol生物素化的配体至淘洗试管中。密封，放置于一大试管中（例如，一个装有冰的250ml离心管），在冷室中来回颠倒旋转1h。
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7.为获得筛选的产物，加入100μl磁珠并在冷室中来回颠倒旋转15min。
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8.倾去翻译反应物，然后用WBT洗磁珠5次，并用磁铁使之吸附在管壁上。
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9.加入200μl冰冷的洗脱缓冲液EB，置于冰上并轻轻振摇5min。洗脱出的mRNA须立即纯化（见mRNA纯化和RT-PCR方案）。
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链霉亲和素包被磁珠的容量依赖于生物素化配体的大小。重要的是必须保证所有的生物素化配体都能被磁珠吸附，每100μl链霉亲和素包被磁珠所用的生物素化配体不能多于10pmol，尽管这些磁珠可结合100多倍的游离生物素。除了链霉亲和素包被的磁珠以外，应使用亲和素琼脂糖以防止筛选到与链霉亲和素结合的蛋白质。
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解离速率型筛选
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1.按上面方案中溶液筛选的步骤1～3准备淘洗试管。
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2.将翻译混合物分成两份。其中一份加入生物素化的抗原（浓度为1～100nmol/L；结合得越好，所需的抗原越少）。
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3.平衡2h至过夜。
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4.加入竞争抗原（1000倍于生物素化抗原）。
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5.孵育至解离速率型筛选所需时间（2h至15d），这依赖于所预期的最好结合物的解离速率。
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6.洗涤链霉亲和素包被的磁珠（见溶液筛选方案的步骤4），回收核糖体复合物（见溶液筛选方案的步骤7和8）。
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含二硫键蛋白质的稳定性筛选
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1.按溶液筛选方案进行筛选，但在体外翻译（见体外翻译方案的步骤1）及亲和筛选（溶液方案的步骤6）过程中，加入一定量的DTT（通常为0.5～10mmol/L）。
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2.在用RIA（见放射免疫分析，方案9）分析筛选出的混合物及单一结合物时也要加入DTT。
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方案6：mRNA的纯化和RT-PCR
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材料
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缓冲液，溶液及试剂
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dNTPs（各20mmol/L；Eurogentec）
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二甲基亚砜（DMSO）（Fluka）〈！〉
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二硫苏糖醇（DTT）（0.1mol/L）〈！〉
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高纯度RNA提取试剂盒（Roche Diagnostics）
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MgCl2（50mmol/L）〈！〉
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寡核苷酸引物T3te、SDA、T7B（见表30.1
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）QIA快速胶提取试剂盒（Qiagen）
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Tris-HCl（10mmol/L，pH8.5）
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生物分子
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superscript逆转录酶
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5×superscript第一链合成缓冲液（GIBCO BRL）
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RNasin（Promega）
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TagDNA聚合酶，10×PCR缓冲液（GIBCO BRL）
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专用设备
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琼脂糖电泳装置
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加热器
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热循环仪
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方法
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1.根据厂家使用手册，用高纯度RNA提取试剂盒提取mRNA（见亲和筛选方案）。
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2.用35μl无RNA酶水洗脱纯化的RNA，立即在70℃变性10min，变性后放置冰上1～2min骤冷mRNA样品，然后进行反转录。
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3.在冰上准备反转录预混合物如下：
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0.25μl 引物T3te（100μmol/L）
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0.5μl dNTP（各20mmol/L）
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0.5μl RNasin（40单位/μl，Promega）
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0.5μl superscript逆转录酶（GIBCO，200/μl）
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4μl 5×superscript第一链合成缓冲液（GIBCO）
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2μl DTT（0.1mol/L）
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——
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7.75μl
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加入12.25μl变性的mRNA，混合，在4℃短暂离心。
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4.50℃孵育1h。
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注：除RT-PCR样品外，应同时进行不加模板的阴性对照以检查缓冲液和引物有否污染。
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5.在冰上建立PCR反应体系：
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0.125μl 引物T3te（100μmol/L）
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0.125μl 引物SDA（100μmol/L）
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0.5μl dNTP（各20mmol/L）
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0.25μl Tag 聚合酶（5单位/μl，GIBCo）
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5μl 10×PCR缓冲液
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2.5μl DMSO
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1.55μl MgCl2（50mmol/L）
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32.45μl H2O
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7.5μl DNA模板，直接来自反转录
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——
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50μl
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按下述程序进行PCR：94℃预变性4min，然后进行20个循环的94℃ 30s，50℃ 30s，72℃ 2.5min，最后72℃延伸10min。
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6.用琼脂糖凝胶电泳纯化PCR产物。
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7.将纯化的PCR产物用相同的反应体系（如上述的步骤5）和引物T3te、T7B进行 第二次PCR扩增。PCR程序如下：94℃预变性4min，10～15个循环的94℃ 30s，60℃ 30s，72℃ 2.5min，最后72℃延伸10min。
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方案7：进化：引入额外的多样性
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材料
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缓冲液，溶液及试剂
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dNTP类似物
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2mmol/L 6（2-脱氧-β-D-呋喃核糖）-3，4-二氢-8H-嘧啶并（4，5-c）（1，2）
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-噁嗪-7-酮三磷酸盐（dPTP，Nucleix Plus，Amersham）
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2mmol/L 8-氧代-2′-脱氧鸟苷三磷酸盐（8-氧代-dGTP，Nucleix Plus，Amersham）
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Triton X-100（Fluka）
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寡核苷酸引物SDA，T7B，Abrev（见表30.1）
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QIAex-II凝胶提取试剂盒（Qiagen）
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生物分子
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分子克隆手册：蛋白质—蛋白质相互作用
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专用设备
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琼脂糖凝胶电泳装置
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加热器
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热循环仪
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方法
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易错PCR
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启动一个标准PCR反应（见mRNA的纯化和RT-PCR方案的步骤5，方案6），但在混合物中加入的是dNTP类似物。最终的突变率可因PCR循环次数及dNTP类似物的浓度而变化。加入85μmol/L 的8-氧代-dGTP及85μmol/L dPTP，经25个循环，突变率可达6×10-2bp-1。
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DNase Ⅰ改组和装配PCR
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1.取5μg纯化的PCR产物（来自mRNA的纯化和RT-PCR方案的步骤5，方案6）溶于下列混合物中：
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10×DNase Ⅰ 缓冲液 10μl
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PCR产物水溶液 5μg
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加水至 100μl
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2.加入DNase Ⅰ（0.15单位/ml）。
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3.室温中孵育5min。
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4.取上述混合物5μl加入2.5μl标准DNA上样缓冲液（含EDTA）。将剩余反应液迅速冷冻于液氮中。
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5.用1.5%琼脂糖凝胶电泳分析样品。原来的DNA条带变成较宽的条带，漂移的范围在50～100bp。若观察到此现象，就用制备型琼脂糖凝胶电泳（用Qiaex-Ⅱ从凝胶中提取，Qiagen）纯化剩余的95μl混合物；若未观察到此现象，再将反应液置于室温，并加入1μl的DNase I，重复该过程，直到预期大小片段的出现。
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6.混合下列PCR成分（不含有引物），加入5～15μl纯化的来自于步骤5的片段（尝试不同的模板浓度）。
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dNTP 0.25μl
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MgCl2（50mmol/L） 0.88μl
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10×PCR反应缓冲液（方案6） 2μl
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Triton X-100 0.8μl
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Taq聚合酶 0.5μl
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加水至20μl
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PCR反应条件为：首先94℃4min，然后进行10个循环的94℃30s，40℃30s，72℃ 2.5min，接着再进行32个循环的94℃30s，45℃30s，72℃2.5min，最后72℃延伸10min。
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7.从凝胶中抽提所需要大小的条带。条带可能会弥散，但若用特异的“外围”引物（例如，SDA及Abrev）进行第二次PCR，条带将会变成一条带。
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方案8：核糖体复合物与游离蛋白质及小分子化合物的分离
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材料
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专用设备
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CL-4B Sepharose（Pharmacia）
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凝胶过滤柱（1ml）（Qiagen）
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方法
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1.按体外翻译方案（方案4）所述方法进行一个体外翻译反应并终止之。
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2.用1mlCL-4B Sepharose（Pharmacia）制备一个凝胶柱（Qiagen），用冰冷的洗涤缓冲液WB平衡之。
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3.向凝胶柱中加入250μl的已终止的翻译混合物。
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4.加入200μl冰冷的WBT，弃去流出液。
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5.再另外加入300μl冰冷的WB，收集洗脱液，其中含有核糖体复合物，它可用作筛选或其他实验。
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用一个简单的实验可检测只含有核糖体复合物而不含有游离的蛋白质。一种用于酶的核糖体展示翻译系统终止后，可形成稳定的复合物（WB）或不形成复合物（平行实验，WB不含Mg2+）。两种样品都经层析柱分离，通过测定酶活性可监控酶的洗脱图谱。通过比较两种洗脱图谱，可以确定只含有核糖体复合物蛋白（酶）的组分。
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方案9：放射免疫分析（RIA）
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材料
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缓冲液及溶液
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分子克隆手册：蛋白质—蛋白质相互作用
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专用设备
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液闪混合液“OptiPhase2”（Wallac，Finland）
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闪烁计数仪
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方法
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1.用配体（若是蛋白质，一般是0.2μmol/L，100μl/孔）或中性亲和素（100μl/孔，4μg/ml溶于PBS）直接包被微孔板，4℃过夜。
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2.用PBS洗孔3次。在中性亲和素包被的孔中，加入100μl 含50pmol生物素化配体的PBS溶液，25℃孵育30min。
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3.PBST洗涤后，再用4%脱脂奶粉（溶于PBS）封闭。
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4.以RNA文库或单克隆RNA为模板，按照体外翻译方案的步骤1进行体外翻译（每110μl反应体系10μg mRNA），并作如下调整：37℃反应30min，然后加入2μl[35S]标记的甲硫氨酸（0.3μmol/L，50μCi/ml的终浓度），但不加冷甲硫氨酸。
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5.翻译完成后用PBST将反应混合物稀释4倍，14000g离心5min。
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6.用等体积的4%牛奶（溶于PBST）稀释上清液，其中不含配体或为了抑制实验含有不同浓度的游离配体，然后室温孵育1h，再加入微孔板中。
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7.在微孔板中加入100μl放射性反应混合物，轻轻震荡，使之与板上固定的配体室温反应30min。
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8.PBST洗涤5次，然后用4%SDS-PBS洗脱。
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9.准备5ml液闪液，加入洗脱组分，在闪烁计数仪上测定放射性强度。
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方案10：Northern印迹
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材料
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缓冲液，溶液及试剂
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分子克隆手册：蛋白质—蛋白质相互作用
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专用设备
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琼脂糖凝胶电泳装置
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带有Nytran尼龙膜的Turboblotter（印迹装置）（Schleicher and Schuell）
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X光片和显影装置
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方法
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1.为优化体外翻译时间，可用一个单一模式的mRNA构建组分，按照体外翻译方案中步骤1的条件进行体外翻译和亲和筛选。测试反应时间6～12min。
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如果用于核糖体展示的文库mRNA较长，则翻译时间相应延长。
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2.在体外翻译到5，7，9，11min时，按方案5所述方法分别进行亲和筛选，但是有一处改动：漂洗后，用200μl洗脱缓冲液EB5洗脱mRNA。
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3.立即加入600μl预冷的乙醇冰浴30min，沉淀RNA。
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4.4℃，14000g离心30min。
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5.弃上清液，室温干燥RNA沉淀10～15min。
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6.用10μl RNA变性缓冲液溶解沉淀（冰浴中），于70℃孵育10min。
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用含有0.2～10ng原始模式mRNA的对照样品作为标准来估计回收的mRNA量。
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7.冰上冷却样品，加入1μl凝胶上样缓冲液，用含20mmol/L异硫氰酸胍的1.5%琼脂糖凝胶进行电泳分离，电极缓冲液为TBE。
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8.使用Turboblotter，将凝胶上RNA样品转印到Nytran尼龙膜上（请参阅厂商建议）。
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9.以3′末端标记有地高辛-11-dUTP/dATP（DIG Oligonucletide Taling 试剂盒）的Anti-SDA寡核苷酸为探针，60℃杂交至少4h。
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10.用含有化学发光底物CSPD的DIG DNA标记与检测试剂盒来检测杂交的寡核苷酸探针，并经X光片曝光。
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参考文献
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31 用膜上肽合成的方法分析蛋白质相互作用
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前言
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相互作用研究的肽合成策略
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在对大的蛋白质进行分析后，用其他实验或计算机预测的方法将相互作用位点缩小到亚结构域可能很有帮助。缺失突变相互作用的分析或基因特异的噬菌体展示（Blüthner et al.，1992；Fack et al.，1997）能提供相互作用的氨基酸是聚集在一个短肽内（线性结合位点，一般小于20个氨基酸）还是散布在一个大结构的部分（构型结合位点）的提示。正如计算方法所能做到的，SDS-PAGE后在一个点上能检测到的结合伙伴与一个蛋白质的相互作用能提供线性相互作用的结构域信息。基于与已知的相互作用分子对的同源性匹配的方法比从头模建更有用。
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用斑点合成法对一个相互作用结构域或整个蛋白质分析至少包括两步。首先，合成15个氨基酸的肽，用3～4个氨基酸移位覆盖整个序列。为了确定中心相互作用区的大小，在第一步搜索所鉴定的反应区可以用第二套肽（有一个氨基酸移位）来鉴定。对于短的蛋白质或相互作用结构域，带有一个氨基酸移位的15aa长的肽可作为起始点（图31.1）。在分析多克隆血清时（这些多系血清可以鉴定被不同的抗体结合的交叉表位），它有助于缩短区分不同交叉表位的肽长度（Blüthner et al.，2000；Mahler et al.，2000）。
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图31.1 典型的相互作用研究的策略
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第二步是分析中心结合结构域以及单个氨基酸残基的贡献。中心结合区可以用从C末端和N末端的连续缩短的肽来确定（Blüthner et al.，2000）。然而，必须对结果数据的仔细的阐释。某些情况下，短肽的实验结果与从“一个移位”的分析所得到的数据并不相符。这可以通过假设不同长度肽的不同结构属性来解释，例如，较长的肽可以形成一个二级结构，这二级结构隐藏了结合结构域。单个氨基酸侧链的贡献可以用一套带有点突变的肽进行分析，例如，丙氨酸和甘氨酸步移或用其他氨基酸替换（Liu et al.，1999；Blüthner et al.，2000）。
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侧链修饰的贡献（如磷酸化或糖基化）能通过合成多套肽段进行分析，这多条肽具有相同的序列但侧链修饰不同（Mukhija et al.，1998）。对于定位在蛋白质氨末端的基序，氨基端氨基酸对结合的贡献可以通过合成在氨末端氨基酸前加入氨基酸残基的肽段来评估。因为肽段是用羧基端残基固定的，所以类似的方法不能用在羧基末端。
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结合反应伴侣的检测
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用斑点合成法时，一个点上的检测，需要至少相互作用伙伴中的一个被纯化并标记。我们推荐在生物素化后用链亲和素辣根过氧化酶（HRP）复合体检测。或者，结合反应伴侣的配基可以用二抗来检测。
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在表位定位实验中，抗体是相互作用伙伴，二抗或标记的蛋白质A或蛋白质G是推荐的检测体系。用检测试剂做对照是必需的，特别是当用酶标的动物血清时，由于非特异的结合，交叉反应或幼儿期免疫接种可以导致假阳性反应的产生（图31.2，阶段2A）。
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图31.2 方案概述
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在更弱的相互作用的情况下（比如，由于序列短缺率的存在），结合反应伴侣要在结合一个肽后能被电转移到第二块膜上（一般是硝酸纤维），在这膜上可以被固定从而得以继续进一步的检测过程（图31.2，阶段2B，图见下页）。
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程序纲要
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以下方法描述在覆盖聚乙二醇500（PEG500）作为隔离物的活性纤维膜上短肽的合成，以及他们的结合反应伴侣的检测。肽是按照Frank描述的方法（1992）用Fmoc氨基酸衍生物从羧基末端开始合成。在第一步中，在亲核反应中PEG末端的活性氨基酸基团被连接到Fmoc氨基酸的活性羧基上，形成了起始的肽键。接下来的每一个反应循环前必须有两个处理来限制氨基端的延伸反应。
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首先，乙酰化使在前一轮合成中不能结合到Fmoc氨基酸上的氨基酸基团失活。其次，氨基端氨基酸的Fmoc保护的侧链可以用哌啶化学性切割，形成与下一个氨基酸结合的氨基基团。合成完后，肽可以和潜在的相互作用伙伴混合温育，从而鉴定他们的靶序列（图31.2）。
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方案
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方案1
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材料
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缓冲剂和溶剂
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分子克隆手册：蛋白质—蛋白质相互作用
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分子克隆手册：蛋白质—蛋白质相互作用
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抗体
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羊抗人HRP-偶联抗体
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羊抗鼠HRP-偶联抗体
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专门设备
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Amersham生命科学超级处理器（Amersham Pharmacia Biotech）
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氨基-PEG膜（Abimed，Langenfeld，Germany，APEG-UC540-10/15，84300）
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印迹装置（Biometra-Fast-Blot，Duren，Germany，B337593）
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印迹纸（Machery-Nagel，Duren，Germany，MN440B）
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ECL Western杂交试剂（Amersham Pharmacia Biotech）
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吹风机
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Hypercassette（Amersham Pharmacia Biotech）
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Hyperfilm ECL（Amersham Pharmacia Biotech）
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Protan硝酸纤维转移膜（Schleicher & Schuell）
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摇床
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点样机器人（model ASP222，Abimed，Langenfeld，Germany）
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所有用来合成和再生的设备应能抵抗有机溶剂腐蚀。在涉及到这些溶液所有步骤中应该用玻璃制品或Teflon制品。可以用标准的微量吸头（Gilson，Eppendorf）。
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方法
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阶段1：纤维膜上肽的合成
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氨基酸衍生物溶液的准备
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除了Fmoc精氨酸外，所有氨基酸衍生物可以按下列步骤准备：
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1.为了避免氨基酸衍生物吸水，可以将氨基酸衍生物的粉末在真空干燥器中溶解。
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氨基酸衍生物粉末必须保存在-20℃下。
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2.将氨基酸衍生物在适当体积的NMP中溶解，使最终浓度为250mmol/L，分成每份400μl等份分装。
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3.溶解的氨基酸（除了精氨酸）可在-70℃下储存几个月。在步骤5使用之前，氨基酸应该在真空干燥器中溶解。
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Fmoc精氨酸非常不稳定，必须在每一个合成循环中重新制备。为了方便，预称的精氨酸粉末可以储存在-70℃下，在每一个循环开始前直接溶解在如前所述的真空预热后的适当数量的NMP中。
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氨基酸衍生物的应用
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根据我们用一个ASP222自动点样机器人的经验，777个肽排列成37×21阵列时很容易在13cm×9cm的纤维膜上合成。所有的步骤在室温下进行，应避免更高的温度；推荐使用有空调的房间。涉及到有机溶剂的使用的步骤要在通风橱下操作。
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4.按制造商的说明操作点样机器人。
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5.将装有氨基酸溶液的试管和氨基-PEG膜放在机器人的适当位置，合成时，向每个点加3×0.1μl的氨基酸稀释液。
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考虑不同氨基酸结合效率的不同（Fields and Nobel，1990），我们建议氨基酸的三个过程总的孵化时间至少需要2h。
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6.将膜从机器人上移走，然后进行洗涤步骤（步骤7）。最后一个氨基酸反应完成后，直接跳到步骤14。
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膜的洗涤
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每一个循环后，膜都应该充分地洗涤，为下一轮合成肽做好准备。除了最后一个循环外，以下的方法在每一个循环后都要用到。在这方法中所列的化学药品和溶液的数量对于四块13cm×9cm的膜是足够了，当用ASP222的机器人时，这些膜可以同时处理。
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7.在50ml4%（V/V）的醋酸酐的DMF液中洗膜30s，再在新制备的溶液中洗5min以乙酰化在前一轮合成中未被延伸的肽的游离氨基。这些乙酰化的氨基酸不再容易结合到新的Fmoc-氨基酸上，从而可以防止错误序列的产生。
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8.用50ml的DMF洗膜2次，洗2min，以除去痕量醋酸酐，这些醋酸酐会妨碍下边步骤。
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9.在DMF中用50ml20％（V/V）的哌啶温育膜5min，化学切割Fmoc保护的基团。
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10.用50mlDMF洗膜10次，洗2min，除去大量哌啶。
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11.在DMF中用0.01%（W/V）溴酚蓝对肽的游离氨基染色5min，以检测哌啶的切割效果。蓝色的点能明显被看到，表明得到了氨基基团。
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由于溴酚蓝是电荷特异性染色，所以它不会只结合到氨基末端的氨基上。其他氨基酸的侧链能强烈地影响染色的强度。肽所显的颜色决定于其总电荷和单个氨基酸序列。而且，不同氨基酸的多种结合效率也会影响染色强度。
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溴酚蓝/DMF储存溶液有很浓的橘色，当颜色变成蓝绿色时，溶液应弃去。
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12.用50ml乙醇洗膜2次，洗2min，以除去非特异结合的溴酚蓝和痕量污水。
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13.用常规的吹风机冷风将膜吹干，膜就可用于下一个循环（回到步骤5）。
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为避免损坏肽，应从反面吹干膜，还要避免膜被加热。
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在大约10～12个合成循环后，用一根石墨铅笔画格标记，这些格子点可以随后一起孵化。这样会方便切膜。
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最后一个循环
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14.用50ml的DMF洗2次，洗2min，除去未结合的氨基酸。
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15.在50ml20%（V/V）哌啶的DMF液中温育5min，切割Fmoc保护的残基。
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16.用50mlDMF洗膜2min，洗10次，除去哌啶。
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17.用50ml0.01%（W/V）的溴酚蓝的DMF液染游离氨基酸残基5min。
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18.乙酰化游离的氨基，用50ml4%（V/V）醋酸酐的DMF溶液洗涤2次（30s和5min），直到所有的点完全脱色。脱色可能需要多于5min时间，但根据我们的经验，应该延长至10min以上。
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19.用50ml的DMF洗膜2次，各2min，除去痕量的醋酸酐。
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20.用50ml乙醇洗膜2次，各2min，以除去DMF。
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21.用吹风机冷风吹干膜（如步骤13）。
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22.新配制20ml的二氯甲烷（化学切割）、20ml的TFA（切割保护基团）、1ml的三异丁基硅甲烷（捕获反应产物）的混合物，用此混合物温育膜1h，从而除去所有的侧链保护基团。
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因为二氯甲烷极易挥发，温育必须在一个密封的玻璃容器中进行。
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注意：不要让残留的反应混合物与DMF接触（用一个单独的废容器），以避免发生危险的放热反应（爆炸！）
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23.用50ml的二氯甲烷洗膜4次各2min。
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24.用50ml的DMF洗膜3次各2min。
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25.用50ml乙醇洗膜2次，各2min，以除去DMF残迹。
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26.用步骤13中描述的吹风机吹干膜。
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膜可以储存在-20℃密封的塑料袋中或直接用缓冲液平衡，这些膜是与结合伙伴相互作用所必需的。
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阶段2：反应斑点的免疫检测
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A.表位作图
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1.将膜放在50ml100%的乙醇中缓慢地再水化。每5min加50ml的TBS到膜上，加5次，逐渐降低乙醇的浓度。
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随着这些点逐渐地水化，其上的白色会完全消失。
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现在膜可以用于免疫检测和蛋白质的温育。
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2.为了封闭非特异的结合位点，可以用封闭缓冲液在室温下温育膜2h或在4℃下过夜。根据研究的抗体的不同，可以比较不同的封闭条件以达到最佳的信噪比。试用下列封闭溶液可以增加“严谨性”。
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a.2%（W/V）脱脂奶粉的TBS溶液。
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b.含2%（W/V）脱脂奶粉和0.2%（V/V）吐温-20的TBS溶液。
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c.含50%（V/V）马血清，10%（V/V）10×封闭缓冲液，0.2%（V/V）的吐温-20，150mmol/L蔗糖的TBS溶液。
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封闭条件非常重要，为了达到最佳化，可以试几个条件。我们做的时候，封闭溶液C对大多数试验来说效果最好。胎牛血清也可以试试。
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3.用TBS/0.2%（V/V）吐温-20洗膜1次。
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4.用稀释在封闭缓冲液中的抗体温育膜（如第2步中所用）。如果用封闭缓冲液（c），则用含3%（V/V）的马血清、10%（V/V）的封闭缓冲液、0.05%（V/V）的吐温-20、150mmol/L的蔗糖的TBS液稀释。
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对于单克隆抗体的表位作图，可以用大约每毫升4～5μg的温育体积的纯化抗体。用多系血清时，我们推荐稀释比例为1∶100。在室温下温育90min或4℃下过夜。
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温育不必用太多的抗体溶液；但要确认膜完全浸入，用一个盖子盖上或放在湿的空间中以防干掉。
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5.用TBS/0.2%（V/V）吐温-20洗膜3次，每次5～10min，以除去未结合的抗体。
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6.用与一抗相同的缓冲液稀释二抗，二抗与膜温育75min。可以用类似于SDS-PAGE后的免疫印迹所用的稀释方法稀释。
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7.用TBS/0.2%（V/V）吐温-20洗膜3次，每次5～10min，随后用TBS洗3次，每次5～10min。
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8.在膜上放置薄纸，以除去膜上过多的缓冲液。
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为了防止肽被的损伤，不可在膜上擦试或挤压薄纸。
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9.用化学发光法检测点（在下面“检测与再生”章节中步骤1）。
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B.低亲和性蛋白质—蛋白质相互作用
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1.如上述表位作图中的步骤1～4的描述，对肽点膜进行平衡，封闭和洗涤。
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2.如上述表位作图中步骤4，用稀释在TBS中的靶蛋白温育膜，建议用1～5μg/ml的浓度。
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3.用TBS洗膜3次，每次2min。
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4.在Western blotting转化缓冲液中平衡肽膜和一张剪成适合肽膜大小的硝化纤维膜。
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5.用每平方厘米0.85mA的电流将结合到肽点膜上的蛋白质转到硝化纤维上，此过程需要1h。由于SDS使蛋白质发生变性，所有蛋白质带有负电。因此，硝化纤维膜应该放在靠近正极端。由于蛋白质配体的化学特性不同，转化所需的时间可能也不同，而且必须根据经验决定。
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6.室温下用2%的脱脂奶的TBS液封闭硝化纤维膜2h。
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7.继续前面表位作图中的步骤7～9。
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C.检测和再生
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检测反应点
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结合蛋白的检测可以用各种传统的染色技术。还可以用沉淀酶底物（如：二氨基联苯胺〈！〉或用于HRP-标记的检测试剂氯萘酚〈！〉）。然而，他们会干扰肽点膜的再生，使膜只能用一次。而且每次分析中建议最少应做两个不同的温育反应（样品加上阴性对照）。因此，化学发光的ECL系统是一个比较好的检测系统。在蛋白质已经被电转到硝酸纤维膜上的情况下（步骤2b），不存在上述限制。然而，当用ECL系统时，如果能得到在不同的曝光时间下的几组数据，这种检测方法可以用在上述两个应用中。
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1.根据厂商的说明准备ECL检测试剂并孵化膜1min。
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2.将膜放在两块透明物间，加入一块ECL膜，室温下用一个Hypercassette曝光。
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首先暴露1min得到信号强度的印象。再试其他暴露时间直到达到最大的信噪比。
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3.将膜转到蒸馏水中并储存在4℃下直到再生。
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再生前，膜可以储存在水中几天。
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如果暴露30min后未见到信号，则检查检测系统。如果检测试剂正确，可以在较不严谨的条件下封闭。如果没有结合的发生，可能意味着结合位点不连续或亲和性非常低。
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如果有非特异的信号及背景很高，则提高封闭条件的严谨性，同时要确保初级结合伙伴和检测试剂（二抗）是高度纯化的并做了最大可能的稀释。
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膜的再生
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4.用重蒸水洗膜3次，每次5min。
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5.用DMF洗膜3次，每次5min。
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6.用蒸馏水洗膜3次，每次5min。
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7.用再生缓冲液A洗膜3次，每次10min。
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8.用再生缓冲液B洗膜3次，每次10min。
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9.用乙醇洗膜2次，每次10min。
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10.如在纤维膜上的肽合成中步骤13中描述的用吹风机吹干膜。此膜可以在-20℃储存在密封塑料袋中或继续用在表位作图的步骤1。
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在没有信号强度损失的条件下，此膜一般可以再生10次。极少情况下，高亲和性的配基很难从点中洗下，则膜只能用1次。这可以通过直接用检测系统孵化以前再生的点膜来校正（表位作图步骤2、3，而后直接进行表位作图的步骤7～9）。
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参考文献
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32 蛋白成束增强蛋白质—蛋白质相互作用检测
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前言
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双杂交相互作用
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双杂交方法是最流行和最为广泛采用的研究体内蛋白质—蛋白质相互作用的手段（Chien et al.，1991；Allen et al.，1995；Bai and Elledge，1996）。双杂交方法的理论基础源于对转录激活蛋白作用机制的最初理解（Gill and Ptashne，讨论于1988；Mendelsohn and Brent，1994；Ptashne and Gann，1997；Keaveney and Struhl，1998）。转录激活因子通常至少由两个功能自主的结构域组成：DNA结合结构域和激活结构域，前者以序列特异的方式结合并调控启动子区域；后者则招募转录机器结合基因的启动子区（Ptashne and Gann，1997）。早期研究表明，将酵母中相对较弱的激活结构域蛋白GAL4替换为疱疹病毒激活结构域蛋白VP16会大大增强转录激活潜能而不影响其DNA结合功能（Sadowski et al.，1988）。这个简单而又完善的实验表明DNA结合结构域和激活结构域在本质上是模块化的。重要的是，在这个实验之后的研究表明，DNA结合结构域和激活结构域无需以共价连接形式存在而只要在非共价连接状态下就足以诱导其靶基因转录（Fields and Song，讨论于1989；Bemis et al.，1995；Estojak et al.，1995）。
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分别表达的DNA结合结构域和激活结构域可以通过许多方法实现结合。正如Fields和Song（1989）在一篇重要的论文中所指出那样，分别表达的DNA结合结构域和激活结构域融合蛋白可以通过彼此间固有的亲和力以非共价键融合成蛋白质。这些融合蛋白的存在激活了它们的相互作用，导致转录激活功能的恢复，随后引起靶基因的转录激活。这个方法的改型是将这些结构域与那些能够与第三个蛋白质或某个化学复合物相互作用的蛋白质相连，而不是将DNA结合结构域和激活结构域与那些本身具有亲和能力的蛋白质相连（Belshaw et al.，1996；Rivera et al.，1996；Zhang and Lautar，1996；Senguptha et al.，1999）。这三个部分的存在恢复了转录激活结构域活性。这些基于双杂交系统的改进分别形成了三杂交和依赖于二聚体的基因调控系统。
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双杂交实验存在的问题
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真核生物细胞表达外源蛋白时存在的一些问题可能会破坏常规双杂交体系中蛋白质之间，甚至是具有高亲和力的蛋白质之间的作用。由于所表达的一个或两个蛋白质对细胞有致死作用而导致的双杂交不能被检测，是经常出现的情况。另一个在双杂交体系中经常出现的情况是杂交蛋白毒性较弱，细胞可以耐受表达水平极低的蛋白质而不被杀死（Tasset et al.，1990；Berger et al.，1992；Gilbert et al.，1993）。某些时候，由于这些融合蛋白表达水平过低以至于杂交蛋白的相互作用发生频率极低。在这种情况下，即使杂交蛋白之间有较高的亲和力也不能使转录激活因子达到足够的数量以激活报告基因启动子使之表达。还有一个双杂交体系中的问题是，体内蛋白质—蛋白质相互作用是非常短暂的。通常，由于所形成的复合体不够稳定，不能招募靶基因转录激活所需的其他蛋白复合体。
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蛋白成束对双杂交实验灵敏性的加强：应用于哺乳动物细胞
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由于双杂交实验中的阳性信号需要转录因子复合体两部分的装配，所以在考虑到彼此亲和力前提下，融合蛋白的表达量要保证复合体的形成。但是在许多情况下，这些融合蛋白表达量很低或其亲和力低于检测分析的阈值。当在哺乳动物细胞中进行双杂交实验时这些问题就变得很尖锐。比如，尽管c-Src-SH3结构域与其配体c-CBL在酵母双杂交实验中可以检测，但以常规双杂交实验方法在哺乳动物细胞中就无法检测蛋白质间的相互作用（Roberston et al.，1997；Ribon et al.，1998）。对转染后的哺乳动物细胞的蛋白印迹分析表明GAL4-cCbl（G-CBL）融合蛋白的表达量过低引起报告基因转录活性丧失。因此，我们考虑可否利用多拷贝蛋白结合c-Src-SH3配体蛋白以增强p65激活结构域的潜能来克服G-CBL融合蛋白表达量过低对报告基因表达造成的负面影响。为测试这个方法的可行性，我们在HT1080B细胞中共表达了G-CBL与SH-3或SH3-4S（分别为p65激活结构域的单拷贝或4个拷贝蛋白）融合蛋白。我们发现这都不能使杂交蛋白诱导报告基因表达至可检测水平（Schmitz and Baeuerle，1991；Nateson et al.，1997）。这个发现说明SH3-S4融合蛋白不能有效地招募转录因子结合于靶基因启动子区，而且与我们预测相悖的是具有p65激活结构域4个拷贝蛋白的SH3-4S融合蛋白的表达增强能力要弱于单拷贝的SH-3融合蛋白。蛋白印迹分析转染细胞中杂交蛋白的表达水平说明GAL4-CBL和SH3-4S两者的表达量均极低。可能是由于这个原因，造成了体内转录激活功能的丧失（未提供数据）。
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图32.1 哺乳动物细胞中，非共价成束激活结构域融合蛋白增强蛋白质—蛋白质相互作用检测
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由于带有多拷贝激活结构域的杂交蛋白不能诱导基因转录，这促使我们发展了一种将多拷贝激活结构域结合于每个报告基因启动子激活结合位点的替代性方法。这种方法是将一个来源于细菌的四聚体蛋白——乳糖操纵子阻遏蛋白（Friedman et al.，1995），作为p65激活结构域和靶蛋白之间的连接物。我们假设c-Src-SH3融合蛋白的四聚体结构域的存在可以允许体内4个激活结构域同4个SH3结构域形成“成束蛋白”。我们预计融合蛋白的成束激活结构域与G-CBL相互作用，可以招募至少4倍量的激活结构域蛋白结合于相应基因的启动子上，从而大大增强其表达（图32.1A）。
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为验证这个假设，我们共表达了GAL-4CBL和SH-3或其四聚体SH3-LS融合蛋白并测定成束SH-3蛋白（图32.1B）是否有助于克服GAL4-cCbL融合蛋白表达量过低的问题。实验中，我们发现成束的SH3-S的蛋白质可以极大地增强来自报告基因的信号（图32.1C）。这个发现说明一些简单的修饰，如成束激活结构域融合蛋白，可以显著改善双杂交实验的结果。尽管这个方法尚未被广泛测试，但我们可以预测利用蛋白成束方法可以测定在常规体系中无法检测的蛋白质—蛋白质相互作用。
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杂交蛋白成束在双杂交实验中的优点
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在双杂交实验中应用成束激活结构域的方法可以在两个方面提高蛋白质—蛋白质相互作用的检测。首先，传统的双杂交体系中DNA结合结构域和激活结构域融合蛋白仅能将单个激活结构域加至启动子上；蛋白成束技术与此不同，它可以在每次相互作用中将多个激活结构域加到启动子上。这增加了分析检测灵敏性，可以使哺乳动物细胞双杂交实验中低表达蛋白或亲和力较差的蛋白质间的相互作用得以检测。其次，成束融合蛋白在蛋白质—蛋白质相互作用中可以产生亲和效应，因此可以增强相互作用本身和／或增加检测的灵敏度。
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除双杂交系统外，本章所描述的蛋白成束方法还可以应用于其他的分析蛋白质—蛋白质相互作用的实验设计上。例如，在荧光共振能量转化（FRET）或基于蛋白质—蛋白质相互作用的哺乳动物的α-互补试验（Adams et al.，1991；Li et al.，2001；见本书的相关章节）。在这些方法中，蛋白成束通过亲和效应和／或增强信号强度来检测在传统双杂交体系中无法探测的阳性信号。
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成束激活结构域融合蛋白在双杂交实验中诱导基因表达的能力说明在表达人工导入基因和内源性基因方面可以采用相似的策略以增强表达。为测试成束激活结构域是否比未成束结构域诱导基因以更高水平表达，我们使用了一个改进的雷帕霉素诱导的基因表达系统（见图32.2）（Natesan et al.，1999）。这个系统由融合了单拷贝FKBP12的GAL4-DNA结合结构域和融合了FKBP12-雷帕霉素蛋白FBR结构域的p65激活结构域组成。雷帕霉素（rapamycin）是一种免疫抑制剂，它可以同时结合FKBP12和FBR；因此在雷帕霉素存在下，RS（FBR结构域+p65激活结构域）融合蛋白可以招募DNA结合融合蛋白。在这种条件下，每个GAL4单体仅能招募单拷贝p65激活结构域蛋白。为增加每个GAL4单体所能招募p65激活结构域蛋白的拷贝数量，我们构建了一个在FBR结构域和单拷贝p65激活结构域带有四聚体化结构域的激活蛋白，这样在雷帕霉素存在下每个GAL4单体最少可以招募4个激活结构域。理论上，这种蛋白应以四聚体形式存在于细胞中并具有4个FBR结构域和4个p65激活结构域。这种做法可以使单个雷帕霉素将成束激活结构域融合蛋白四聚体招募到GAL4单体上。将重复的4个拷贝FKBP12蛋白的一半融合到GAL4 DNA结合结构域，直到一个GAL4单体可以结合16个拷贝的p65激活结构域蛋白（图32.2）。
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图32.2 用于增加结合启动子激活结构域蛋白数量策略的示意图
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为检验系统中成束结构域能否作为强诱导激活蛋白，我们将表达不同融合蛋白的质粒转染HT1080B细胞并用10n mol/L的雷帕霉素重建有功能的转录诱导因子。实验数据表明，招募单拷贝p65激活结构域的每个GAL4单体诱导报告基因表达很差。与之相比，能招募包含4个拷贝p65激活结构域的融合蛋白RLS（FRB结构域+乳糖操纵子阻遏蛋白四聚体结构域+p65激活结构域）可以高水平地诱导报告基因表达。蛋白印迹分析表明，RS和RLS融合蛋白在转染后的细胞中表达水平相近。在实验中为测试不同的融合蛋白，可以系统的在1到16个拷贝范围内改变结合于GAL4-DNA结合结构域的激活结构域的数目。在这样的条件下，结合到启动子的激活结构域的数量同报告基因活性呈现良好的相关性。而且，发现增加结合到启动子的激活结构域的数量可以极大地增强基因表达（图32.3A）。
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我们又发现将成束激活因子结合于启动子上可以诱导报告基因以更高的水平表达，但是以串联重复激活结构域方式将同样数量的成束激活结构域结合于报告基因则不能很好地诱导基因表达。例如，当融合GF1的DNA结合结构域同RS4（FRB结构域+4个拷贝的p65激活结构域）或RLS共表达并在培养基中加入雷帕霉素诱导体内结合，只有RLS成束蛋白强烈诱导报告基因表达（图32.3B）。不管实验中用RLS 还是RS4融合蛋白，每一种蛋白预期应招募同样数量的激活结构域结合到启动子上，RS4无法诱导基因表达很可能是由于招募蛋白到启动子上的能力削弱的缘故。为支持这种解释，蛋白印迹分析转染细胞的抽提物发现RS4融合蛋白表达水平很低，这可能是不能有效诱导报告基因表达的原因。相比之下，RLS融合蛋白在转染细胞中表达量很高，因此可以诱导报告基因强烈表达。总之，我们的数据表明，成束激活因子的毒性更低，可以很有效地招募蛋白到启动子上，从而诱导基因的强烈表达。
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图32.3 结合于启动子的激活因子的数量和强度同稳定整合的报告基因的表达水平之间的关系
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成束激活因子的增强表达能力还有其他方面的应用。例如，我们发现在单个GAL4结合位点调控下，即使是高强度激活蛋白，如GLA4-p65和GLA4-VP16，也不能诱导报告基因转录。但是，在单个GAL4结合位点控制启动子区下游的稳定整合的报告基因可以被成束p65或VP16激活结构域蛋白诱导高水平表达（S.Nateson，未发表）。成束激活因子在其他方面也可能有用武之地，比如激活因子在细胞中表达水平过低以至不能激活基因表达或细胞难于转染或靶基因编码的信使RNA高度不稳定。
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为测试成束激活因子至少在上述任一情况中的能力，我们构建了表达嵌合转录因子的稳定表达细胞株，而且故意不采用巨细胞病毒的强启动子，而是用相对较弱的Rous肉瘤病毒启动子（Nateson et al.，1999）来限制激活因子的表达。一部分稳定细胞系（HT34）用来表达成束激活因子，另一部分细胞（HT35）表达常规的RS。这两部分细胞对雷帕霉素诱导的响应是不同的；HT34表现强烈，而 HT35没有一点反应。比较起来，RS和RLS融合蛋白在两部分细胞中表达的水平是相同的。因此，成束激活因子可以强烈诱导在传统条件下不能表达的基因（Nateson et al.，1999）。
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许多基因治疗方面的应用得益于治疗基因的高效表达。哺乳动物细胞可以很好地耐受成束激活结构域融合蛋白，因此在许多基因治疗方法中可以利用其诱导治疗基因高表达。成束激活结构域可以在雷帕霉素调控下强表达，即使是低表达量的转录因子——许多基因治疗中常发生的情况。或许成束体系的最大优点是雷帕霉素激活基因表达的量效反应至少增加了十倍，这意味着使用成束激活结构可以提高治疗基因调控的实用性而且减少药物用量。理论上，成束激活结构域也可以被用于其他的小分子调控基因表达系统，包括四环素和类固醇激素调控基因表达系统（Gossen and Bujard，1992；No et al.，1996；Wang et al.，1997）。
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内源基因的表达需要招募一些转录因子结合其启动子区的结合位点。以单一转录因子调控内源基因表达在基因治疗方面有着很大优势。目前，为达到上述目的而发展的方法是使用人造的转录因子结合于目的基因启动子的特殊位点，以诱导或阻遏内源基因的表达（Beerli et al.，2000；Zhang et al.，2000）。例如，最近研究表明，此方法可诱导血管表皮生长因子（VEGF）在细胞中表达，而表达特殊设计的结合于血管内皮生长因子（VEGF）基因启动子的锌指VP16蛋白（Zhang et al.，2000）不能诱导这种蛋白质的产生。很可能是由于成束这些合成的锌指转录因子可以诱导内源基因表达的明显增强。另一种可选择的方法是将合成的锌指蛋白或来自天然的DNA结合结构域用于改进后的雷帕霉素调控系统，这种系统使用成束激活结构域调控治疗相关基因的表达。成束激活因子无细胞毒性诱导基因的高水平表达可能是这些方法成功的关键。
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程序纲要
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DNA结合结构域和DNA结合结构域融合蛋白
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理论上，任何与结合位点低或高亲和的序列特异的DNA结合结构域都可用于双杂交实验。但是，绝大多数双杂交筛选分别是利用来自酵母的DNA结合结构域GAL4（1—94氨基酸）和细菌的转录因子LexA完成的。最近，合成的DNA结合结构域，如ZFHD（Rivera et al.，1996），已经用于小分子基因表达调控系统。这些DNA结合结构域蛋白也可用于双杂交体系。携带GAL4和LexA编码区的质粒已经商业化，可以从供应商如Invitrogen、Stratagene和Clontech获得。这些序列可以方便地通过PCR扩增并加以限制性位点，消化片断可以克隆到选择好的质粒中。合成的DNA结合结构域可以从实验室或通过网站从生物技术公司获得（如Ariad Pharmaceuticals）。
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由选择好的DNA结合结构域组成的杂交蛋白和“诱饵”蛋白可以通过附加体或哺乳动物病毒载体表达（见图32.4A）。选择含有选择性标记的表达载体，如具有新霉素或zeomycin抗性基因，是非常重要的。因此如有必要，可以构建稳定表达这类融合蛋白的细胞系。更好的做法是用逆转录病毒表达这种嵌合体蛋白，以减少基因组中嵌合基因的数量和/或削弱对接受细胞的毒性效应。经特殊设计能够同时表达多个重组蛋白质的逆转录病毒载体目前已有报道（Pollock et al.，2000）。
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激活结构域和激活结构域融合蛋白
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在双杂交筛选中，激活结构域的能力对实验结果很重要。大量已报道的双杂交筛选都是用单疱疹病毒VP16蛋白作为激活结构域（410—490氨基酸）。我们发现在哺乳动物双杂交体系中NF-κB蛋白的p65亚基（361—551氨基酸）比VP16激活结构域更能诱导报告基因以高水平表达（未发表）。带有VP16或p65激活结构域的质粒可以从Clontech、Invitrogen、Stratagene和Ariad Pharmaceuticals等公司获得。
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质粒和病毒载体可以用于表达编码靶蛋白与激活结构域的融合蛋白基因（见图32.4B）。这些载体无需包含选择性标记。传统上，融合了选择的激活结构域的cDNA质粒文库已用于双杂交实验当中。但是，多种逆转录病毒载体或腺病毒载体目前可从研究所和商业机构得到（Clontech和Ariad Pharmaceuticals）（Pollock et al.，2000）。
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成束结构域
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理论上，任何插入激活结构域和靶配体蛋白的多聚体结构域均可增强蛋白质—蛋白质相互作用的检测。我们测试了一部分多聚体结构域发现来自细菌转录因子的乳糖操纵子阻遏蛋白（46—360氨基酸）在调控基因表达和双杂交体系中结果最好。若不考虑乳糖操纵子阻遏蛋白DNA结构域，阻遏蛋白质羧基端（330—360氨基酸）30个氨基酸四聚体结构域发挥的作用同全部阻遏蛋白相同（S.Natesan和E.Molinari，未发表）。有关编码成束融合激活结构域蛋白质粒的概述见图32.4C。
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报告基因和报告质粒
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图32.4 蛋白质—蛋白质相互作用实验中质粒的构成
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在双杂交实验和其他分析蛋白质—蛋白质相互作用中可以采用不同的报告基因。具有EGFP、EYFP和CD8报告基因的细胞在荧光激活分选（FACS）方法中表现为阳性，故可用来检测和选择细胞。如果实验目的是构建蛋白质—蛋白质相互作用的结构域图谱，那么可以采用SEAP和荧光素酶这类报告基因。大体上，报告基因被置于两个或个更多拷贝的GAL4或LexA结合位点控制之下。对于ZFHD这样的复合DNA结合结构域，我们将其DNA结合位点的12个拷贝置于报告基因上游以获得最大的转录激活。但是当使用成束p65激活因子融合蛋白时就没有必要将多拷贝的转录因子结合位点置于报告基因上游，只要一或两个转录因子结合位点的拷贝就可以诱导报告基因高水平表达（未发表）。
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与DNA结合结构域和激活结构域融合蛋白相似，报告基因可以由质粒或病毒载体携带。整合到基因组中的报告基因的拷贝数可以通过逆转录病毒载体缩减至一个。瞬时表达结合于报告基因启动子区的嵌合转录激活蛋白因子可用来测定稳定整合的报告基因的响应程度。
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细胞系
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体内分析蛋白质—蛋白质相互作用时，细胞系的选择对实验结果有着重要的影响。由于许多哺乳动物细胞系不适用于标准的瞬时转染过程，因此在筛选前要对重组基因和cDNA文库转染哺乳动物细胞的方法进行优化。如果病毒载体是用于将重组基因导入细胞，那么目的细胞系中病毒载体内的基因表达水平应在构建常规的用于筛选cDNA文库之前加以确定。在哺乳动物细胞中，稳定整合基因的表达水平或报告基因控制下的报告基因的响应逐步降低是常有的事情。因此，用于筛选而构建的稳定细胞系应定期地对其表达能力检测。由表达GAL4-VP16诱导的报告基因激活水平可用于测量GAL4结合位点控制下稳定整合报告基因的响应能力。DNA结合结构域融合蛋白的表达水平可由蛋白印迹测定。
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对照
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众所周知，双杂交实验可能会产生大量的假阳性结果。因此，要尽可能多地使用对照来区分实验中的真、假阳性结果。通常使用对照消除假阳性是构建与野生型报告基因完全一致的报告基因，除非转录因子的结合位点已由突变位点所替代。大体上，哺乳动物双杂交实验中，我们通过诱导由野生型和突变型的GAL4或LexA结合位点共同控制的报告基因转录的能力来分析最初得到的全部阳性结果；只有那些能够特异诱导由野生型GAL4或LexA结合位点控制的报告基因转录的结果才进行下一步分析。在这种类型的分析中分离的阳性克隆可以用在筛选中使用的结合于DNA结合结构域的非特异性诱饵蛋白进行测试。
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方法
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分析蛋白质和多蛋白复合物之间的相互作用需要较熟练地掌握一些技术，如瞬时转染、稳定细胞系构建、蛋白印迹和免疫共沉淀分析及普通克隆技术。上述技术详见Sambrook and Russell，2001，Molecular cloning。也可参见本书其他章节中的双杂交和哺乳动物两组件体系的特殊方法。
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致谢
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上述工作开展于ARIAD医药品公司（ARIAD Pharmaceuticals）。
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33 用计算方法分析全基因组蛋白质相互作用蛋白质相互作用
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前言
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计算基因组学最近的进展包括了对全基因组序列中蛋白质功能分析的新方法。这些方法优于常规的通过序列相似性进行功能预测的方法，因为它考虑了基因组中基因和蛋白质的“上下文关系”。与基因组上下文关系不清楚的一批蛋白质相比，从完整的基因组序列能获取更多的信息。基因组上下文关系的例子包括基因本身及位置的保守性，在基因组范围内的基因融合分析，代谢重建，基因共调控，以及对于给定种系的已知分子相互作用的表达和注释。这些技术可用于获取以下信息：蛋白质的多功能关联，蛋白质复合物的形成，蛋白质在代谢和信号通路中的作用，或蛋白质之间直接的物理相互作用。随着全基因组序列的增加，迫切需要将这些方法作为传统的基于计算和实验室方法的补充。本章概述了当今计算基因组学方法，并详细叙述了这些方法在蛋白质功能关联和物理相互作用发现中的应用。
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从基因组到后基因组
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自从大规模测序出现以来，已获得了许多全基因组序列。所预测的基因和蛋白质的功能已经通过已知功能的同源基因来得到（Andrade et al.，1999b）。但是，全基因组序列提供了许多附加的约束，如果明智地加以使用，能提供所关注基因功能特征方面的更多信息（Tsoka and Ouzounis，2000b）。这些约束可能来自于基因/基因组的结构，基因表达模式，以及基因产物在生化网络中的作用等。换句话说，基因组上下文联系可用于改进功能预测（Huynen et al.，2000）。这些方法的一个最大的用途在于，用本章所述的不同方法从整个基因组序列发现蛋白质相互作用。
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发现全基因组蛋白质相互作用的问题
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最近几年，我们见证了生物学研究从个案方法到系统化、大规模、高通量的计划的转变（Nierman et al.，2000）。在这期间，一些诸如DNA测序、凝胶电泳、质谱、序列分析和结构测定等方法都发展到了高通量阶段。随着测序继续产生大量需要解释的遗传信息，像后基因组学等词汇也加入到了基因组学革命当中。后基因组学的称谓意味着，如果已给出一个有机体的全基因组序列，就可以分析生物的功能特性（Eisenberg et al.，2000）。
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后基因组时代最重要的一个问题是在全基因组序列的基础上发现蛋白质相互作用的功能。蛋白质相互作用这个术语已在许多地方用到，而且它可能比蛋白质分子的直接物理作用具有更重要的意义。我们已使用“功能关联”（functional association）这个术语来描述蛋白质参与直接物理作用、多亚单位复合体，或者相同的代谢/信号通路。
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发现蛋白质相互作用远比发现单个基因及其功能特性复杂。为了说明其难度，假设我们有一个含70个基因的基因组，现在要预测所有的两两相互作用（图33.1）。此外，预计在4900个可能的两两相互作用中，仅有1%（49个）是真实的。这个问题比发现染色体上的基因更为困难，因为两两相互作用处于巨大而复杂的空间中（图33.1）。同时，假设我们现在用于发现蛋白质相互作用的方法的准确性为50%，就是说，对于每一个正确的相互作用，都有一个不正确的（图33.1）。现在的问题就成了将真阳性与假阳性（噪音）区分开来，并将假阴性（未发现的情况）数目保持在低的水平。而指出真阴性（将证明两个蛋白质不发生相互作用）也是非常困难的。
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图33.1 二次空间中一个假想基因组的示意图
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现在的挑战在于用许多原本不相干的方法来准确预测或发现全基因组蛋白质相互作用。这些方法可能是理论上的、实验的或者结合了两者的混合方法。我们将本章分为三个部分：（1）使用全基因组序列的纯计算方法；（2）混合方法，其中计算主要是用来检测实验信息中的模式（patterns）；（3）数据库挖掘和注释（curation）方法，它们特别依赖于对直接的实验信息的自动提取或人工高密度的注释（图33.2）。后面的步骤对于通过提供可靠、充分明白其特性的蛋白质相互作用来发展新的预测方法是很关键的。该示例亦反映了计算生物学中一连串发生的事件，首先通过算法来预测，而后一些预测与实验信息结合，最终建立某些办法来贮存信息并将其发布出去。
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图33.2 计算预测蛋白质相互作用的不同方法的示意图
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在此，我们讨论一些用于发现全基因组中蛋白质相互作用的技术，其中特别强调计算方法（图33.2）。通过实验方法来大规模发现蛋白质相互作用已经在其他章节回顾过了（Chen and Han，2000；Legrain and Selig，2000）。
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软方法：纯计算
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种系发生谱
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基因组上下文的一种形式是在整个基因组中同源基因的共同发生。共同发生的基因定义为那些在多个物种中都能观察到的基因的集合。同源基因可分为直系同源（orthologs）和旁系同源（para-logs）。直系同源是指在物种形成中出现，并在两个物种的共同祖先中都存在的基因。旁系同源定义为物种形成后通过基因复制而出现的基因。直系同源或旁系同源可能具有（或没有）相同的功能，虽然在大多数情况下它们有相似的功能特性，而且通常在缺乏种系形成史时无法将它们区分开来（Ouzounis，1999）。不幸的是，直系同源这个术语在基因组学中用得比较松散（Ouzounis，1999），为了避免混淆，我们使用下面实用性的定义。直系同源是指那些穿越两个物种的基因，它们彼此之间非常相似并因此具有类似的功能。
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直系同源基因的共同发生定义了一个种系发生背景，也就是说，它允许将在某些物种中存在的基因进行分类。在进化中一起“旅行”的基因被认为会参与相似的细胞进程，因此预测其为功能相关的。换句话说，如果两个蛋白质有功能关联，其编码基因就可能在某一基因组中一起出现。反过来这个论点也是成立的，如果在给定基因组中某个基因不存在，那么可能其伙伴也不存在（图33.3）。
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图33.3 图表说明直系同源簇是怎样用于产生种系发生谱的
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为了检验基因组的进化背景而构建了种系发生谱。这个谱列出了基因的种类，后面有在不同基因组中其直系同源是否存在的二进制表述（图33.3）（Ouzounis and Kyrpides，1996；Rivera et al.，1998；Pellegrini et al.，1999）。然后就有可能预测那些具有相似的谱的基因的功能关联了（Pellegrini et al.，1999）。种系发生谱亦被用于预测基因产物的细胞定位（Marcotte et al.，2000），将相互作用的概念在细胞空间中扩展到了更高的形式。
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随着基因组数目的增加，这个方法变得更为有效，因为它允许构建更精确的谱。但是，虽然看起来不错，这个方法还是有许多缺陷。首先，基因组中广泛的基因复制使得直系同源的发现非常困难，特别是在没有种系发生史的情况下（Ouzounis，1999）。其次，进化过程如非直系同源基因置换（displacement）、基因缺失（loss）及基因水平迁移（Galperin and Koonin，2000）等阻碍了对直系同源家族成员的可靠发现。此外，更为重要的是，通过种系发生谱发现功能关联蛋白质还是一个假设，需要检验，还只能用于少数高度相关的基因群。
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非直系同源基因置换通常发生于不相关、但是具有相似或类似功能的两个基因之间。在这些情况下，一个基因置换了另一个基因的角色。被置换的基因可能丢失，或进化成一个新的、功能稍有不同的基因。根据定义，新获得的基因与其他未发生置换的基因组中执行该功能的基因不是直系同源的。世系特异基因的缺失是另一个与进化背景分析有关的问题。在这种情况下，某世系中一个基因家族的一个成员或者由于缺失而丢失，或者由于加速进化至新的功能而丢失。当基因从一个世系转移到另一世系（有可能是距离比较远的世系）就发生基因水平迁移。这些进化机制使种系发生谱的构建变得混乱，因为它们使得在给定基因组中发现基因家族的成员非常困难。但是，可获得的完整基因组数目不断增长，这些预测的可信度也随之而增强。
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基因簇
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另一个探索基因的基因组背景的有用方法是共定位（colocalization）或邻域基因法（gene neighborhood）（图33.4A）。其思想是，相互作用或功能关联的基因必定在基因组中是物理上彼此邻近的（Tamames et al.，1997；Dandekar et al.，1998；Overbeek et al.，1999）。
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这种现象最明显的例子发生在细菌和古细菌的操纵子中，在这些操纵子中共同起作用的基因通常在相同的多顺反子mRNA上被转录。虽然在真核细胞中通常不是这样，也可以推断在没有操纵子的基因组中蛋白质功能关联。这包括在其他非真核细胞基因组的操纵子所包含的基因中发现直系同源。这个过程有其内在的优势，通常在物种之间操纵子结构变化很大，导致出现其他的情况，提示在缺乏操纵子的基因组中基因的功能关联。然而，由于目前仍然难以预测操纵子，可用于这种功能推测的数据是非常有限的。在真核细胞物种中缺乏操纵子也意味着，对于包含跨越原核生物和真核生物的同源基因家族的细菌基因组的分析是非常有价值的。这提供了极少的或没有提供关于eukaryal域的家族的信息（Ouzounis and Kyrpide，1996）。但是，已经有一些关于操纵子（Zorio et al.，1994）和真核细胞的多顺反子性转录（Blumenthal，1998）的报告，其范围目前仍不清楚。
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这种方法并不局限于研究在操纵子中出现的基因。如果在许多基因组中其同源性在物理距离上接近（如<300 bp），预测一对基因的功能关联也是可能的（图33.4A）。这种方法已经成功地用于在许多物种中发现代谢通路的缺失成员（Dandekar et al.，1998）。随着更多完整基因组的出现，这种方法的有效性就更为明显了。例如，第一例这类报告没有导致保守基因簇的发现（Mushegian and Koonin，1996），这个结果其后被证明是错误的（见上面）。这种方法也可作为基因融合分析的补充，基因融合代表了基因邻近的极端情况，两个基因融合成为一个单元。
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图33.4
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基因融合
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基因融合代表了基因结构和进化的另一个方面，已被用于发现功能关联或直接相互作用蛋白质。基因融合包括单个基因产物合并为多功能、多结构域的蛋白质（图33.4B）。这种事件在两个基因的产物发生相互作用或功能关联时最可能发生，可能是由于调控负荷减少引起的选择优势（Enright et al.，1999）。在全基因组中发现基因融合提供了一个比较好的计算方法来预测蛋白质之间的相互作用和关联（Enright et al.，1999；Marcotte，1999b）。在这种方法中，一个基因组中融合成一个“复合物”的蛋白质提供了一个模板，以发现在其他基因组中没有融合的同源“组分”蛋白质之间的相互作用（图33.4B）（Enright et al.，1999）。这种方法非常准确有效：即使是一个物种的单个基因融合，也足以为其他物种同源组分的功能关联提供证据。
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但是，这种方法应用的范围有限，因为它只能在进化过程中已经发生融合时预测蛋白质的功能关联。证据表明，编码代谢酶的基因更有可能参与这些活动（Tsoka and Ouzounis，2000a）。再次地，完整基因组数目的增长将使得这个方法更为有效。在给定的一对感兴趣的蛋白质中发现融合的复合蛋白质的机会随着新的基因组的出现而增长。这种方法看来也能用于真核细胞生物（Enright and Ouzounis，2001），就像原核细胞生物一样。但这需要准确性高的基因预测方法，这仍是未解决的问题（Lewis et al.，2000）。同时，必须小心的是，应避免发现混杂（promiscuous）的结构域（Marcotte et al.，1999b），如DnaJ，丙氨酸丁氨酸硫醚β合酶（cystathionine β synthase，CBS），以及螺旋—转角—螺旋（HTH）结构域。这些结构域在高等真核细胞中经常出现，需要将其过滤掉，因为它们会极大地增加假阳性率（噪音）。但是我们已经看到，小心处理这些情况可以达到较低的假阳性率（Enright et al.，1999）。多种组分情况（即极度旁系同源）使得一些预测不那么准确，因为对多组分成员不可能预测两两相互作用。
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中间方法：计算与实验
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代谢重组
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以全基因组序列的注释为基础，对给定物种的代谢重组已经进行了很多尝试（Karp et al.，1996；Tatusov et al.，1996；Bono et al.，1998；Selkov et al.，2000）。总的原则依赖于这样一个事实，大多数中心代谢的组分在进化中通常是保守的（一些有趣的例外参见Huynen et al.，1999）。这样，已知的参与氨基酸、核酸和脂质生物合成的酶可用作对物种的基因组序列进行比较的模板（图33.5）。
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图33.5 代谢/调控通路信息和基因表达数据如何用于通路重组的示意图
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与已知酶非常相似的蛋白质被预测为所查询物种中相应的酶。这种检测是通过与参考物种（如E.coli）或作为注释源头的完整蛋白质数据库进行序列比较得到的。前一种方法能提供更可靠的注释，但是不足以覆盖所查询物种可能的代谢功能（Karp et al.，1996）。由于序列数据库的噪音增加，后一种方法注释的可靠性没有那么高，但是能保证最大限度地覆盖可能的功能，而这些功能在任何给定参考物种中都可能是不存在的。
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这样，在所预测的酶存在或不存在的基础上重组了代谢通路（Bono et al.，1998）。参与某一通路的一组酶可以看作是功能相关的组，其中可能发生蛋白质相互作用。实际上，最近我们已经看到，E.coli 的代谢酶比其他任意选定的一组蛋白质更经常地参与基因融合，这些蛋白质大多参与酶复合体（Tsoka and Ouzounis，2000a），提示这两种不相关的方法可能相互交迭。实际上，几乎半数已知的E.coli 代谢补体中的酶亚单元参与形成蛋白质复合体（Ouzounis and Karp，2000）。因此，代谢重组代表了预测蛋白质功能关联的另一条途径，无需直接依赖基于同源性的预测（图33.5）（Marcotte，2000）。
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代谢重组的自然延伸是开发数据库系统来获得信号通路的信息，如细胞信号网络数据库（CSNDB）包含2000个以上生物大分子的信息（Igarashi and Kaminuma，1997）。这些不如代谢通路那样被清楚地进行了说明，包括每一个未被详细说明反应过程的单独步骤中出现的多种蛋白质。但是，信号通路是生化网络的关键成分，决定细胞的功能，通常参与多种蛋白质相互作用。具体地说，将蛋白质划分为不同的功能类别（Tamames et al.，1996；Andrade et al.，1999a）也可被看作为蛋白质通常参与一些相关细胞功能提供了一些线索。
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转录谱
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现在可以用微阵列技术来产生整个基因组某个状态的基因表达信息。构建一个包含一个基因组如酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）所有开放阅读框架（ORFs）的DNA芯片，然后从细胞中提取这个生物在某个特定状态下（如diauxic shift）的mRNA，并建立一个荧光标记的cDNA种群（po-pulation）。同时从mRNA建立一个参考状态的cDNA种群。后一个种群也是荧光标记的，但是具有不同的标记。标记的cDNA种群代表了在两种状态下基因mRNA表达的数量。然后这些cDNA就可以和DNA芯片上相应的ORF杂交。测量芯片上每个ORF两种标记的荧光，就可以根据与参考值的比较估计细胞中某个状态下基因的相对表达。
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这些表达率测量提供了一种有价值的检测共表达基因的方法（DeRisi et al.，1997）。在许多此类实验中表达模式相似的基因可能是共调控的（图33.5）。这些基因的相应基因产物可作为功能关联和可能相互作用的候选者。因为可以对不同状态（如正常和疾病）的细胞和组织（如人的神经元）进行分析（Ross et al.，2000），可获得的数据量可能是巨大的。
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基因表达数据的计算分析包括在实验之间及实验中进行数据的标准化（normalization），通常继之以某种形式的聚类操作（clustering operation）（Eisen et al.，1998）。标准化包括为数据统计分布图（profile）建立模型，然后用有意义的分值替代原始表达率。对这些标准化的数据点的聚类可以以多种方式进行。对于成功的聚类，需要使用距离度量（Eisen et al.，1998）。这是一个表示两个基因的表达谱的相似性的数值。可以使用简单的欧几里德距离度量，或者也可以采用相关系数（如Pearson相关性）。这就允许用标准的聚类技术，如K方法（K-means），将成对的基因分组。事实表明，通过这些方法产生的簇对共表达基因的分组非常好。
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但是，基因表达数据并非没有缺陷。相似基因可能在DNA芯片上交叉杂交（cross-hybridization），从而给出错误结果。产生的表达率数据有很多噪音，通常只能测量在任意给定时间基因表达的强烈诱导或抑制，因此非常难以发现基因表达的精细变化。通过多次实验和多个时间点，噪音可以减少。通过精确的标准化和可靠的聚类，然后有可能产生好的功能关联的候选者。在预测酵母基因组蛋白质相互作用的尝试中，转录谱也已和基因融合被一起使用（Marcotte et al.，1999a）。
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硬方法：纯实验
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注释（Curated）数据库
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最近几年，进行了许多建立数据库以贮存蛋白质相互作用信息的尝试。从前，这种来自于实验的数据没有明确地存贮于主要的分子生物学数据库中。蛋白质相互作用的两个例子包括相互作用蛋白质数据库（Database of Interacting Proteins，DIP）（洛杉矶加州大学，UCLA）和INTERACT（曼彻斯特大学）。这些数据库提供了用于表述、贮存、查询和浏览蛋白质相互作用信息的机制。DIP亦提供了用于确定数据库中贮存的任意相互作用的实验条件和过程的信息。虽然还处在初步的阶段，这些数据库包含了几千个已经了解清楚并有文档的蛋白质相互作用。随着数据库的增大，这些资源将为开发新的算法和确证已有算法提供基础（参见本章“生物学家的计算资源”部分）。
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文本挖掘
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常规注释生物学数据库和详细注释蛋白质相互作用数据库的任务令人望而生畏。这包括广泛审视文献以确定和提取相关的信息。由于数据库注释类似于手册的特性，提取的信息大都引用有良好文档、可重复的结果。
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事实上，大量有关蛋白质—蛋白质相互作用和蛋白质功能的信息已存在于已发表的文章中。美国国立医学图书馆（NLM）在MEDLINE数据库中收集并维护生物学文摘。因为MEDLINE仅提供了主要基于关键词的搜寻和检索，直接查找复杂的实验信息如两个蛋白质是否相互作用是非常困难的。由于这个困难，检索复杂信息是非常艰巨的，在得到所需信息前要涉猎无数的文摘。最近，计算基因组学中一种新的基于文本挖掘并且围绕这个概念的方法出现了（Craven and Kumlien，1999）。
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其中心思想是采用自然语言处理（NLP）技术来提取相应的信息片段，并按预先定义的模型（schema）将其收录在数据库中。这个过程称为信息抽取，可能包括非常复杂精密或尖端的处理算法以识别文本复杂的语法和语义结构。有关发现和处理关于蛋白质—蛋白质相互作用的文本信息的尝试已有报道（Blaschke et al.，1999；Thomas et al.，2000）。文本挖掘的其他过程包括文本聚类（Stapley and Benoit，2000；Iliopoulos et al.，2001），它产生相关文档组。这些文档收集可能包含关于某个主题如蛋白质相互作用的非常特异的信息。
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文档聚类系统并不试图“理解”文档，而是根据它们是否采用相似的术语将相似的文档集中到一个组中。从计算的观点来看，文档聚类比信息抽取要简单。生物学文摘的文档聚类应找出使用相同概念或主题的文摘，如代谢通路或发育过程。这可通过对文摘关键词的统计发现来达到，进而根据对这些术语的使用进行聚类。对于这个特定的问题，在相同文档簇的文摘中经常出现的蛋白质可能代表着功能有联系、可能相互作用的分子。但使用文档聚类很难确定这种联系的具体特性，因为我们不能查询特定的信息，例如“蛋白质A与蛋白质B相互作用”。
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信息抽取包括使用为“理解”文摘而设计的计算系统来分析文摘或全文。由于科学文本的复杂特性和人类语言的不确定性，这些算法承受着高噪音水平之苦。此外，对应于一个基因或蛋白质名称的多个同义词以及永远变化的科学词汇使其成为一个极具挑战的任务。这种方法通过试图理解生物学文摘及搜找短语所表示的相互作用，有可能产生一个相互作用蛋白质的列表。一个简单查询将发现短语如“蛋白质A与蛋白质B相互作用”。即使具有对语法和同义词信息的复杂理解，目前这些方法的假阳性率仍较高，且难以重复。
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虽然评价构建包含蛋白质相互作用信息或其他类型的功能信息的数据库的工具这类系统的用途还为时过早，数据可用性仍将可能推动文本挖掘的发展。随着最近生物学出版物公共仓库的启动，这种技术可能会迅速发展，并对从生物学文献中发掘蛋白质相互作用信息的速度和覆盖面有重大影响。
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使用这里描述的不同方法来计算蛋白质相互作用在几年前看起来还是不可能的。一些算法采用来自基因和基因组结构的某些强约束，使用这些算法结合功能数据如代谢通路或转录谱，以及存贮在高质量、注释数据库中的可靠信息，现在有可能得到关于基因或蛋白质相互作用的线索。这些方法在可见的将来会成熟起来，并在后基因组革命中扮演重要角色。我们希望，来自于专为发现蛋白质相互作用而设计的高通量生物学实验的功能基因组学信息将与处理这个问题的算法和数据库结合，以使分子相互作用计算带来有意义的、重大的结果，促进人类健康、农业生产和环境控制。
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生物学家的计算资源
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纯直系同源和种系发生谱
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如前所述，种系发生谱可作为预测蛋白质间功能关联和可能的相互作用的有效工具。产生种系发生谱所需的方法十分复杂。美国国家生物信息中心（NCBI）有一个完整基因组中直系同源蛋白质的综合目录。该收集称为直系同源组簇，或COGs（图33.6）。最近，与这些簇的种系发生谱有关的信息被添加到了COG数据库中。这使得对完整基因组中蛋白质序列种系发生谱和直系同源的综合分析成为可能。COG数据库为使用这种方法进行种系发生谱分析和计算预测蛋白质的功能关联提供了很好的框架。
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图33.6 屏幕截图（A）显示直系同源组簇（COGs）数据集的条目页面，另一屏幕截图（B）显示数据库中包含的不同簇，以及与其相关的种系发生谱
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COG数据库是按照以下方式组成的：
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1.采用序列相似性算法如BLAST对所有将要分析的完整基因组的蛋白质序列进行完整的自身比较。
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2.使用双向最佳命中度量描绘直系同源，直系同源定义如下：
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如果两个不同基因组中的两个蛋白质为直系同源，则在第一步两个基因组的比较中它们必须有最高的相互命中分值。
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然后旁系同源可以定义为，在同一基因组中的两个蛋白质，当用BLAST进行基因组的自身比较时，相互具有相似性命中的最高分值。
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3.以上定义这些联系的标准用于将所有基因组的蛋白质聚类到直系同源或旁系同源家族。
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4.初始的簇使用多重比对进行分析，以确认在给定簇中存在保守模体（motif）。同时检查簇，看其中是否存在多结构域蛋白质，如果发现有，簇将按每个结构域划分为相应的子群。
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5.建立每个COG的种系发生谱，列出在每个完整基因组中该COG的成员是否存在。
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这种直系同源蛋白质家族和代表性种系发生谱的收集可用于蛋白质相互作用和相关分析。对于簇A中感兴趣的某个蛋白质，将该簇的种系发生谱与其他所有簇的进行比较。比较时，可以用相关度量（correlation measure）（如Pearson相关性）或欧几里德距离度量来搜寻精确匹配（exact match）或查找密切匹配（close match）。簇中与簇A具有非常相似发生谱的蛋白质可能与我们感兴趣的蛋白质在功能上关联。而且可能相互作用。但是，需再次强调的是，当有大量的完整基因组时，这些谱能较好地发挥作用。因此，30个基因组的谱比基于较少物种的谱能提供更多的信息。
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基因共定位
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相关基因定位研究亦能提供关于功能关联和可能的蛋白质相互作用的知识。一些资源提供了关于基因簇和基因相邻的详尽信息。WIT（Overbeek et al.，2000）是其中一个资源，它结合了序列簇、代谢通路重组和基因共定位信息。STRING（Search Tool for Recurring Instances of the Neighborhood of Genes）（Snel et al.，2000）是另外一个这样的资源，仅关注于基因共定位（图33.7）。这两个资源都以相似的方式收集基因共定位的信息。
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分子克隆手册：蛋白质—蛋白质相互作用
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图33.7 EMBL的STRING服务器的屏幕截图该图显示genitalium 支原体的MG252基因的基因邻域信息，其中直系同源基因以相同颜色显示。
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1.双向最佳命中的概念扩展到成对相邻双向最佳命中（Pairs of Close Bi-directional Best Hits，PCBBHs）。
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当一个基因组的一对相邻基因是另一不同基因组的一对相邻基因的双向最佳命中时就出现PCBBH。这种情况下，“相邻”是指这些基因直接相邻或在DNA链上彼此在300bp之内。典型的情况是，这些基因在同一条链上。PCBBH可以准确发现不同基因组中经常以相同基因邻域出现的一串基因。双向最佳命中的约束意味着这些基因通常是直系同源的。
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2.将基因组间保守基因簇的不严格约束定义为近同源性对（Pairs of Close Homologs，PCH）。它能够发现那些经常出现在相同邻域，但是彼此不是双向最佳命中的基因，惟一的要求是它们的同源性高于某些设定的相似性阈值。这个标准不那么严格，允许保守基因簇中的基因执行相似的功能，并且这些基因不必是直接同源的。
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3.对出现在多个基因组中相同邻域的基因（PCH或PCBBH）根据其重要性进行打分。其中最重要的一种打分分类依赖于感兴趣的基因组之间的种系发生距离。基因簇中种系发生相似的基因组比种系发生距离远的基因组更有可能被发现。有一个打分系统是基于16S rRNA种系发生树来度量两个基因组之间的种系发生距离。
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4.如果两个基因在不同的基因组中有相同的共定位特征，那么根据成对分值可以确定是否具有足够的证据称这两个基因在功能上关联。这通常涉及把联系两个所讨论基因的所有PCH和PCBBH分值相加。
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5.最后，将成对分值高的基因作为功能关联和可能编码发生物理作用蛋白质的候选者。
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使用STRING和WIT资源，从感兴趣基因列表中提取所有有证据表明在不同基因组中发生共定位的候选基因就相对简单了。其后这些证据可方便地与种系发生谱和基因融合数据一起使用，生成可能相互作用的基因产物对的列表。和种系发生谱方法一样，这种方法随完整基因组的增加而受益。随着基因组越来越多，基因共定位和种系发生谱方法的分辨率有望极大地提高。
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基因融合分析
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基因共定位研究依赖于这样一个事实，进化有时使发生物理相互作用或关联的基因在基因组内保持非常接近。这种情况的极端形式是两个基因实际融合成单个多功能蛋白质。已知实际上有许多这种基因融合的例子，例如参与酿酒酵母芳香族氨基酸生物合成的基因。在这个例子中，通路中的所有5个基因融合成一个单元，可作为一个单独的蛋白质执行所有通路步骤。这看起来是一个非常合理的假设：当这些事件发生时，所研究的蛋白质很可能发生物理相互作用或功能关联。现在的问题是从完整基因组数据库中准确发现这些情形。AllFUSE资源是获取关于有证据表明存在基因融合的感兴趣的基因的信息的好去处（图33.8）。这个资源产生于采用融合检测算法对24个完整基因组基因融合证据的系统分析。发现基因融合的处理是复杂的，按照以下方式进行。
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图33.8 EMBL-EBI的AllFUSE服务器的屏幕截图
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1.选择一个查询基因组和一个参考基因组。参考基因组中融合的复合蛋白已找到。在查询基因组中找到未发生融合的蛋白质，而假设在参考基因组中它们形成了一个融合蛋白。
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2.采用序列相似性搜寻工具如BLAST将查询基因组中的所有蛋白质序列与参考基因组的序列进行比较。查询基因组也采用BLAST进行自身比较。
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3.所有查询对参考和查询对查询的相似性高于某个阈值的相似性用二进制表示方式存储在序列相似性矩阵中。检查查询基因组查询矩阵的对称性（即，如果A命中B，B是否命中A？）。采用非常灵敏的搜索算法如Smith-Waterman算法重新检查相似性以解决非对称性命中。
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4.然后，参考基因组查询矩阵和查询基因组查询矩阵被用于检测参考基因组中蛋白质A命中查询基因组中蛋白质B和C的情况。然后，检测这种关系的传递：寻找蛋白质A命中B且A命中C、但是B和C彼此互不命中的情况。如果出现这种情况，采用Smith-Waterman算法进行另一轮比较，以确认B和C之间没有较大的相似性。如果找不到相似性，A被标记为可能的基因融合，B和C为可能的相互作用者。
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5.对这些候选融合事件使用最小交迭标准，以过滤以下情况：当与参考复合物序列对齐时，两种组分蛋白质的交迭超过5%。
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6.在查询基因组中如果旁系同源物的同源性较高，可能导致难以判断可能的相互作用者，因此其后可采用聚类步骤来进一步对融合事件分类。
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这个方法看来能够足够可靠地以较高的准确性（>90%）发现基因融合事件。这样，就提出了一个发现有可能相互作用的蛋白质的好方法。如同前面提到的两种方法，在这种类型的分析中，使用越多的完整基因组，准确性和灵敏度就越高。只在一个基因组中融合直系同源的两个基因可视为测序错误或可能是假阳性，但是如果在多个基因组中检测到，预测的可靠性就增强了。这种方法能迅速地检测出已知的相互作用蛋白质（如色氨酸合酶α和β亚基）以及许多组成复合体的蛋白质。由此得出结论，预测蛋白质之间的未知功能应该是非常可靠的。通过大规模实验如AllFUSE项目来验证这些预测非常困难，因为还没有蛋白质—蛋白质相互作用的大规模实验的数据。但是，与酵母的基因表达数据集的比较表明二者有很大交迭（Enright and Ouzounis，2001）。对于寻找计算方法来确定蛋白质相互作用的生物学家来说，AllFUSE提供了一个可用的相关资源，包括几万个按照上述方法预测的功能关联和相互作用。
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代谢网络和调控通路
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基因网络分析是生物信息学中快速发展的领域。根据基因在细胞内如何参与基因调控和代谢通路的相互连接的研究能提供关于蛋白质—蛋白质相互作用的直接信息。代谢通路分析和重组通常包括非直接蛋白质相互作用网络（即酶的关系）。基因调控网络分析提供直接蛋白质相互作用的证据，如磷酸化。代谢通路数据库已存在了一段时间，这些数据库的例子包括EcoCyc（图33.9）（Karp et al.，2000）和KEGG（图33.10）（Kanehisa and Goto，2000）。KEGG（Kyoto Encyclopaedia of Genes and Genomes，京都基因和基因组百科全书）已经显著地扩展，不仅考虑代谢通路信息，也包括调控网络信息、基因组间直系同源以及基因表达信息。
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图33.9 屏幕截图
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KEGG和EcoCyc的开发都使用了知识库技术。虽然根本的表述非常不同，复合并丰富的数据库模型是其共同主题。知识库本质上是具有独特的表现形式的面向对象的数据库。知识库相对于传统关系型数据库的优势是其清楚而真实的表述以及强大的查询能力。EcoCyc提供了多种对象类型，但是在蛋白质相互作用中最重要的一点是蛋白质复合体类型，由其对同构和异构聚合复合体进行评注（Karp，2000）。KEGG包含一系列已知的代谢和调控通路（如凋亡和细胞周期）。两个数据库都链接到其他分子生物学数据库如SwissProt（Bairoch and Apweiler，2000）。KEGG试图通过将某个基因组中的基因映象到其他基因组中的已知通路和直系同源基因来描述代谢和调控通路。此外，两个数据库都能处理基因表达信息，允许在相应的代谢或调控通路背景下对基因共调控进行系统分析。
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从蛋白质相互作用的观点来看，用这些资源可直截了当地检验感兴趣的基因。处于相同调控或代谢通路的蛋白质是功能关联和可能相互作用的候选者。调控通路预测系统可能是定位那些根据某种机制如磷酸化预测是有相互作用的基因的最佳方法。
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图33.10 京都基因和基因组百科全书（KEGG）的屏幕截图，显示该数据库中包含的两条通路
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基因表达分析方法
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通过基因表达谱分析基因共调控是定位功能关联蛋白质时使用越来越多的公用方法。DNA芯片方法现在能将给定基因组的所有开放阅读框架（ORFs）放在一个芯片上，允许快速进行许多基因表达实验。不幸的是，目前没有基因表达结果的标准积累。一些关于存贮和使用这些信息的标准系统的建议已发表，如微阵列基因表达数据库小组（Microarray Gene Expression Database Group）提出的。看来不远的将来会有这么一个数据库。但是，多数此类信息现在也可以直接从产生这些信息的实验室取得。诸如斯坦福大学和哈佛大学的实验室是获取生物（如S.cerevisiae）的基因表达数据的极好的来源。
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欧洲生物信息学研究所的微阵列小组提供了一些可公开获得的基因表达数据以及Expression Profiler（图33.11）。这是对基因表达数据进行可视化、分析和聚类的极好资源。它允许从不同实验中选择一组基因表达谱，然后通过相似表达谱的聚类来定位基因。这里可以使用多种不同的聚类方法，如欧几里德距离、相关性和K方法。因此，基于分区的和分级的簇信息都可得到。
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图33.11 EBI的Expression Profiler工具中EPClust服务器屏幕截图
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一旦聚类完成，聚类结果就以标准化的图形和颜色对表达率进行可视化显示，同时伴以在表达谱相似性基础上置于某一特定簇的基因的列表。也有其他工具用于检索每个蛋白质的代表序列，以及在DNA水平上分析这些基因的上游区域以识别可能的调控区域。基因的精细模式分析也是可能的。
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利用这个资源，可以得到显现出表达谱相关的可靠的基因簇。然后，显现出非常相似的表达模式的蛋白质就可用作功能关联和可能直接发生物理相互作用的候选者。表达数据越多，基因表达分析就越可靠。例如，在十个实验中相关性高的基因比两个实验的相关基因其功能有联系的可能性就大得多。基因表达数据对噪音还是非常敏感的，必须十分小心地在分析中将其影响缩减到最小或将其过滤掉。当与分析方法（包括调控网络重组，以及其他发现功能关联和蛋白质相互作用的方法）结合在一起时，这些数据是非常有用的。
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包含相互作用信息的数据库
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相互作用蛋白质数据库
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相互作用蛋白质数据库（DIP）是建立一个通过实验已知发生物理相互作用的蛋白质的注释数据库的尝试（图33.12）。用户可以向数据库中提交条目。目前这个数据库详细描述了已知的与大约80个物种相互作用的约3500个蛋白质。数据库中亦存贮了确认这些相互作用的文章和实验，使其成为蛋白质相互作用信息的无价资源。希望越来越多的生物学家最终将相互作用和附加的证据提交到这个数据库，使它成为从单个来源获取任意生物相互作用信息的综合指南。
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图33.12 洛杉矶加州大学相互作用蛋白质数据库（DIP）服务器的屏幕截图。
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生物专业数据库
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现有许多专业数据库包含关于单个生物的多个来源的信息，现在其中许多数据库包含关于细胞定位、基因表达和蛋白质相互作用的信息。对于酿酒酵母（S.cerevisiae）有两个这样的数据库：SGD（Saccharomyces Genome Database）（Ball et al.，2000）和YPD（Yeast Proteome Database）（Hodges et al.，1999）。这些数据库组织得非常好，提供了关于酵母基因和蛋白质的详尽信息。酵母蛋白相互作用的信息也能从这些数据库中获得并可方便地进行访问。另一个专业数据库的例子是FlyBase（Gelbart et al.，1997），这是关于黑尾果蝇（Drosophila melanogaster）的综合数据库。像YDP一样，FlyBase也包含了大量关于黑尾果蝇蛋白质—蛋白质相互作用的信息。
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当查找某个生物蛋白质—蛋白质相互作用的特定信息时，这些丰富的、物种特异的数据库资源是非常有价值的工具。此外，对于其他没有注释得这么好的生物，一些信息也是有效的。
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参考文献
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Bairoch A.and Apweiler R.2000.The SWISS-PROT protein sequence database and its supplement TrEMBL in 2000.Nucleic Acids Res.28：45～48.
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34 蛋白质—蛋白质相互作用的可视化和整合
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前言
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为什么需要可视化
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首先，对大多数人而言，在说明一个问题时，图形要比数据容易理解。对大量数据存在或者复杂的情况，这一点更为明显。比如在细胞内部，存在一个动态的过程，如果用一系列数据或者是一个表格来描述蛋白质之间的作用，我们就不容易了解细胞里面发生的事情。其次，在各种感官之中人们更加偏好视觉，图形化的描述方法能够很好地迎合这点。就像一张公路示意图（road atlas），蛋白质相互作用图形能够给新手和专家提供一种指南（orientation）。为了使这种图形对两类使用者都有用，非常需要发展一种动态地图，使我们在只需要一个大体的框架时它能够隐藏某些具体的细节。最后，蛋白质相互作用图能模拟验证某些可以用实验验证的假说。例如，一种膜蛋白发现可跟调控因子作用，这种结果可能被认为是假阳性的。这种明显的不一致性可以导致一些关于信号转导的新发现，就像“切迹基因的信号转导”和“无毛的抑制基因”（Artavanis-Tsakonas et al.，1999）或者SREBPs的情况，调控因子定位于内质网膜上（Edwards et al.，2000）。发展一种合适的图形可以帮助我们鉴定这类有价值的反常现象。
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蛋白质相互作用图与代谢途径
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人们在代谢路径的可视化上投入了很多精力（如Michal，1993，1998），很多最新的工作借助于计算机完成（如Küffner et al.，2000）。代谢路径和蛋白质相互作用网络的结构虽然相似，但仍存在明显差异：代谢路径的研究关注的是小分子的转化，在这个转化中，酶起着主要作用。蛋白质相互作用图（或者是信号转导图）主要是研究那些没有明显化学变化的物理接触。研究单个的蛋白质分子或者特定的生物过程时，物理相互作用是非常有用的，但是它们本身不能反映生物文献中积累的相关的大量的有用信息。比如图34.5，它表明酵母中的PEX蛋白形成了一个复合体，但是它不能提供关于这个复合体的装配、生物功能，或其调控方面的任何信息。这个问题在一定程度上可以通过建立蛋白质数据库中的超级链接得以解决，但是遗憾的是，现在几乎没有一个数据库用一种便于阅读的格式收集了这些信息。
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除物理网络和代谢网络之外，很多研究小组提供了另外一种网络模型——遗传网络（Kolpakov et al.，1998；Serov et al.，1998；von Dassow et al.，2000）。这种网络不需要物理相互作用，能够反映某些尚待考证的影响生物进程的因素（von Dassow et al.，2000）。所有这些网络的最终目标都是一个整合了遗传和代谢信息、能够预测显型的物理网络。
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对物理网络进行条理分明的显示的最大挑战仍然是显示那些关于分子和它们的相互作用的大量生物信息。图形化的网络能够描述复杂的生物相互作用，但不能解释生物学进程，因为一些生物学进程中某些重要的细节是不能可视化的，比如空间上的和暂时的表达模式或者发生相互作用的特定条件。
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蛋白质网络、蛋白质复合物和动态的蛋白质相互作用
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现在确定蛋白质复合物组成最常用的方法是质谱分析（Yates，2000）。然而质谱不能反映蛋白质的拓扑关系，因此还需要借助其他手段辅助判断结合对象。酵母双杂交系统就可以提供直接相互作用的补充信息。然而，整合不同条件下得到的数据仍然是一大挑战（例如不同的环境下生长的细胞）。图34.2描述了这种非重叠的数据集。蛋白质相互作用发生在稳定的复合物之间，或者是作为一种暂时的相互作用。不幸的是，大部分蛋白质相互作用是一种定性描述，我们不知道这种相互作用的实际强度。例如，截至2000年12月，DIP数据库仅仅列出了不到20种蛋白质相互作用的结合常数（Xenarios et al.，2000）。现在几乎没有任何关于蛋白质相互作用的量化数据，利用“信息学”的手段对蛋白质复合物进行定量研究变得非常的困难。
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图34.2 蛋白质复合体和蛋白质网络
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理论上，蛋白质三维结构的计算分析可以帮助我们找到蛋白质结合表面进而预测它们的相互作用（Tsai et al.，1996；Palma et al.，2000）。在酵母蛋白质组的接近6000种酵母蛋白质中，大约600种蛋白质的三维结构已经通过实验测定，有接近2600种（接近44%）的结构能够根据同源蛋白质构造出模型（http：//jura.ebi.ac.uk：8765/ext-genequiz//genomes/sc/index.html；Sanchez et al.，2000；Vitkup et al.，2001；U.Pieper and M.Andrade，pers.comm.）。虽然如此，但实验数据的缺乏和计算能力限制了我们进行深入的研究，以至于在很多情况下我们无法进行成功的预测。
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蛋白质—蛋白质相互作用和相关的信息
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为了描述分子之间的相互作用，特别是描述那种动态的、跟很多参数相关的相互作用，我们需要知道很多信息。例如，一旦确定了一对蛋白质的相互作用，我们就希望知道这参与作用的结构域。因为知道了这些，我们就可以做出关于这种作用的特性和性质的很多假设。相互作用强度也是一个很重要的参数，根据这个值可以判断这两个蛋白质分子之间是形成了稳定的复合体或者还只是短暂的相互作用。相互作用的强度会受到蛋白质的磷酸化或者其他化学修饰的影响。例如，具有SH2-和一些WW-结构域的蛋白质只会同那些磷酸化的蛋白质发生作用。
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表34.1 分子相互作用参数和相关生物信息资源
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静态蛋白质相互作用可以直接进行描述，但动态的相互作用研究和可视化就要困难得多。例如，酶的活性可能是由很多的亚基来调控的，但这些亚基的相互作用还受到温度、磷酸化、浓度等物理生化参数的影响。蛋白质相互作用可以用一个蛋白质施加在另外一个蛋白质上的作用来描述，就像是酶和底物之间的作用，常见的例子如蛋白乙酰转移酶或者蛋白酶。在酶促反应中，为了保证有一个高的反应速率，酶和底物之间的作用要求是短暂的并且不能太强。表34.1总结了描述蛋白质相互作用和作用条件的一些参数。表34.2列出了一些有关的数据库和网址。
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表34.2 数据库和网站
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可视化
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关系的可视化
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蛋白质相互作用经常表示成蛋白质对的一个线性列表（Uetz et al.，2000）。关系型可视化就是要用图形去反映实体和实体之间的关系（图34.3）。这种描述的复杂度不尽相同，从比较简单（图34.3A～C）到高度复杂（图34.3D～H和图34.4）。图34.3F和G说明了图形在跟酵母相关的小型蛋白质相互作用网络中的作用。
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图34.3 蛋白质相互作用的可视化
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尽管图形和文字描述能够传达完全同一信息，但是图形描述（一般称之为布局），相对于文字表达甚至其他表达方式更具有优势。
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1.定位 一个实体可以对应多个实体。在一种文字的表述中，蛋白质X参与的相互作用会出现在蛋白质相互作用列表的不同位置，如果需要查找所有的蛋白质X参与的作用，我们就必须对这个蛋白质列表进行一次全面的搜索。而使用图形表达，蛋白质X只出现一次，寻找其参与的蛋白质相互作用也变得非常简单，图形化的表达方法使结果一目了然。
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2.上下文关系 一个图形中，一旦一个蛋白质X被确定，所有与之相邻的蛋白质就容易被确定。我们马上就可以对与之相关的相互作用进行研究。
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3.智力图 图形化的描述可以帮助我们利用蛋白质在智力图（Mental Map）中的位置去进行记忆（Eades et al.，1991）。为了确定节点的位置，需要借助于一些辅助的信息，例如蛋白质的位置或者功能（常常在图形中根据这些参数进行空间分组），利用这种方法排列网络中的蛋白质，大大增加了这个图形蕴含的信息量，也更易理解。
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首先大规模实验方法可以得到大量的实验数据，这就使得全部蛋白质相互作用不可能仅仅在一个图层中表达出来。即使一个相对比较简单的有机体比如酵母也不太可能。
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例如，图34.4显示一个酵母中的蛋白质相互作用网络，其中包含了实验得到的大量的蛋白质相互作用（截至2000年4月），其中不同功能的蛋白质用不同的颜色标记出来（根据YPD分类，Costanzo et al.，2000）。从中可以很清楚地看出，具有相同功能的那些蛋白质聚集在一起。通过图34.5，我们可以更具体地研究图34.4中的相互作用。虽然在外围区域蛋白质相互作用排列得很好，但在图的中心，由于相互作用的边和名字标签相互交叠，以至于分辨不出单独的相互作用。最后，计算机产生的图形表达信息的容量不如手绘图形。手工作图（Michal，1993；Kohn，1999）通常具有很高的质量，但是需要很大的工作量，只能在处理小的数据集时使用。最后，随着更复杂基因组更复杂数据的出现使得手工作图不太合适。
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图34.4 酵母中的2 358对蛋白相互作用
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图34.5 图34.4的细节
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符号和规则
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人们建议采用一些符号描述蛋白质之间的相互作用。值得一提的是Kohn（1999）提出的一些符号规则，他们用来描述一些参与细胞周期调控和DNA修复的蛋白质相互作用（图34.6至图34.9）。Kohn的连线图很容易人工作出，但计算机自动产生就很困难。这就意味着如果图形包含大的变化时，必须人工重新绘制。考虑到这套符号规则将来也有可能被使用，我们把这些符号列在下面供大家参考。2001年，Cook等也提出了一套描述复杂生物体系，包括蛋白质相互作用的一些符号和规则。还有其他很多人在这方面也进行了研究。如想了解这方面的最新进展，可到我们的网站（http：//www.systemsbiology.org/pubs/vizprotein）查阅一下最近的更新。
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分子克隆手册：蛋白质—蛋白质相互作用
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图34.7 Kohn的二选一结合模型描述
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图34.8 Kohn对多分子复合物和转录调控信息整合的描述
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图34.9 Kohn对同类多聚体的描述：p53的同类四聚体结合和影响。填字的圆圈代表另外的p53拷贝
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图形和图形的绘制
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研究图形绘制的主要目的是解决图形中映象（maps from graph）的自动计算问题。蛋白质相互作用的抽象性质可以用图形中的数学概念进行表达。一般而言，图形中的节点表示蛋白质分子，节点之间的连线代表相互作用。图形应用在很多领域中，比如社会学、工程管理学和软件工程学，也应用在生物学的其他领域，例如生物分类学和生物化学。在数学中，人们专门发展了一门研究图形性质的理论——图论（Bollobas，1998）。
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图是点和线的集合。图论不研究图中的点和连线的具体位置。如果要想知道一个图的绘制和布局，就需要进一步研究每个点的二维或者三维坐标，同时指出这些连线的画法。用计算机来完成上述任务，这是计算机研究领域的一个相对年轻的子领域图形绘制（Graph Drawing）的主要目标（Di Battista et al.，1999）。各种指标用来衡量二维图形的质量好的图形，应该具有以下一些特征：节点均匀分布，连线为直线，同构或者相同的不同子图应该画得一致等。一个最为一般的准则是，图形中连线交点的数目能够反映出绘图能力（Purchase，1997）。
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作图时最好选择平面图。只要选用合适的方法，图形就可在平面内画出而避免交叉。平面图有很多重要应用，比如电子线路图（电路是不允许交叉的）。尽管在满足没有连线交叉的情况下，我们可以用多种方式设计一个平面图，但不能容易地判断一个给定图形是否为平面（Hopcroft et al.，1974）。很多图形，比如描述蛋白质相互作用的图形就不是平面图。
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弹簧镶嵌体算法
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弹簧镶嵌体算法（Spring embedder algorithm）是一种在大的二维或者三维图上应用最广泛的算法（Eades，1984）。这种算法把图形模拟成一个机械体系。边看作弹簧，点比作环。弹簧的两端固定在环上。当两个环相距较远时弹簧会产生拉力，相距较近时会产生斥力。通过模拟体系在一段时间内的动力学行为，找到一种合适的环排列方式，使整个体系的能量最低。图形中的各个节点被确定。图34.4就是用这种方法作出来的。
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大型图形的局限性
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对超过100个节点的大型图进行计算时，就会有一些技术上的限制。首先，这些图的算法复杂度往往不是线性的，至少跟图的大小呈平方关系，很多图的计算甚至会变成NP-困难问题（Garey et al.，1979；Garey et al.，1983）这类问题可能根本不存在多项式时间（polynomial-time）算法，这就意味着在大图的计算中，非常复杂的计算是不可避免的。第二，在一个拥有成千上万或者更多节点的相互作用体系中，仅仅去画一个动态改变的图，即使他们是一个线性的操作，所需要的时间往往也是不能接受的。虽然更快的计算机的出现在一定程度上可以减轻上面的矛盾，但是，在以上质量标准下，计算机也作不出让人感到满意并达到实用水平的图形。
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扩展到三维空间
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计算能力的增强和图形显示技术的进步促进了三维图形的发展。任何图形在三维空间内都可以做到不交叉。因此连线交叉的准则不再适合判断三维空间内图形的好坏（Fary，1948）。现有人提出了一种改进的弹簧镶嵌体算法来处理三维空间中蛋白质相互作用的显示问题（Basalaj and Eilbeck，1999）。
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可视化技术
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缩放和分区存取技术
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常用的一个方法是“缩放和分区存取”。这类似于网页浏览器中使用的一种技术。浏览网页时，不是从头到尾地同时显示一个网页，而是通过一个滚动条连续地翻滚页面，使某个时刻在浏览器只显示网页的一小部分。
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上下文关系和焦点技术
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缩放和分区存取技术有一个缺点：我们看不到框架（layout）的某些区域，在创建“焦点”的同时，丢掉了“上下文关系”。使用焦点和上下文技术就可以解决这个问题，这种技术不是隐藏框架的某些部分，而是把框架压缩到窗口的边上，这就避免了上下文关系的丢失。这种技术的一个例子就是为大家所熟知的鱼眼效果（fish-eye effect）。焦点和上下文技术是缩放和分区存取技术的补充，两种技术可以同时使用。
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折叠蛋白质类群技术
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这种技术是前两种技术的补充，它通过把一群蛋白质折叠成一个节点来简化图形。图34.10是根据YPD（Costanzo et al.，2000）在蛋白质的功能分类的基础上利用酵母的2709对蛋白质相互作用产生的相互作用图（Schwikowski et al.，2000）。蛋白质具有很多的功能，因此它们属于很多的集合。图形中的每个节点代表具有相同功能的蛋白质集合。这个集合的信息可以用很多手段表示出来。图34.10中，边A-B上面的数字表示具有功能A的蛋白质集合和具有功能B的蛋白质集合之间的蛋白质相互作用的数目，边A-B的粗细也反映这个数目的多少。每个节点旁边括号中的数字分别表示功能集内的相互作用的数目和蛋白质的数目。
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图34.10 蛋白质根据功能进行的分类
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可用的图形表达工具（Available Tools for Visualization）
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表34.3列出了一些现在常用的蛋白质相互作用图形可视化的软件包。表34.4中列出了对预先定义好的有限蛋白质集合进行了可视化的某些蛋白质相互作用数据库。
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表34.3 一般网络的可视化软件
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表34.3 一般网络的可视化软件（续）-1
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表34.4 某些数据集的可视化
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表34.4 某些数据集的可视化（续）-1
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利用补充数据整合蛋白质相互作用网络
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补充数据类型的同时显示
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蛋白质不是生物学家惟一感兴趣的分子，蛋白质相互作用也不是控制进程和影响表型（Phenotype）的惟一作用。相反，在对蛋白质相互作用网络成功的进行可视化后，会马上出现很多的问题，比如：这些蛋白质是怎样跟DNA、底物和其他细胞成分相互作用的？蛋白质相互作用会给参与作用的蛋白质分子的性质和行为带来怎样的影响？
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实际上，不难想像把一些新的数据类型补充到图形中。获取补充数据（Complementary Data）一般有四种途径：新的蛋白质相互作用类型、新的分子类型、已有的相互作用的新信息和已有分子的新信息（可参看表34.1）。在图形描述时，我们不仅希望能够描述出蛋白质相互作用，也希望描述出蛋白质跟其他配体或者小分子的相互作用。例如，具有调控功能的蛋白质不仅能跟各种蛋白质辅助因子结合，也可以跟特定的DNA片断结合形成复合体。另外，在某些时候，考虑到这些性质会是非常有用的。除此之外，在基因相互作用的上下文关系中引入蛋白质相互作用；在每个已知的蛋白质节点上加上最后的表达模式；在每个蛋白质相互作用加上作用的瞬时强度。这些都是一些很有意义的工作。
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现在的很多论文和教科书，已经有很多描述不同类型的分子和它们相互作用的图形。这些图形常常是利用非常有限的元素做出的，仅仅是为了描述某个独立的生化进程或者是信号转导通路。这些图形往往是为了专门去说明一个预先确定的概念，它需要合适的文字来说明问题（Pirson et al.，2000）。我们研究的图形与这截然不同。双杂交技术、DNA微阵列技术和高通量蛋白质组学技术给出了庞大的蛋白质相互作用的数据，我们非常需要一种可视化描述去显示和组织这些数据。这些图形不是为了去解释某种已有的结论，而是为了准确地模拟蛋白质功能或者生物关系以求新的发现。由于原始数据所代表的补充数据的类型越来越复杂，研究图形描述和相互作用的工具在我们需要强调和抓住关键特征时变得越来越重要。
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实例：研究半乳糖代谢的整合网络
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35 通过调节蛋白质—蛋白质之间相互作用发展新的治疗方法
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前言
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蛋白质—蛋白质间的相互作用几乎参与了所有的生物学过程，操控蛋白质—蛋白质之间的相互作用是发展新的治疗策略的有力工具。现已应用几种方法来开发改良的启动子，用于基因治疗或改变病毒载体的定向。本章描述了此研究领域的一些代表性的例子。
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靶向性转录
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附录1 注意事项
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一般注意事项
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以下一般注意事项应该时刻遵守：
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● 在开始操作之前，应该完全熟悉所使用的所有物质的性质。
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● 没有注意事项未必意味着物质是安全的，因为信息不可能总是完整全面的。
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● 若接触有毒物质，及时与当地安全部门联系，以获得相关指导。
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● 对于所有化学、生物及放射性废物应采用适当的处理程序。
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● 关于合适手套的特殊使用准则，向当地安全部门查询。
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● 处理浓酸和浓碱要特别注意。应戴防护镜和合适的手套。当处理量大时应佩戴面罩。强酸不能与有机溶剂混合，因为它们能发生化学反应。特别是硫酸和硝酸能发生强烈放热反应，易引起火灾和爆炸。强碱不能与卤化物溶剂混合，因为它们能形成可导致爆炸的活性碳烯。
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● 决不能用嘴吸取溶液。这种方法既不能保证无菌又很危险。应使用移液管或吸球。
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● 分开保存卤化物溶剂和非卤化物溶剂（如在碱性条件下混合氯仿和丙酮能引起意外反应）。卤化物溶剂是有机溶剂，如氯仿、二氯甲烷、三氯三氟乙烷和二氯乙烷。某些非卤化物溶剂是戊烷、庚烷、乙醇、甲醇、苯、甲苯、N，N-二甲基甲酰胺（DMF）、二甲基亚砜（DMSO）和乙腈。
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● 激光辐射（可见或不可见）能对眼睛和皮肤造成严重伤害。采取适当的防护措施以防止直射和反射光束的辐射。始终遵守厂商的安全指导准则并向当地安全部门查询。详细信息参见后面的注意事项。
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● 由于其光的强度，闪光灯能对眼睛造成伤害，它们有时也会发生爆炸。要佩戴合适的防护镜并遵守厂商的安全指导准则。
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● 固定液和显影液也含有有害化学物质。应根据厂商说明书小心操作。
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● 电源和电泳设备如使用不当会引起严重火灾和电击事故。
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● 实验室的微波炉和高压锅需要可靠的防护措施。事故常发生在它们使用的时候（如熔化瓶中的琼脂或细菌培养用琼脂时或灭菌时）。如果瓶塞没有松到足够程度，蒸汽没有足够空隙排出，当容器被拿出微波炉或高压锅时，瓶子就会爆炸而造成伤害。因此在使用前应将瓶塞完全拧松。对于不需灭菌的常规琼脂糖凝胶可将称量的琼脂放入烧瓶中的溶液内。
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● 使用剪切器械（如刀片、解剖刀、剃刀或注射针）时要非常小心。刀片特别锋利，使用时要小心！如果操作者使用不熟练，请有经验者演示正确操作程序。为了适当的处置，在实验室内使用放置“利器”的容器。丢弃使用过的无遮护注射针时应与注射器连接在一起。这种方法可以防止损伤他人（和可能的感染：见生物安全），很多事故就是发生在使用注射针后把针罩套回时。损坏的巴斯德移液管、盖玻片或载玻片也可能造成损伤。
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常用化学物质的一般性质
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危险物质可归结为以下几类：
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● 无机酸：如盐酸、硫酸、硝酸或磷酸，是有刺激性气味的无色液体。避免溢出液体接触皮肤或衣服。溢出液体应用大量的水稀释。浓酸能腐蚀纸张、纺织品和皮肤，也能对眼睛造成严重损伤。
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● 无机碱：如氢氧化钠，是溶于水的白色固体。浓碱会慢慢腐蚀皮肤甚至指甲。
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● 重金属盐：通常是能溶于水的粉末状有色固体。其中许多是酶的强抑制剂，对人和环境（如鱼和水藻）都是有害的。
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● 大部分有机溶剂是易燃的挥发性液体。避免吸入挥发的气体以免引起恶心或头晕。避免与皮肤接触。
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● 其他有机化合物包括有机硫化合物（如巯基乙醇）和有机胺，有很难闻的气味。其他有机化合物活性很高，必须小心操作。
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● 如果操作不当，染料及其溶液不仅能使样品染色，也能使皮肤和衣服染色。某些染料也是诱变剂（如溴化乙锭）、致癌剂和具有毒性。
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● 所有以“ase”结尾的名词[如过氧化氢酶（catalase），β-葡糖醛酸糖苷酶（β-glucuronidase）或消解酶（zymolase）]都属于酶类。也有的酶不是系统命名的，如胃蛋白酶（pepsin）。其中许多是由厂商制备在缓冲溶液等物质中供应。要注意这些物质中所含原料的特性。
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● 常用于处理细胞的有毒化合物可能是危险的，应当注意操作。
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● 应当注意一些对其毒性研究还不完全的化合物。在操作任何一种化学物质时要予以适当的重视。尽管化合物的毒性可以量化（如LD50值），但这对于致癌剂或诱变剂是不可能的，接触这些物质一次就能产生影响。应当知道化合物的危险性也依赖于它的物理性质（精细粉末与大的晶体，乙醚与甘油，干冰与气体钢瓶中的高压二氧化碳）。应当提前预测在实验中各种可能发生的情况和如何最好地保护自己和周围环境。
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危险物质
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附录2 供应商
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2 信号转导和哺乳动物细胞生长：问题及范例
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前言
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分裂还是分化，黏附还是迁移，存活还是死亡——这都是后生动物细胞在发育和成年生活过程中必须作出的重要抉择。这些抉择必须准确无误和协调一致，并且可由胞外因子和胞内信号同时指令。细胞执行这些抉择的过程就叫信号转导。本章综述了近年涌现出的控制细胞生长与分裂的信号通路的原理，尤其强调蛋白质—蛋白质相互作用在其中所扮演的角色。由此可明显看到，蛋白质相互作用在丝裂原信号转导中的重要作用，以及为检测这种相互作用而涌现的技术的重要性。
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丝裂原信号转导通路很复杂。人类基因组测序完成后，认定的信号分子的数量必然上升，这些信号通路的模型也会变得越来越复杂。虽然很多信号通路从整体上看很复杂，然而更近距离审察就会发现这些通路通常可用一系列简单的蛋白质—蛋白质相互作用来描述。实际上，这些相互作用非常基础，以至于可以毫不夸张地说它们构成了所有信号转导机制的基础。
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为什么蛋白质—蛋白质相互作用在丝裂原信号转导中如此重要？一个信号蛋白和另一个蛋白质的结合能产生很多结果。一种结果是这种结合可募集信号蛋白，使其定位到它被激活的地方和/或需要它执行功能的地方。一个能说明这个现象的相关例子是蛋白激酶Raf的行为，细胞被刺激以后，Raf通过结合到GTP酶Ras上而从胞浆被募集到胞膜上（Avruch et al.，1994）。第二种蛋白质相互作用的结果是一个蛋白质和另一个蛋白质结合能诱导蛋白质构象发生变化，这种变化能影响其活性或与其他结合结构域的可靠近性，从而诱发进一步的蛋白质相互作用。如p21-活化激酶，作为信号蛋白就是这样一种情况，p21-活化激酶和GTP酶Cdc42或Rac结合后，构象发生很大变化，解除一个自抑制结构域，因此激酶活性被激活（Lei et al.，2000）。当然，刺激物诱导的蛋白质定位和构象的变化并不相互排斥。在很多情况下，蛋白质募集到信号复合体可同时引起蛋白质重新定位和酶活性被激活，例如，随着蛋白酪氨酸磷酸酶SHP2从胞浆被募集到胞膜已活化的受体酪氨酸激酶（RPTK）上，其本身的SH2结构域也同时通过与RPTK的磷酸化酪氨酸残基相互作用而被激活（Barford and Neel，1998；Hof et al.，1998）。
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信号转导框架
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成对的蛋白质—蛋白质相互作用是信号转导的基石；然而，该研究领域新出现的一个观点认为，高度有序的组装对有效的信号转导也很重要。支架分子、接头分子、隔离分子和抑制分子都附加在丝裂原信号转导机制的基础框架上。这些附加层次的复杂性已经改变了我们对信号转导的看法，并为研究这些通路的组织构成指出了新思路。例如，人们早已认识到，在激活胞膜上RPTKs时多组分复合体要进行组装（Schlessinger，2000），而其他复合物则在核内染色质的基因启动子上进行组装（Lee and Young，2000）。目前已清楚认识到这种多组分复合物在胞浆信号转导和有丝分裂发生的调节中也具有重要作用。作为一个重要的生物学例子，由于发现复合物中很多组件不仅发生物理的相互作用，而且通过几个独特的支架蛋白与其他胞质信号蛋白分开，我们对Ras—Raf—Mek—丝裂原—活化蛋白激酶（MAPK）中心通路的理解也得以推进（Garrington and Johnson，1999；Kolch，2000）。这些支架蛋白通常没有催化功能，但并不总是如此；然而，由于它们能与Ras/MAPK通路中的两个或更多的组件形成复合物，因此它们在信号转导中起着重要的作用。在信号转导中支架蛋白的使用是一个进化保守的策略。在所有通常研究的真核生物中已发现MAPK信号模块的支架蛋白的例子。目前，这些蛋白质的功能在酵母中最清楚（图2.1）。在酿酒酵母中，支架蛋白起分离MAPK模块中各种普通组件的作用。例如：MAPK Ste11p参与3个不同的MAPK信号模块：（1）Ste5p支架蛋白，协调外激素应答的MAPK信号模块中的成分；（2）Pbs2p支架蛋白，协调渗透调节MAPK信号模块的成分；（3）Ste11p也参与调节纤维形成的MAPK信号模块。在最后一种情况下，还未鉴定到支架蛋白。Pbs2p功能缺失时，渗透压能诱导纤维生长途径和交配途径的不正确活化（O’Rourke and Herskowitz，1998；Davenport et al.，1999）。因此在酵母中，这些支架蛋白的一个功能就是特化和隔离MAPK模块的信号功能，这似乎已经很清晰明了了。
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图2.1 芽殖酵母中的支架蛋白
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在哺乳动物细胞中，MAPK模块的支架蛋白包括Ras激酶抑制子（kinase suppressor of Ras，KSR），（Downward，1995）、生长因子受体结合蛋白10（growth factor receptor-binding protein 10，Grb10）（Nantel et al.，1998），和Mek伴侣分子1（Mek partner 1，MP1）（Schaeffer et al.，1998，图2.2）。KSR与标准的MAPK级联反应的所有3个成员结合：Raf、Mek和Erk。Grb10与RPTKs，Raf和Mek结合，但可能不是同时结合，因为Grb10 C端的单一SH2结构域介导所有这些反应。MP1将MAPK Erk1与其激活子MEK连接在一起，已知SAPK Jnk和其上游激活子MKK7及MLK也存在类似的支架蛋白（如JIP-1）（Yassuda et al.，1999）。在芽殖酵母中，这种机制能确保有效的信号转导，在哺乳动物细胞中，这种机制可能也用于防止来自其他信号途径的过量的干扰或交叉反应。
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图2.2 哺乳动物细胞中支架蛋白例子
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支架样蛋白不仅参与信号转导，而且参与信号干涉（图2.3）。RKIP，最初被鉴定为Raf结合伴侣分子，也能与Mek和Erk结合，提示它可能以类似KSR的方式起作用（Yeung et al.，1999，2000）。然而，跟KSR不同的是，RKIP是抑制而不是增强Raf到Mek的信号。这个现象的结构基础可能是由于RKIP上与Raf和Mek的结合部分有大量重叠的原因。因为RKIP不可能同时与Raf和Mek结合，RKIP可能作为这两个蛋白质的隔离分子，阻止它们之间有效的相互作用。那么，如果发现其他以类似方式阻断信号模块的抗支架蛋白并不足为奇。
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图2.3 抗支架蛋白阻止信号的有效转导
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在哺乳动物细胞中，已发现其他种类的胞浆支架蛋白，它们连接在普通信号途径中起作用的蛋白质上。这些蛋白质有时也叫锚定支架蛋白。这些与丝裂原途径相关的锚定支架蛋白例子包括：A-激酶锚定蛋白（AKAPs）、许多RPTKs的胞浆结构域、胰岛素受体底物1（IRS1）、活化T细胞的T-细胞蛋白联结子（LAT）、含SH2结构域的76kD蛋白质（SLP76）（Burack and Shaw，2000）。这些类型的支架蛋白与Raf-Mek-MAPK途径的支架蛋白不同，因为这些复杂蛋白质彼此不具有酶活性（例如，Raf磷酸化Mek，后者磷酸化MAPK），而是都参与特殊的信号转导功能。利用其分布的时空限制性，这种类型支架蛋白质的锚定功能可能在信号组件的组装中具有重要作用。
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蛋白质—蛋白质相互作用和信号转导交叉点的调控
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尽管哺乳动物细胞质中存在多组分信号模块已是不争的事实，但它们的作用还不完全清楚。是不是正如在酵母中那样，它们是为了防止相互竞争的信号转导通路发生交叉反应而提供隔离作用？还是通过将相关组件彼此拉近来增强信号转导效率？哺乳动物信号转导中交叉点的普及和关联是信号转导文献热烈争论的话题。争论的焦点是哺乳动物细胞信号转导通路用线性流程图来描述好，还是用相互交联的网络来描述好（Tucker et al.，2000）。在简单真核生物中，如芽殖酵母、果蝇和线虫，可能是由于隔离接头蛋白的存在，大多数信号通路以分散的、线性的形式运作。这方面的信号转导可以在酿酒酵母的交配通路中清楚的看到。激活外激素受体引发一连串事件，这些事件就像救火时排成长龙传水救火的一群人，信号从外激素受体经一组排列有序的激酶（有些组分通过Ste5p支架蛋白联结在一起），最后传递到转录因子上（Posas et al.，1998）。在实验上，该系统的本质线性应归功于一个事实，那就是酵母细胞对交配外激素的转录反应完全依赖于一个单一的转录因子Ste12p（Roberts et al.，2000）。如果有重要的交叉点产生，外激素信号可能发生分叉并诱导非Ste12p依赖的其他基因的表达。
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在高等真核生物中，丝裂原信号通路是以分散的、线性的方式，还是以相互联结的网络方式运作？已知刺激一个确定的受体能激活多种通路，并且刺激类似的受体可产生不同的结果。后一现象的经典例子可在PC12细胞中见到，在PC12细胞中开启表皮生长因子（EGF）受体引发增殖，而刺激神经生长因子（NGF）受体则引起生长阻滞和分化（Marshall，1995）。很多相同的信号蛋白可以被这两个受体激活，因此任何对EGF和NGF信号的不同结果的描述都应该调用空间、时间概念或募集到受体上的效应分子的微弱不同。我们知道，EGF引起MAPK的短暂激活，而NGF引起MAPK的长时间激活（Qui and Green，1992；Traverse et al.，1992），这很可能是它们相反生物学效应的原因；然而，这些时间差异的分子基础还不清楚。支架蛋白的不同使用极可能是个关键因素。Landreth及其同事已经证明EGF引起的MAPK的短暂激活是形成短寿命复合物的结果，这种复合物组装在EGF受体上，由接头分子Crk、交换因子C3G、GTP酶Rap1和蛋白激酶B-Raf组成（Kao et al.，2001）。相比之下，NGF刺激PC12细胞引起支架蛋白FRS2磷酸化，在FRS2上形成由Crk、C3G、Rap1和B-Raf组成的稳定复合物，从而引起MAPKs的长时间激活。因此，虽然NGF和EGF募集相同的信号蛋白，但不同的刺激诱导支架蛋白形成不同排列，并产生独特的结果。
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信号转导和技术——对未来的一种看法
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考虑到支架蛋白和抗支架蛋白在调节丝裂原信号转导交叉点中的重要性，以及这些蛋白质的不同结构使通过序列检查或互补来对它们进行鉴定很困难的事实，因此为发现这种类型蛋白质而涌现的技术将会很有用。例如：多诱饵相互作用捕集系统（Serebriiskii et al.，1999），在这个系统中，与共同伴侣分子结合的诱饵蛋白可被成对的检测到，该系统可用于鉴定同时与Raf和Mek结合的蛋白质，或支架蛋白可能在其中起作用的任何一对信号蛋白。因为过表达支架蛋白通常抑制信号转导（Dickens et al.，1997），可能是由于改变了内源信号成员的计量关系，因此也认为具支架蛋白或抗支架蛋白功能的蛋白质可通过表达丝裂原生成抑制子文库来鉴定。最后，质谱技术的高速发展，使胞质中丝裂原信号复合物在免疫沉淀中直接被鉴定逐渐成为可能。
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如果高等真核生物丝裂原信号以这种复杂方式传递，那么要理解信号途径必须发展一种方法来分析大的蛋白质网络的运作和相互作用，而不是孤立的思考几个独立成员的行为。然而，目前还缺乏很好的工具进行这种多组分分析。直到现在，我们对信号通路的理解还主要建立在生化骨架上，这是在体外对单个蛋白质进行仔细的且通常是费时费力的一种分析。信号转导是否需要新的分析模型？如果需要，那么又是什么样的模型？
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显然，我们从对丝裂原信号的大量分析数据中已获得一些信息，但这些信息并不易于分析。血清刺激培养的纤维母细胞可诱导大量基因的表达（Iyer et al.，2000）。活化的Ras可诱导或抑制没有数百也有数十个基因的表达（Zuber et al.，2000）。如何着手弄清这些数据的意义？有人认为协调表达的蛋白质可能共同起作用，影响类似的过程。换言之，表达的时间一致性可能暗含功能的相似性。可能支持该理论的最好例子存在于芽殖酵母的交配途径中，该途径涉及的很多基因协调一致的上调。这个理论在哺乳动物系统中也可能是正确的，但还没有足够的证据支持。
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除了时间上的协调一致外，原则上还可能加上数据组织的第二个层次，也就是空间定位。如果我们知道所有这些蛋白质在细胞内的定位，我们就可以分出什么蛋白质和什么蛋白质相互作用。候选结合蛋白的共同定位可通过荧光共振转移法及相关技术来确定（Bastiaens and Squire，1999；Pollok and Heim，1999）。定位蛋白质的通用方案也已经出版，通常涉及绿色荧光蛋白融合物（GFP fusions）文库的筛选（Ding et al.，2000；Misawa et al.，2000）。在基因组范围内，将这种定位数据和用独立方法所获得的数据结合起来可能很有用。
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近期被确认的一个类似方法是，将生化数据和双杂交分析结合起来分析蛋白质—蛋白质间的相互作用，以确定信号网络的组成。在芽殖酵母中，综合分析双杂交和生化数据已证实相互作用蛋白质群的存在，并且在一些情况下已提示蛋白质的功能，而这些功能过去是模糊的（Schwikowski et al.，2000）。最后，进化关系也可能提供理解信号复合物的一个重要数据，因为在真核模式生物如酵母、线虫、果蝇中共同起作用的一些保守蛋白质，通常指示在人体中也有类似设计方式。
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我们已进入一个新时代，有关丝裂原信号的旧观念正进行着快速的更新。目前已非常清楚地知道：不仅蛋白质—蛋白质相互作用构成信号转导的基础，而且这些相互作用是在以前未曾料到的范围内和复杂程度上发生的。整合基因组测序计划所得数据来确定丝裂原生成的信号蛋白质的组成将是一个很大的挑战。然而，迎接这个挑战将使我们知道在治疗人类疾病，如癌症中（在疾病中这种信号转导的正确调控已完全被扭曲）如何利用蛋白质—蛋白质相互作用。
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参考文献
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3 蛋白质相互作用技术对肿瘤生物学与药物遗传学的影响
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序列变异：肿瘤易感性及基于遗传特异型蛋白相互作用的肿瘤治疗
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新的基因组与蛋白质组技术以及人类基因组计划的完成预示着我们对人类疾病的认识将发生革命性的变化。人们期望这些新发展不仅可以极大地改变对如肿瘤这类疾病的研究，而且可以对这类疾病进行分子分类。此外在后基因组时代，人类基因组遗传变异的鉴定与功能特性的描述将成为后基因组时代一个主要的科学成就。遗传变异的鉴定是现在许多基因组计划的焦点并且正在快速推进（Service，2000）。许多不同来源的数据显示：任何两个个体之间基因组序列上都存在99.9%以上的相似性，这意味着人类物种中任何个体之间的差别都归咎于那仅占0.1%的基因（或者说相当于2900000个碱基）的不同（Venter et al.，2001）。对遗传变异功能意义的鉴定将是一项艰苦劳动，而且可能会在未来的许多年中继续成为科学的焦点问题。这其中两个饶有兴趣的领域是：使人类易感疾病的遗传变异以及影响人体对药物反应性的遗传变异（称为：药物遗传学/药物基因组学）。遗传变异能够通过各种各样的机制呈现出一种功能表型，这些机制包括：蛋白质—蛋白质或蛋白质—配体相互作用的引入或中断。本章主要讨论本书所描述的一些技术在研究人类遗传变异功能意义方面的应用，主要涉及人类疾病易感性和药物遗传学。
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肿瘤与基因组
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遗传危险因子
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发生高发病率肿瘤（例如：肺、乳腺/卵巢、结肠、前列腺）的危险不是在人群中均等一致地分布的。缺乏这种一致性的原因，部分是由于不同的环境、职业，以及休闲接触史（例如，紫外线、吸烟以及不能完全定性的饮食因素）。这些致癌物通过遗传的和非遗传的机制影响肿瘤形成的一个或多个阶段（Shields and Harris，2000；Rothman et al.，2001）。然而，仅有一小部分接触的个体最终会发展成为肿瘤患者；而且，有相似接触的个体他们所具有的危险也不是均等分布的。研究显示，某些家系中的成员会具有更大的易患肿瘤的危险以及更早地被肿瘤侵袭，这些家系是通过一个肿瘤先证者（该家系中疾病最先证实者）被确定下来的，家系成员中也显示出具有显著多的易患其他肿瘤的危险性。甚至当这些家系中分离的稀有的孟德尔范式被除去时，这些家系中所存在的肿瘤发生率超出平均水平的情况还会一直持续下去。这些观察结果预示：普通肿瘤的易感性除了由到目前为止所鉴定出来的孟德尔因子决定外，可能部分是由个体的遗传因子所共同决定的。
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至少有两类基因已确定为可以决定人类肿瘤发生的危险。第一类是由有限数量的基因所组成，这些基因直接参与肿瘤形成，例如：原癌基因、抑癌基因以及DNA错配修复基因。它们都被认为是引发肿瘤的基因（Fearon，1997；Godwin et al.，1997）。肿瘤发生的危险与以下这些基因种系突变的相关性很高，如：抑癌基因（包括：RB1，TP53，CDKN2，WT1，NF1，NF2，TSC1，TSC2，VHL，PTCH，PTEN，LKB1，SMAD4，APC，MEN1，CDH1，TGFBR2，EXT1，EXT2）、原癌基因（RET，MET，KIT，CDK4）、DNA错配修复基因（MSH2，MLH1，PMS1，PMS2，MSH6）以及与DNA修复和肿瘤抑制都有关的两个基因（BRCA1，BRCA2 ），但是，在人群中这种危险的等位基因非常罕见（图3.1）。例如，RB突变携带者发生肿瘤的危险是极高的（＞1000倍），然而，在总人口中，处于“危险中”的等位基因却是不常见的（在20000例新生儿中只有1例）。这类基因同时也是偶发肿瘤中常见的突变靶标。这些肿瘤易感基因所编码的蛋白行使不同的细胞功能，包括：转录、细胞周期调控、DNA修复以及凋亡。这些基因所编码的蛋白通常通过蛋白质—蛋白质相互作用发挥其功能，这些蛋白的特性可以用本书所描述的技术进行特异性地鉴定。第二类基因更为广泛且不能完全定性（Rothman et al.，2001）。在该类基因中，研究最多的是一组与解毒代谢途径以及类固醇和氨基酸代谢途径有关的基因（Evans and Relling，1999）。与该类基因相关的危险值明显较低（可能为2～10倍），但是，它作为高频（在某些人群中达到50%）的危险修饰因子，可能具有更大的公众健康意义（图3.1）。例如，细胞色素P450（CYP）参与了催化无数结构不同的内源性和外源性分子的代谢。人类基因组上有大约55个不同的CYP基因，基于序列的同源性可将其分为不同的家族和亚家族。例如，CYP3A亚家族的成员可以催化结构不同的内生素、药物、前毒素或前致癌剂分子的氧化、过氧化以及还原的代谢反应（Rendic and Di Carlo，1997）。另外，因为CYP3A可以将雌激素代谢为2-羟雌酮、4-羟雌酮和6α-羟化雌激素，所有这些代谢产物都涉及了雌激素介导的肿瘤形成，CYP3A的变异可能影响了雌激素的血液循环水平以及乳腺癌的发病危险性。CYP3A4是CYP3A的家族成员，它与睾丸酮的氧化失活有关，Rebbeck及其同事证明：CYP3A4基因的单碱基突变与男性前列腺癌的较高临床阶段和级别有显著的相关性，指出CYP3A突变可能影响前列腺癌的发生。Kuehl及其同事最近证实CYP3A5基因的单核苷酸多态性（SNP）导致该基因具有不同的mRNA剪接形式和蛋白质截短形式；在一些纯合子个体组织中，导致该基因编码产物的缺失（Kuehl et al.，2001）。因为呈多态性表达的人群中，CYP3A5占据了肝脏CYP3A总量的至少50%，因此，CYP3A5可能是在CYP3A依赖的药物清除以及药物反应上，造成个体之间差异的最重要的遗传因素。
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图3.1 与遗传性肿瘤易感基因相关的等位基因频率以及肿瘤危险因子，和药物代谢基因变异相关的肿瘤危险与药物反应性改变之间的负相关
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分子遗传学方法正在与基因组学方法相结合以促进在这类候选基因位点上的先天DNA变异的鉴定和大规模的特性记述。人类基因组上这些肿瘤易感基因以及药物反应基因的实际数量目前未知，这将需要再研究很多年来揭示这些基因所编码的蛋白质的正常功能以及这些被精确调控的活动在肿瘤发生时是如何被打破的。新的蛋白质相互作用技术将成为关键技术，以揭示在任何给定基因中小至单核苷酸取代这样的序列突变是如何能够通过与其他蛋白或底物的相互作用来改变该蛋白质的功能。就肿瘤而言，对肿瘤易感性、肿瘤发展以及药物治疗反应有影响的基因将是该领域的关键研究内容。下面将分别对上述各类基因进行较为详细的讨论。
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癌基因
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原癌基因
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原癌基因/癌基因的功能是正面促进细胞增殖。正常的非突变的形式严格地说称为原癌基因，突变的形式称为癌基因，具有过度的或不正常的活性。使正常的原癌基因转化为癌基因的突变是功能获得型突变，这些突变包括：点突变、插入、缺失、倒位以及转位类的结构改变、基因扩增、甲基化不足。癌基因最初是基于它们与逆录病毒序列的相似性而被鉴定出来的，这些序列可以使细胞转化；很多细胞型的癌基因已被鉴定出来，但是，它们参与肿瘤发生的过程仍未被完全阐明。最常被研究的癌基因是：SRC、RAS、MYC、ERBB家族基因（Godwin et al.，1997）。尽管这些基因的功能看起来是不相关的，蛋白相互作用的阐明在某种程度上显示这些基因的作用具有共性。而且，癌基因蛋白的研究与信号转导（第2章）的研究领域有一些共同之处。
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抑癌基因
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抑制细胞生长基因的概念来源于早期体细胞融合实验（Harris et al.，1969；Stanbridge，1976）。在该实验中，肿瘤细胞与非肿瘤细胞融合导致的杂交细胞能够继续在培养基中生长，但是不再对动物有致癌性。另外，当一些杂交细胞重新呈现致瘤表型的时候，这种重新呈现往往与来自正常的、非肿瘤亲本细胞的染色体丧失有关。1969年，De Mars 推测在某些家族性肿瘤中，基因携带者可能是隐性突变的杂合子，肿瘤的出现是因为后续的体细胞突变致使一个细胞变成为致癌基因的纯合子细胞。成视网膜细胞瘤和维耳姆斯氏瘤的流行病学分析为这一理论提供了重要的证据，并形成现在被称为Knudson 的“二次打击”假说（Knudson，1971；Knudson and Strong，1972）。科学家观察到这一疾病的两种形式：具有家族病史的病人通常表现出多重的双侧病灶；而没有家族病史的病人呈现典型的单一的单侧病灶，且发病者的年龄较前者晚。Knudson和Strong推测，家族形式的疾病表明倾向成瘤的突变的可遗传性，而且仅需要一种附加肿瘤形成的限速遗传事件。而另一方面，偶发形式肿瘤需要两个独立的遗传损伤，因此它的发生速度较慢。因为两个独立的损伤发生在同一细胞中的情况比较少见，因此只有单侧肿瘤可能发生，这一假说由于RB基因的分离而在分子水平得到了证实（Cavenee et al.，1983；Dunn et al.，1989）。成视网膜细胞瘤的发生被证实涉及同一位点的两个等位基因丧失，因为具有成视网膜细胞瘤形式的个体在种系中有一个突变的等位基因（Marshall，1991）。RB基因是符合Knudson 的“二次打击”假说经典定义的许多原型抑癌基因（如TP53，APC，WT1，NF1，PTEN）中的一个。
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现在发现，越来越多不同的突变机制参与了可以致瘤（遗传和非遗传形式的肿瘤）的抑癌基因失活，这些突变机制包括：点突变、缺失、插入、过度甲基化、基因组印迹的改变、导致遗传物质丧失、显性负突变以及纯合子缺失（Fearon，2000；Hanahan and Weinberg，2000；Prowse et al.，2001）。基于抑癌基因是复杂组分中成分的观点，这些遗传性的损害预计有多种作用模式，包括维持基因组的稳定性、程序性细胞死亡、DNA修复以及细胞周期的调控（Fearon，1997；Godwin et al.，1997；Lundberg and Weinberg，1999；Hanahan and Weinberg，2000）。而且，随着越来越多的个体被挑选出来进行在DNA水平上的疾病易感性诊断，所知道的这些基因突变的范围将继续增加。这一情况也引起了一系列新的问题，即良性肿瘤的多态性中也呈现出缺失突变。评价一个蛋白质中单残基改变的功能后果的蛋白技术将成为关键技术。例如，目前在BRCA1和BRCA2中，已经分别鉴定出来多于860和880个不同的序列变异（缺失突变、自然发生的多态性以及未分类的变异体），多于50%的序列变异仅报道过一次（参见乳腺癌信息中心www.nhgri.nih.gov/Intramural_research/Lab_transfer/Bic/index.html）。尽管这些基因中有些错义突变被鉴定出来作为乳腺癌的诱因，但绝大多数这样的突变还没有与一种已知的表型联系起来。与无义突变一样，错义突变都是由编码区密码子上的单核苷酸取代所造成，而不同于无义突变的是，错义突变的单核苷酸取代导致在此相应密码子的位置上产生了编码不同氨基酸的功能密码子。确定此氨基酸取代是否将影响蛋白的功能并且是否会促进疾病表型的形成并不总是那么简单。如果错义取代在对照人群（从人种上讲为没有乳腺癌和/或卵巢癌家族病史的健康个体）中非常常见，那么，这种错义突变就是一种自然发生的多态性。然而，许多这样的突变仅在少数家系中发现，而且这样的突变目前大多未知功能。未知意义变异的频繁发现是一个严重问题，因为许多做过遗传检测的病人，在做重要的健康保健决定时，要求解释这些含糊的结果。因此，需要新的蛋白质组技术去补充遗传研究并帮助确定这些单碱基改变对蛋白功能以及肿瘤危险所造成的后果。
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杂合性丧失（LOH）研究是最常用的鉴定染色体某一区域是否蕴藏有抑癌基因的方法，几乎每一种常见肿瘤的全基因组等位基因型的研究都揭示出：LOH存在于每一条染色体臂上。这些研究显示：可能存在着大量的抑癌基因，其中多数尚待鉴定，功能尚待明确。随着技术的不断改进，功能基因组学以及高通量筛选方法将为鉴定影响人类健康和疾病的遗传成分提供有力的方法。蛋白组方法将进一步拓宽疾病的分子表达谱并确定其功能通路。
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DNA修复基因
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同其他物种的基因组一样，人类基因组编码保护其自身完整性的信息（Lindahl and Wood，1999）。DNA损伤修复酶时刻监视着染色体以矫正由于暴露于致癌剂和细胞毒性化合物所产生的受损核苷酸残基。由大量DNA损伤剂所致的基因组不稳定性将是细胞和有机体无法抗拒的。负责碱基切除修复、核苷切除修复、错配切除修复的蛋白质都已被鉴定出来，其中某些蛋白质的缺陷已证实与肿瘤的发生密切相关。例如，由错配修复基因所编码的蛋白可以矫正DNA复制中的偶然错误以及在重组过程中形成的异源体。细菌mutS和mutL基因编码负责鉴定错配的蛋白，人类基因组中也有大量与它们同源的基因，而且与酵母和线虫基因组相比，人类基因组中的此类基因有更大的多样性。其中的某些蛋白专门负责查找特定类型的DNA错配；某些专门负责减数分裂和/或有丝分裂过程中的重组；而另一些的功能目前仍然未知。在130多个DNA修复基因中，至少有11个是错配切除修复基因（Wood et al.，2001），其中某些基因（如hMSH2、hMLH1、hPMS1和hPMS2）突变时，易患遗传性非息肉性直肠癌（HNPCC）或Lynch综合征（Lynch and Smyrk 1996），以及一些散发性疾病。HNPCC家系中，hMLH1和hMSH2中的缺失突变被认为是致病的原因（Peltomaki and Vasen，1997）。从对细菌到哺乳动物中该类蛋白的研究都强调了它们全部被组装进入DNA重组的“机器”中。对各成分所装配成的结构中的突变位置的研究，有助于深入认识基本的修复机制，并为下述讨论的介入治疗提示治疗靶点。
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蛋白质—蛋白质相互作用的研究有助于深刻认识许多已知的原癌基因、抑癌基因、DNA损伤修复蛋白的功能。这些研究还证明，其中每一类蛋白的成员都参与了互相重叠的路径，理论上，当其中的每一个发生突变后都有助于肿瘤的形成。一个有力的例子是人类TP53基因。TP53基因编码的蛋白称为p53，它在一个细胞周期检验点上发挥重要功能，p53最初是因为它能与SV-40的大T抗原形成稳定的复合物而被发现的，从它十多年前被发现以来，p53一直是一个令人着迷的研究对象（综述参见Gannon and Lane，1990；Soussi et al.，1990）。该基因所编码的这一53ku的核内磷酸化蛋白当初被认为是一个细胞癌基因，因为将突变的TP53 cDNA表达载体转染宿主细胞时，能够使宿主细胞发生转化，同时伴随着ras基因的激活。然而后续的许多研究证明，正常的p53实际上是作为一个抑癌基因起作用。
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TP53基因是在人类肿瘤中被鉴定出来的最常发生改变的基因之一（如在散发性骨肉瘤、软组织肉瘤、脑瘤、白血病、乳腺癌、肠癌、肺癌、卵巢癌），在美国，这些肿瘤占总肿瘤的一大部分（也许近一半）（Hollstein et al.，1996；Levine，1997；Hainaut et al.，1998）。与很多抑癌基因不同，在TP53基因的突变中，错义突变占70%以上（http：//www.iarc.fr/p53/homepage.html）。遗传病症是确定RB这种偶然的基因的基础，与此相反，TP53基因是先被发现，后来才发现它在遗传性肿瘤中具有作用。1990年Li及其同事在一系列患有Li-Fraumeni 综合征（LFS）的家系中鉴定出了TP53基因的种系突变，该症的特征是：不同的童年期肿瘤，以及早期发作的乳腺癌（Malkin et al.，1990）。
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实际上，p53以低水平的状态存在于所有正常细胞中，野生型p53充当细胞生长的负调节者，DNA损伤之后，p53被诱导表达使细胞周期阻滞于G1期晚期。在某些情况下，野生型p53诱导细胞凋亡（程序性细胞死亡），在野生型p53蛋白缺乏的情况下，会导致抵抗电离辐射和化疗药物。例如，当正常细胞受到紫外线或γ射线辐射致使DNA受到损伤时，那么细胞周期就会被阻断在G1期，此过程与p53水平的陡然升高是相偶联的。细胞在生长阻滞的过程中，DNA的损伤修复在进入S期之前已经完成。然而，如果基因组的损伤过度，细胞就会经历凋亡，这一过程同样需要正常行使功能的p53。在功能性p53缺乏的情况下，细胞就可以逃脱凋亡而存活，同时使其受损的DNA进行复制，周而复始会导致DNA突变的扩散。据此，p53也被形象地描述为“基因组的护卫者”，即在基因组没有完成清除可能的损伤性突变的情况下，它能够阻止细胞进入S期；此外，因为许多化疗药物是通过诱导凋亡来杀死肿瘤细胞的，p53功能的丧失将直接使细胞对这类细胞毒试剂的敏感性降低，使对化疗药物产生抗药性的细胞群增加。
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p53调控细胞增殖的生化机制尚未完全阐明；然而，经多种方法证实，p53实现其使细胞生长抑制的功能，部分是通过它的特异性DNA结合能力以及转录调控能力（El-Deiry et al.，1994；Ko and Prives 1996）。许多这类功能研究是依赖于明确了p53上所具有的功能域而实现的，p53通过它们与其能特异结合的蛋白发生相互作用（Mansur et al.，1995；Dobner et al.，1996；Gottlieb and Oren，1996；Ko and Prives，1996；Levine，1997；Lill et al.，1997；Zhang et al.，1998；Nie et al.，2000）。如图3.2所示，p53与许多蛋白质发生相互作用，包括抑癌基因BRCA1，原癌基因c-ABL。最近，Zilfou及其同事通过蛋白质相互作用的研究证实：辅抑制物SIN3可以与p53的脯氨酸富集区发生直接相互作用并保护p53免受蛋白酶降解（Zilfou et al.，2001）。这一相互作用特别值得关注，因为p53脯氨酸富集区的缺失会使p53蛋白具有转录激活子的功能，同时丧失诱导细胞凋亡的功能。p53—SIN3相互作用功能的阐明，有希望揭示p53所参与的诱导凋亡以及抑制肿瘤的全新机制（Zilfou et al.，2001）。
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图3.2 p53蛋白质与其相互作用蛋白质示意图
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许多癌基因、抑癌基因以及DNA修复基因的产物都是许多大的复合物的组成部分。例如，Wang及其同事最近报道了由一系列与BRCA1相关的蛋白质所形成的一个大至兆道尔顿的蛋白复合物，称做BASC（BRCA1-缔合的基因组监视复合物）。这个复合物包括：肿瘤抑制因子、DNA损伤修复蛋白MSH2、MSH6、MLH1、ATM、BLM和RAD50-MRE11-NBS1蛋白复合物（Wang et al.，2000）。另外，有助于PCNA结合到DNA上的DNA复制因子C（RFC）蛋白复合物，也是BASC的一部分。BRCA1可以与两个转录偶联的修复蛋白MSH2和MSH6有相互作用，这为BRCA1（和BRCA2）在这条通路上的作用提供了可能的解释。这些相互作用与这两个蛋白质参与转录偶联的DNA修复和DNA重组的作用是一致的。
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DNA损伤之后BRCA1蛋白的研究也已经揭示了其他抑癌基因和癌基因（例如：ATM，ATR，CHK2，CDK2）在调控BRCA1活性方面的作用。BRCA1以聚集形式存在于核内，DNA损伤之后发生高度磷酸化并散在分布（Scully et al.，1997a；Thomas et al.，1997）。这种剂量依赖性的改变，伴随着S期含有BRCA1的核位点的特异性丧失。BRCA1分散之后，BRCA1，BRCA2，BARD1，RAD51聚集在PCNA+复制结构的位点，暗示了含有BRCA1/BRCA2/BARD1/RAD51的复合物与受损的、正在复制的DNA之间具有一种相互作用（图3.3）。Lee及其同事报道：DNA损伤之后，人类CHK2激酶（CDS1/CHK2）通过磷酸化BRCA1的988位丝氨酸残基而调控BRCA1的功能（Lee et al.，2000）。CHK2和BRCA1呈离散形共定位于核内，并具有相互作用，在γ射线辐射之后分离。BRCA1在988位的丝氨酸磷酸化是BRCA1从CDK2里释放出来的必要条件。ATR是哺乳动物中酵母S期检验点基因产物的同源物，羟脲处理后，可以控制部分BRCA1的磷酸化（Tibbetts et al.，2000）。最近发现ATR与BRCA1在复制阻滞前后的体细胞内共定位，同样，CDK2可使BRCA1的1497位丝氨酸磷酸化，这与不依赖于DNA损伤的G1/S期BRCA1的磷酸化特异性增加相一致（Ruffner et al.，1999）。与DNA损伤相应的BRCA1的磷酸化依赖于ATM（Cortez et al.，1999）。Falck 与其同事最近通过不同蛋白质的研究证明了ATM、CHK2及磷酸酯酶CDC25A和CDK2之间的功能联系，这些蛋白参与耐辐射的DNA合成，其中某些蛋白的缺陷，易于或者促进肿瘤的形成（Galaktionov et al.，1995；Bell et al.，1999；Rotman and Shiloh，1999；Falck et al.，2001）。总之，上述这些研究都强调，各种不同的研究蛋白质功能的方法都正在揭示出不同蛋白所参与的共同的关键功能通路，以及在这些功能通路中某些成分中的缺陷是如何促进肿瘤形成的。
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图3.3 BRCA1/2在DNA复制和修复中的作用
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药物遗传学：当前的状态与未来的目标
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抗肿瘤治疗的反应
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如上所述，与DNA修复和药物代谢基因有关的新的临床应用方法将必定出现。肿瘤细胞往往能够获得对射线以及治疗药物的抗药性。像芯片技术这样的基因组学研究方法将被用来确定在这一情况下，哪些DNA修复基因可能被过表达了。另外，非常重要的是寻找操纵DNA修复和药物代谢的方法，或者选择性转运化疗药物的方法，以在避免可以致癌的损害、促进药物疗效的同时，鉴定出相关基因的遗传多态性，并认真尝试将蛋白质活性对特殊治疗的反应的影响与临床效果联系起来。尽管报道DNA修复基因和药物代谢基因中存在许多的多态性，但是，此类氨基酸改变却较少有功能信息。找寻哪个多态性实质上影响了蛋白的功能以及集中精力进行这些疾病的流行学以及临床研究将是重要的。例如，DNA连接酶的亚单位XRCC1中的一个多态特异性的纯合子与吸烟者中较高的姐妹染色单体交换率相关，表明这个等位基因与烟草及年龄相关损害的高危险性相关（Duell etal.，2000）。另外，随着基因和蛋白芯片技术的应用，比较正常细胞和肿瘤细胞中DNA修复基因和药物代谢基因的表达谱必将成为可能，并且这些信息将最终导致我们可以量体裁衣式地进行肿瘤的放、化疗。例如，具有低水平核酸外切修复的肿瘤更宜用顺铂治疗（Claij and te Riele，1999）。比较而言，错配修复缺损的细胞对烷基化的化疗药物具有更高的耐受性（Koberle et al.，1999）。人类基因组学知识的快速扩展与基因多态性探测方法的自动化为阐明这些药效的多重决定因素提供了工具，为药物基因组学这一新兴研究领域注入了活力。然而，能够评价多态性与其相应蛋白功能的功能相关性的方法将成为重中之重。
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运用蛋白质相互作用研究手段去分析遗传变异的功能意义
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标签融合蛋白
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GST—融合蛋白或类似的标签蛋白，已广泛地应用于沉降实验、亲和纯化以及far-western实验（第4章）。这些经典的技术被广泛应用于包括代表药物靶标的蛋白质以及属于遗传多态性的蛋白质，例如抑癌基因p53是人类肿瘤中突变最频繁的基因之一（Levine，1997）。一个常见的Pro72Arg多态性突变已经在人类p53蛋白的多脯氨酸区被鉴定出来（Harris et al.，1986）。Thomas et al.（1999）运用GST蛋白的pull-down实验证明：p53的Pro72与p53的Arg-72同种异型酶比较，与转录激活子TAFⅡ32和TAFⅡ70的亲和性要大；证实Pro72与Arg-72比较是一个更好的p53活化基因的反式激活因子。p53的Pro72Arg的多态性可能将表型改变归因于该蛋白质，这其中的分子机制的研究已经开始，观察到的现象使研究者提出如下假设：这一常见的多态性可能会影响p53蛋白的生物学功能。
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免疫共沉淀
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像GST—融合实验一样，免疫共沉淀（第5章）已经成为一项经典的用于研究蛋白质—蛋白质相互作用的技术。该技术是一项建立生理性相关蛋白质相互作用的严格方法。免疫共沉淀和酵母双杂交方法（讨论见下）已经成为研究许多所谓的“孤儿”蛋白质功能特性的驱动力量。如上所述，BRCA1和BRCA2两个乳腺癌/卵巢癌易感基因在1994年和1995年就已经被分别鉴定出来（Miki etal.，1994；Wooster et al.，1995；Tavitigian et al.，1996）。在一个限定的区域内BRCA1和BRCA2的氨基酸一级序列上有很低的相似性（Wooster et al.，1995；Tavitigian et al.，1996），而且与其他已知蛋白质的同源性也很低。直到Scully和他的同事用免疫共沉淀技术证明BRCA1和RAD51、BRCA2、RAD52存在相互作用，才认识到其在细胞对DNA损伤反应的过程中发挥潜在的作用（Scully etal.，1997b；Wong etal.，1997）。真核RAD51蛋白质是细菌RecA的同源物，是有丝分裂和减数分裂过程中的重组以及双链DNA断裂的重组修复所必需（Shinohara et al.，1992）。通过酵母双杂交和生化实验证明，RAD51特异性地与由BRCA2的第11个外显子编码的8个进化上保守的BRC基序发生相互作用（Wong etal.，1997）。进一步的免疫共沉淀证明BRCA2上至少在982～1066和1139～1266残基间存在另外两个RAD51的结合域（Katagira etal.，1998）。这些研究表明，BRCA2可通过它的多个位点与RAD51发生相互作用，并以BRCA1- BRCA2- RAD51复合物的形式相互作用和共定位（Chen etal.，1997）。BRCA2与p53在体内也可以形成复合物（Marmorstein etal.，1998）。在肿瘤细胞中，BRCA2的外源性表达可以抑制p53的转录活性，RAD51与BRCA2共表达会进一步促进BRCA2的这种抑制效应。蛋白质相互作用技术得到的这些结果证明，BRCA2与两个细胞周期控制的关键蛋白（其中一个与DNA修复有关，另一个与凋亡有关）存在生理性以及功能性的相互作用。应用这些方法，鉴定了许多与BRCA1和/或BRCA2的特殊结构域存在相互作用的蛋白（图3.5）。
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图3.5 BRCA1（A）和BRCA2（B）以及它们相互作用蛋白质图解
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基于错义突变所存在的蛋白质中的定位，以及可能对蛋白质—蛋白质相互作用的影响，这些研究还有助于预测哪些错义突变可能是有害的突变。对蛋白质相互作用的理解也有助于更好地去理解肿瘤的危险因素。例如，BRCA2有几个重要的重复基序，这样的基序在BRCA1中没有，而在所有已经测序的哺乳动物的BRCA2蛋白中是高度保守的。八个内部由30～80个氨基酸形成称为BRC-motif的重复由人类BRCA2基因的第11个外显子编码（图3.5）。其中每个重复的保守性是可变的，表明该核心序列在进化过程中复制过8次，但现在有许多重复是冗余的（Chen et al.，1995）。后来证明此BRC-基序在BRCA2通过与RAD51的相互作用而参与BRCA2介导的DNA损伤修复功能中发挥作用（Wong et al.，1997）。BRC重复序列位于贯穿第11个外显子的一个大的区域内，该区被认为是卵巢癌的基因簇（OCCR），因为此区域的突变与卵巢癌的高发病率相关（Gayther et al.，1997；Neuhausen et al.，1998）。
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尽管免疫共沉淀技术不便于检测未知蛋白质的相互作用，但它却适于在已知蛋白质相互作用内功能获得或丧失的遗传变异的研究。例如，Marin等（2000）用这一技术证明，p53的72位密码子为精氨酸的突变形式比72位密码子为脯氨酸的蛋白形式与p73（p53的同系物和结合蛋白）有更高的亲和性。令人感兴趣的是，这些结果再次证明：在单独p53突变的情况下，常见p53多态性也是具有生物学意义的。另外，p53突变体阻止足叶乙甙化疗活性的能力与p53和p73的结合能力相关（Blandino et al.，1999），p73在顺铂诱导的凋亡中发挥作用（Gong et al.，1999）。总之，这些观察说明，p53中常见的Pro72Arg多态性可能与某种肿瘤的化学敏感性相关（Marin et al.，2000）。
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酵母双杂交
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尽管酵母双杂交技术最常用于鉴定与一个已知蛋白质相互作用的未知蛋白质（第7章），该技术也可被改变以适用于突变蛋白质间相互作用的研究。例如，Maier等人（1998）用该方法分析小鼠的芳香族碳水化合物受体（AHR）等位基因间的基因型—表型相关性。AHR是许多药物代谢基因的一个转录激活子。AHR向核内的转移依赖于它与小分子配体以及与ARNT蛋白的相互作用（Gu et al.，2000）。在AHR配体如二英（Dioxin）存在下AHR同功酶与ARNT蛋白的亲和性可以用β-半乳糖苷酶报告系统来定量（Maier et al.，1998）。这些作者报告，两只小鼠的AHR与配体的亲和性存在15倍的差异，表明其多态性的生物意义。随后人类AHR遗传变异的功能意义已经在AHR基因型与AHR所调控的目标基因的表达水平相关性的研究中被证明（Smart and Daly，2000）。
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近来对酵母双杂交技术的革新为药物遗传学研究提供了又一保证。例如，包括“诱饵”、“鱼钩”、“鱼”成分的三杂交系统为检测小配体—蛋白质受体相互作用提供了条件（Licitra and Liu，1996）。这代表了一个系统，在该系统中，如药物代谢酶等这样的小分子结合蛋白的遗传—表型相关性可能被分析。另外，反向双杂交系统可用来筛选特异的蛋白质—蛋白质相互作用的干扰物质，将有助于检测功能丧失的变异蛋白（Leanna and Hannink，1996）。
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荧光共振能量转移技术
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荧光共振能量转移技术（FRET）通过检测受体和供体荧光团标记的分子的激发态来测量分子的邻近性。如本书第10章所述，该技术通过有选择地给所感兴趣的两个蛋白质分子分别标记以荧光团，并能在生理条件下实时确证目的蛋白质的相互作用。这项技术应用于药物遗传学研究的最好例证是运用染料末端掺入法进行基因分型实验，该法是用来检测单核苷酸的邻近性而不是检测蛋白质的邻近性（Chen and Kwok，1999）。在这一方法中，应用受体染料标记的dNTPs通过PCR中的DNA多聚酶的作用，一个等位基因特异的供体染料标记的寡核苷酸被延伸，一旦供体与受体染料成为一个新分子的组成部分（通过等位基因特异的PCR扩增），分子内部的FRET即可被检测与定量。另一个FRET相关的基因分型技术，即Invader分析，最近发展起来（Lyamichev et al.，1999；Mein et al.，2000）。依赖于特异性的识别与切割，Invader通过一个flap内切酶（FEN）使“信号”与“入侵者”杂交入包含一个多态位点的目标DNA。在DNA模板与信号单核苷酸匹配的情况下，信号单核苷酸被切割，同时驱动第二个FRET标记的切割反应。信号可用荧光板读数仪检测，这一技术的优势是实验的敏感性与可实现高通量。
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表面等离子共振技术
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表面等离子共振技术（Biacore SPR技术）是（第14章）通过监测相互作用的分子表面的折光系数的变化，来检测和定量分子间的结合反应。该技术在获得关于蛋白质、脂类、核酸以及小分子之间相互作用的动力学数据方面是十分有用的工具。因为这种多功能性，将这一技术应用于研究与遗传变异相关的表型改变上将极具潜力。例如，Baynes 等（2000）曾运用该技术研究人类野生型与突变型p85α蛋白与脂质底物的结合特性。p85α蛋白是一个PI3激酶，与胰岛素刺激的葡萄糖代谢有关。研究发现了一个常见的p85α多态性，以及在严重的抵抗胰岛素个体中的一个突变。表达p85α多态变异性体的细胞，像表达该野生型蛋白的细胞一样维持着类似的PI3激酶与其脂类底物的活性。然而，表达突变型p85α的细胞表现出显著低水平的PI3激酶活性。于是研究者运用Biacore技术去测定突变蛋白是否在结合脂质底物方面有缺陷。研究数据显示：野生型的、多态性的、突变体的p85α每种都有类似的底物结合能力，因此说明突变体蛋白产生的表型改变不是通过改变其与底物的结合性而实现的。
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原子力显微镜技术
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原子力显微镜技术是（AFM）通过探测分子表面的键和力的微小变化来描绘出分子表面的形貌。此技术经常用于研究配体—受体的相互作用。Yip等（1998）运用AFM技术证明人类胰岛素蛋白的突变体与野生型胰岛素相比，会形成更弱的自身寡聚体结构。结果在溶液中较大比例的突变体胰岛素就采取单体而非六聚体的构象。因为商业化胰岛素制剂的效能依赖于胰岛素六聚体分散为单体，因此，这些研究结果有助于发展有更好生物利用率的胰岛素治疗方案。
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与Biacore技术相似，AFM已经成为一种高通量的基因分型技术。基因分型最困难的方面之一是单倍型的排布（Service，2000）。单倍型的排布有时对临床诊断极为重要。例如，本章前面所描述的TPMT的多态表型可被几个TPMT等位基因所编码。等位基因之一的*3A由两个基因内部分离的SNP位点所决定，此两个位点被大于13kb 的DNA序列所分开。然而，每个SNP位点也决定等位基因（分别是*3B和*3C），它们每个都编码了有缺陷的TPMT酶。在临床情况下，区别具有*3A等位基因的杂合子与具有*3B/*3C复合型杂合子的个体是十分关键的。具有前者情况的病例个体，被预测具有“中间型”TPMT表型，这样的个体可以给予巯基嘌呤的标准剂量。然而，具有*3B/*3C复合型杂合子的个体可能是TPMT缺陷，而且可能在同一剂量下具有显著的骨髓抑制（图3.6）。Woolley等（2000）已经描述了对AFM技术的改进，即运用碳纳米管探针去测定基因组的单基因型。这一方法运用了荧光素标记的等位基因特异型的寡核苷酸探针与目标DNA片段杂交，然后用AFM去探测标记物的存在及空间位置。这一方法学的主要优势是可以共同探测相距几千个碱基（甚至100kb）之遥的SNP，并且具有高通量的基因分型能力（Service，2000）。
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图3.6 与硫代嘌呤甲基转移酶相关的单倍型－表型
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结论
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肿瘤易感性以及肿瘤治疗有效方法的发展将极大地依赖于成百上千的蛋白质功能的破解。人类基因组测序计划以及对成千上万特征未知基因的认识已成现实，而阐明这些基因所编码的蛋白质功能的工作刚刚开始。预计直接或间接地参与肿瘤易感性、肿瘤发生以及对药物治疗反应的蛋白质的数量，即便有可能也是困难的。如果仅仅把原癌基因、抑癌基因以及DNA损伤修复基因看做是与肿瘤相关的基因，那么，数量可能会超过500。然而，并不是所有的这些基因在人类肿瘤中都有作用，而且该类基因也并不构成惟一的促成肿瘤危险的因子。例如，涉及解毒代谢、类固醇和氨基酸代谢通路基因的数量是非常之大的，而且可能与肿瘤的许多方面紧密相关。另外，在任何物种基因组中的百万个SNP中，可能只有一小部分非常重要的SNP会导致同一蛋白质出现具有轻微修饰的生物化学和生物学属性的多种形式。因此，新的基因组和蛋白质组技术对于鉴定重要的基因组上的危险因子和将这些发现转化成为功能改变上的现实，都是非常必要的技术。本书中，作者提出了新的、令人激动的蛋白质相互作用技术，这些技术有助于推动该研究领域继续前进。特异的蛋白质—蛋白质以及蛋白质—配体相互作用是绝大多数生物过程的主要事件，是发展许多用以中断这些基本相互作用的基于小分子治疗研究领域的焦点。后基因组时代刚刚开始，未来的十年将同样是一个激动人心的十年，这十年中，将存在着伟大的发现与挑战，成千上万新蛋白质及其潜在的重要变异型与同种异型蛋白质的功能将会被鉴定出来。
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4 用GST融合蛋白鉴定蛋白质—蛋白质相互作用
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前言
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Far western印迹和pull down技术的优点
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这些技术能用新蛋白大规模筛选文库以鉴定新的相互作用，以及确定介导这些相互作用的蛋白质上的特异区域。而且，在目的蛋白还没有可用的抗体之前或当蛋白质抗体干扰蛋白质—蛋白质相互作用的时候，就可以使用这些方法。虽然本章所述的方法产生的结果是定性的，但是，GST融合蛋白可用于高度定量及复杂的分析中（参见Posern etal.，1999；McDonald et al.，1999）。值得注意的是，这些方法只用于确定体外相互作用，还应当在体内用单独的方法，如免疫共沉淀（参见第5章）加以证实。这些技术的灵活性使其被应用于广泛的生物学问题。
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本章由《分子克隆》（Sambrook and Russell，2001）第18章，方案2改编和扩展而来。
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替代方法，类似范例
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以下描述的方案使用了GST融合蛋白。有很多可替代的生产重组蛋白的系统。最常用的蛋白质融合系统包括：多聚组氨酸标签系统（His-tag；Gentz etal.，1989）、麦芽糖结合蛋白融合物（MBP；Bedouelle and Duplay，1988；Guan et al.，1988；Maina et al.，1988）、体内生物素标记融合物（Promega），以及以确定的抗原区作为标签，如Myc抗原表位。His标签融合蛋白插入一段多聚组氨酸肽，可通过它与金属离子的高亲和性结合而得以纯化（Hochuli et al.，1987）。该系统的优点是：融合蛋白在纯化过程中能被变性，而His标签仍具有与金属离子结合的能力，使变性融合蛋白亲和纯化。这对于不溶解的蛋白质而言是一个独特的优点。很多这种融合蛋白表达载体可用于细菌、果蝇和哺乳动物表达系统。用得最多的两个系统是GST和His标签的融合蛋白。
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支持GST融合蛋白应用的载体和抗体的发展使其得到普及。然而，每个融合部分都赋予不同的亲和纯化方法以适用于所研究的特定蛋白质。因此，为取得最佳结果，针对特定目的蛋白质，研究者要衡量每个系统的优缺点。
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程序纲要
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Far western印迹分析
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Far western印迹中使用的检测方法
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检测GST融合蛋白与靶蛋白相互作用常用的三种方法：放射性标记融合蛋白、抗GST抗体检测、生物素标记融合蛋白。每种方法各有优点。放射性标记融合蛋白的方法快速、简单易行，并且因磷酸化位点位于蛋白的融合部分而对蛋白质的后续活性影响很小。多种蛋白激酶位点已被整合到融合蛋白载体中（Blanar and Rutter，1992；Kaelin et al.，1992；Ron and Dressler，1992），以实现对细菌表达的重组蛋白进行32P标记。该技术在早期是利用目的蛋白质的内源性磷酸化位点作为32P磷酸化位点（Skolnick et al.，1991；Ayer et al.，1993）。该策略只能用于含这种位点的蛋白质探针，且磷酸化这些残基有利于（至少是无害于）实验设计（对蛋白质相互作用的影响而言）。目前，由于试剂盒的出现（from Amersham Pharmacia Biotech，Inc.），生物素标记蛋白质相对比较容易，然而，生物素化可能对探针蛋白质与其他蛋白质的相互作用有影响。最后，商品化的抗GST抗体（Amersham Pharmacia，Santa Cruz Biotech，Upstate Biotechnology，Convance/Babco）也是在含细胞裂解液的膜上检测相互作用的很好选择。后两种方法的优点是没有放射性，但是，如果计划进行文库筛选，买抗体和检测试剂的成本很高。
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诱饵融合蛋白的设计
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融合蛋白的设计主要取决于所选择的检测方法。如果选择32P标记蛋白，使用含激酶靶位点的载体很重要。另一个要考虑的问题是：在实际的筛选中是使用切割的（GST去除）还是全长的GST融合蛋白。GST部分会产生背景，因此，大多数融合载体含切割位点，便于将GST从目的蛋白中分离开。然而，一旦选择切割形式的融合蛋白，与靶蛋白的相互作用就不能用抗GST抗体检测。而且，在选择切割位点时，重要的是检查诱饵蛋白质，保证它不含蛋白酶的识别位点。要表达的目的蛋白区段取决于计划所用的筛选类型。对于文库筛选，将尽可能大的探针蛋白包括进去可检测到更多的相互作用蛋白。相反，检测一个蛋白质的已知相互作用结构域以验证预测的相互作用，最好选择只含这些结构域的融合蛋白，因为这样最不易产生假阳性相互作用。
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其他考虑因素
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在用Far western印迹时，最重要的考虑因素是能合成融合蛋白，但无过度降解和不溶。如果融合蛋白在纯化过程中被过度降解，探针蛋白就变成不同降解产物的混合物。从不同融合蛋白制备物得到的结果可能有所不同，因此在纯化后及使用前的储存过程中监控融合蛋白的状态非常重要。
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以GST融合蛋白探测固定在膜上的蛋白质类似于Western印迹分析，然而，对蛋白质—蛋白质相互作用检测的一个变数是：是否用变性/复性循环来探测膜，这个过程是为了使错误折叠的蛋白质恢复成天然构象。从SDS-PAGE转移到膜上的蛋白质通常不需要变性/复性。然而，在探测呈现表达文库的滤膜时，很多研究人员发现变性/复性是必需的步骤。如果没有成功的检测到从SDS-PAGE转移到膜上的蛋白质，引入支持方案1中的变性/复性循环后可能会获得阳性结果。
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对照
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在设计Far western印迹实验的对照时，应考虑以下几个问题：
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●如果GST保留在融合蛋白上，必须有单独用GST的重复实验。在筛选文库时，这样做是不可行的，此时重要的是：在克隆鉴定前，经4次纯化后，对阳性斑进行检测。
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●制备预测相互作用结构域突变的蛋白质探针，并在与真正蛋白探针的平行实验中证明其相互作用丧失，是验证相互作用特异性的最好的对照。
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●含靶蛋白的SDS-PAGE上应该包括单独GST或非特异蛋白质的阴性对照。如果目的蛋白是一个保守蛋白家族的成员，目的蛋白相互作用应该和同家族中的其他蛋白质相对比。
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GST沉降分析
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GST沉降技术的应用
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GST沉降技术通常有两方面应用：鉴定融合蛋白和未知蛋白间的新的相互作用（Kaelin etal.，1991；Orlinick and Chao，1996）；鉴定融合蛋白和已知蛋白间可能的相互作用（参见，Grgurevich et al.，1999；Hutter et al.，1999；Posern et al.，1999；Sun et al.，1999）。这两个实验在设计和操作上都有所不同。
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鉴定未知相互作用蛋白
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在实验开始时，必须根据经验确定可能影响实验成败的多种因素。首先，什么蛋白源适宜于用诱饵来探测其中的相互作用蛋白？认真选择相互作用蛋白源非常重要。该实验要求可能的相互作用蛋白在蛋白源中达到足够的浓度，使其在所选用的检测方法的灵敏度范围内。基于这个原因，放射性标记细胞裂解液是最常用的蛋白源。选择相互作用蛋白源前，需要回答的一些重要问题是：目的蛋白是否在特定的细胞或组织中表达（如果没有表达，生理相关的相互作用蛋白也不存在），比较的是否是不同类型的细胞群（静止期/循环期，细胞因子处理/未处理）？
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鉴定预测的或已知的相互作用
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如果要鉴定一个预测的相互作用，实验设计就更为直接，因为可制备大量的蛋白源来鉴定和查验这种相互作用。检测相互作用的方法取决于是否存在预测的相互作用蛋白的抗体。如果没有，可用35S标记的体外翻译蛋白，或在预测的相互作用蛋白上标上抗原表位标签，另外也可进行细胞转染以增加预测的相互作用蛋白的丰度。然而，控制质量作用（聚集）效应和保证相互作用的特异性非常重要。测定特异性的最好对照是包括一种含相互作用结构域突变的GST融合蛋白，证明其相互作用丧失，并与只含GST部分做比较。
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其他考虑因素
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该技术要求对分析的每个蛋白复合物都进行一些条件优化。应该考虑的一个更重要的变动因素是反应缓冲液，它通常是制备潜在相互作用蛋白质时所用的缓冲液，但也可能不同，从一种细胞裂解缓冲液（如RIPA）到一个体外翻译反应混合物都可以作为缓冲液。虽然很多缓冲液都可用，但是每个相互作用可否被检测，或多或少依赖于所使用的缓冲液。第二个要考虑的因素是与融合蛋白混合的靶蛋白的量。潜在相互作用蛋白质的丰度和相互作用的亲和性（在实验开始时这两个变量通常是未知的）决定了所需材料的量。第三个可优化的因素是洗涤条件。本方案中，细胞裂解液被用于洗涤GST沉淀复合物；然而，含不同浓度盐和去污剂的缓冲液也可用于去除非特异性的相互作用。
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对照
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应考虑以下对照
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●只用GST进行沉降实验，并与GST融合蛋白进行比较。
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●构建一个在预测的相互作用结构域突变的突变体，并证明相互作用丧失。不断增大无GST部分的融合蛋白的量（或仅有相互作用结构域）来证明竞争关系，用预测的相互作用结构域突变体平行进行这一竞争实验。
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方案
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方案1：GST融合蛋白的制备
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材料
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缓冲液和溶液
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分子克隆手册：蛋白质—蛋白质相互作用
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抗生素
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适当的抗生素（参见步骤1）
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细菌菌株
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经GST和GST融合表达质粒转化的菌株
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专用设备
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离心机
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Eppendorf管
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一次性色谱柱（Econo-column；Bio-Rad）
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谷胱甘肽琼脂糖球珠
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SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳装置和试剂〈！〉
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超声破碎仪
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方法
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1.将过夜培养的细菌单克隆（只含GST或GST融合蛋白）接种于5ml含抗生素的LB液体培养基中。
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虽然有各种各样的GST融合蛋白表达载体，最常用的载体（可从Amersham Parmacia公司获得的）包含：GST部分，可由多克隆位点与目的蛋白分离；一个IPTG诱导的启动子；氨苄（amplicillin）抗性基因；用于表达调控的lacI基因；一个细菌复制起始点。能用的菌株很多，包括那些常用的克隆菌株。另外，蛋白酶缺陷菌株如CAG456（在30℃生长）可用于表达37℃条件下不好诱导的蛋白。
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2.5ml过夜培养液接种于1L含抗生素的LB培养基。
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3.培养至OD600约0.5～1.0。
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4.加入终浓度为0.1mmol/L的IPTG诱导蛋白表达。
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不同浓度的IPTG适用于表达不同的蛋白。如果蛋白表达有问题，首先滴定加入的IPTG的量以确定蛋白诱导的最佳条件。
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5.在37℃继续摇动培养3h。
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6.在4℃以3500g离心20min收集细菌培养物。[1]
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7.弃上清。
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此时，如需要可将沉淀物冷冻保存于－20℃。
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8.用20ml含蛋白酶抑制剂的裂解液重悬沉淀。
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9.在冰上超声破碎沉淀，每次超声10s后休息10s，一般循环3次。
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超声过度会引起融合蛋白降解和变性，也会引起细菌蛋白的污染。如果这些问题发生在目的蛋白的制备阶段，需要做超声时间梯度来解决。
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10.裂解物在4℃，以3500g离心15min。
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11.将上清转移到一个干净的离心管。
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12.加入5ml50∶50混悬度的谷胱甘肽琼脂糖球珠。
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买来的谷胱甘肽琼脂糖球珠通常储存于含乙醇或其他成分的溶液中。在使用之前，树脂应该用裂解缓冲液洗涤并以50∶50（V/V）混悬度的形式储存于4℃。
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13.4℃孵育30min，不停地反复颠倒以确保混匀。
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14.在4℃以750g离心，收集球珠。
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15.用5ml含蛋白酶抑制剂的预冷PBS洗涤。
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16.在4℃以750g离心，收集球珠。
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17.加5ml含蛋白酶抑制剂的预冷PBS，轻轻混匀以重悬球珠。
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18.在4℃以750g离心，收集球珠。
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融合蛋白可在4℃储存于球珠上，这适用于蛋白要进行标记或用来做GST沉降实验。
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19.加5ml含蛋白酶抑制剂的预冷PBS，轻轻混匀以重悬球珠。
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20.将以上混悬液加入一次性色谱柱内（如Bio-Rad Econo-columns）。
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21.让PBS从柱内流出，用5ml含蛋白酶抑制剂的预冷PBS洗涤。
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22.在柱子流着的时候，准备一个装有10个Eppendorf管的试管架，并分别标上1～10。
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23.加5ml冷的含20mmol/L还原型谷胱甘肽的50mmol/L Tris（pH 8.0），以洗脱融合蛋白。
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24.每个Eppendorf管收集约0.5ml洗脱液。
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25.在使用前将洗脱液储存于4℃。
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柱子适当的封好后储存于4℃以防止干燥和污染。
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洗脱的蛋白储存于含20mmol/L还原型谷胱甘肽的溶液中，在多数情况下，最好除去谷胱甘肽。这可用最适于用该蛋白进行分析的缓冲液进行透析来完成。
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26.在洗脱液中进行蛋白分析，SDS-PAGE电泳并用考马斯亮蓝染色。
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疑难解惑
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在Amersham Pharmacia网站上有亲和纯化GST融合蛋白极具参考价值的资料：
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http：//www.apbiotech.com/product/publication/brochure/brochures_recombinant.html。
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●低产量
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如果产量很低，以较小规模重复纯化蛋白并在以下步骤中取出小量样品，这些步骤是：加入IPTG前的步骤3、步骤9、步骤11的上清，步骤14的上清及洗脱组分。
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1.要比较收集到的组分中融合蛋白的量，将以下组分加到一个小型SDS-PAGE胶中，体积是根据开始的体积为1L培养物定的，可根据实际情况做相应的调整。
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步骤3中15μl未诱导的培养物。
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步骤5中15μl诱导的培养物。
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步骤9（总细胞裂解液）中0.2%上清：40μl。
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步骤11（可溶性裂解液）中0.2%上清：40μl。
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步骤14（与球珠孵育后的裂解液）中0.2%上清：10μl。
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0.2%的每份洗脱组分：1μl。
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2%的每份洗脱组分：10μl。
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2.与上样缓冲液混合并进行SDS-PAGE电泳，GST部分分子量约27kD。
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3.考马斯亮蓝染色，分析这些组分将获得如下信息：
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a.蛋白是否被诱导表达（未诱导与诱导培养物比较）。
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b.蛋白是否可溶（步骤9与步骤11的比较）。
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c.是否有大量的蛋白未跟球珠结合（步骤14与步骤11的比较）。
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d.蛋白的产量和蛋白的完整性。
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●蛋白无法表达
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为确定诱导条件是否有效，平行进行GST和GST融合蛋白的制备。如果GST表达，有必要优化融合蛋白的诱导条件。滴定加入的IPTG的量，改变IPTG加入时的OD600值，降低温度，同时或单独延长或缩短诱导时间。
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●蛋白降解
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可利用蛋白酶缺陷型（lon-）菌株来解决。目前市场上有大量专门为蛋白表达而设计的可用菌株，这些菌株具有适当的遗传背景以减少蛋白降解（BL21，CAG456）。过度的超声破碎也可能产生降解。可通过小量的超声并检测不同的超声时间来确定目的蛋白的最佳超声时间。
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●不溶性
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蛋白不溶性可通过在较低温度下诱导更长时间而得以缓和。另外，在裂解时使用不同的去污剂也有帮助（该问题可参考Frangoi and Neel 1993）。然而，这可能是一个无法克服的困难。要继续使用本章所述的方法分析蛋白，可将靶蛋白转入His标签载体（该法可对变性蛋白进行亲和纯化）可能是一个恰当的选择。
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●无法与谷胱甘肽琼脂糖球珠结合
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当融合蛋白过度变性时可能会有这种情况，通常是由于过度超声破碎引起的。减少超声时间和强度可说明这种可能性。在裂解前加入终浓度为5mM的DTT也能增强一些融合蛋白的结合。参见Amersham Pharmacia网站：
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http：//www.apbiotech.com/product/publication/brochure/brochures_recombinant.html.
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方案2：Far western印迹：标记GST融合蛋白
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材料
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缓冲液和溶液
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分子克隆手册：蛋白质—蛋白质相互作用
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试剂
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分子克隆手册：蛋白质—蛋白质相互作用
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专用设备
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G50 Sephadex Spin column（可选，Boehringer-Mannheim）
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谷胱甘肽琼脂糖球珠
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微型离心机微
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离心管
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方法
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1.在Eppendorf管中准备以下反应混合物：
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分子克隆手册：蛋白质—蛋白质相互作用
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2.37℃孵育30min。
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3.标记反应完成后，用200μl 1×PK缓冲液洗涤球珠，然后以13000r/min离心1min。去掉含游离核苷酸的上清。重复洗涤一次，在这一步中，标记的蛋白将被蛋白酶切下（如果需要）或直接用含20mmol/L还原型谷胱甘肽的50mmol/L Tris（pH 8.0）洗脱。蛋白从球珠上脱下以后，即可用于杂交。探针可在制好的当天使用并在使用前于4℃保存。
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可替换：如果标记蛋白在标记反应前已从GST部分切下（参见步骤1中的可选方案），将蛋白上样到一个备好的Sephadex G50柱（Boehringer-Mannheim）上以去除游离核苷酸，柱子在上样前应用1×PK缓冲液平衡好。根据厂商的说明使用层析柱，一旦探针蛋白与游离核苷酸分离，即可用于杂交。探针应在制备好的当天使用并在使用前于4℃保存。
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因为探针在下个实验方案中需要稀释，这一步探针的终体积不要调整。该步要注意的最重要的变量是加入的探针总毫克或摩尔数。探测膜时探针的终浓度是1～5nmol/L。标记前蛋白的浓度应确定，这可根据蛋白分析或对SDS-PAGE进行考马斯亮蓝染色或银染并与已知浓度的标准蛋白比较来确定。如果在两个蛋白之间进行比较（GST与GST融合蛋白或野生型与突变型融合蛋白），重要的是要保证杂交时每个探针终浓度相同。
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方案3：Far western印迹：探测膜
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材料
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缓冲液和溶液
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分子克隆手册：蛋白质—蛋白质相互作用
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试剂
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标记的GST融合蛋白
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固定在尼龙或硝酸纤维素膜上的可能靶分子
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专用设备
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可容纳膜的塑料容器
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X光底片
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方法
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1.以标准方法转移制备要探测的膜。通常，从SDS-PAGE转移到膜上的蛋白可直接进行探测。如果蛋白是从表达文库中转移来的，在进行第二步前先用支持方案1处理。
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2.以能完全覆盖膜的足量基础缓冲液于4℃轻摇洗膜10min。
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3.以能完全覆盖膜的足量封闭缓冲液于4℃轻摇封闭4h至过夜。
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4.将1～3μg（终浓度为1～5nmol/L）标记好的融合蛋白与相互作用缓冲液混合，该探针溶液应该与膜表面均匀接触，4℃轻摇孵育4～5h。
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5.正确弃去放射性探针溶液，用能完全覆盖膜的足量洗涤缓冲液1于4℃轻摇洗膜10min，重复3次，正确弃去洗涤液。
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6.以能完全覆盖膜的足量洗涤缓冲液2于4℃轻摇洗膜10min，重复1次。
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7.用塑料包纸小心包住膜并用X光片曝光。
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疑难解惑
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●没有信号
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1.通过分析SDS-PAGE上的标记蛋白以确保蛋白已被标记；烘干并进行X光片曝光。
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2.确定膜上是否有蛋白质（表达文库的诱导是否正确，蛋白质转移是否正确）。
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3.探测前进行变性－复性循环（支持方案1）。
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4.探针蛋白有限，做一个滴定，不断增大探针蛋白的量以获得最佳的探针浓度。
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5.相互作用蛋白源可能不含伴侣分子，可试用其他相互作用蛋白源。
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6.如果可能，做一个阳性对照，然而，对于检测的相互作用蛋白源，没有信号也可能是正确的结果。
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●信号过强
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1.探针蛋白降解或不纯，分析SDS-PAGE以检测探针蛋白的完整性。
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2.由GST产生的背景，在探测前通过蛋白酶解将GST除去。如果这一步不可行，可在封闭前或探针孵育时加入过量未标记的GST（该方法不能用于以抗GST抗体进行检测的方案）。
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3.探针过量，可通过做探针滴定实验确定最佳探针浓度来控制。
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4.缩短孵育时间以减少非特异性相互作用。
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支持方案1：在盐酸胍中进行变性－复性实验
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有时，转移后的膜上蛋白质不起相互作用，可能是由非正确折叠造成。那么，可能有必要进行变性和缓慢复性。用变性缓冲液洗膜，然后再用逐步稀释的变性缓冲液洗膜，使变性蛋白慢慢复性。最有效的方法是用含6mol/L盐酸胍的基础缓冲液开始洗膜，然后在洗膜的过程中再逐步稀释该缓冲液。
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转移后，用变性缓冲液在4℃轻摇洗膜10min，重复1次。用基础缓冲液以1∶1稀释变性缓冲液，如前述方法洗膜。变性缓冲液每次都以1∶1方式稀释，共重复5次。如：
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1.用50ml变性缓冲液在4℃轻摇洗膜10min。
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2.重复1次。
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3.弃去一半变性缓冲液，加入25ml基础缓冲液使总体积达到50ml，这是第一个1∶1稀释，还放回4℃轻摇洗涤10min。
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4.再重复上一步骤4次，最终洗涤液中含187mmol/L盐酸胍。
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此时可继续方案（探测膜）中的步骤2。
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支持方案2：用抗GST抗体检测
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非放射性方法之一就是用非标记GST融合蛋白与膜上蛋白质相互作用，并用可买到的抗GST抗血清来检测这种相互作用。
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1.将可能的相互作用蛋白转膜后（方案3中步骤1），直接跳到方案3中的步骤6。
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2.在方案3步骤6后，根据厂家说明将抗GST抗体和膜孵育。
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该方法筛文库的成本要比用放射性标记蛋白质的方法高得多（购买抗体和检测试剂）。另外，还要谨防GST本身产生的非特异性相互作用，以及因抗体的交叉反应而产生的信号。
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方案4：GST沉降
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材料
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缓冲液和溶液
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分子克隆手册：蛋白质—蛋白质相互作用
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试剂
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考马斯亮蓝（Coomassie blue）
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GST蛋白
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GST融合蛋白
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还原型谷胱甘肽（Sigma）
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35S标记的细胞裂解液
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硝酸银（silver nitrate）
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Tris（50mmol/L，pH 8.0）
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专用设备
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分子克隆手册：蛋白质—蛋白质相互作用
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方法
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1.细胞裂解液与50μl谷胱甘肽琼脂糖球珠（用裂解缓冲液制成50/50混悬度的溶液）和25μgGST于4℃孵育2h，并翻转混匀。用于检测相互作用的蛋白质量是高度可变的，可从1×106～1×107组织培养细胞相当的裂解液开始（Orlinick and Chao，1996；Spector et al.，1998）。
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以下实验要比较GST与GST融合蛋白，牢记这一点很重要，因此需要制备足够的细胞裂解液，使每个反应中所用细胞裂解液相等。要确保足够大的体积允许自由混合，500μl～1ml是一个好的始点。该步是为清除细胞裂解液中与GST或球珠起非特异性相互作用的蛋白而设计的。如果用候选相互作用蛋白的抗体检测相互作用，并不一定要求清除细胞裂解液中与GST或谷胱甘肽琼脂糖球珠相互作用的蛋白。然而，用35S标记细胞裂解液鉴定新蛋白质—蛋白质相互作用时，这些步骤有助于减少背景。当用相互作用蛋白抗体检测相互作用蛋白时，做“GST＋球珠”和“GST”对照很重要。另外，如果相互作用目的蛋白被局限于特定细胞区室时（如细胞核），对应于该细胞区室的部分裂解液（如核抽提液）可作为相互作用蛋白源。
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2.于4℃以13000r/min离心2min。
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3.将上清移到一个干净的离心管。
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4.将细胞裂解液分别与GST和GST探针蛋白孵育。两个试管分别加入等量预清除的细胞裂解液，再加入50μl谷胱甘肽琼脂糖球珠（50∶50混悬度于裂解缓冲液中），一管加入GST蛋白，另一管加入GST融合探针（每个约10μg）。
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这两个反应中加入的蛋白量应该是等摩尔的（即GST与GST探针蛋白的终摩尔浓度相同）。
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5.于4℃以翻转混合的方式孵育2h。
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6.以13000r/min离心2min。
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7.上清保存在干净的离心管中（只供SDS-PAGE分析）。
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8.以1ml预冷裂解缓冲液洗涤球珠4次，弃去洗涤液。
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9.此时，融合蛋白及与其结合的任何蛋白质都可被50μl含20mmol/L还原型谷胱甘肽的50mmol/LTris（pH 8.0）洗脱。
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或者，球珠用等体积的2×SDS-PAGE上样缓冲液混合，并于上样前煮沸。
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如果样品从球珠上煮下来，包括“只含谷胱甘肽琼脂糖球珠”的对照非常重要。即使在单用GST的比较中，也出现与球珠非特异结合的蛋白，就像是与融合蛋白结合的蛋白质一样。
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10.SDS-PAGE电泳，检测相互作用：
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a.如果目的是要在SDS-PAGE电泳后检测35S标记蛋白与融合蛋白的结合，就将胶在胶烘干器中烘干并进行X光片曝光。
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b.如果目的是要检测特异的伴侣分子，SDS-PAGE电泳后，蛋白应转移到膜上进行Western印迹分析。
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c.如果目的是要确定非放射裂解液中与融合蛋白结合的蛋白的大小和丰度，在SDS-PAGE电泳后，胶应用考马斯亮蓝或硝酸银染色。
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疑难解惑
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●确定最佳条件
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如果难于确定GST沉降实验条件是否最佳，一个解决疑难的起始步骤是：本方案过程中产生的每个组分，取等体积比的量上样。
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例如，在SDS-PAGE上分析1%体积的以下样品能有助于解决疑难：
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总细胞裂解液（步骤1）
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洗脱液（步骤9）
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洗脱后的球珠（步骤9）
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步骤7保存的上清
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“球珠＋GST”洗脱液“仅含球珠”洗脱液
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在所示步骤中收集这些样品，加适当体积的SDS-PAGE上样缓冲液，在干冰∶乙醇浴中速冻，以备后用。
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步骤1组分：你将从这些样品中获得如下信息：新的相互作用蛋白在总细胞裂解液中的存在情况。
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步骤9洗脱前组分：有多少蛋白与GST融合蛋白结合。
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步骤9洗脱后组分：有多少GST融合蛋白＋结合蛋白从球珠上洗脱下来。
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步骤9存留下的球珠：有多少新的相互作用蛋白残留在球珠上。GST＋球珠及只含球珠的对照可鉴定非特异性相互作用。
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●弱信号
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即使相互作用蛋白在总细胞裂解液中含量丰富，但获得的相互作用信号很弱，如果这样可能指示结合条件不是最佳。改变盐和去污剂的浓度，另外延长结合时间，可能会改进实验结果。
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相反，由于洗脱不充分，复合物可能留在球珠上，这可通过用SDS-PAGE比较洗脱液与“洗脱后融合蛋白—球珠”组分来确定。如果这是问题所在，可通过混合多种洗脱液或延长洗脱时间来改进实验条件。
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●非特异性背景
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单用GST或球珠预清除细胞裂解液有助于减少非特异相互作用。减少加入的细胞裂解液的量并增强洗涤条件的强度也能减少背景。
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●重要的对照
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如果用Western印迹分析相互作用，探测候选相互作用蛋白前用抗GST抗体预探测膜很重要。这可确定是否所有样品都与等量的GST融合蛋白孵育，并有助于确定在与细胞裂解液孵育时融合蛋白是否降解。
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5 通过免疫共沉淀法鉴定相互作用蛋白质
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前言
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已知蛋白质间相互作用的检测
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也许对两个蛋白质生理上相互作用的最严格证明是它们在细胞提取液中的免疫共沉淀。例如，一个假定的相互作用可能首先通过应用一个强有力的，高通量的方法例如酵母双杂交筛选，然后，通过免疫共沉淀证实两种蛋白质是体内的生理性的相互作用。通过这种途径检测一个相互作用常常通过相关蛋白质的异位表达来完成，例如，通过编码相关蛋白质的质粒瞬间转染细胞。然而，如果可能的话，可以不求助于这些方法，因为过量表达可能形成非生理性的相互作用。
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新蛋白质间相互作用的鉴定
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免疫共沉淀也可用于寻找与一个已知蛋白质相互作用的新蛋白质。同其他很多用于鉴定缔合蛋白的方法相比，这种方法的主要优点是它非常有效地用于鉴定细胞内生理上的蛋白质间相互作用。这种方法的缺点是相对费力、耗时，并且需要大量的培养细胞（尽管从很多升培养的悬浮细胞得到的冰冻细胞沉淀物可以买到，例如，从美国国家细胞培养中心购买［http：//www.nccc.com］）。
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程序纲要
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细胞裂解与免疫沉淀
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裂解细胞时，需要考虑的主要问题是裂解条件，它应能溶解和提取出用于免疫共沉淀的蛋白质，但不破坏存在于细胞内的所有蛋白质—蛋白质相互作用。因此，最好提前决定最有效地溶解大多数感兴趣蛋白质的最温和条件。这些预备试验可小规模进行，每次免疫沉淀用106～107的细胞提取物。一般来说，高盐浓度（200～1000mmol/L NaCl）和离子型去污剂（例如：0.1%～1%SDS或脱氧胆酸钠［DOC］）比低盐浓度（120mmol/L NaCl）和非离子去污剂（例如：0.1%～1%NP-40或Triton X-100）对细胞有更强的破坏性。机械过程，如超声，也会使蛋白变性并打破蛋白间相互作用。然而，必须指出的是，溶解但不解离一个特定的蛋白复合物的条件应当是通过经验确定的。EBC（50mmol/L Tris ［pH 8］、120mmol/L NaCl、0.5% NP-40）和RIPA（50mmol/L Tris ［pH 8］、150mmol/L NaCl、1% NP-40、0.5% DOC、0.1% SDS）是两个常用的缓冲液。每种缓冲液中应该加上蛋白酶和磷酸酶抑制剂的混合物（例如，500 μg/ml氟化苯甲磺胺、50μg/ml亮抑蛋白酶肽、100μg/ml抑蛋白酶肽、100mmol/L NaF、0.2mmol/L正矾酸钠）。
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一旦确定了裂解条件，就要用抗目的蛋白质的抗体对澄清的细胞裂解液进行标准的免疫共沉淀。用相关的对照抗体做平行的免疫沉淀是非常重要的（请见：优化和对照）。当确定了细胞裂解和蛋白质溶解条件后，应注意高浓度的离子型去污剂（例如，大于0.2% SDS）和还原剂、去污剂（例如，二硫苏糖醇［DTT］和巯基乙醇）会使抗体变性并干扰免疫沉淀。免疫沉淀后，蛋白质一般通过一维SDS-PAGE分离并通过下述方法检测。
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缔合蛋白的检测
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如果试验的目的是测定两个特定的蛋白质是否存在体内相互作用，第二个蛋白质的存在通常用Western印迹检测。如果裂解前细胞已经用［35S］-甲硫氨酸代谢标记的话，可用放射自显影检测。前者直接，而且如果对Western印迹中的抗体有充分了解，结果也相对明确。后者的优势在于，35S标记的蛋白可通过胰酶酶解图谱与体外特定的cDNA转录翻译的35S标记的编码蛋白进行比较，进而鉴定蛋白质（Xiong et al.，1992，1993；Kibel et al.，1995）。
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如果目的是鉴定新的缔合蛋白，可以通过对胶上的蛋白质直接染色检测。此时，在扩大程序的规模之前，只有灵敏度较高的染色例如银染和咪唑—锌负染色（例如与考马斯亮蓝相对）才有需要的灵敏度（Matsui et al.，1999）。最近，一种荧光染色剂SYPRO宝石红已经开发出来，灵敏度与银染和咪唑—锌负染色相似，而且很容易用质谱方法进行蛋白质鉴定（Berggren et al.，2000）。另外，如果裂解前细胞已经用［35S］-甲硫氨酸标记的话，标记的蛋白质可用放射自显影或荧光成像仪检测。
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优化与对照
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抗体的鉴定
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任何用于免疫共沉淀的抗体都应该接受很好的鉴定（Hu et al.，1991；Marin et al.，1998）。也就是说应该明确表明，该抗体可以从细胞的粗提物中免疫沉淀出产生该抗体的蛋白质。有许多方法可以用来阐明该问题。（1）针对同一蛋白质独立产生的多个抗体都能识别相同的多肽。（2）在缺乏靶蛋白的细胞系中抗体不能鉴定出这种靶蛋白。缺乏特定蛋白质的细胞系有时可以得到，如从癌症易感症患者来源的人细胞株中（如缺乏pVHL肿瘤抑制蛋白的786-O肾癌细胞系），或来自特定基因定向敲除的小鼠细胞系。（3）从代谢标记的细胞中免疫沉淀得到的35S标记的蛋白质进行水解消化，得到的肽图谱与35S标记的特定的cDNA体外翻译的蛋白质酶解肽谱进行比较。如果从细胞提取物中免疫沉淀的蛋白质与cDNA编码的蛋白质相同，那么肽图谱应该是相同的（Xiong et al.，1992，1993；Kibel et al.，1995）。
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使用对照抗体
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即使是小鼠的单克隆抗体也可以非特异地与不同于免疫原的蛋白质相互作用（图5.1，复合体3）。对照的和特异的抗体都可以免疫沉淀的蛋白质，它与抗体的结合可以说是非特异的。很明显，对照抗体和特定的抗体越匹配，错误地鉴定非特异结合蛋白的几率越小。对一个小鼠的单克隆抗体来说，正确的对照是同一个亚家族的另一个单克隆抗体；对兔血清是同一只兔子免疫前的血清；对一个纯化的兔的多克隆抗体是另一种纯化的兔的多抗。
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使用多种抗体
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与抗体识别的靶蛋白相关，而不是与抗体有交叉反应的蛋白质，可能被一种以上针对免疫沉淀蛋白质的抗体共沉淀下来。因此，使用针对单一蛋白质的一种以上的抗体来共同沉淀推测的缔合蛋白，能增加结果的可信度。同样，对复合物中任一蛋白质做免疫沉淀，都应该能检测到两种蛋白质间生理性相互作用。这里需要提醒的是，不同抗体识别不同的表位，其中有些可能在特定的蛋白质复合物中被隐蔽了。这样，有些抗体反倒可以破坏特定的蛋白质—蛋白质相互作用。因此不能指望所有抗体都可沉淀相同一组结合蛋白质。
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使用缺失靶蛋白的细胞系
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与被免疫沉淀的蛋白质相结合的蛋白质，而不是与抗体非特异结合的蛋白质，在缺乏抗体所识别的靶蛋白的细胞系中将不会被免疫共沉淀。所以，如果可能的话，免疫沉淀的对照应该在缺乏那种蛋白质的细胞系中进行。
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测定生物学上相关的突变体
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以有功能意义的方式与免疫沉淀的蛋白质相结合的蛋白质，也许不能与无生物学活性的蛋白质突变体相互作用。因此，如果可能的话，假定的免疫共沉淀蛋白质与无生物学活性的免疫沉淀蛋白质的相互作用应该给予检测。这样的突变体也许在某些人细胞系中是天然表达的（如肿瘤来源的含有该蛋白突变体的细胞系）。或另外作为带表位标签的蛋白质通过瞬时转染被异位表达。这种异位表达的突变体蛋白质可以用针对表位标签的抗体特异地免疫沉淀。例如，cullin家族的成员Cul2，以及许多其他生理上相关的pVHL结合蛋白，如延伸因子B和C以及纤连素，不能与肿瘤来源的天然发生的点突变体pVHL相互作用。
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验证细胞裂解前后发生的相互作用
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图5.2 pVHL相关蛋白的免疫共沉淀
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细胞的裂解涉及细胞分室作用的大量破坏，使得在正常情况下从不在同一亚细胞定位的蛋白质拉近。这样，在细胞裂解后提供了非生理性复合体形成的机会。从理论上讲，通过在细胞裂解液中加入假定的相互作用蛋白质，有可能竞争掉这种裂解后的相互作用。例如，Ohh等（1998）将非放射标记的纯化的纤连蛋白加入细胞裂解液，不能阻止裂解前细胞内存在的35S标记的纤连蛋白与pVHL的免疫共沉淀。由此，他们认为，35S标记的纤连蛋白与pVHL的结合发生在细胞裂解前。
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降低非特异蛋白质的背景
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由于与抗体的非特异性相互作用或者与抗体所识别的蛋白质的非生理性结合而产生免疫共沉淀的蛋白质数目可通过优化免疫共沉淀的条件来减少。通常采用三种方法来达到该目的。
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1.增加免疫沉淀洗涤缓冲液的离子强度。由于裂解缓冲液中高浓度的盐常常会破坏蛋白质与蛋白质的结合，因此一般洗涤缓冲液用较高浓度的盐来降低蛋白质与蛋白质之间非特异性的相互作用。洗涤缓冲液的浓度滴定可在120～1000mmol/L之间。然而，高浓度的盐会干扰SDS-PAGE。因此，免疫沉淀物在上样之前，应该用标准的盐缓冲液（120mmol/L NaCl）冲洗。
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2.降低免疫沉淀中一抗的量。降低免疫沉淀中一抗的浓度将会降低非特异共沉淀蛋白质的量。抗体的浓度应该降到一个点，这时从任何特异蛋白质获得的信号和非特异蛋白质相比是最大的。
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3.用对照抗体预清除细胞裂解物。在用针对感兴趣蛋白质的抗体进行免疫沉淀之前，用多余量的对照抗体和proteinA-sepharose对细胞裂解物进行预沉淀（Harlow and Lane，1988）。
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蛋白质鉴定
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以质谱为基础的方法
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由于以下几种原因，以质谱为基础的方法成了蛋白质鉴定的选择方法。首先，如上所述，以质谱为基础的方法比化学测序方法更灵敏。第二，从近来基因组测序所得到的信息使质谱分析得到了极大的简化。第三，质谱方法可以鉴定蛋白质混合物中的单个蛋白质。第四，质谱方法可以获得蛋白质翻译后修饰的信息。第五，质谱分析方法比化学测序方法更快速。由于以上原因，虽然质谱分析方法还是一种正在兴起的技术，但它有望使蛋白质分析方法发生革命。下面是蛋白质谱分析的一个简短回顾。因为此项技术十分复杂，并有待于进一步的发展，关于样品的准备、处理和分析的详细步骤应请教对这些方法有经验的人。
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概观
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质谱分析可以分为三步（Kuster and Mann，1998；Gygi et al.，1999；Yates，2000）。
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第一，样品被离子化。第二，根据荷质比对离子进行分析。第三，对离子进行检测。
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经常用两种方法来对生物样品进行离子化。在MALDI方法中，离子化的实现是通过用短的激光脉冲来辐射吸附有生物样品的晶体状的光吸收基质。在电喷射离子化过程中，通过对来自毛细管针溶液中的生物样品进行喷射，产生持续的离子流，毛细管针放在高的电势下面。
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离子化后，可以用几种方法进行分析。在飞行质谱分析仪中，离子在电场中被加速，距离检测器一个固定的距离，到达检测器的时间依赖于离子的荷质比。相应地，TOF通常被用来确定混合物中蛋白水解后肽的质量（或完整蛋白质的质量）。然而，在肽的顺序方面获得的信息却很少。相比之下，triple quadrupole和离子捕获质谱分析仪可以被用来进行串联质谱分析，从而产生序列依赖的信息。在那样的机器中，第一个质谱阶段测量质量和电荷的比例，然后测量混合物中单个肽的质量。接下来，具有确定质量和电荷比的肽被选择出来，经过碰撞诱导解离（CID），在胺键处将起始的肽分离，产生两个互补的离子化产物（指y系列和b系列），其质量提供序列依赖的信息。
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MALDI TOF
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用离子化和分析程序的特定结合，来确定所谓的肽质量图谱（图5.3）。感兴趣的蛋白质从胶中被切下，用序列特异的蛋白酶消化。肽被提取，用MALDI TOF分析，来确定在消化后每个肽的质量、产生蛋白质特异的指纹。通过和蛋白质数据库中预测的指纹相比较，从而鉴定出该蛋白质。一旦有机体的基因组被完全测序，MALDI TOF指纹可以和基因组编码的每个蛋白质的指纹相比较。为了证实这种方法，已从二维聚丙烯胺凝胶中切下的蛋白质中鉴定出了90%的酵母蛋白质和65%的流感噬血杆菌蛋白质。
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图5.3 通过MALDI TOF鉴定相关蛋白质
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ESI-MS/MS
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将离子化和一定的分析系统相结合不仅可用来获得肽质量信息，最重要的是肽的序列信息（图5.4）。尤其是当可以得到一个蛋白质的多肽的质量和序列时，这种信息足以鉴定出数据库中的单个蛋白质。感兴趣的蛋白质通常从聚丙烯酰胺凝胶中切下，用序列特异的蛋白酶消化（如胰蛋白酶），在溶液中进行ESI-MS/MS。因为样品在溶液中被分析，可以将这种方法与高效液相色谱或毛细管电泳相结合，简化一次被分析的肽混合物，使得数据的分析更加直接。
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图5.4 通过ESI MS/MS鉴定缔合蛋白
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这种方法和MALDI TOF比起来有两方面的优势：第一，因为MS/MS数据包含有来自单个肽内部的一段短的直接序列信息，而不仅仅是一个质量图谱或整个蛋白质的指纹图，这种方法可以容易地被用来搜索翻译的EST数据库（这样的数据库不能提供完整蛋白质的序列信息）。第二，因为序列信息是由具有确定m/z比例的单肽获得的，这使得对来自蛋白质混合物的多肽序列的测定成为可能。这意味着不需要通过一维或二维聚丙烯酰胺凝胶电泳对蛋白质进行预先纯化（McCormack et al.，1997；Link et al.，1999；Tong et al.，1999）。例如，Yates及其合作者利用CE-MS/MS和LC-MS/MS分析了经过胰酶消化纯化过的酵母核糖体，成功鉴定了这种复合体中已知的78个蛋白质。而且，他们能在总的酵母细胞裂解物中鉴定出78个核糖体蛋白质中的71个（Link et al.，1999）。
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通过MS来对多蛋白质复合体进行鉴定
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前面概括的以质谱分析为基础的方法的独特优势使得对纯化的蛋白质复合体成分的鉴定成为可能。Aebersold及其合作者利用LC-MS/MS鉴定出了大量的和凋亡抑制蛋白bclXl免疫共沉淀的蛋白质。Mann及其合作者利用ESI-MS/MS鉴定了酵母蛋白质及人的RNA拼接体（Neubauer et al.，1997，1998；Ajuh et al.，2000）。拼接复合体的纯化是通过将凝胶过滤和亲和层析方法相结合得到的。ESI-MS/MS也被用来鉴定免疫纯化的酵母APC（anaphase-promoting complex）复合体亚单位，该复合体为蛋白质泛素化连接酶复合体，是进行和退出细胞有丝分裂所必需的（Zachariae and Nasmyth，1999）。
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一个亚单位，Apc2p与在另一个泛素蛋白连接酶复合体中的亚单位cullin（Cdc53p）相似，该复合体为SCF（Skp1，Cdc53，F-box），是DNA复制所必需的。这意味着APC和SCF复合体在进化上的联系（Zachariae，1998；Koepp，1999）。近来两个研究小组利用LC-MS/MS在体内鉴定出了与BRCA1相关的蛋白质。一种方法是直接从细胞提取物中免疫沉淀BRCA1，然后用LC-MS/MS来鉴定免疫沉淀的蛋白质。发现BRCA1以高分子量复合体的形式出现（BRCA1相关的基因组拯救复合体，BASC），包含肿瘤抑制因子和DNA损伤修复蛋白质如MSH2，MSH6，MLH1，ATM和BLM（Wang et al.，2000）。在另一种方法中，含有BRCA1的复合体经过离子交换和免疫亲和色谱后，通过LC-MS/MS鉴定出SWI/SNF染色质重构家族的成员是与BRCA1相结合的蛋白质（Bochar，2000）。
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方案
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方案1：pVHL结合蛋白Cul2的鉴定
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材料
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缓冲液和溶液
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分子克隆手册：蛋白质—蛋白质相互作用
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细胞和抗体
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12CA5，抗HA的小鼠单克隆抗体
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786-O/HA-pVHL 细胞，6×107
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凝胶和染色液
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乙腈（50%）〈！〉
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考马斯亮蓝 R250
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SDS-PAGE凝胶
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专用设备
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ABI 477A或494A测序仪
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HPLC 设备
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方法
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1.用磷酸盐缓冲液冲洗在30cm×10cm的细胞培养板上同步生长的细胞786-O/HA-pVHL（细胞总数大约为6×107），将每一个培养板上的细胞刮入1ml冰冷的EBC细胞裂解液。
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2.4℃以14000g离心细胞裂解液15min。
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3.收集可溶成分（30ml），加30μg抗HA的小鼠单克隆抗体12CA5。在4℃下摇免疫沉淀物1h。
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4.加入0.9ml1∶1protein-A sepharose（混悬于20mmol/L Tris，pH8，1mmol/L EDTA，0.5% NP-40）。在4℃下和免疫沉淀物共同摇30min。
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5.用NETN+900mmol/L NaCl洗4次protein-A sepharose，然后用NETN洗1次。
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6.吸干proteinA-sepharose 珠子，加入800μl 1×Lammli 的样品缓冲液，煮4min。
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7.准备SDS-PAGE凝胶。分离胶（7.5%～15%不连续凝胶，pH 8.8）应为20～30cm长，浓缩胶（5%，pH 6.8），长10cm，孔本身应为10cm深。倒浓缩胶时不用多孔的梳子，用玻璃板之间垂直的隔板条插入来形成足够大的样品孔，将样品加入，然后在10mA的恒流下电泳过夜。
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8.用考马斯亮蓝R-250染色检测蛋白质条带，从胶中切下感兴趣的条带，放入小离心管，用1ml50%的乙腈洗2次，每次3min。当蛋白质还在胶中时，用胰酶来消化，用电洗脱法（electroelvtion）将肽洗脱，通过细孔HPLC分离。将收集的肽在ABI 477A或494A测序仪上进行自动的Edman降解测序（Lane et al.，1991）。
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检测和消化蛋白质的步骤可有很大不同。尤其是既可以当蛋白质还在聚丙烯酰胺凝胶中时消化，也可以在蛋白质转移到纤维素膜或PVDF膜上后进行消化。进行Edman测序或MS分析时样品的处理也可以有很大的变化。最好与操作仪器的科学家讨论。Matsudaira（1993）和Link（1999）对这些方法做过综述。
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免疫共沉淀蛋白质的鉴定虽然相对来说比较费力，但却是一个有效的鉴定生理相关的缔合蛋白的方法。将来随着以质谱分析为基础的蛋白质鉴定敏感性的增加，将会补充人类基因组计划所得的序列信息资源，并进而促进这种方法的应用。
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致谢
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感谢Bill Kaelin对该文原稿的审阅。
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6 化学交联技术在研究蛋白质相互作用中的应用
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前言
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交联是共价连接不同化学功能基团的技术。对于蛋白质来说，亲核侧链或多肽链的末端均为交联的功能基团。这项技术应用于蛋白质之间相互作用的研究已近50年，是应用时间最长的技术，同时也是最有效最多样化的技术之一。交联技术可用于研究稳定复合体内的蛋白质相互作用，或用于研究可逆相互作用蛋白质间的作用。在异源寡聚复合体中，交联技术可以确定蛋白质的相邻亚基（Dey et al.，1998）及相互作用蛋白质间最大间距（Hajdu et al.，1977），甚至可以确定相互作用蛋白质间特异的相邻残基（Hartman and Wold，1967）。交联技术还可以应用于确定复合物中的最小亚基数量，即使是不溶性的膜复合体也适用（Heymann and Mentlein，1980）。通过亚基交联模式的改变而产生的交联技术可用于检测复合物内的构象变化，例如那些由效应物诱导产生的构象变化（Nadeu et al.，1997a，b），交联技术还可以使寡聚体锁定在某一特定构象状态（Benesch and Kwong，1991）。至于可逆相互作用蛋白，不管两者均为可溶性蛋白，还是一蛋白质可溶而另一为膜蛋白（如配体与其膜受体，Ji，1977）或者两者均为不溶性的膜蛋白，交联技术都可以确定这些配对分子。因此，交联技术的应用非常广泛，从相互作用蛋白的筛选，到提供它们相对的和绝对的结构信息（Ji，1977）。当然，现今它最普遍的用途之一就是验证酵母双杂交、沉降及免疫沉淀结果。
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在本章中，我们只考虑化学交联，也就是由化学试剂引起的共价交联。这通常引起交联试剂的部分分子掺入到交联蛋白的亲核基团之间，然而对于零距离交联来说，则没有交联剂掺入到连接产物中。交联也可以由某些酶的使用而产生，如转谷氨酰胺酶，尽管酶交联不属于本章内容，但其多数变量及涉及问题与化学交联相同。有关交联方面深刻、彻底且有助于实验的进一步论述，读者可以参考Wong（1993）或Hermanson（1996）的著作。另一有用的信息资源是Pierce化学公司的产品目录，其中含有大量交联剂商品。
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在使用化学交联剂研究蛋白质间相互作用时，有相关的两个要点无论如何强调都不为过。首先，交联完全是经验过程，无法预测哪种蛋白质在何种条件下与何种交联剂发生交联，需要对各种各样的实验条件及试剂进行筛选以得到最佳交联。其次，对未发生交联原因的解释要极其谨慎。这是那句格言“无证据并不证明不存在”的极好的例证。如本章所述，对于两个发生交联的相互作用蛋白，任一蛋白质的适当功能基团如侧链，需要正确定位且有足够的活性，这样才会被具有适当物理化学特征的交联剂所修饰。
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体内与体外交联反应的区别
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除了传统的和广泛应用的体外方法，交联也可在体内进行，尽管文献中很少有这种例子。显然，体内交联的最大优点在于感兴趣的蛋白质相互作用发生在接近于自然的条件下，即它们之间的相互作用可能只受交联剂介入的干扰。由于在体内系统中，蛋白质组分的复杂性及集中度要远远大于体外环境，可以通过使用短交联剂使得只有邻近的蛋白质被连接，这样可以增加真正相互作用蛋白的识别特异性。例如，甲醛，一种交联距离极短的脂溶性试剂（2-3A）已应用于体内交联研究（Jackson，1987）。但是事实上，这种方法最主要的困难就是对交联特异性的控制。在体内交联的研究中，通常用脂溶性疏水交联剂（如甲醛、CS2、C2N2）以穿透细胞膜（Valentine et al.，1993；Alaedini and Day，1999；Jackson，1999）。决定或控制细胞内交联特异性最适合的条件是个极其困难的过程，除了与感兴趣的蛋白质相互作用外，交联剂还可以与大量其他蛋白相互作用，其中包括细胞表面蛋白、整合膜蛋白、胞浆内蛋白及核蛋白。而且，代谢产物及非蛋白组分也是交联剂的潜在竞争剂，特别是当它们具有与蛋白质侧链同类的反应基团时，如胺类、羧化物或者硫醇。通常情况下，在控制交联条件的同时改变细胞内蛋白质之间的相互作用是非常困难的，大量的潜在靶蛋白更使数据的说明复杂化。
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体外交联更有可能同时控制交联的特异性及条件。例如，水溶性及脂溶性的交联剂可分别用于修饰相互作用蛋白的亲水区及疏水区。pH、反应物的浓度及反应温度也易控制。体外交联还允许对蛋白质及其复合物的纯度进行优化，以使蛋白质的交联模式更易解释。而且，相对于复杂的蛋白质复合物来说，明晰的接合体的真正交联区域更易确定。体外交联方法的另一优点是有各种各样的交联剂及操作步骤可供选择。但这种方法的明显不利是，相互作用蛋白的这种体外交联研究是在非生理条件下进行的。即使是交联在细胞裂解液中，用去污剂溶解细胞膜也会破坏细胞内分区及蛋白质复合体，并可能会破坏蛋白质与膜及蛋白质与蛋白质之间的相互作用。
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在选择适当的交联方法时，目的蛋白的类型是一个重要的决定因素。例如，想要说明整合膜蛋白的相互作用最好选用体内交联方法，研究细胞因子受体之间的相互作用往往是在激活配体如干扰素存在的情况下将细胞表面受体交联（Nadeau et al.，1999b）。而胞浆内蛋白质之间相互作用的分析则体内体外方法均可使用，但如果蛋白质可以轻易大量纯化则通常选用体外方法。
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交联的步骤
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蛋白质作为交联反应物的作用
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交联技术只是对一般的蛋白质化学修饰的简单延伸，两种过程均靠经验，且受到多种可变因素的影响，包括反应物的浓度、反应时间、温度及pH。对交联程度及氨基酸侧链选择性的控制对于减少副产物的形成至关重要，因为交联过程是不停歇的过程，就是说产物的形成不断变化由单取代蛋白到交联蛋白，最终形成不可溶的高度交联的聚集体。该聚集体存在于反应混合物中不但造成技术难度，还降低了特异性交联的可能。即使在最适条件下，交联反应体系中仍然存在至少三种不同的共价修饰形式：单取代蛋白、分子内交联及分子间交联。除此以外还有图6.1A所示三种形式的组合。
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图6.1
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1.当蛋白质仅被交联剂中的一个活性基团修饰时，会形成单取代连接。余下的自由活性基团不与邻近的蛋白质侧链发生反应，因为它们不适合这种反应所需的空间定向，或因为第二个有活性的亲核多肽侧链恰巧不在附近，又或因为它们与溶剂或非蛋白溶质产生竞争性反应。
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2.当蛋白质或者交联剂的浓度较低，或交联剂的长度只能在同一蛋白质内，而不是邻近空间相邻侧链形成交联桥时，易形成单个多肽链的分子内交联。
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3.当交联剂的几何形状、化学性质、柔韧性、跨度均适合于共价连接两个分离蛋白的反应侧链时，会形成分子间交联。尽管需要反复筛选不同的交联剂及反应条件，以获得目的蛋白的分子间交联，但是对于典型的蛋白质交联实验中各组分本质的了解可以减少摸索最适反应条件的实验次数。
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4.作为反应物的蛋白质含有大量潜在的有活性的氨基酸侧链，它们可以被不同类型的化学交联剂选择性识别，在交联反应中，考虑到这一点是有益的。氨基酸侧链可以在大小、形状、极性、电荷以及亲核性上有所不同。根据疏水性，氨基酸可分为两类：（1）具有氢（甘氨酸）、脂肪族（丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸及脯氨酸），或者芳香族（苯丙氨酸和色氨酸）侧链的非极性氨基酸。（2）具有非电离侧链（天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸及苏氨酸）或可电离侧链（精氨酸、酪氨酸、赖氨酸、半胱氨酸、组氨酸、天冬氨酸和谷氨酸）的极性氨基酸残基。除了少数例外，均是第二类氨基酸中的亲核侧链参与交联。任何给定类型的侧链功能集团的反应活性都会受到它在蛋白质上定位的影响，即受它所在微环境的影响（可接近性、极性，与其他残基或溶剂的非共价相互作用等等）。例如，即使同在蛋白质表面，赖氨酸的伯胺基仍具有不同的反应活性。这些反应活性上的差异是交联反应必须被看成是一种经验方法的原因。
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pH的影响
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大部分交联反应就是亲核取代反应，其中，对亲核氨基酸侧链的攻击使一对电子转移至交联剂，造成了交联剂离去基团的直接取代并在交联剂与蛋白侧链间形成了共价键。所有这种亲核取代发生的反应速率依赖于交联剂的离去基团是否易被置换（即交联剂的化学本质）以及攻击侧链的亲核性。在蛋白质中发现的最有效的亲核侧链是R-S-，即阴离子的半胱氨酸去质子化硫酸盐。质子化会降低该基团及其他可电离的反应侧链作为电子对提供者的有效性，从而降低它们的亲核性。因此，pH是影响交联反应的可变因素中最重要的一个。
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Henderson-Hasselbalch方程预测一旦pH从其pKa上升两个单位，则去质子化侧链的百分比将从50%升至99%，它的反应活性也相应升高。尽管教科书上给出典型的侧链pKa值为我们提供了十分有用的参考，但任何给定的侧链功能基团的实际pKa值都和其反应性一样依赖于它的微环境。反应混合物的离子强度及温度也对pKa值有所影响。因此，pH必须作为经验因素加以考虑，以控制交联反应的速度、程度，以及最重要的交联反应的选择性。当交联反应过度时，会产生一些技术问题，特别是对于鉴定其中的蛋白组分，此时若降低反应的pH则可避免这种情况的发生。在优化反应条件时，要非常谨慎地选择一些不同的pH。
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交联剂的类型
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各种交联剂可以从公司购买，如Pierce化学公司、Sigma-Aldrich公司及分子探针（Molecular Probes）公司（表6.1）。可以购买到的最普通的化学交联剂是双功能试剂，即具有两种化学反应基团，可以与蛋白质靶的两条侧链发生反应从而形成交联复合体的化合物。交联剂中将这两个反应基团相连的部分称之为间隔段（spaces）或接合部（linker）。该间隔段除了确定这两个反应基团的距离外，还提供了其他重要的特征。例如，间隔段内含有二硫键这样的功能基团（如二硫键），就会对于还原剂产生的化学裂变异常敏感，这种化合物被称为可裂变交联剂。其他具有共价键的可裂变交联剂还可以被氧化剂或碱性化合物断裂。同时间隔段为分析交联剂的几何学参数及可溶性提供线索。具有相同或不同的反应基团的双功能交联剂分别被定义为同型双功能或异型双功能交联剂。异型双功能交联剂的优势在于可以用其不同功能的基团选择不同类型的亲核侧链，且可以使两步交联反应在不同的条件下单独进行。光活化交联剂是一种经常使用的异型双功能交联试剂，它同时具有化学反应基团及光反应基团，后者暴露于适当波长的光下即可被激活。
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表6.1 交联剂
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三功能交联剂是最新研制的一种试剂，含有呈三角分布的三个反应基团，三羟甲基磷化氢是其中的一种（表6.1），它的三个化学反应臂能与三个靶蛋白形成交联。还有一类不同的交联剂有时也被归为三功能交联剂，它只有两个可能产生交联的反应基团，此外还有一特异性配体用以亲和纯化交联的靶蛋白（Alley et al.，2000）。
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零距离交联剂组成了另外一类交联剂，这种交联剂可以激活靶蛋白侧链的功能性基团，无需插入任何外源间隔段即可在侧链间形成共价键，由此命名为零距离交联剂。碳二亚胺可能是应用最广泛的零距离交联剂，它激活羧基形成活化的酰化异脲中间体，继而被胺类修饰，于氨基与羧基间形成酰胺连接（即异肽键）。与碳二亚胺作用机制相似，氰也能将相互作用蛋白之间的盐桥赖氨酰基与酸性氨基酸共价连接（Simon and Day，2000）。由于氰是一种气体试剂，可以轻易穿过细胞膜，因此可以用于体内交联。转谷胺酰胺酶是一种酶促零距离交联剂，可以催化相互作用蛋白的谷胺酰基与赖氨酰基间的异肽键形成。
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位点特异性光交联剂是光不稳定性氨基酸的类似物，它可以通过定点诱变的方式在蛋白质上的特定位点取代天然氨基酸（Fischer et al.，2000）。被置换的蛋白与靶蛋白温育并通过照射促使定点交联。
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交联的特异性及选择性
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在这一章中，“特异性”的概念是针对通过交联检测到的蛋白质间可能发生的相互作用，而“选择性”则是指交联剂对某一种特定类型的氨基酸侧链的偏爱。特异性与选择性息息相关，因为选择性低的交联剂会造成大范围的修饰，因此也降低了其特异性。尽管交联剂的选择以它们反应功能基团对某种亲核物质的选择为基础（表6.1），但不能忽略的是，用于蛋白质化学修饰的试剂很少，有只针对所有蛋白中的一种氨基酸侧链绝对专一的。微环境对蛋白内某一特定亲核基团的影响，可以改变它的本质，使其看上去像另一类亲核基团。虽然如此，高选择性仍然可以通过改变反应时间、反应物的浓度、交联剂的类型以及反应体系的pH来经验性获得。选择合适的pH及交联剂对于整个实验的设计是统一的。例如，如果需要蛋白质内赖氨酰基的ε氨基作为化学修饰的首选，那么就要选择合适的pH以使这一部分亲核基团去质子化，并选择氨基的交联剂。当然，选择除氨基以外的侧链交联剂也有许多，如选择巯基的双马来酰亚胺和双卤代乙酰胺。还有一些选择蛋白糖基、辅基及其他组分的交联剂在几篇综述中有精彩的描述（Wong，1993；Hermanson，1996）。
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在用交联方法判断相互作用蛋白时，控制交联的特异性可能是最关键的可变因素之一。在一步交联反应中，所有的反应物都包括在一步反应内，在这种情况下，额外的交联极易发生，造成许多假阳性。如pH高于8的交联反应，易去质子化且激活蛋白表面许多亲核基团，使蛋白质像一个棉球一样，吸附交联剂结合并最终吸附反应过程中与其接触的溶质分子。当交联剂的浓度远远高于靶蛋白时，这种情况也会发生。反应条件的不同还可以改变蛋白质的天然结构，暴露出深埋于蛋白质内部的区域，从而与交联剂或反应体系中的其他组分产生非特异反应。同时交联剂毕竟是一种化学试剂，它也可能会改变蛋白质的高级结构，造成活性的丧失和聚集体的形成。用来将不溶的疏水性交联剂引入反应体系的载体溶剂也可以改变蛋白的结构并产生假阳性。温度和离子强度除了可以影响有机交联反应的速率外，还能进一步通过直接影响蛋白质间相互作用来改变交联的特异性。缓冲液的选择对交联的程度及特异性也有影响，如Tris缓冲液中含有游离的胺基，其他缓冲液含有不同的亲核基团，这些基团都能有效地与蛋白质的亲核侧链竞争交联剂，特别是在它们的浓度远远高于靶蛋白时。
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另外一个与交联反应特异性相关的问题是一些非特异性交联产物的存在，它们并非由假阳性产生，而是由真正相互作用蛋白之间过度交联而产生的。这样就产生了庞大而稳定的异源寡聚复合体，其中的每条多肽都可以直接或间接的与其他多肽相连接。这种非特异交联即使程度非常温和，对产物的分析及解释也会随加合物的增大而变得愈加困难。对于异源寡聚复合体来说，最大的挑战就是如何在实验中控制交联的程度。目前最容易分析和解释的交联加合物是双分子。
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利用异型双功能交联剂的反应基团的不同特性而产生的两步交联反应，可以用于提高交联的特异性。在这种反应过程中，首先感兴趣的纯化蛋白常常被光活化异型双功能交联剂的化学反应基团（如：马来亚胺基或琥珀酰亚胺基）修饰，过量的未共价连接的交联剂随即从被修饰蛋白中去除。在第二步里，这种单衍化的蛋白质与其可能的蛋白质相互作用在一起，暴露于激活波长的光波中以形成交联（Nadeu et al.，1999a）。这种采用光活化交联剂的两步交联方案如图6.1B所示。在第一步的化学修饰中另一种可替换方案是，将光不稳定性氨基酸类似物掺入多肽链内，产生一种蛋白质突变体（Fischer et al.，2000），其优势在于能够在精确的位置将结合成分插入蛋白，而不是随机选择。通过其他方法将选择分子位点的能力应用于蛋白质相互作用，可以显著提高交联的成功率及特异性。
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交联剂是由单功能化学修饰剂衍化而来，这种单功能化学修饰剂有时也称之为封闭剂，它们含有如表6.1所示的相同类型的反应基团。如果首先用单功能封闭剂对蛋白加以修饰就会减弱交联剂的作用，因其只选择性与特定的氨基酸侧链反应。例如，甲醛在NaCNBH3存在的情况下，选择性地和稳定地使赖氨酸的ε氨基甲基化，形成二甲基赖氨酸，与其母体形式比较还是一种弱亲核剂。因为甲基较小，而胺基上的电荷并未改变（Jentoft and Dearborn，1983），所以蛋白质的整体结构及活性保持不变。衍生蛋白上较不丰富的氨基酸（如半胱氨酸）上的亲核基团可作为靶点以促进特异性交联。另一种方法是将氨基酸侧链的反应基团变换成具有不同反应活性的另一种化学功能基团。例如，由硫醇转化为氨基可以通过乙烯亚胺或者溴化乙烯胺来实现，许多用于侧链功能基团转换的试剂都可以购买到（Wong，1993）。
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交联剂的溶解度是决定其靶蛋白类型的重要因素。疏水交联剂通常用于交联整合膜蛋白的跨膜区，或者寡聚复合物的疏水区（Sanders et al.，1992），非极性交联剂比极性水溶性交联剂更易与深埋于内部的反应侧链反应，由此它们也更易促进蛋白质的分子内交联。水溶性交联剂更倾向于与溶剂接触到的侧链反应，因而常用于可溶性胞浆蛋白的分子间交联。
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交联的特异性及间距（分子标尺及近邻法）
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侧链亲核体间的距离若大于交联剂的长度则无法被交联，故交联的特异性依赖于交联剂反应基团之间的距离。测定活性氨基酸残基间最大距离的基本方法，特别是在寡聚复合体中，是采用一系列同源的具有不同长度（分子标尺）的间隔段或几何形状的交联剂来加以测定（详细论述见Wong，1993）。在系列同源的分子标尺中只有保持交联剂活性基团的一致性，才能排除交联剂化学反应上的差异，从而简化对实验后果的解释。虽然如此，对于阴性结果（即不发生交联）的解释也要十分小心。用这种分子标尺方法确定的反应基团间的距离称为最大间距，因为距离小于交联剂伸展长度的反应基团也会由于交联剂可能的柔性而发生交联（Green et al.，2001）。蛋白的微动可能会使交联残基的间距测定更加复杂。
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近邻法是用来测定异源寡聚复合体中涉及亚基相对定位拓扑结构的一种方法，这种方法的基本前提是复合体中的蛋白质只有在相邻足够近以适应交联剂的跨度的时候才能发生交联。对多交联合成物中组分的鉴定可以推论出其拓扑结构模型。这种方法成功应用的最好实例是对30S核糖体亚基的作图（Lambert et al.，1983）。尽管在复合体中有多拷贝亚基时近邻法也可行，但若每种亚基只有单拷贝时则对于结果的解释会更容易。这种方法的一种变化是分析由底物或效应物诱发的寡聚体内亚基相互作用的变化，这可以通过亚单位交联模式的改变而检测。应用该变化方案，已经区别出十六寡聚体的磷酸化酶激酶复合体的不同激活状态（Nadeau et al.，1997a，b）。
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一般步骤
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样品制备
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对于体内实验来说，首先要确定用凝胶染色或免疫化学技术来检测目的蛋白所需细胞的数量（每毫升5000万～1亿个已足够）。此外，为了检测与过量表达蛋白发生交联的少量蛋白质，交联前可用mCi量的［35S］-甲硫氨酸对将要铺满的培养细胞进行标记。（De Gunzburg et al.，1989）。在加入交联剂之前，将细胞在磷酸缓冲液中（PBS）反复洗涤以除去所有细胞培养基，因为在细胞培养基中可能会存在一些能与交联剂反应的多肽或其他成分。
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对于体外实验来说，要将蛋白质在不可能与交联剂反应的缓冲液中溶解或透析至终浓度0.05～0.5mg/ml，pH达到7.5对最初的筛选是适宜的。
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筛选反应条件
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在将交联剂加入蛋白质样品时，如果交联剂是疏水性的，那首先要将其溶解于合适的溶剂中（如乙腈、丙酮或甲醇），但加入的量要少，以免在反应体系中溶剂的量过大（通常占反应总体积的1%，但一定要少于影响靶蛋白活性的量）。在不同的实验中，交联剂与蛋白质的分子比例可以按所需增额从10增至500。交联的时间可以从30min开始，温度及pH的影响也可以在相同条件下加以测定。一般来说，低于中性pH的交联更倾向于选择蛋白质巯基，而碱性条件下则包含了大量的定向于氨基的交联。
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交联的时间进程
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使用的交联剂与蛋白质浓度之间比例，应可以形成最大程度的目的交联，再进一步通过改变交联时间使反应优化。当然，由于反应物可能不稳定，要小心避免反应的时间过长。
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如果考虑到pH、温度、水解等因素对交联剂稳定性的影响，可以在不同的时间将交联剂以几等份分别加入反应体系以提高交联产量。因为实验的最终目的正常是在保持特异性的同时使形成的目的交联产物与消耗的反应物之间的比例最大化，也就是说，避免形成过多的非目的交联物或过大、过复杂的交联体。当用交联作为探针来检测寡聚复合体中效应物诱导的构象变化时，必须确定感兴趣的产物生成率在直线范围内变化，这样才能在观察其形成时看到其升高或降低（Nadeau et al.，1997a）。
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交联反应的灭活
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交联反应的最后一步是对交联剂的猝灭，也就是加入可以与交联剂反应基团相竞争的过量亲核试剂（如甘氨酸、Tris）或其他试剂以避免额外的蛋白质交联。可以用亲和层析、超滤或透析这样的技术从其他反应组分中纯化出蛋白质交联物，或者用去垢剂同时进行猝灭和变性。后种方法适用于通过SDS-PAGE或Western blotting对交联剂进行快速筛选。在PAGE中使用的典型的SDS样品缓冲液中含有可以扰乱蛋白质相互作用的变性剂SDS及两种可以与交联剂反应基团竞争的亲核试剂（Tris和β-巯基乙醇）。交联反应可以通过加入SDS样品缓冲液，涡旋震荡，并在90℃加热5min而迅速猝灭，还可以用三氯乙酸或其他沉淀剂（如聚乙二醇、硫酸铵等）沉淀蛋白而终止反应。在加入蛋白质沉淀剂时要加以注意，因为它们可能会促进残留的非特异交联，最好是在加入沉淀剂以前先加入交联的亲核性竞争剂。
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交联蛋白的纯化及检测
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可裂变交联剂
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含有不稳定键、交联后可以被化学裂变的双功能试剂被称为可裂变交联剂。两个可裂变部分是二硫键及邻二醇，它们通常被并入交联剂间隔段，前者通过硫醇发生还原反应而裂变，后者则通过高碘酸盐的氧化作用而发生裂变。在混合物中，将可裂变交联剂与二维电泳胶结合起来的对角线方法，可以鉴定复合物中接合成对的交联产物（Traut et al.，1989）。在与可裂变交联剂发生交联后，没有裂变剂存在下用SDS-PAGE分离蛋白质，从胶上切下垂直泳道，用裂变剂打开交联，然后将胶条水平放置于SDS-PAGE胶的顶部，使蛋白质在第二维胶上再根据质量加以分离。未交联蛋白质会按照分子量从高至低沿对角线迁移，每一个在交联加合物中存在并在一维方向被分离开的裂变单体便会根据其分子量不同，在对角线下方迁移不同距离。这种对角线方法尤其适用于分析含有大量蛋白质组分的复杂体系。
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标记的交联剂
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有两类可以参入交联剂中的标签有助于鉴定交联合成物，一类是包含可以被光谱法鉴别的基团，如荧光团（Kosower and Kosower，1995）、UV-VIS载色体（Sigrist et al.，1982）、自旋标记物（Gaffney et al.，1983）等，另一类报告基因包含放射性标记，如放射性的碘125常用10DOGEN（1，3，4，6-四氯-3α，6α-二苯基甘脲）参入至苯酚类交联剂（Fraker and Speck，1978），合成这种碘标记的交联剂所需的试剂可以购于皮尔斯化学公司。但在使用这种放射性标记交联剂时常遇到单取代的问题，即被标记的蛋白质未发生交联。
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标记转换技术可以在一定程度上减少由单取代产生的假阳性（综述见TRAUT et al.，1989；Fancy，2000）。首先将诱饵蛋白与可裂变、放射性标记的异型双功能光激活交联剂偶联（如表6.1中SHAD），继而从过量试剂中纯化标记蛋白，接下来加入靶蛋白并在光解作用下激活交联，使标记基团与相互作用靶蛋白共价结合。随后交联剂裂变释放出标记的配偶体，该配偶体可以通过对放射标记的跟踪加以纯化。
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在使用碘125标记的芳香基叠氮化合物（这一方法中最常用的光活化组之一）时会遇到许多困难。一旦激活，芳香基叠氮化合物会形成高反应活性的硝基苯化合物（nitrenes），据报道，硝基苯化合物（nitrenes）经过转化会形成氮杂草（azepine）和许多活性中间体（Li et al.，1998），最终通过某种机制导致放射性标记物的丢失（Watt et al.，1989）。将放射性标记与活性叠氮基团分离，会减少标记物的释放（Koch et al.，1994）。理论上，光诱导中间活性体的过渡活性也能够减少标记的转移，也就是说活性中间体的寿命一定要超过标记诱饵蛋白与靶蛋白相互作用的时间，以获得大量特异的分子间交联产物。相互作用蛋白之间暂时性的结合更倾向于探针与内源性诱饵蛋白残基的分子内交联，或者与溶剂发生反应形成单取代产物。
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从分子探针公司（Molecular Probes）购买的溴代烷基试剂Bromobimanes（见表6.1），会与蛋白质形成荧光标记的交联复合体。尽管不是自身内在的荧光化，但溴代烷基试剂Bromobimanes所含有的溴代烷基可以烷基化巯基从而形成荧光接合物。这种试剂有几种固有优势，首先，这种试剂对硫醇的选择性会使其对大量赖氨酰基ε氨基的亲核攻击敏感性降低，从而使交联的特异性增加；其次，这种试剂的稳定性能够显著降低它们与溶剂分子反应形成单取代蛋白的可能性；第三，只有交联才能形成荧光产物，这样大大简化了对产物的阐述与分析。
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亲和检测及交联蛋白的纯化
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最新研制的所谓三功能交联剂除包含双功能反应基团外，还含有共价连接的配体，可以通过亲和方法检测或纯化交联产物（Hermanson，1996）。在三功能交联剂中附加的亲和配体通常是生物素，它可以通过与链亲和素或亲和素结合而使结合物定向（Wedekind et al.，1989）。将反应混合物过链亲和素柱，再用生物素洗脱可以纯化交联物。分析型的上述方法可以用来筛选不同的交联条件，这时交联反应通常在小离心管中进行（终体积至50～300μl），交联后固定于胶上的链亲和素悬浮物直接加入交联混合物，在室温下温育并轻轻混匀，再经连续的洗涤离心除去非特异性结合的组分。沉淀物在SDS缓冲液中煮沸并在SDS-PAGE胶上分离，用蛋白染色或免疫化学检测。
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另一种相关方法最早由Ballmer-Hofer等提出（1982），是使用交联剂的特异性抗体。交联后，用交联剂的多克隆抗体通过免疫沉淀来分离接合物。用标记的交联剂时，单取代及分子内交联会使亲和检测及纯化更加复杂。
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交联残基的鉴定
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高效液相色谱（HPLC）法分析肽图谱
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鉴定蛋白质间交联区域的传统方法是肽图谱法。这项技术需要高效液相色谱的应用，如果组成交联物的蛋白较小且已纯化则成功率会提高。发生交联的肽段或直接由交联剂的特异特征来识别，或间接通过肽图谱的差异加以区分。在肽图谱中，已修饰肽段可根据它们不存在于消化的母体蛋白中，而被鉴定出来，它们以新的形式出现在交联产物的消化片断中。一些其他方法如二维电泳胶也应用于蛋白质CNBr消化产物的图谱分析（Dukan et al.，1998）并有可以用于检测交联蛋白的肽图谱。
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质谱法肽制图
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随着蛋白质组学的出现，通过质谱法（MS）进行快速的肽制图正在成为可供选择的方法，质谱法肽制图可以减少分析蛋白质消化片段的许多步骤，更重要的是，这种方法需要的样品量极少（通常仅需10-12摩尔的量）。其高灵敏度使来自胶条（Sechi and Chait，1998）或印迹（Binz et al.，1999）中单个分离点的交联产物也可以被基质辅助激光电离飞行时间质谱检测（MALDI-TOF-MS）（Bennett et al.，2000）。微孔HPLC及电喷雾电离质谱技术（ESI-MS）的联合应用可能是分析天然蛋白及修饰后蛋白消化片段的最有效方法（Kosaka et al.，2000）。肽段首先用微孔HPLC分离，继而将洗脱液的组分做质谱分析，直接判断多肽的质量。采用相同可裂变交联剂对待测蛋白的消化片段可以得到多肽的实验分子量，通过与其理论值加以比较即可确认这些多肽。现在有许多网站（ExPASy、SWISS-PROT、NCBI及其他数据库）含有搜索引擎及预测程序，可以获得用大量可裂变交联剂，如胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和CNBr消化产生的蛋白质理论多肽图谱。
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尽管以上方法可以简单应用于蛋白质的鉴定，许多更新更精确的直接鉴定交联多肽的技术仍不断涌现出来。如Chen等（1999）将同位素衍生物与电喷雾电离质谱结合起来组成分离交联多肽的通用技术。首先蛋白质可以与任何选定交联剂交联，为了防止它们与后来的交联剂发生反应，蛋白质赖氨酰胺的ε氨基基团在NaCNBH3存在的情况下被甲醛的还原性甲基化阻断。继而选择除赖氨酸基团之外的基团特异性蛋白酶将蛋白质水解，释放多肽的α氨基是仅存的游离氨基，它可以被等摩尔的同位素标记及未标记的二硝基氟苯（DNFB）修饰。单体肽只有一个α氨基靶，而交联肽含有两个α氨基靶，这样通过苯基柱的亲和层析就将已修饰肽段分为单DNP和双DNP成分，各种成分进一步用HPLC分离并用ESI-MS分析。交联多肽因其标记二硝基氟苯产生双取代而造成质谱特征被确定。如果有各种大量标记交联剂，还可以想像许多MS与标记技术相结合的技术。
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交联多肽的亲和纯化
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如“交联蛋白的亲和力检测及纯化”一节所述，三功能交联剂可以应用于交联蛋白的鉴定和纯化，不仅如此，它还可以确定发生交联的特异残基。亲和纯化后，由合适的试剂对交联蛋白进行消化，消化产物通过针对交联剂亲和配体的特异性柱子，洗脱后采用MS或气相测序鉴定交联多肽，也可使用针对特异交联剂的抗体。除了链亲和素或其他配体结合蛋白外，固定化的抗体也可纯化结合物和交联多肽。单取代在这些基于亲和力的方法中引入复杂性。
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7 研究蛋白质—蛋白质相互作用的酵母和细菌双杂交筛选系统
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前言
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酵母双杂交系统提供了一种研究蛋白质—蛋白质相互作用的有效工具。这种遗传学的方法基于在酵母中重新构建一种有功能的转录激活子（Fields and Song，1989），现在已经被广泛用于鉴定新的蛋白质—蛋白质相互作用和分析已知的相互作用。原始的双杂交系统经过许多改进，大大地扩展了用途（见Serebriiskii等人最近的综述，2001）。最近报道了一种与酵母双杂交类似的细菌遗传筛选系统（Dove et al.，1997；Dove and Hochschild，1998；Joung et al.，2000）。与酵母双杂交系统相比，以细菌为基础的系统有两个显著的优点：可以分析很大的文库（大小为＞108）；为不适合以酵母系统为基础的真核蛋白的分析（如自激活的诱饵、对酵母有毒性的蛋白或与内源酵母蛋白有不期望的相互作用的蛋白）提供了可替代的方法。总而言之，酵母和细菌双杂交系统为分析蛋白质—蛋白质相互作用提供了有效的方法。
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方案
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第一部分：一种基于转录激活的酵母双杂交系统
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阶段1：“诱饵”蛋白的构建和鉴定
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材料
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抗体
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抗LexA的单克隆抗体（CLONTECH）或抗LexA的多克隆抗体（Invitrogen）或抗靶蛋白融合结构域特异性的抗体（如果可以得到）。
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缓冲液和溶液
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分子克隆手册：蛋白质—蛋白质相互作用
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分子克隆手册：蛋白质—蛋白质相互作用
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分子克隆手册：蛋白质—蛋白质相互作用
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离心机和转头
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Sorvall GSA转头或同等转头
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Sorvall RT6000离心机和H10000B转头或同等离心机和转头
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酶和缓冲液
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限制性内切酶EcoRⅠ、XhoⅠ、HaeⅢ
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凝胶
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分子克隆手册：蛋白质—蛋白质相互作用
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培养基
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分子克隆手册：蛋白质—蛋白质相互作用
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核酸和寡核苷酸
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担体DNA
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分子克隆手册：蛋白质—蛋白质相互作用
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专用设备
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分子克隆手册：蛋白质—蛋白质相互作用
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载体和酵母菌株
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分子克隆手册：蛋白质—蛋白质相互作用
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方法
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检测诱饵蛋白的表达
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在鉴定诱饵蛋白时的一个重要的步骤是直接分析诱饵表达是否可检测到，以及诱饵的大小是否正确。在大多数情况下以上两项都符合要求；但是，一些诱饵蛋白（特别是当融合结构域是约60～80kD或更大的时候）合成的水平会很低，或者被酵母蛋白酶翻译后切割。两类结果都能导致文库筛选时产生问题。蛋白质低水平表达，在转录激活测定中表面上没有活性，但在亮氨酸缺陷的选择培养基上能被上调到很高的水平，突然表现出很高的转录激活背景。而蛋白质被蛋白酶水解切割，LexA仅和大的诱饵蛋白的氨基末端融合，这可能会不经意地用于筛选。用Western分析含有LexA融合诱饵的酵母裂解物有助于预期和避免这些可能的问题（见表7.2）。
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1.对新构建的测定诱饵和蛋白质表达的阳性对照如pEG202-Ras和/或pSH17-4，至少接种两个原始转化子。用一根无菌的牙签从Glu/CM-Ura-His主平板挑取菌落到Glu/CM-Ura-His液体培养基中。
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如果带手套操作牙签，可以将其丢到培养基试管中而不会有污染。
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2.在滚动桶（roller drum）或其他振荡器中30℃过夜培养。第二天早上，稀释饱和培养物到一个新的装有约2.5mlGlu/CM-Ura-His培养基的试管中，开始的浓度OD600约为0.2，再像以前一样继续培养。
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在主平板上标记好哪个菌落用作蛋白质表达测定，用已被测定并且正确表达诱饵的同一菌落作为起始细胞用于生长和文库引入。
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3.当培养物达到OD600约0.45～0.7（约4～6h）时，取出1.5ml到一个Eppendorf管中，微离心机上最高速离心细胞3～5min。沉淀可以看到时，倾倒出或吸出上清。
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对一些LexA融合蛋白达到饱和期后在培养基中蛋白质的水平下降的很快。这可能是由于在生长晚期ADH1启动子的活性减少和特殊的融合结构域相对不稳定共同造成的。因此让培养物达到饱和，期望获得高产量的蛋白质以供测定之用不一定是一种好的方法（虽然对某些蛋白质是奏效的）。如果打算做多次试验（或万一出现问题时），在这时冷冻几份样品或许会有所帮助。
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4.动作要快，加入50μl 2×Laemmli上样缓冲液到离心管中，涡旋，将离心管置于干冰上。此时样品可以冷冻到-70℃中，在一定的时期内是稳定的（至少4～6个月）。
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5.Western分析之前，准备聚丙烯酰胺凝胶电泳时（SDS-PAGE），从冰箱中取出样品直接放到沸水浴中或放到100℃加热块或PCR仪中。煮沸5min。
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6.冰上冷却，在微离心管中离心5～30s沉淀大的细胞碎片，每道上样约20～50μl。
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7.用标准的方法作PAGE、印迹和Western分析（Harlow and Lane1988；Sambrook et al.，1989；Sambrook and Russell 2001，Molecular Cloning）。用抗融合结构域的抗体（如果可以得到）能检测到LexA融合蛋白；另外可以用抗LexA的抗体（可从CLONTECH和Invitrogen公司买到）。最好用抗LexA的抗体，因为这样可以比较试验中诱饵蛋白和其他标准诱饵蛋白如LexA-Ras的表达水平。
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8.记下主平板上哪些菌落表达正确的诱饵，用其中的一个菌落作为起始菌扩大培养，生长用于文库的引入。
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此时所有可替代的诱饵表达载体上带有bla（AmpR）基因，因此转化到细菌中后应该用氨苄青霉素筛选。这样，在文库筛选后，研究者可能需要用KC8细菌传代，以在文库筛选后方便地分离文库质粒。
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疑难解决和诱饵的修饰
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在筛选之前可能遇到三个基本问题和可能的纠正办法如下：
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1.诱饵激活转录。有几种办法可以解决这个问题。其一是做一系列截短的蛋白质，试着去除激活结构域。如果诱饵像阳性对照一样转录激活很强，这一步就非常必要。
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如果诱饵有中等程度的激活，最简单的方法是用更不严谨的报告子质粒和菌株重新做对照实验（表7.2和表7.3），观察激活是否变轻了。另外强激活子蛋白质可以被截短。最后可以用整合形式的诱饵载体（表7.2），使蛋白质水平稳定减少。
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表7.3 在专门应用中可能增强诱饵性能的修饰方法
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表7.3 在专门应用中可能增强诱饵性能的修饰方法（续）-1
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如果诱饵是一个弱激活子，一个选择是用不严谨的报告质粒；另外研究者可以继续试验，假定可以区分低的背景假阳性。一般来说，用可能的最敏感筛选条件是个好办法；在一些情况下，用很严谨的相互作用菌株会检测不到生物学相关的相互作用（Estojak et al.，1995）。
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2.诱饵质粒产生的蛋白质水平或大小不正确。如果低水平表达的蛋白质非常大，最简单的方法是将其分为二或三个重叠的部分，每一部分可单独做试验。另外pJK202载体引入核定位序列，将会增加测定所需的在核中的诱饵浓度。这样的方法对于不容易高水平表达的蛋白质能达到最好的条件。
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3.含有诱饵质粒的转化子只有很少几个表达诱饵蛋白，或表达诱饵蛋白的酵母在缺乏选择性时比对照酵母生长明显差。这些结果提示诱饵蛋白对酵母有一定的毒性。因为毒性会造成文库筛选的困难，可将目的蛋白质重新克隆到pGilda上，该载体可从GAL1启动子诱导表达蛋白，因此在实际筛选中限制了蛋白质的表达时间。但是，要注意的是用pGilda作载体，在试验时应该在半乳糖为碳源的培养基上进行。
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推荐的能增强诱饵的性能的修饰方法总结如下（表7.3）。
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转化和鉴定文库
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当前可以得到的使用此系统的文库列表可在以下网址获得http：//www.fccc.edu/research/labs/golemis/InteractionTrapInWork.html。目前适用于相互作用陷阱最方便的文库来源是从公司购得，可以在提供这些试剂的公司网址上见到。以下列出的方法叙述了完成一次筛选的步骤，应该可以满足复杂的哺乳动物基因组来源的cDNA文库。筛选基因组复杂性较低的低等真核生物文库需要更少的平板，研究者应该相应地按比例缩小。
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因为在接下来的步骤中有一个计算假阳性频率的有用的对照，在大规模文库转化的同时，只用文库载体小规模转化交配菌株SKY473是有用的。当前作为最方便的方法，我们推荐用文库和目的诱饵交配（Finley and Brent，1994）。此方法的主要优点是如果研究者希望用同一文库来筛选多个诱饵，只需要一次大规模的转化，接下来是相对比较简单的交配步骤。另外当只筛选一个诱饵时，只稍微改动一下，此方法就能直接将文库转化到带有诱饵的酵母中。在后一种情况下文库的转化应该如同以下第二阶段一样，来代替交配方法。
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1.选择适当的交配伴侣酵母菌株的一个菌落（如SKY473），在约20ml液体YPD培养基中30℃振荡培养过夜。
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用一个新鲜的（从-70℃融化，提前划线到长出单菌落，要少于7d）菌落，并在所有以下步骤中保持无菌的条件非常重要。
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2.将约20ml过夜培养物稀释到大约300mlGlu/CM- Ura，-His缺陷培养基上，使稀释后培养基OD600约为0.15。在旋转摇床中，30℃培养到OD600约为0.50～0.70。
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3.转移培养物到无菌的6×50mlFalcon管中，1000～1500g室温离心5min。在约5ml无菌水中轻轻重悬沉淀，所有的液体合并到一个Falcon管中。加入无菌水到管顶部、混匀。
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4.1000～1500g重新离心细胞5min。将水倒出，重悬酵母到1.5mlTE缓冲液/0.1mol/L醋酸锂中。
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在接下来的方法中，另外用一个对照菌株和新的诱饵菌株交配是个较好的方法。对照菌株是用于文库的同一菌株（如SKY473），但带有无插入cDNA的文库载体。将步骤4的一份感受态酵母用于转化空的文库质粒（pJG4-5或pYesTrp2）。涂布到100mm平板上，收集转化细胞作为文库（方法在下面列出）。在液体培养基中对照菌株可以可靠地重新扩增。
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5.在一个Eppendorf管中混合30μg文库DNA和1.5mg新鲜变性担体DNA，然后将DNA混合物加到酵母中。轻轻混合，将DNA/酵母悬液等分到30个微离心管中（每管约60μl）。
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6.每个管中，加入300μl无菌的40%PEG 4000、0.1mol/L醋酸锂和TE缓冲液（pH7.5）。轻轻颠倒管几次混合（不要涡旋）。将离心管于30℃放置30～60min。
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7.每个管中加入约40μl DMSO，再次颠倒混匀。将管子在42℃的加热块中放置10min。
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8.将每管中的液体吸到24cm×24cm Glu-Trp缺陷培养基平板上。用12到24个无菌的玻璃珠均匀涂布细胞，倒置平板，30℃培养直到菌落出现（通常2～3d）。虽然涂布后能将玻璃珠扔掉，培养平板时将玻璃珠留到盖子上也是可以的并且是有用的；玻璃珠将被用来收获文库转化子（见下面）。
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9.选择几个有代表性的转化平板，在一个菌落平均分布的点上画一个23mm×23mm的正方形（平板底面积的1%），计数选择每个格子中的菌落，再核算所有转化子的数目。在此方法中，一个好的转化在每个大平板上应该长出约20000～40000个菌落，代表每微克文库DNA约105个转化子。
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分成一小份做转化减少了污染的可能性，并且比扩大的转化方法转化效率明显要高，原因不清楚。每份感受态酵母细胞不要用过多的转化文库DNA，否则每份感受态细胞可能会带有多个文库质粒，使随后的分析变复杂。用这里所述的条件，少于10%的酵母带有2个或更多的文库质粒。
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如果直接将文库转化到诱饵菌株中，以上的方法有几处修改：
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a.用已经鉴定的诱饵菌株代替天然的酵母。
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b.在步骤1和2中，在Glu/-Ura-His液体培养基中而不是YPD中生长菌株。
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c.在步骤8中，用Glu/-Ura-His-Trp平板代替Glu/-Trp。
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收集第一次转化细胞
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用来自第一次转化的细胞进行均匀分散，通过下述步骤形成混悬液。在用这些细胞和各个诱饵菌株交配前，先对其进行计数。
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1.观察所有的转化平板。如果在平板上可以观察到霉菌或其他污染（菌落颜色、形状等异常），在收获文库转化子前预先用一个无菌的保险刀片切去它们及其周围的区域。
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2.在5个24cm×24cm含有转化子的平板上，每个倒入10ml无菌水。如果需要，倒入无菌的玻璃珠。一个压一个将5个平板叠放在一起。抓紧，摇动一摞平板直到所有的菌落重悬起来（1～2min）。用无菌的移液器，从每个平板（倾斜平板）上收集5ml酵母悬液，倒入无菌的50ml圆锥形离心管中。继续做下五个平板。本步最终应该得到分布在3个50ml管中总体积为150ml的液体。
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可以转移玻璃珠到新的平板中或用新的玻璃珠。一次可以洗掉5个以上的平板（到手所能拿和摇动的数目）。好节拍的音乐也会有帮助。
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3.用无菌的TE缓冲液或水填满含有酵母的每个圆锥形的管，涡旋或颠倒重悬细胞。低速离心机上 1000～1500 g室温离心5min，丢弃上清。加入无菌的TE或水洗细胞。重悬细胞，室温1000～1500g离心5min，然后弃去上清。重复洗一次。
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在第二次洗以后，来自1.5×106转化子的细胞累积沉淀体积应为约25ml。
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4.重悬沉淀到1体积的甘油溶液中。把不同的Falcon管的液体放到一起混合均匀。分成1ml一份冻存于-70℃（这些样品至少在1年内稳定）下。如果直接作交配实验，留出一份不冻存，保证培养物的存活性为100%。
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如果文库直接转化到诱饵菌中，留出一份不冷冻，直接到第二阶段，筛选相互作用蛋白。
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再铺板效率的确定
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一般少于1年冻存的酵母的存活性将大于90%。但是再次冷冻一份融化的样品会导致存活性的丢失；因此应该做（特别是如果打算做交配实验）许多冷冻的等份（0.2～1.0ml）。在Glu/CM-Trp上（或作为直接文库转化用Glu/CM-Trp-His-Ura）做一系列有限稀释来确认存活率，用每毫升菌落形成单位数表示（cfu/ml）。
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阶段2：筛选相互作用蛋白
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诱饵菌株和预转化文库交配
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一旦诱饵菌株准备好了并已鉴定，文库菌株已经转化并按份冷冻，下一步是两种菌株交配。两种菌株交配，先在液体培养基中生长诱饵菌株，并与一份融化的预转化文库菌株混合。然后将混合物铺到YPD上生长过夜。在此期间诱饵菌株单个细胞和文库菌株单个细胞融合形成二倍体细胞。然后二倍体细胞和没有交配的单倍体细胞被收集并铺到培养基上筛选相互作用的蛋白质。实际中，二倍体/单倍体混合物通常被冻存几份，以便滴定和在不同稀释度重复铺平板。
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一般用新的诱饵菌株和一个对照菌株交配是个好方法。对照菌株和文库用的菌株一样，但是带有无cDNA插入的文库载体。在文库交配的同时，可以作与对照菌株的交配，在接下来的筛选相互作用蛋白步骤中两个交配处理的方法一样。此对照将清楚地估计不依赖cDNA的假阳性频率，在决定挑取和鉴定多少阳性时这个频率非常重要。
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1.从Glu/CM-Ura-His主平板上的诱饵菌株开始用30mlGlu/CM-Ura-His液体培养。30℃振荡培养到对数晚期（OD600=1.0～2.0）。
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2.1000g离心5min收集细胞。所有的操作可在室温下完成。重悬细胞沉淀到1ml无菌水中，转移到无菌的1.5ml微离心管中。测量1∶100稀释的一份悬液光学密度，保证未稀释的悬液OD600为30～50。相当于约1×109cfu/ml。
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3.在室温融化一份预先转化的文库菌株。混合200μl诱饵菌株和约108预转化的文库菌株细胞。同时混合诱饵菌株和同样数量只带有文库载体的细胞。分开处理：显然只需要筛选几个平板，因为目的不是获得呈现整个文库。
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4.1000g，5min离心细胞的混合物，弃上清。重悬细胞沉淀到200μl YPD培养基中。铺到一个直径100mm的YPD平板上，30℃培养12～15h。
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5.加1～2ml无菌水到YPD平板的表面，用无菌的玻璃珠摇动重悬细胞。转移到无菌收集管中，轻轻涡旋2min。1000g离心5min收集细胞，重悬到1体积无菌的甘油溶液中。分成200μl等份，冻存到-80℃。就像冻存预转化文库菌株一样，交配的酵母不应被反复冻融。只需要一份或几份来呈现文库；因此融化的等份在使用之后可以被丢弃。
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6.滴定交配的细胞，先融化一份并在Glu/CM-Trp-His-Ura平板上涂布系列稀释的细胞。未交配的单倍型细胞在此培养基上不生长。在生长2～3d后计数菌落，确定冻存的交配细胞的铺板效率。
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此次计数将基本表明交配的成功与否，要用多少平板才能得到全部呈现文库。例如在文库转化中已经得到了1×106个克隆。在实际筛选中，希望在选择平板上转化的每个原始菌落有3～10个独立的酵母细胞（解释见下面）。因此你必须在选择平板上铺总共约5×106二倍体细胞。如果你已经确定二倍体的效价是5×107cfu/ml，你必须铺约100μl悬液。但是铺板细胞总数要更高，因为交配的效率一般为1%～10%。从OD读数上能大致核算效价。实际上同样100μl含有5×106cfu/ml二倍体的悬液，将含有约1×108细胞。为避免互养，在一个90mm平板上只能放约106个细胞。因此要进行完全的文库筛选，需要铺大约50块平板（见下一个方法的注释）。
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我们推荐铺比转化获得的菌落数多3～10倍的二倍体，因为不是所有带有相互作用蛋白的细胞在-Leu 培养基上以100%效率铺板（Estojak et al.，1995），产生的悬液不可能是完全均匀的。这将导致在一些情况下多次分离同一cDNA；但是，所有原始转化子在选择平板上至少有一个细胞呈现的可能性将会增加，事实上，在一些相对少的阳性中反复分离到相同的cDNA可以被看做特异性的相互作用标志。
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筛选相互作用蛋白
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下一步把交配的细胞铺到缺亮氨酸的选择平板上，相互作用的蛋白质就会被筛选出来。知道有多少可存活的二倍体铺到选择平板上是很重要的，这样可以知道已经筛选了多少文库并确定假阳性的频率。上面步骤6中确定每单位体积冻存的交配细胞中可存活的二倍体数目，用cfu/ml表示。为了节省时间，用以下方法在筛选相互作用蛋白的同时可以做效价的测定。因为二倍体的效价将可能在108cfu/ml的数量级范围内，你可以在选择平板上铺板两个或三个不同的稀释度来筛选相互作用蛋白，同时如在上面步骤6中一样铺板稀释液确定精确的效价。
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1.融化一份交配的酵母（或含有pBait并直接转化了文库DNA的细胞），用Gal-Raff/CM -Ura、-His、-Trp缺陷培养基1∶100稀释。30℃振荡培养4～6h以诱导文库GAL1启动子。如果冻存的培养物前面没有测定效价，现在铺系列稀释液到Glu/CM -Ura -His -Trp平板上。同时处理含有诱饵和只有文库载体的交配酵母。
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2.在10个100mmGal/Raff/CM -Ura、-His、-Trp、-Leu缺陷平板上，每块平板铺约1×106个细胞（或OD600=1.0的50μl培养物）。对诱饵/文库载体的交配，只用1或2个平板。每块平板约106个细胞不是随机选择的。
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每块100mm平板铺细胞约106cfu对Leu+菌落最容易视觉观察。铺更高的浓度可能会造成酵母间的互养，导致假的背景生长。当然高浓度的铺板也大大减少了倒平板和接种的数量。根据诱饵的背景，在每块90mm平板上也可能用多达107cfu。因此我们建议，开始以两种不同的细胞密度铺交配的酵母，并比较结果。
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在另外10个100mm平板上每个铺约5×106个细胞。
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3.30℃培养平板5d。在此期间，好的阳性相互作用蛋白候选菌会产生菌落，这与所用的诱饵有关。最常见的菌落应该在铺板后2～4d出现。
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4.比较低浓度和高浓度接种的选择平板。菌落的数目大致和接种的浓度成比例。
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在浓的接种平板上没有背景的生长就是成功的。在高浓度接种的平板上看到很多不均衡的菌落（特别是位于薄菌苔上面），可能是由于互养产生的背景。在这种情况下另取一份冻存的交配物，重复诱导，每块平板铺1×106个细胞，并铺足够多的平板，以全部呈现计算的二倍体数目。
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最好每天观察平板，但是不一定立即挑出菌落。第一天的菌落可以用眼睛看到，用特定颜色的实验室记号笔点一个点标记它们的位置。每天用不同的颜色标记又长出的菌落（例如，3d=红色，4d=蓝色，等）。
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5.在5d时，根据出现的天数把菌落分类并挑到一个主平板上（Glu/CM -Ura -His -Trp）。
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如果出现大量明显的阳性，有必要把2d、3d、4d得到的菌落用不同的平板分开。最好在以后的步骤中用一个阴性对照，从一个存活力确定的平板上随机选择3～5个菌落，平行地接种到试验的主平板上。如果用多支管或蛙形器做随后的测定步骤，要保证成方格状，菌落对应蛙形器的辅条（图7.5）。
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如果在1周内没有菌落出现，以后出现的菌落可能是假阳性。在主平板的试验中，一个特定诱饵真正的相互作用倾向于在一个特定的时间出现，而假阳性在一个不同的时间点比较集中。因此按照生长日期预分类有利于决定首先分析哪些菌落。如果用影印技术，做另外一块Glu主平板是有用的。对照与空文库载体交配后，在Leu+平板上出现的cDNA不依赖的假阳性的数目应该是要挑取和鉴定的Leu+平板上的菌落数目的基础。假阳性频率越高，应该挑取更多的Leu+菌落以发现稀少的真正阳性。因为这一步真正阳性的频率是未知的，因此目标是从筛选的文库转化子数目中所预期的假阳性里挑取真正的阳性。例如文库转化子的数目是106，交配要多于这个数目来保证所有的106转化子以二倍体呈现，则目标是从106二倍体中预期的假阳性数目中挑选真正阳性。如果cDNA不依赖的假阳性频率是104cfu中有1个Leu+菌落，有必要在阳性频率是106cfu中有1个的Leu+平板上，挑取至少100个Leu+菌落来发现一个真正的阳性。
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如果早期步骤中有污染，一般反映在铺到选择培养基上24～48h后生长出大量的菌落（每块平板多于500）。与滴定平板比较平板味道和菌落形态（解剖显微镜会有帮助）。在后面的工作中，如果污染被确认为细菌（而不是真菌），一种选择是再做加四环素（15μg/ml）的选择性平板，重复文库的诱导和铺板。
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6.30℃培养直到菌斑或菌落形成。
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阳性相互作用的第一次确认
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以下步骤检测半乳糖依赖的lexAop-LEU2和lexAop-lacZ 报告基因的转录激活。以半乳糖特异的方式同时激活两个报告基因，一般表明转录的表型是由于文库编码的蛋白表达，而不是来自于酵母的突变。β-半乳糖苷酶的活性和Leu的需求的试验已在前面第一阶段描述，见构建和鉴定诱饵蛋白。
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1.在实验台上倒置复制器或蛙形器。然后把主平板倒置放在辅条上，保证正确对准辅条和菌落。抬起平板，把蛙形器插入到每孔含有50～75μl无菌水的微滴定板中。让装置放置5～10min，不时摇动重悬留在辅条上的细胞。当所有的细胞都重悬起来后，复印（如在诱饵鉴定方法中所述）到下列平板上。
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从微滴定板上转移酵母到以下每块平板上：
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Glu/CM-Ura-His-Trp 2
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Gal/Raff//CM-Ura-His-Trp 1
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Glu/CM-Ura-His-Trp-Leu 1
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Gal/Raff/CM-Ura-His-Trp-Leu 1
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2.30℃培养3～4d。在1d培养后，拿出所有的三个-Ura -His -Trp平板。其中一个Glu/CM -Ura -His -Trp可以保存为新鲜的主平板，第二个应该和Gal/Raf/CM -Ura -His -Trp平板一起用于β-半乳糖苷酶测定。继续观察生长状况。在-Ura-His-Trp-Leu平板上48～72h对亮氨酸的差示生长一般比较明显。
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3.原始候选菌落表型的解释在表7.4中给出。
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表7.4 原始候选菌落表型的说明
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此时，如果在Gal/Raf/CM平板上培养后X-Gal分析显示蓝色，但在Glu/CM平板上是白色或轻微的蓝色，并且在Gal/Raff/CM -Ura -His -Trp -Leu平板上生长，但在Glu/CM -Ura -His -Trp -Leu平板上不生长，那么菌落和它们含有的文库质粒被暂时当作阳性。
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极少数情况下，如果相互作用的亲和力很高，在酵母中两个蛋白质都稳定，在葡萄糖和在半乳糖培养基上，生长和X-Gal活性都将有微弱的增强。这是因为在葡萄糖培养基上从GAL1启动子很低水平的转录可以积累足够水平的强相互作用的稳定AD融合蛋白，相互作用就可以被检测到。
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在一些情况下，将观察到强烈激活两个lexAop 报告基因中的一个，但只是轻微激活另一个。一些诱饵—相互作用子的组合明显倾向于激活lacZ而不是LEU2，或者相反（Estojak et al.，1995）。在确定这些相互作用是否为真的时候要注意，一般这样的相互作用的可信度水平显著低于强激活两个报告基因的相互作用（特别是在缺亮氨酸的培养基上可以观察到强的生长，但事实上用X-Gal观察不到蓝色的情况下）。是否继续，由研究者决定。
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分离文库质粒的插入片段，阳性相互作用的第二次确认
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不同的诱饵得到的阳性数有极大的不同。随后怎么处理取决于开始得到的数目和每个研究者的喜好。如果得到的数量相当少（1～48），可以按照下面详细介绍的步骤来做。但是，有时研究将产生大量的菌落（50～300或更多）。在这种情况下有不同的选择。
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第一种选择是，把大多数的阳性菌落存入仓库，而处理一开始出现的24～48个阳性菌落，因为通过观察发现，生长最快的菌落经常含有最强的相互作用蛋白。这些菌落可以用于检查相互作用的特异性；也就是除了原始的诱饵外结合其他不相关的诱饵的能力。同时，能用限制酶切消化来确定它们是否都是独立的cDNA或代表有限数目cDNAs的多个独立菌落。如果前者是正确的，建议用不敏感的菌株/质粒背景重复筛选，因为获得许多不同的相互作用子可能表示一种低亲和力的非特异性的背景。第二种选择是，处理大量的阳性菌落以获得独立的相互作用子的全面图谱。采用的方法依赖于研究者的目的和资源。
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如果PCR和自动化的测序很容易得到和实施，下面所述的方法非常有用。在这些条件下，此方法使特异性检验所需的文库分离的数目达到最少，节约了时间（因此减少了Escherichia coli和酵母转化的数量）。这个方法在许多实验室中已经成功地应用，逐渐取代了老的方法。老的方法着重于在测序前完全鉴定诱饵—文库蛋白质相互作用的特异性。
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最后，在一些情况下，一个特定的诱饵没有得到阳性。可能有几条原因。一是文库资源不适合或筛选的菌落数目不够。二是事实上诱饵不和任何一个伴侣蛋白有足以检测到的亲和力（Estojak et al.，1995）。三是因为不受欢迎的剪切或与融合结构域的空间相互作用使诱饵不具有天然的构象；或因为融合蛋白的一部分隐蔽了该蛋白质，使诱饵不能和lexA 操纵子很好的相互作用（Golemis and Brent，1992）。有时可以修改诱饵和筛选的条件来获得相互作用子；但是，一些诱饵就是不出现相互作用子。研究者必须决定要付出多少精力。
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1.从Glu/CM-Ura-His-Trp主平板开始，用多菌落的复制器/蛙形器重悬酵母到一个含25μl β-葡糖醛酸糖苷酶溶液的96孔微滴定板的孔中（与第一次确认阳性相互作用同一技术，步骤1）。用胶带封住孔，在一个水平的振荡器上37℃温育1.5～3.5h。
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另外，用移液器头或牙签也能把酵母转移到孔中（大约一个中等大小酵母菌落的体积，或2～3μl压紧的沉淀）。不要取得太多，否则分离的DNA的质量就会受影响。主平板不一定是绝对新鲜的，4℃存放5d的平板曾被成功地使用。在本步中消解酶替代β-葡糖醛酸糖苷酶的效果也很好。
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2.去掉胶带，在每孔中加入约25μl玻璃珠（150～212μm；如Sigma G-1145），再次封住。把微滴定板和平顶面的涡旋器绑到一起（例如用橡皮筋），剧烈混合5min。
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3.在每个孔中加入100μl无菌蒸馏水。取1～2μl作每个PCR模板。用胶带再次封住滴定板，将剩余的部分置于-70℃。
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在许多情况下，即使没有β-葡糖醛酸糖苷酶处理也能从酵母菌落直接得到PCR产物（例如在PCR开始的程序中引入一个94℃10min的步骤）。但是，此方法（步骤3）中得到的粗酵母裂解液也能用作质粒DNA的来源（用1～5μl电击转化到E.coli 中），用于取代更费时的方法（使这种更完全的制备值得去做）。
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4.用下列程序在约30μl体积做PCR扩增：
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94℃2min94℃45s56℃45s72℃45s 35个循环用
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分子克隆手册：蛋白质—蛋白质相互作用
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对于JG4-5质粒： 正向引物（FP1）5'-CTG AGT GGA GAT GCC TCC反向引物（FP2）5'-CTG GCA AGG TAG ACA AGC CG
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此方法经修改，延长了延伸时间，也可以很好地工作；但是以上的方法曾扩增出质量较好的长达1.8kb的片段。pYesTrp2质粒的扩增引物可从Invitrogen公司得到。
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为了解释PCR的结果，下列对照模板是有用的：
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a.空的文库质粒（约0.1ng）。
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b.阳性对照菌落的酵母，和以上实验的菌落一起处理。
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c.同样量的文库质粒和阳性对照酵母混合到一起。
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可能的PCR结果的解释总结在表7.5中。
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表7.5 PCR结果的解释
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5.取10μl PCR产物用HaeⅢ消化，在0.7%琼脂糖凝胶上分析其余的PCR产物（约20μl）。区分似乎是同样大小的片段；HaeⅢ消化后这些片段应该并排跑胶。把胶放到冰箱中直到准备分离DNA片段。
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6.使用HaeⅢ限制酶切消化10μl PCR产物，总体积为20μl。为了将明显相似的克隆分组，根据未消化PCR得到的结果重排上样的顺序，将消化的产物用1.5%的琼脂糖凝胶分离。DNA电泳应走足够的距离使得在200～1000bp大小范围内DNA产物有好的分辨率。
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一般将区别明显的插入片段分类，确定是否多次分离获得一小部分cDNAs。如上面提及，很少有一个酵母中含有两个或更多的不同的文库质粒。如果有，通过PCR可以立即得到验证；因此，在细菌转化后，应该检查多个克隆以避免丢失真正的相互作用子。
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7.用标准的分子生物学技术从琼脂糖凝胶上纯化未消化的片段。在获得一小部分cDNAs分离物的大部分后，研究者可以直接对PCR产物进行测序。
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本步得到的PCR产物不仅将用于测序，而且用于第二次确认相互作用（见下面的方法）。为得到足够的PCR产物，必要的时候重新扩增。
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只有正向的引物FP1在测序PCR片段时能够可靠地工作；反向的引物只在纯化的质粒测序时才有效。一般在pJG4-5载体上多克隆位点下游ADH终止子序列富含TA，使其难于在此区域设计高质量的引物。
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阶段3：特异性的检验
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材料
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质粒和PCR产物
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分子克隆手册：蛋白质—蛋白质相互作用
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方法
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1.用两种酶消化空文库质粒在多克隆位点区产生不匹配末端（例如EcoR I和Xho I消化JG4-5质粒）。保证限制酶切位点在引物位点所包含的区域内。
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2.如前面一样用FP1和FP2引物以pJG4-5-Raf1为对照质粒做PCR，然后纯化PCR产物。
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3.用以下质粒转化含有pEG202-Ras和pMW109的SKY48：
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a.消化的文库质粒（50～100ng）
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b.消化的文库质粒（50～100ng）和Raf1对照PCR产物（0.5～1μg）
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c.未切的文库质粒（50～100ng）
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保存消化的文库质粒和Raf1 PCR产物用于13步。
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4.将转化物铺到Glu/CM-Ura、-His、-Trp缺陷的培养基平板上，30℃培养直到菌落长出（2～3d）。存放到4℃下。
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此对照实验表示文库质粒消化的程度。用消化的空文库质粒转化（a）的菌落的背景水平应该是最低的。在背景高的情况下，通过延长消化温育的时间或增加限制性酶的浓度来保证完全而不是部分消化空文库质粒。
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当共转化后，从Raf1 PCR产物经PCR扩增的cDNA片段和消化的文库质粒在体内发生同源重组高达97%，同源重组的转化子同时需要载体和插入片段。这是由于cDNA PCR片段和质粒在引物位点处是一样的。如果在b中的转化效率比a高5～20倍，可以继续下一步。c是转化的阳性对照。
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5.用消化的文库载体和选择的PCR产物（如在步骤3a中同样的比例）转化以下菌株：
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含有pMW109 的SKY48和：
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a.pBait
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b.pEG202-Ras
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c.另一个诱饵
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同时，将消化的文库质粒和Raf1对照PCR产物转化到含有pMW109和a～c的SKY48中。
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用于筛选的诱饵对自身有弱的转录活性时，建议选择对自身能弱转录激活的非特异性的对照诱饵以便对转录激活背景水平有比较。强烈建议采用这个对照，因为有转录激活能力的诱饵一般在假阳性背景上会遇到更大的困难。
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6.将每个转化混合物铺到Glu/CM -Ura、-His、-Trp缺陷平板上，30℃下培养直到菌落长出（2～3d）。
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7.为每个试验的文库质粒准备一个主平板。每个平板应该含有a～c中各至少10个菌落，菌落含有PCR插入片段/消化质粒。
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8.检测β-半乳糖苷酶活性和对亮氨酸的需求，如在上面阳性相互作用的第一次确定中所述。真正的阳性和a表现Leu+LacZ+表型，但是和b、c不表现。用Raf对照PCR转化的克隆将提供阳性和阴性对照：测定β-半乳糖苷酶活性和在-Leu平板上生长情况时，a和c应该是阴性而b应该是阳性。
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9.继续测序和生物学鉴定。因为此步骤后将离开用双杂交系统的工作，可能因为需要存档而回收酵母质粒（对所有随后的克隆步骤，PCR产物就足够了）。可以转化选定的阳性到E.coli 中，要用2～4μl β-葡糖醛酸糖苷酶处理的冻存的酵母（来自快速筛选相互作用陷阱阳性的方法）。强烈推荐用电穿孔方法。酵母质粒的分离有许多商品化的试剂盒（如CLONTECH，Zymo Research），或用老的酚－氯仿的技术。以上方法的主要优点在于在分离质粒和细菌转化前将先鉴定出多余的克隆，在一些情况下大大减少了工作量。但是应该精确记录每一类cDNA得到了多少克隆；如果不明白一个特别的cDNA是否为一个系列中的一部分或者是独特的，研究者应该注意以免犯错。
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已经编译了一个常见的假阳性的数据库，在万维网上可以得到http：//www.fccc.edu/research/labs/golemis/InteractionTrapInWork.html。对于只分离到一次的cDNA或以开始的诱饵背景来看似乎没有生物学意义，咨询数据库保证此克隆没有被多个其他工作组报道可能会有所帮助。
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第二部分：一种基于转录激活的细菌双杂交系统
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鉴定蛋白质—蛋白质相互作用
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要用细菌双杂交系统鉴定蛋白质—蛋白质相互作用，可以将诱饵蛋白和一个识别弱启动子附近DNA位点的DNA结合蛋白（如λcI蛋白）融合，从而把它限制在弱启动子附近。正像酵母双杂交系统一样，理论上与诱饵相互作用的蛋白质能从融合到RNAP亚单位（如α亚单位）的候选文库中鉴定出来。要注意诱饵和猎物可以反过来放；也就是能把诱饵融合到RNAP亚单位上和做一个融合到DNA结合结构域上的猎物文库。最好把诱饵融合到DNA结合结构域，因为容易估计融合蛋白的稳定性和活性（见方法）；相比之下，目前还没有检验RNAP融合蛋白稳定性和活性的方法。
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鉴定蛋白质—DNA相互作用
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蛋白质—DNA相互作用也能用细菌双杂交系统鉴定。如图7.7所示，在此系统的应用中，“诱饵”是位于弱启动子附近的目的DNA结合位点。然后通过两种方法之一鉴定结合到诱饵DNA结合位点的猎物DNA结合结构域。第一种方法是，猎物文库融合到一个恒定的蛋白质X上，然后与连接到RNAP（双杂交方法）亚单位的蛋白质Y相互作用。另外一种方法是，猎物DNA结合结构域的一个文库被直接融合到RNAP的一个亚单位上（单杂交方法）。两种方法都能通过猎物DNA结合结构域和诱饵DNA结合位点产生的相互作用把RNAP招募到弱启动子上，激活转录。在单杂交和双杂交结构中，原核生物（Dove et al.，1997）和真核生物（Joung et al.，2000；J.K.Joung and C.O.Pabo，未发表）DNA结合结构域都能激活转录。
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图7.7 用细菌双杂交系统鉴定蛋白质—DNA相互作用
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细菌双杂交系统的选择标记基因
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在以激活为基础的细菌双杂交系统中，从文库中鉴定想要的相互作用伴侣使用了两种不同的选择性标记基因：
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1.酵母HIS3基因（Pabo及同事）。带有hisB基因缺失的E.coli细胞在没有组氨酸的培养基上不生长（His缺陷培养基）。在这样的细胞中能用酵母的HIS3基因作为选择性标记，因为HIS3的表达互补了hisB缺失，使E.coli 在His缺陷的培养基上生长（Struhl et al.，1976；Struhl and Davis，1977）。在培养基中改变3-氨基三唑（3-AT）〈！〉的浓度很容易升高或降低选择的严格程度，3-AT是一种HIS3酶的竞争性抑制剂（Brennan and Struhl，1980）。选择性的HIS3系统的两个性质使它在从很大的文库中（>108）发现稀有的候选菌时很有用：它表现低自发背景频率（用20mmol/L 3-AT 约3×10-8反跳菌落）（Joung et al.，2000），一个245mm×245mm的琼脂平板上能铺约109个候选菌。此系统曾成功地用于从一个大的随机文库中鉴定改变了DNA结合特异性的锌指变异体（Joung et al.，2000）。
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2.β-内酰胺酶（bla）基因（Hochschild，Greenberg et al.）。此系统用氨苄青霉素抗性基因β-内酰胺酶（bla）做选择性标记。此系统有高反跳频率（约2×10-6）（Shaywitz et al.，2000）和每块平板铺板不能多于106个转化子的能力限制它只能用于分析较小的文库。但是，准备bla系统的培养基比HIS3系统中组氨酸缺陷培养基要简单。Hochschild、Greenberg和其同事曾用此选择系统鉴定出了一个CREB结合蛋白（CBP）突变体，该突变体增加了对CRE结合蛋白（CREB）的亲和力（Shaywitz et al.，2000）。
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虽然HIS3选择系统已用于鉴定蛋白质—DNA相互作用并且bla 系统已被用于鉴定一个改变的蛋白质—蛋白质相互作用，两个系统之间显著的不同在于所用的选择性报告基因。理论上，无论用哪一个选择系统来研究蛋白质—DNA和蛋白质—蛋白质相互作用都可以。决定用哪一个选择系统的主要考虑应该是所分析文库的大小。要分析很大文库的实验（如随机肽文库、靶向突变或随机蛋白质文库，或来自cDNA文库的稀少的候选菌）应该用HIS3系统，而小文库的实验用哪一个选择系统都可以。
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两个选择系统另一个主要的区别是有不同的第二个报告基因。如图7.8所示，两个选择系统报告菌株带有和第一个选择性标记（HIS3或bla）同顺反方向的第二个报告基因。第二个报告基因能提供一种快速的验证开始筛选得到的可能为阳性克隆的方法。HIS3系统带有选择性细菌的aadA基因（带有对抗生素链霉素和壮观霉素的抗性），bla系统带有β-半乳糖苷酶基因（lacZ）。lacZ报告基因的一个优点是它的表达能定量测量，因此比较容易估计可能的阳性活性的数量级。第二个报告基因的不同性质可能影响人们对系统的选择。
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图7.8 不同的细菌双杂交筛选系统的报告基因
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以下部分提供了用HIS3选择系统或bla选择系统分析蛋白质—蛋白质相互作用的细菌双杂交详细方法。两个选择系统都成功用于从随机和/或突变文库中分离目的候选蛋白。虽然这些系统没有被用于从cDNA文库中分离相互作用蛋白，但这些方法应该能用于此目的。
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阶段1详细介绍了含有诱饵融合蛋白的选择性菌株的构建和鉴定的方法。阶段2叙述了把一个猎物融合蛋白文库引入到选择性菌株的方法和筛选的操作步骤。最后，阶段3详细介绍了从筛选中得到的可能阳性的其他实验验证。图7.9所示的流程图给出了不同阶段的概况和每一步估计的时间框架。
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图7.9 细菌双杂交系统流程图
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阶段1：带有“诱饵”的筛选菌株的构建
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材料
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缓冲液和溶液
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分子克隆手册：蛋白质—蛋白质相互作用
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培养基
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分子克隆手册：蛋白质—蛋白质相互作用
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LB/T/K平板——带有四环素和卡那霉素的LB平板
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LB/T/C/K平板——带有四环素、氯霉素和卡那霉素的LB平板
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LB/T/C/K/I平板——带有四环素、氯霉素、卡那霉素和IPTG的LB平板
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LB/T/C/K/I/XG平板——带有四环素、氯霉素、卡那霉素、IPTG、X-Gal和苯乙基-β-D-硫代-半乳糖苷的LB平板。NM琼脂平板
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配500ml平板，高压蒸汽灭菌含有7.5g Bacto琼脂和一个搅拌棒的418mlddH2O。让琼脂冷却到65～70℃，然后加入与液体NM培养基同样的基本成分（预混合）：并根据需要加抗生素、IPTG和3-AT。NM/K平板——带有卡那霉素的NM平板NM/K/5mmol/L 3-AT平板——带有卡那霉素和5mmol/L 3-AT的NM平板
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特殊平板添加物浓度见表7.6。
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表7.6 用于琼脂平板的抗生素和其他添加物浓度
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专用设备
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无菌牙签。
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载体和细菌菌株
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见表7.7至表7.9。
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方法
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构建一种诱饵λcI融合蛋白
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1.将编码诱饵的DNA插入到编码λcI的表达载体pBT的多克隆位点处，产生诱饵-λcI融合蛋白。在诱饵序列的末端应该按读框引入一个翻译终止密码。此质粒在本方法中被看作pBait。
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鉴定DNA结合和激活活性：噬菌体免疫和lacZ 表达试验
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2～6步测试在细胞中诱饵-λcI融合蛋白特异性结合λcI DNA结合位点（DNA结合试验）和从弱报告启动子处的自身激活转录的能力（激活试验）。检查DNA结合能力是必要的，因为如果融合蛋白不能与它特异结合位点结合，则它不适合于筛选。另外，自激活的诱饵融合蛋白不能用于筛选。
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用噬菌体免疫试验检查DNA结合能力。检测表达诱饵λcI融合蛋白的细胞对λcI-噬菌体超感染的免疫性。融合蛋白能结合到λcI结合位点，那么表达这种蛋白质的细胞应该抵抗λcI-噬菌体的感染和裂解。
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通过测定lacZ基因报告蛋白的表达来检查诱饵蛋白的自身转录激活活性，lacZ 基因的表达是由其上游一个带有λcI-结合位点的弱启动子引导的。理想的融合蛋白在没有RNAP-猎物融合蛋白的时候应不能激活lacZ 的表达。
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表7.7 细菌双杂交系统的融合蛋白表达载体
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表7.8 细菌菌株和噬菌体
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表7.9 细菌噬菌体
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2.用以下质粒组合进行双转化Bacteriomatch报告菌株：
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a.pBait+pTRG（用于激活和抑制试验）
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b.pBT-LGF2+pTRG-Gal11P（激活和抑制的阳性对照）
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c.pAC-UV5+pTRG（激活和抑制的阴性对照）
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3.每组转化物涂布到LB/T/C/K平板上并在37℃下培养12～18h。
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4.噬菌体免疫试验（DNA结合），用约100μl高滴度的λcI－噬菌体划一条线到一个LB/T/C/K/I平板的中心，使其干燥。从步骤2中每种转化平板挑取至少两个独立菌落用于免疫挑战。用一根无菌的牙签取菌落，然后从平板的一边开始拖动牙签垂直穿过噬菌体线。37℃培养平板16～18h。
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阳性对照细胞应该穿过噬菌体线生长，而阴性对照细胞生长艰难，只能长到噬菌体线。一个期望得到的诱饵应该类似于阳性对照细胞的表型。
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5.转录激活试验
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a.从每种转化物中（步骤2）挑两个独立菌落，重悬到100μl LB培养基中。
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b.用LB培养基以1∶10稀释每种重悬液两次（亦即稀释到10-2）。
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c.点5μl每种重悬液和稀释液到LB/T/C/K/I/XG平板上。37℃培养16～18h。
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d.检查每种转化物完全分离菌落的颜色。阳性对照应该产生蓝色菌落，阴性对照应该产生白色或淡蓝色菌落，期望的诱饵融合蛋白的细胞应该和阴性对照类似。
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带有非期望特征的诱饵的解决方法
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·如果一个诱饵没有免疫性，考虑增加（或减少）用于试验平板的IPTG浓度。另外考虑加长在λcI和诱饵之间的接头。用从Invitrogen买到的cI抗体通过Western blot也能检测诱饵蛋白的表达。
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·如果一个诱饵有免疫性但是自身能激活启动子，考虑融合诱饵到RNAPα亚单位来代替（见下面可替代的方法）。
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构建含有诱饵的选择性菌株
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6.如果获得了合适的诱饵，转化pBait质粒到Bacteriomatch菌株中（如果用bla 选择）或到菌株KJ1567中（如果用HIS3选择），铺到LB/C/K平板上。37℃培养16～18h（对于Bacteriomatch报告菌株）或12～14h（对于KJ1567菌株）。
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7.用bla 选择系统，制备含有pBait的Bacteriomatch报告细胞感受态，冻存这些细胞到-80℃。如果用HIS3选择系统，用直接来自转化平板的细胞继续；但是如果在继续到下一步前有长于1周的延迟，含有pBait的KJ1567菌株细胞应该以冷冻甘油贮液存放于-80℃。
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可替代的方法
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诱饵和RNA聚合酶α亚单位融合
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在特定的情况下，可能期望诱饵蛋白和RNAPα亚单位融合（例如当融合到λcI DNA结合蛋白时诱饵能自激活）。但是不像融合到λcI上一样，诱饵和RNAPα亚单位的融合蛋白不容易检测稳定性和功能，也不能检查和RNAP复合体的结合。惟一能做的试验是保证诱饵融合蛋白不能假性地从报告基因启动子处引起转录增加。
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方法
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构建α诱饵融合蛋白
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1.将诱饵编码DNA插入到一个编码α表达载体的多克隆位点上。如果用bla 系统，用质粒pTRG；如果用HIS3系统，则用质粒pKJ1323来产生α-诱饵融合蛋白。在诱饵序列的末端应该按读框引入一个翻译终止密码。在这个方法中此质粒被看作pαBait。
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α诱饵融合蛋白激活活性试验
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2.用以下质粒转化Bacteriomatch报告菌株：
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a.HIS3系统：pαBait + pTRG
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bla 系统：pαBait + pBT（用于假的诱饵激活试验）
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b.pAC-UV5 + pTRG（激活的阴性对照）
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c.pBT-LGF2 + pTRG-Gal11P（激活的阳性对照）
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3.铺每种转化物到LB/T/C/K平板上，37℃培养12～18h。
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4.转录激活试验：
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a.从每种转化物中（步骤2）挑两个独立菌落，重悬到100μl LB培养基中。
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b.用LB培养基以1∶100比例稀释每种重悬液（如通过两次1∶10稀释）。
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c.点5μl每种重悬液和稀释液到LB/T/C/K/I/XG平板上。37℃培养16～18h。
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d.检查每种转化物完全分离菌落的颜色。阳性对照应该产生蓝色菌落，阴性对照应该产生白色或淡蓝色菌落，期望的诱饵融合蛋白的细胞应该和阴性对照类似。
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5.期望的α-诱饵融合蛋白应该不引起假的转录激活。
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构建含有α诱饵的选择性菌株
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6.如果用HIS3选择系统，用pαBait质粒转化菌株KJ1567，铺到LB/C/K平板上。37℃培养12～14h。直接用来自这种转化平板的细胞继续下面的实验；但是如果在进行下一步前有超过1周的延迟，细胞应该以冷冻甘油贮存液存放于-80℃。
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7.如果用bla 选择系统，用pαBait质粒转化Bacteriomatch报告细胞，铺到LB/T/K平板上。37℃培养16～18h。在进行下一步前，制备转化Bacteriomatch报告细胞感受态，冻存于-80℃下。
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阶段2：将文库引入筛选菌株细胞，筛选可能的相互作用蛋白
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材料
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缓冲液和溶液
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分子克隆手册：蛋白质—蛋白质相互作用
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核酸和寡核苷酸
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分子克隆手册：蛋白质—蛋白质相互作用
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培养基
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LB/C平板——带有氯霉素的LB平板〈！〉
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LB/C/C/K平板——带有羧苄青霉素（100μg/ml）、氯霉素和卡那霉素LB平板
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LB/C/C/K/I平板——带有羧苄青霉素（100μg/ml）、氯霉素、卡那霉素和IPTG的LB平板〈！〉
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LB/C/K平板——带有氯霉素和卡那霉素的LB平板
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LB/T平板——带有四环素的LB平板
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LB/T/C平板——带有四环素和氯霉素的LB平板
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LB/T/C/K平板——带有四环素、氯霉素和卡那霉素的LB平板
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LB/T/C/K/C平板——带有四环素、氯霉素、卡那霉素和羧苄青霉素（250～1000μg/ml）的LB平板
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LB/T/C/K/C/XG平板——带有四环素、氯霉素、卡那霉素、羧苄青霉素（250～1000μg/ml）、X-Gal和苯乙基-β-D硫代半乳糖苷的LB平板
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NM/C/C/K/I/20mmol/L 3-AT——带有羧苄青霉素（100μg/ml）、氯霉素、卡那霉素、IPTG和20mmol/L 3-AT的NM平板
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2×YT液体培养基（配方见Sambrook and Russell，2001，Molecular Cloning，p.A2.4）
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专用设备
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培养平板（245mm×245mm）
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玻璃珠
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微滴定板（96孔）
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多道的微量移液器
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载体和细菌菌株
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见表7.6至表7.9。
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方法
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构建和扩增猎物融合蛋白文库
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1.建一个猎物融合蛋白文库，克隆编码猎物的插入片段到：
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a.pTRG质粒（用于bla 系统和诱饵融合到λcI的蛋白质—蛋白质实验）
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或
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b.pBR-UV5-αLP噬菌粒（用于HIS3系统和诱饵融合到λcI的蛋白质—蛋白质实验）
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或
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c.pBR-UV5-λcILP噬菌粒（用于HIS3系统和诱饵融合到RNAPα亚单位的蛋白质—蛋白质实验）
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或
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d.pBT质粒（用于bla 系统和诱饵融合到RNAPα亚单位的蛋白质—蛋白质实验）。
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2.扩增文库
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适用于用HIS3选择的文库：
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a.用电穿孔法文库连接物转化到一个高转化效率F+克隆菌株（例如XL-1 Blue，Stratagene）。此菌株应该对卡那霉素敏感（可以选择被辅助噬菌体感染的细胞；见下面），并且在F'菌株上有一个选择性的抗生素标记。
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b.收集电击转化物，让细胞在2×YT中，37℃振荡1h以恢复正常（用10×收集的转化物体积）。
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c.用2×YT 1∶10比例稀释一小份转化细胞至少8次（到10-8）。做3个稀释的重复。在一个96孔滴定板中，用一个多道移液器用小的100μl体积（稀释10μl的样品到90μl YT中）很容易操作。取每个稀释液5μl，共3次点到：
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LB/T/C平板上（估计转化子的数目）；
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LB/C/K平板上（对照；应该不产生任何菌落）。
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这些效价代表了扩增前文库的大小。
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d.接种其余的转化细胞到加四环素（用于选择F'）和羧苄青霉素（用于选择文库质粒）的2×YT（用10×回收细胞培养物的体积）中。37℃振荡培养2h。
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e.用2×YT 1∶10倍比稀释一小份转化细胞至少8次（到10-8）。做3个平行稀释。取每个稀释液5μl，共3次点到：
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LB/T/C平板上（估计扩增的转化子的数目）；
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LB/C/K平板上（对照；应该不产生任何菌落）。
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37℃培养平板16～18h。
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f.离心其余的扩增培养基沉淀细胞。用加15%甘油（V/V）的2×YT（用1/100扩增培养基体积）重悬细胞沉淀。分成至少4份，在干冰/乙醇浴中冷冻。存放于-80℃。
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g.从步骤b中在LB/T/C平板上的菌落数确定转化效率估计文库的大小。通过比较步骤d和步骤b中在LB/T/C平板上的菌落数估计扩增倍数。典型的扩增是4～8倍。确定在步骤d和步骤b中在LB/C/K平板上没有菌落长出。
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h.融化一或更多份在步骤f中冷冻的扩增细胞。根据计算的效价用足够的细胞，至少是原始文库大小的3倍。加入融化的细胞到加羧苄青霉素和四环素的2×YT中（用10×体积的融化细胞）。37℃振荡培养1h。
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i.用辅助噬菌体（M13KO7或VCS-M13）感染细胞，感染复数（moi）>100∶1。加入噬菌体，把培养物混合好，让培养物在室温下不振荡放置30min，使噬菌体被细胞吸收。
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j.37℃振荡培养物1.5h。让辅助噬菌体基因组上的卡那霉素抗性基因表达。
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k.加终浓度为70μg/ml的卡那霉素到培养物中。卡那霉素的存在保证只有噬菌体感染的细胞才能生长。让噬菌体培养物在37℃下生长18h，或者可以在30℃下生长24h。
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辅助噬菌体感染的培养物生长时，产生了单链形式的文库质粒（由于在质粒上有一个f1噬菌体复制起点），并被包装为感染性的M13颗粒。通过简单的让噬菌体颗粒感染受体细胞，噬菌体中的质粒能被重新引入到任何F+细胞中。单链的质粒被受体细胞转换成双链的质粒，然后再次像一个质粒一样开始复制。因此，用这些“假噬菌体”简单的感染提供了一种用包装的质粒转化受体细胞的方法。
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l.收获噬菌体文库，离心两次沉淀细胞，保留上清（含有噬菌体）。
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m.通过如下方法定量在噬菌体贮存液中的氨苄青霉素转导单位（ATUs）以确定噬菌体文库的效价：
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i.用2×YT 1∶10倍比稀释噬菌体贮存液至少8次（亦即稀释到10-8）（可在一个微滴定板中方便地完成）。
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ii.在微滴定板的孔中加10μl每种稀释液到50μl XL-Blue（或其他F+，氨苄青霉素敏感的菌株）的过夜培养物中。在室温下不振荡放置10～15min让噬菌体吸收。
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iii.加入190μl 2×YT到每个孔中，37℃静置2h。
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iv.5μl每种感染物（亦即总共15μl）点到LB/T/C平板上，重复3次。让斑干燥，37℃培养16～18h。
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v.通过计数在原始的噬菌体贮存液中氨苄青霉素抗性菌落计算ATUs。
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n.在噬菌体贮存液中ATU浓度应该足够高，以使预期的候选数目能在500μl或更少的贮存液中得到。如果不然，应该用PEG沉淀的方法浓缩噬菌体。
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i.加入4体积的噬菌体贮存物到1体积的5×PEG/NaCl溶液中。
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ii.放到冰上，保温＞2h。
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iii.6000g离心40min。
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iv.弃上清，一般噬菌体在离心管或瓶的边上出现一个大的沉淀。用小体积的含有15%甘油的2×YT重悬沉淀。
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o.同步骤m，滴定浓缩的噬菌体文库贮存液。
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p.分装噬菌体文库，在冷冻管中冷冻于-80℃下。
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可替代的步骤：适用于用bla选择系统的文库（可选择的）
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a.用文库连接物转化（电穿孔或化学转化法）一个标准的克隆菌株（如XL-1 Blue MR［Stra-tagene］或DH5［GIBCO BRL］）。
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b.用LB培养基1∶10倍比稀释一小份转化物至少6次（到10-6）。做三个稀释的重复。在一个96孔滴定板中，用一个多道移液器用100μl的小体积（稀释10μl的样品到90μl LB中）很容易操作。取每个稀释液5μl 共3次点到：
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LB/T平板上（用于基于pTRG质粒的文库）；
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LB/C平板上（用于基于pBT质粒的文库）。
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c.把其余的转化物涂布到大的：
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||
LB/T平板上（用于基于pTRG质粒的文库）；
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LB/C平板上（用于基于pBT质粒的文库）。
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d.37℃培养所有的平板18～24h。
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e.从倍比稀释的平板菌落计数来计算文库大小。
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f.从大的平板上把细胞刮到液体LB培养基中收获细菌。
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g.用商业购买的碱裂解小量制备试剂盒分离一半细胞重悬液的质粒DNA。此DNA为扩增的文库，将用于随后筛选菌株的转化。
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h.加入终浓度为15%的甘油到剩余的一半细胞悬液中，冻存于-80℃。
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文库引入筛选细胞并进行筛选
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3.把文库引入到阶段1中制备的选择菌株中，如下：
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HIS3选择系统：
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a.用10ml加氯霉素、卡那霉素和50μmol/L IPTG的NM培养基接种第一阶段的选择性菌株。用一个125ml的烧瓶，37℃下轻轻振荡（125～150r/min）20～24h。
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b.检查选择性菌株培养物的光密度（600nm）。饱和的培养物的OD600应该大于2.5。
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c.将5ml选择性菌株的培养物转移到一个无菌的125ml烧瓶中，然后加入在步骤2中准备的噬菌体文库。能在细胞中加入高达109ATUs。
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i.短暂旋动培养物混合噬菌体和细胞，让培养物在室温下静置25～30min。在此期间噬菌体吸收到细胞中。
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ii.加入20ml有氯霉素、卡那霉素和50μmol/L IPTG的NM培养基（至少预热到室温）。37℃轻轻振荡（125～150r/min）1.5h，让氨苄青霉素抗性基因和进来的质粒上编码的猎物融合蛋白表达。
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iii.转移培养物到一个无菌的50ml圆锥形管中，在一个桌上离心机上，2000g室温离心30min。
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iv.把培养基倒尽，用2.5ml有氯霉素、卡那霉素和50μmol/L IPTG的NM培养基重悬细胞沉淀。
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d.用NM培养基以1∶10稀释一小份转导细胞至少8次（到10-8）。做3个稀释的重复。取每个稀释液5μl 共3次点到（亦即总共15μl）：LB/ C/K平板上（估计细胞总数）；LB/C/C/K平板上（估计转导细胞的数目）；NM/C/C/K/I平板（估计能在His缺陷的培养基上生长的转导细胞的数目）；37℃培养平板16～18h。
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e.把剩余的转导细胞放到一个NM/C/C/K/I/20mmol/L 3-AT平板上。（在一个245mm×245mm平板上能铺高达109个转导子。）加入约12个无菌玻璃珠，轻轻摇动（不要振荡）使细胞均匀分布到平板上。使其在空气中干燥，倒置，37℃下培养24h，然后在室温下放12h。
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f.计数从步骤h生长在滴定板上的菌落，验证铺到选择平板上的带有猎物质粒的转导细胞总数。注意铺板的细胞总数（转导和不转导的）应该超过铺板的转导细胞数5倍。此比例保证大多数的细胞转导/感染了只有一个猎物质粒。
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g.观察3-AT选择平板上菌落的出现。
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i.如果铺了足够的候选数，但是在选择平板上没有菌落出现，用低浓度的3-AT（低到5mmol/L）重做筛选。但是注意用低浓度的3-AT背景菌落的出现就会增加。
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ii.如果在选择平板上有太多候选出现，用高浓度的3-AT重做筛选（高到40mmol/L）。但是应该注意，高于30mmol/L浓度的3-AT可能降低阳性候选的铺板效率。
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h.第一次确证试验时，立刻检验生长在选择平板上的菌落（步骤4）。
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bla 选择系统：
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最好首先做小量转化确定选择细胞的文库转化效率。
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a.用0.1μg步骤1的文库连接物或步骤2的扩增文库转化在阶段1中的化学感受态选择菌株细胞。
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b.用LB培养基以1∶10稀释一小份转化物至少8次（亦即稀释到10-8）。5μl每个稀释液3次（亦即总共15μl）点到LB/T/ C/K上。让斑干燥，30℃过夜培养。
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c.从b步的滴定平板上，计算转化物中含有猎物质粒的细胞数。
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接下来，扩大转化规模筛选。
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d.用足够的文库以获得期望数目的转化子，然后转化选择菌株细胞。取出一小份转化物，与步骤b一样比例稀释，铺板。把剩余的转化物铺到含有250μg/ml羧苄青霉素的LB/T/C/K平板上。在一个100mm琼脂平板上不应放超过约105个转化子。
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e.30℃培养18～24h。培养不要超过24h。
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f.观察滴定平板，保证铺了足够的猎物质粒转化细胞。也观察羧苄青霉素选择平板上菌落的出现。
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i.如果铺了足够的候选，但在选择平板上没有菌落出现，可用低浓度的羧苄青霉素（低到150μg/ml）重做筛选。
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||
ii.如果在选择平板上出现了太多的候选，可用高浓度的羧苄青霉素（高到1000μg/ml）重做筛选。但是应该注意，高于250μg/ml浓度的羧苄青霉素会减少阳性候选的铺板效率。不过，用高浓度的羧苄青霉素可以铺板更多的候选。
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g.第一次确证试验时立刻检验生长在选择平板的菌落（步骤4）。
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阳性相互作用的首次确证：第二个报告基因活性的检测
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||
验证步骤3中可能的阳性菌落的一个快速的方法是检查选择菌株中第二个报告基因的表达。由于从弱启动子转录增加，真正的阳性应该表现第二个报告基因表达的增加。步骤4详细介绍了怎样评定aadA表达的增加（HIS3选择菌株）或lacZ表达的增加（bla选择菌株）。
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4.第二个报告基因表达增加的测定
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aadA基因（HIS3选择系统）：
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a.直接从选择平板上挑取可能的阳性菌落，重悬到含有100μl NM培养基的一个微滴定板孔中。
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b.用NM培养基以1∶10稀释每个菌落悬液两次（亦即到10-2）。
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c.取5μl每种重悬液和稀释液点到以下平板上：
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NM/C/C/K/I/20mmol/L 3-AT（再次确证生长）；
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NM/C/C/K/I/20mmol/L 3-AT/50μg/ml壮观霉素（检查aadA 表达）。
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d.37℃培养平板24h。观察平板上的生长情况。如果必要，让平板在室温下再培养12～18h。如果在壮观霉素平板上没有候选长出，考虑用低浓度的壮观霉素在平板上重铺板步骤b中的稀释液。
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||
e.在壮观霉素平板上生长的菌落被看作第一轮阳性，转入第三阶段进一步分析。此平板可作为这些候选的主平板。
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lacZ基因（bla选择系统）：
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||
a.直接从选择平板上挑取可能的阳性菌落，重悬到含有100μl LB培养基的一个微滴定板孔中。
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b.用LB培养基以1∶10稀释每个菌落悬液两次（亦即到10-2）。
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c.取5μl每种重悬液和稀释液点到以下平板上：LB/T/C/K/C（再次确证生长）；LB/T/C/K/C/XG（检查lacZ 表达的增加）。
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d.作为阴性对照，也按比例稀释和点第一阶段得到的含有pTRG质粒的选择菌株。
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e.37℃培养平板12～18h。
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f.观察平板。检查每个候选中完全分离的菌落的颜色并与阴性对照中完全分离菌落的颜色比较。期望的候选应该比阴性对照更蓝。这些候选应该转入阶段3进一步分析。
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阶段3：可能的阳性相互作用候选蛋白的再次确证
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材料
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缓冲液和溶液
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分子克隆手册：蛋白质—蛋白质相互作用
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培养基
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LB琼脂平板（配方见Sambrook and Russell，2001，Molecular Cloning，pA2.5配方
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）LB/C平板——带有氯霉素的LB平板〈！〉
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LB/Carb平板——带有100μg/ml羧苄青霉素的LB平板
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LB/C/C/K/I平板——带有羧苄青霉素（100μg/ml）、氯霉素、卡那霉素和IPTG的LB平板〈！〉
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LB/T平板——带有四环素的LB平板LB/T/C/K平板——带有四环素、氯霉素和卡那霉素的LB平板
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液体LB培养基（见Sambrook and Russell，2001，Molecular Cloning，pA2.2配方）
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||
NM液体培养基（见阶段1）
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||
NM琼脂糖平板（见阶段1）
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||
NM/C/C/K/I/20mmol/L 3-AT——带有羧苄青霉素（100μg/ml）、氯霉素、卡那霉素、IPTG和20mmol/L 3-AT的NM平板
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||
专门平板的添加物的浓度见表7.6。
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||
载体和细菌菌株
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见附表。
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方法
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分离阳性质粒
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1.从可能的阳性候选中分离纯化猎物质粒。
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a.每个可能的候选，从阶段2中的主平板上接种一个良好分离的菌落到2ml含有100μg/ml羧苄青霉素的LB（如果用HIS3选择）或到含有15μg/ml四环素的LB中（如果用bla 选择）。37℃摇动生长12h。
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b.用标准的小量制备分离方法从1.5ml过夜培养物中分离质粒DNA。终体积100μl重悬或洗脱DNA。
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||
此方法分离的质粒DNA不仅含有猎物质粒而且含有诱饵质粒。因此有必要进行另一轮的转化来从诱饵中分离猎物。
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||
c.用1μl b步的DNA转化一个不抗羧苄青霉素或四环素的标准克隆菌株（如XL1-Blue MR［Stratagene］）。用96孔板做转化很容易。取1/20 转化物点到一个LB/Carb（HIS3选择）或LB/T（bla 选择）平板上。37℃培养16～18h。
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d.从每个转化中挑取两个菌落，并点到：
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LB/C和一个LB/Carb平板（如果用HIS3选择）；
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LB/C和一个LB/T平板（如果用bla 选择）。
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让斑在37℃生长6～8h。
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e.只含有猎物质粒的转化子应该在氯霉素平板上不能生长（LB/C）。对每个转化，从d步中LB/Carb或LB/T平板的斑上满足上述标准的候选中挑取一个，接种到10ml添加了100μg/ml羧苄青霉素的LB培养基中（如果用HIS3选择）或添加了15μg/ml四环素的LB培养基（如果用bla 选择）中。37℃摇动生长16～18h。
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||
f.用标准的商品化的碱裂解或柱纯化的方法从10ml培养物中分离质粒。用低拷贝质粒的方法，做所有的特别的洗涤步骤。
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g.此DNA是纯化的猎物质粒。
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阳性相互作用的第二次确证：连锁试验
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2.用1μl纯化的猎物质粒转化第一阶段构建的选择菌株细胞。
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||
3.用NM（如果从HIS3选择中分离）或LB（如果从bla 选择中分离）培养基以1∶10稀释每种转化物两次（亦即到10-2）。
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4.取5μl每种转化物及其稀释液点到指示平板上。
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a.用HIS3系统筛选的候选：
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NM/C/C/K/I平板（转化的阳性对照）；
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NM/C/C/K/I/20mmol/L 3-AT平板（连锁试验）。
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37℃培养18～24h。
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b.用bla 系统筛选的候选：
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LB/T/C/K平板（转化的阳性对照）；
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添加250μg/ml羧苄青霉素的LB/T/C/K平板（连锁试验）。
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37℃培养12～18h。
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5.分析平板上的生长。在选择培养基上再次生长的候选应该将其猎物插入片段测序（用在1g步骤中分离得到的纯化猎物质粒DNA）。
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可选步骤：阳性候选的特异性试验
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在猎物编码的质粒测序之前，可以做另一个试验，检查在双杂交测定中候选猎物和诱饵相互作用的特异性。通过测定缺乏诱饵融合蛋白时是否猎物能激活弱启动子报告基因来完成。
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6.特异性试验的操作如下：
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用HIS3系统筛选的候选
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a.用以下质粒组合双转化菌株KJ1567：
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i.猎物候选质粒 + pBT（特异性试验）；
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ii.猎物候选质粒 + pBait（特异性试验-阳性对照）；
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iii.pBR-αGal4 + pACλcI-Gal11P（阳性对照）。
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b.用NM培养基以1∶10稀释每种转化物两次（亦即到10-2）。
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c.在指示平板上点5μl每种转化物及其稀释物。
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NM/C/C/K/I平板（验证转化效率）；
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NM/C/C/K/I/20mmol/L 3-AT平板（检查报告基因的激活）；
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37℃培养18～24h。
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d.分析平板上的生长。只有诱饵融合蛋白存在时在选择培养基上生长的候选可能编码和诱饵特异相互作用的猎物。
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用bla系统筛选的候选
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a.用以下质粒组合双转化Bacteriomatch报告菌株：
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i.猎物候选质粒 + pBT（特异性试验）；
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ii.猎物候选质粒 + pBait（特异性试验-阳性对照）；
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iii.pTRG-Gal11P + pBT-LGF2（阳性对照）。
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b.用LB培养基以1∶10稀释每种转化物两次（亦即到10-2）。
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c.在指示平板上点5μl每种转化物及其稀释物：
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LB/T/C/K平板（验证转化效率）；
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含有250μg/ml羧苄青霉素的LB/T/C/K平板（检查报告基因的激活）；
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37℃培养18～24h。
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d.分析平板上的生长。只有诱饵融合蛋白存在时在选择培养基上生长的候选可能编码和诱饵专一相互作用的猎物。
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7.其他阳性分离克隆的鉴定，请见以上酵母双杂交部分以后的鉴定的讨论。
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其他方法：用于蛋白质—DNA相互作用
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本部分提供了一个用细菌双杂交系统研究蛋白质—DNA相互作用的方法的概述。此类型实验的目的是从文库中鉴定特异性结合目的DNA位点（诱饵）的蛋白质（猎物）。这里所述的方法采用HIS3选择系统和含有酵母Gal11P和Gal4蛋白质片段的两个融合蛋白，已知Gal11P和Gal4能发生相互作用（Farrell等，1996）。Gal4片段融合到RNAPα亚单位，Gal11P片段融合到一个猎物蛋白的文库。在此结构中，如果一个猎物融合蛋白结合诱饵DNA结合位点，通过Gal11P-Gal4的相互作用RNAP被招募到弱启动子上。此方法以前用于筛选鉴定有新特异性的DNA结合蛋白质（Joung et al.，2000）。虽然这里没有叙述，理论上讲也能用bla 筛选系统或单融合蛋白质（单杂交）的方法（猎物直接融合到RNAPα上）。
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构建诱饵报告菌株
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1.目的DNA位点（诱饵）位于弱启动子的上游，控制选定的报告基因表达。经修饰的报告基因在这里被看作“诱饵报告基因”。用细菌交配的方法将诱饵报告基因引入△hisB 菌株KJ1C。
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完成该实验的方法技术细节超出了本章的范围；但是，读者可参考提供更多信息的文献（Whipple，1998；Joung et al.，2000）。
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诱饵报告基因激活的试验
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在把诱饵DNA序列引入到弱启动子上游后，检查这些新序列不影响启动子的基础转录。要比较从新的诱饵报告基因和从没有上游诱饵DNA序列的报告基因的HIS3的表达水平。通过检查在缺His培养基上细胞的生长可以检测HIS3的表达。如果HIS3的水平没有降低或升高，新的诱饵报告基因适用于筛选实验。
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2.接种KJ1567（对照）和带有诱饵报告基因的KJ1C菌株到3ml加了卡那霉素（50μg/ml）的NM培养基中，37℃生长16～18h。
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3.用NM培养基以1∶10稀释每种培养物8次（亦即稀释到10-8）。
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4.每种培养物取5μl 10-3～10-8稀释液点到NM/K和NM/K/5mmol/L 3-AT平板上。让斑点干燥，37℃培养12～18h。
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5.用单个分离很好的菌落鉴定稀释的斑点，记录生长。KJ1567应该表达足够的HIS3，在没有3-AT的NM平板上可以生长，但是在有5mmol/L 3-AT的NM平板上应该不能生长。在两种类型的平板上带有诱饵报告基因的KJ1C菌株的生长模式应该与KJ1567相似。
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构建带有诱饵报告基因的选择性菌株
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6.用pACL-αGal4质粒转化带有诱饵报告基因的菌株KJ1C，铺LB/C/K平板。直接用转化平板上的细胞继续试验；但是，如果在继续试验前延迟的时间超过1周，细胞应该用冷冻的甘油贮存液保存到-80℃。
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从本步开始往前，用以上第二阶段和第三阶段中详述的同一HIS3系统操作方法（用于蛋白质—蛋白质相互作用）。有一点不同是在做猎物融合蛋白文库时，编码猎物的插入片段应该克隆到噬菌粒pJK1514上（见表中）。
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致谢
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我们感谢Scot Wolfe、Jeff Miller和Matt Rhoades对文稿有帮助的意见；感谢Jessica Hurt和Elizabeth Ramm在构建细菌双杂交质粒和菌株时具专业性的帮助；Carl Pabo提供的资源、支持和鼓励；以及Ann Hochschild、Simon Dove（哈佛医学院）和Bonnie Wu（Stratagene）为bla 选择方法提供的意见和方案。
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参考文献
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