序
一、多糖：β-葡聚糖、低聚木糖
（一）β-葡聚糖
Effect of Long-term Administration of Dietary β-1，3-glucan on Growth，Physiological and Immune Responses inLitopenaeus vannamei（Boone，1931）
Introduction
二、谷胱甘肽、核苷酸
（一）谷胱甘肽
Dietary Glutathione as an Antioxidant Improves Resistance to Ammonia Exposure in Litopenaeus vannamei
Acknowledgments
This work was supported by the National Science Foundation of Guangdong Province，China （05006223） and partly by the Norwegian Research Council （SIP project number 173534/I30）.
26 references omitted.
Keywords：ammonia，glutathione，hepatopancreas，innate immune system，Litopenaeus vannamei，resistance
A Mitochondrial Model to Evaluate Endogenous Peroxidation in Litopenaeus vannamei：an in vitro Tool to Research Cellular Mechanisms of Antioxidants
The Israeli Journal of Aquaculture-Bamidgeh，2010，62（4）：288-29s6
饲料中添加谷胱甘肽对凡纳滨对虾肝胰腺抗氧化指标和脂质过氧化物含量的影响
1 材料与方法
1.1 试验饲料
以酪蛋白、明胶为蛋白源，鱼油和豆油为脂肪源，玉米淀粉为主要糖原配制基础饲料（表1），向基础饲料（对照组G0）中分别添加60、120、180、240和3000mg/kg谷胱甘肽（GSH）配制成5种试验饲料，分别称为试验G60、G120、G180、G240和G300组。GSH购自AMRESCO公司，纯度>98.0%。饲料原料经过60目粉碎，混合均匀后用SLX—80型双螺杆挤压机制成直径为1.2mm的饲料，在45℃烘干冷却后放入密封袋中于-15℃冰箱中保存待用。
Table 1 Formulation and nutrition composition of the basal diet%
1.2 试验虾及饲养管理
凡纳滨对虾由中山大学珠海基地提供，试验开始前在循环水养殖系统中驯养2周，期间投喂基础饲料，饱食投喂，每天2次。试验开始前，停止投喂1d，然后将始均重为每尾（1.12±0.01g）的虾随机分箱，每个水族箱放入30尾，每种饲料设4个平行。每天按体重的8%（以饲料干物质计算）投料，投喂时间为7：00、12：00、16：00和20：00，每次投喂量为总量的30%、20%、20%和30%。观察对虾健康状况，记录死亡情况，每3周称一次体重，根据体重调整投喂量。养殖水源为天然海水用自来水稀释后，经砂滤，消毒，试验期间盐度5～8，水温25～30℃。养殖过程中不断充氧曝气，溶解氧（7.25±0.56）mg/L，氨氮（0.17±0.06）mg/L，亚硝酸氮（0.018±0.008）mg/L，pH（7.95±0.04）。试验进行8周，于2004年9月4日至10月30日在广东省农业科学院畜牧所水产研究室珠海试验基地进行。
1.3 样品收集与分析
饲养试验结束时，称重，统计增重率、成活率、饵料转化效率，每个平行随机取15尾对虾，剥离肝胰腺，取0.2～1.0g在预冷的匀浆介质（w/v =1/9）中匀浆，在4℃下以3000～4000r/min离心10～15min，取上清液分装，于-80℃保存备用。饲料中营养成分的测定参照AOAC（1990）方法；饲料中GSH测定采用四氧嘧啶分光光度法［8］；对虾组织中谷胱甘肽还原酶（GR）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）、总抗氧化能力（T-AOC）水平、氧自由基（ROS）的测定参照南京建成生物公司试剂盒说明书；GSH含量测定采用DTNB分光光度法；按照Lowry［9］方法测定组织蛋白含量；抗超氧阴离子（抗O-2）活力测定依照Mu·oz等［10］方法略加修改（用各试验组肝胰腺匀浆上清液代替原文献中的呼吸爆发抑制剂；用试验组OD值与对照组的比值来表示抗O-2能力）；脂质过氧化产物MDA的测定采用Tbars法［11］。
试验结果用±s表示。用SPSS 12.0版软件先进行One-way AVONA分析，若差异显著，进行Duncan’s多重比较，显著性水平P<0.05。
2 结果
2.1 试验虾的增重率、饲料转化效率和成活率
饲料中添加GSH能不同程度的提高南美白对虾的增重、饲料转化效率和成活率（表2）。随着GSH添加量的增加，南美白对虾的增重率逐渐增加，在G180组达到最高（P＜0.05），尔后降低，除G60组外各试验组均显著高于对照组。饲料转化效率呈现相似的变化趋势，但最高值出现在G240组。与对照组相比，各试验组对虾的成活率显著提高，提高幅度为8.53%～31.69%，在G120组达到最高。以增重率为指标，得到增重率和添加量之间的一元二次回归方程为：y=-0.0032x 2+1.1144x+270.39，R 2=0.7497。经计算，饲料中GSH的最适添加量为174.13mg/kg。
Table 2 The growth performance of litopenaeus vannamei for 8weeks
Table 3 GR、SOD、GSH-PX、GSH and T-AOC levels in hepatopancreas of experimental shrimp
2.2 试验虾肝胰腺中抗氧化酶活力、GSH含量和总抗氧化能力
随着饲料中GSH浓度的升高，凡纳滨对虾肝胰腺GR、SOD、GSH-PX活力、GSH含量和T-AOC水平基本呈现先升后降的趋势，分别在G120、G180、G120、G60和G240水平达到最高，并显著高于对照组（P<0.05）（表3）。其中，肝胰脏SOD活力和GSH含量在G300组略有回升，但与对照组差异不显著（P>0.05）。
2.3 试验虾肝胰腺中氧自由基、抗超氧阴离子和脂质过氧化物含量
凡纳滨对虾肝胰腺ROS含量随着饲料GSH含量的升高呈现下降趋势，在G180和G240组显著降低（P<0.05），在G300组又明显升高，但与对照组差异不显著（P>0.05）（表4）。凡纳滨对虾肝胰腺抗O2ˉ能力随饲料GSH浓度的升高呈先升后降的趋势，在G120组达到最高（P<0.05）。与对照组相比，试验组对虾肝胰腺的MDA含量显著降低，在G300组达到最低（P<0.05）。
Table 4 Oxygen radicals，anti-O2- ability and MDA in hepatopancreas of experimental shrimp
3 讨论
3.1 GSH对凡纳滨对虾生长性能的影响
动物机体的抗氧化水平，在一定程度上反映了机体的健康状况。机体在代谢过程中不可避免产生自由基。过量的自由基与不饱和脂肪酸发生脂质过氧化，会损伤细胞膜及细胞内的大分子蛋白和核酸，对机体造成损伤。近年来，添加外源性抗氧化物提高动物机体抗氧化能力的研究受到了越来越多的重视。低等动物的非酶类抗氧化物质如GSH、VC、VE等在机体中发挥的作用远远大于高等动物。
研究表明，日粮GSH对断奶仔猪、黄羽肉鸡和罗非鱼的生长性能和生长激素水平及生长轴相关基因的mRNA表达有明显的影响［5-7］。本试验结果也证明，在饲料中添加一定量的GSH能够提高凡纳滨对虾增重率、饲料效率、成活率。谷胱甘肽中的半胱胺酸的中间代谢产物半胱胺是辅酶A的组成成分，可破坏生长抑素分子的二硫键，解除生长抑素对生长激素等激素的抑制，说明谷胱甘肽可以通过破坏生长抑素而发挥提高动物生长性能的作用。GSH提高对虾生长性能的作用机制是否与之一致，还有待进一步探讨。
3.2 GSH对凡纳滨对虾肝胰腺抗氧化能力的影响
刘平祥［5］在仔猪饲料中添加200mg/kg的GSH能显著影响回肠黏膜GSH含量，而回肠黏膜GSH含量与MDA水平呈强的负相关（r=-0.954）。吴觉文［6］在肉鸡饲料中添加GSH80、120mg/kg，饲喂92d后，血清中GSH-PX活力和T-AOC显著提高，但随添加剂量的增加，反而呈剂量依赖地降低。焦彩虹［7］在罗非鱼饲料中添加GSH8周后，发现肝脏中SOD活性出现差异，饲料中添加200mg/kg剂量组肝脏中GSH-PX和GR活力显著高于对照组。
多不饱和脂肪酸在水生物中发挥重要作用，对虾饲料中脂质含量所占的比例较大，极易发生脂质过氧化［12］。目前，关于GSH对甲壳动物抗氧化能力影响的研究尚未见报道。在甲壳动物中，用T-AOC作为衡量对盐度和热应激［13］、对氨氮应激［14］和弧菌攻毒应激［15］的反应指标，草虾摄入抗氧化剂能提高机体总的抗氧化能力。本试验中，在饲料中添加一定量的GSH能提高肝胰腺中3种酶的活性、总抗氧化能力（T-AOC），但饲料中GSH含量过高（300mg/kg）时，对虾肝胰腺中的抗氧化酶GR、GSH-Px活性和T-AOC量有下降趋势，这和吴觉文等［6］的研究结果有相似的趋势。这可能是由于过量的抗氧化剂的促脂质过氧化作用的结果［16］，而过量的抗氧化剂如α-生育酚在体内和体外模型中也起着促氧化和促进脂质过氧化物生成作用［17］。
过量的ROS会损伤生物分子，而生物分子受损后产生更多的ROS，呈现出一种恶性循环。脂质过氧化会产生醛、酮、醇和环氧化物，典型的代表产物是MDA，它可以衡量机体的抗氧化状态又间接反映细胞损伤水平。本试验结果表明，外源性GSH能清除凡纳滨对虾肝细胞内的自由基，阻止脂质的过氧化作用。
GSH提高动物机体抗氧化功能的作用机制是综合性，一方面GSH在GSH-Px作用下，直接与过氧化氢作用，阻断链式反应，另一方面通过与其他抗氧化剂如VE、VC、辅酶Q10、硫辛酸等协同作用发挥抗氧化作用，形成一个动态的抗氧化体系，再者通过对金属离子和异生物质（如杀虫剂等）引起的细胞毒性的解毒作用，降低了机体的氧化应激［18］。
将本试验的结果与其他抗氧化剂进行比较发现，饲料中添加GSH后，凡纳滨对虾肝胰腺脂质过氧化水平的变化与在对虾等动物的饲料中添加VE［17］和叶黄素［13-15］所呈现的变化趋势相似，但本试验添加GSH后的效果更明显。究其原因，可能是饲料中添加VE和叶黄素后，凡纳滨对虾肝胰腺中脂质过氧化水平的降低是通过提高肝胰腺中GSH含量来实现的［13-15，17］，而本试验在饲料中添加GSH，减少了抗氧化剂在体内的转化过程，减少了因为代谢所造成的损失，呈现出更高的抗氧化效率。关于GSH对凡纳滨对虾抗氧化酶活性调节的作用机制，有待于通过对离体肝胰脏细胞内相关酶类的基因表达研究进一步阐明。
4 结论
饲料中添加一定量的谷胱甘肽能显著提高凡纳滨对虾的生长性能，提高肝胰腺谷胱甘肽还原酶、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶等抗氧化酶的活性，增强总抗氧化能力和抗超氧阴离子能力，降低脂质过氧化产物MDA的含量。
参考文献18篇略。
饲料中添加谷胱甘肽对凡纳滨对虾生长及组织生化组成的影响
1 材料与方法
1.1 试验饲料
以酪蛋白、明胶为蛋白源，玉米淀粉为糖源，鱼油和豆油为脂肪源，矿物质和维生素参考文献［7］略有修改配制基础日粮并作为对照组饲料（表1）。在基础日粮中分别添加60、120、180、240和300mg/kg GSH配制5种试验饲料。GSH购自AMRESCO公司，纯度>98.0%。所有饲料原料经60目过筛，混匀，经双螺杆挤压机制粒，干燥，-20℃冷藏保存。
1.2 试验虾及饲养管理
试验凡纳滨对虾来自中山大学珠海试验基地，试验开始前放在珠海基地循环系统（每套循环系统24个水族缸，每个缸容积250L）中暂养2周，期间投喂对照饲料，然后将初始均重为（1.12±0.01）g/尾的凡纳滨对虾随机分箱。每种饲料设4个平行，每个平行养虾30尾。水源为经沙滤、消毒后的天然海水加自来水调配成盐度为5‰～8‰的人工海水，水温25～30℃。养殖过程不断充氧曝气，溶解氧（7.25±0.56）mg/L，氨氮（0.17±0.06）mg/L，亚硝酸氮（0.018±0.008）mg/L，pH（7.95±0.04）。按体重的8%确定投饲量，分别于每天的7：00、12：00、16：00和20：00投喂。每3周称一次体重，根据体重调整投喂量。饲养实验期为56d。
Table 1 Formulation and proximate composition of the basal diet %
1.3 样品收集与分析
饲养试验结束时，停止喂料24h，虾体称重，统计死亡率。每个平行随机取15只虾，自头胸甲和第一腹节之间抽取淋巴［8］，注入Ependoff离心管（1.5mL）中，4℃冰箱静置3～4h，3500r/min离心15min，取上层血清于-80℃冰箱中保存备用。同时剥离肝胰脏，称重后置于-80℃低温冰箱保存备用，并采集肌肉和鳃丝分别制备样品冷冻保存。
另外每个平行再随机取虾3只，参照文献［9］略作改动，每只虾用1mL消毒的注射器吸取0.1mL预冷（4℃）的对虾抗凝剂，抽取血淋巴，混匀，4℃保存，用于血淋巴细胞计数。采用Lowry［10］法，以小牛血清蛋白作为标准测定组织蛋白含量，采用DTNB分光光度法测定组织GSH含量［11］。
1.4 数据统计分析
实验结果用平均数±标准差（x±s）表示，用SPSS12.0版软件进行ONE-WAY，AVONA分析，然后进行Duncan’S多重比较法分析实验结果平均数的差异显著性。
2 结果
2.1 试验虾的成活率、增重率和饲料转化效率
从表2可以看出，饲料中添加GSH能不同程度地提高凡纳滨对虾的成活率、增重和饲料转化效率。与对照组（组1）相比，各试验组的成活率分别升高了8.53%～31.69%，其中以第3组的成活率最高，显著高于第1 、第2、第5、第6组（P<0.05），4 、5、6 三组之间差异不显著（P>0.05）。随着GSH 添加量的增加，凡纳滨对虾的增重率逐渐增加，在第4组达到最高，分别与除第3 组外的其他四组呈现显著差异（P<0.05）；随着GSH 添加量的进一步升高，增重率下降，但仍显著高于对照组（P<0.05）。以增重率为指标，得到增重率和添加量之间的一元二次回归方程为：y=-0.0032 x2 + 1.1144x+270.39，R2=0.7497（图1）。经计算，饲料中GSH 的最添加量为174.13mg/ kg。饲料中添加GSH 不同程度提高了凡纳滨对虾的饲料转化效率，与对照组相比，除第2 组外，其他4 组的饲料系数均分别呈现显著差异（P<0.05）。
Fig.1 Effect of dietary GSH supplementation on the weight gain rate of litopenaeus vannamei
Table 2 Effects of dietary GSH supplementation on the growth performance of litopenaeus vannamei
2.2 凡纳滨对虾的组织蛋白含量
由表3可见，饲料中添加GSH 能不同程度地提高凡纳滨对虾血清、肝胰脏和肌肉的蛋白含量。随着饲料中GSH添加量的升高，血清蛋白含量呈先升后降趋势，第3、第4、第5组的血清蛋白含量分别比对照组显著升高（P<0.05）。肝胰脏、肌肉蛋白含量与血清蛋白含量的变化趋势相似，其中不同的是第6 组的肝胰脏蛋白含量也显著高于对照组（P<0.05）。鳃丝蛋白含量在各组间差异不显著（P>0.05）。
2.3 凡纳滨对虾的血淋巴细胞计数和肝胰脏GSH含量
如表4 所示，饲料中添加不同浓度的GSH对凡纳滨对虾的血细胞密度有较大影响。试验各组的血淋巴细胞计数均显著地高于对照组（P<0.05），且与GSH呈一定的量效关系，在第5组达到最高；随着GSH添加量的进一步升高，血淋巴细胞计数显著下降（P<0.05）。与对照组相比，第2、第3、第4组虾肝胰脏的GSH含量显著升高（P<0.05），其他二组试验虾的差异未达到显著水平。
Table 3 Protein content in different tissues of litopenaeus vannamei
Table 4 The number of haemocytes and GSH content in hepatopancrea of litopenaeus vannamei
3 讨论
GSH在凡纳滨对虾中的应用研究尚属空白，在仔猪、黄羽肉鸡、罗非鱼中的应用也刚刚起步。刘平祥［4］ 在仔猪日粮中添加50～200 mg/kg GSH 能提高仔猪采食量、平均日增重、体重、饲料报酬，并提高仔猪血清中的IGF-Ⅰ 和leptin 含量；在黄羽肉鸡［5］ 中添加80～160mg/ kg GSH，能提高肉鸡血清中GSH 含量，对肉鸡生产性能也有促进作用。在罗非鱼［ 6］ 日粮中添加100～400mg/kg GSH，能显著提高罗非鱼摄食率、饲料转化率、蛋白质效率和生长速度。本试验结果表明，在凡纳滨对虾日粮中添加一定量的GSH 能提高虾的成活率、增重率和饲料转化效率。有资料表明，GSH 在动物肠腔［12］ 和肠黏膜细胞［13］ 中起着保护肠黏膜免受毒物和过氧化物的损伤的作用。肠腔GSH 可跨小肠绒毛刷状缘被完整吸收［14］；GSH 在小肠上皮细胞内将脂质过氧化产物清除，发挥对脂肪酸氢过氧化物的脱毒作用［12］；外源性GSH 被小肠吸收后，可降低肠上皮细胞对脂质过氧化产物的吸收，进一步保护着肠黏膜［15］。还有研究发现，GSH 对激素分泌具有调节作用：对大鼠胰岛细胞的体外培养试验表明，外源性GSH（0.01mmol/ L） 可促进葡萄糖介导的胰岛素分泌［16］。所以，可以认为GSH可能通过影响凡纳滨对虾一系列生理活动而影响着凡纳滨对虾机体的生长、提高饲料转化效率和成活率，其具体作用机理有待进一步研究。
进一步分析发现，本实验以对虾增重率作为评价指标计算出在饲料中的最佳添加剂量为174.13mg/kg，添加量继续增加，试验虾的增重率呈现下降趋势。观察试验虾血淋巴细胞计数和组织蛋白变化，也表现出近似情况。这说明饲料中添加GSH 在一定范围内发挥积极作用，但超过一定剂量后，作用不太明显，有的甚至产生一定的抑制效应。这可能是由于过多的GSH 摄入体内，会对虾体代谢产生一些不利影响。因为已有研究结果表明，虽然GSH 在清除自由基中发挥抗氧化作用，但过多的GSH 可与多种化合物（如醛类、醌类、卤烯烃等）结合产生毒性代谢物，这些代谢物可与DNA 共价结合或产生氧自由基或肿瘤［ 17］，毒性代谢产物的长期积累对机体产生不利影响。Steven等［18］ 还报道，GSH 本身也可以作为氧化物的前体，在较高的浓度时产生毒性。高姝娟［ 19］ 用ESR技术研究GSH 对NADH 诱导的心肌线粒体自由基损伤的氧化机制时也发现这一规律。
本实验结果还表明，饲料中添加GSH 能提高凡纳滨对虾血淋巴细胞数量和肝胰脏中GSH 含量。甲壳动物依靠细胞免疫和体液免疫来抵制外界不良刺激、减少感染、消除疾病［ 9］。其中细胞免疫主要依靠血淋巴细胞。对虾血淋巴细胞分为3 种［ 20］：无颗粒细胞（透明细胞）、小颗粒细胞（半颗粒细胞）和颗粒细胞。无颗粒细胞具有吞噬作用；小颗粒细胞在防御反应中胞吐作用与识别异物能力活跃［ 21］；颗粒细胞内有大量的颗粒，含有大量的酚氧化酶原，激活后释放酚氧化酶（PO），从而对细胞免疫反应发生作用。Johansson等［ 21］ 认为，它们的染色与哺乳动物白细胞中的粒细胞相近，所以对虾血淋巴细胞可能在防御中起重要作用。对虾血细胞数量上升和成活率升高的一致性关系从一个方面表明饲料中添加GSH 可能通过增加凡纳滨对虾血淋巴细胞中的细胞数量，提高对虾的免疫功能，这为进一步深入研究GSH 对对虾细胞免疫功能的影响提供了有益的线索。本试验中外源GSH 提高了凡纳滨对虾肝胰脏中GSH 的含量，说明外源添加GSH 能在机体组织中蓄积，发挥它的生理功能，这同Vincenzini［ 22］ 研究的结果一致。
参考文献22篇略。
饲料中添加谷胱甘肽对吉富罗非鱼生长、组织生化指标和非特异性免疫相关酶的影响
1 材料与方法
1.1 试验饲料
以酪蛋白和明胶为蛋白源、玉米淀粉为糖源、豆油和磷脂为脂肪源配制基础饲料，其配方和营养组成如表1所示。在基础饲料中添加谷胱甘肽（购自美国AMRESCO公司，纯度>98.0%）配制5种试验饲料，其添加量分别为80、160、240、320和400 mg/kg 饲料。饲料原料粉碎后过60目筛，微量成分采取逐级扩大法添加，谷胱甘肽先溶于水，然后混入各组饲料中。全部混合均匀后用SLX—80型双螺杆挤压机制成直径为2.5 mm颗粒饲料，在55℃下烘干，冷却后放入密封袋中，于-20℃冰箱中保存待用。
Table 1 Ingredient and nutrient levels of the basal diet（air-dry basis）
1.2 试验鱼与饲养管理
吉富罗非鱼苗购自广州番禺罗非鱼良种场。试验鱼先在室外水泥池中暂养至3g左右。饲养试验在广东省农业科学院动物科学研究所水产研究中心室内循环水养殖系统中进行。养殖玻璃纤维桶容积为350 L（直径80 cm，高70 cm，水体容积300 L），养殖水为经过活性炭、珊瑚石过滤的自来水。试验开始时选取平均体重（3.27 ± 0.04）g罗非鱼720尾，随机分成6组，每组4个重复，每个重复30尾鱼，分别投喂基础饲料和5种试验饲料，记作G0、G80、G160、G240、G320和G400。每天分别在9：00和17：00投喂，投喂率为体重的6%，每2周称重一次，并相应调整投喂量。每天排污一次，每2天换一次水，换水量为30%左右。饲养期为7周。试验期间，循环水进水速率为5 L/min，水温28～32℃，自然光照，养殖过程中不断充氧曝气。
1.3 样品采集与分析
1.3.1 样品采集
试验结束时，禁食24 h，称重。每个重复随机选取5尾鱼用于全鱼体成分分析。随机从每个重复中取5尾鱼测定肝体比和肥满度，用1mL无菌注射器尾静脉取血，合并置于无菌Eppendrof管中，4℃冰箱静置1 h后离心并分装，置-80 ℃冰箱中保存备用。剥离肝脏，置于-80℃冰箱中保存备用。
1.3.2 生长性能指标计算
增重率（weight gain rate，WGR，%）=100×（末体重-初体重）/初体重
特定生长率（specific growth rate，SGR，%/d）=100×［ln（末均重）－ln（初均重）］/ 饲养天数
摄食量（feed intake，FI，g/fish）=投饵总量/［（试验开始时鱼尾数+试验结束时鱼尾数）/2］
饲料系数（feed coefficient，FC）=摄食量/（终末鱼体重＋死亡鱼重－初始鱼重）
蛋白质效率（protein efficiency ratio，PER，%）=100×（终末鱼体重＋死亡鱼体重－初始鱼体重）/摄入蛋白量
肝体比（hepatosomatic index，his，%）=（肝脏重/体重）×100
肥满度（condition factor，CF，g/cm3）= 100×鱼体重/鱼体长3
1.3.3 肝脏RNA/DNA测定
采用Trizol 试剂盒提取肝脏中总RNA，采用QIAGEN 公司的试剂盒进行提取DNA，紫外吸收法（岛津UVmini—1240型紫外可见分光光度计）测定RNA和DNA溶液浓度和纯度。RNA/DNA比=RNA OD260/DNA OD260。
1.3.4 常规成分测定
粗蛋白含量采用凯氏定氮法（GB/T 6432—1994）、粗脂肪含量采用乙醚抽提法（GB/T 6433—1994）、灰分含量采用550℃灼烧法（GB/T 6438—1992）、水分含量采用105℃烘箱干燥法（GB/T 6435—1986）进行测定。
1.3.5 生长激素测定
生长激素（growth hormone，GH）、类胰岛素生长因子Ⅰ（insulin-like growth factor，IGF-Ⅰ）、三碘甲腺原氨酸（3′-triiodothyromine，T3）含量采用放射免疫法。试剂盒购自天津九鼎医学生物工程公司，测定方法参照试剂盒的说明书进行。
1.3.6 生理生化指标和非特异性免疫相关酶测定
血清胆固醇（cholesterol，CH）、甘油三酯（triglyceride，TG）、尿素氮（urea nitrogen，UN）、血糖（glucose，GLU）的含量采用日立7600全自动生化分析仪检测，测定试剂采购自罗氏公司。血清胆固醇的测定采用邻苯二甲醛法；甘油三酯的测定采用GPO-PAP法；尿素氮的测定采用尿酸酶过氧化物酶偶联—终点法；血糖的测定采用邻甲苯胺法。溶菌酶（lysozyme，LZM）、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，AKP）、酸性磷酸酶（acid phosphatase，ACP）和一氧化氮合成酶（nitric oxide synthase，NOS）活性的测定采用南京建成生物工程研究所的试剂盒进行测定，测定方法按照试剂盒的说明进行。酚氧化酶（phenoloxidase，PO）活性的测定，以L-多巴为底物，把10 μL 血清加入96孔酶标板中，然后向各孔中加入200μL浓度为0.1mol/L、pH为6.0的磷酸盐缓冲液，最后向各样品孔中加入10μL浓度为0.01mol/L的L-多巴液，振荡4次，在酶标仪（550，Bio-Rad）中每隔4min读取490nm处的吸光值。酶活力以试验条件下，OD490值每分钟增加0.001为1个酶活力单位。
1.4 数据统计与分析
试验数据用平均值±标准差（means ± SD）表示。采用SPSS17.0版软件进行数据分析和统计，先对数据作单因子方差分析（One-way Anova），若处理间有显著差异，再作Duncan’s 多重比较。显著性水平为0.05。
2 结果
2.1 饲料中添加谷胱甘肽对吉富罗非鱼生长性能的影响
由表2可知，随着饲料中GSH添加量的增加，罗非鱼的增重率（WGR）、特定生长率（SGR）、蛋白质效率（PER）和肝脏RNA/DNA比值均呈现先升高后降低的趋势，当添加量为320 mg/kg 时，与对照组相比，这4个指标显著升高，饲料系数显著降低（P<0.05）。添加谷胱甘肽各组的肝体比高于对照组，但差异不显著（P>0.05）。各添加组的肥满度与对照组之间无显著差异（P>0.05）。以增重率为评价指标，得出罗非鱼增重率和谷胱甘肽添加量之间的一元二次回归方程为：y=-0.0004x2+0.2841x+786.77，R2=0.7943（图1）。经计算，吉富罗非鱼幼鱼饲料中谷胱甘肽的最适添加量为355.13mg/kg。
Table 2 Effect of GSH on growth performance of GIFT Oreochromis niloticus
Figure 1 Effect of GSH supplementation on weight gain rate of GIFT Oreochromis niloticus
2.2 谷胱甘肽对吉富罗非鱼体组成的影响
由表3可以看出，各添加组的粗蛋白和粗脂肪含量均高于对照组，其中G160～G320组粗蛋白含量、G240～G300组粗脂肪含量显著升高（P<0.05），其最高值均出现在G240组。各添加组灰分和干物质含量均高于对照组，但差异未达到显著水平（P>0.05）。
Table 3 Effect of GSH on whole-body composition of GIFT Oreochromis niloticus （dry matter） %
2.3 谷胱甘肽对罗非鱼血清生化指标的影响
由表4可知，各添加组胆固醇（CH）和甘油三酯（TG）均高于对照组，但没有显著性差异（P>0.05）。其中G400组CH含量最高，比对照组升高15.5%；G240组TG含量最高，比对照组升高12.5%。各添加组尿素氮（UN）含量均低于对照组，其中G320组显著降低（P<0.05）。血糖（GLU）含量随GSH添加量的升高呈先升高后降低的趋势，各组之间差异不显著（P>0.05）。
Table 4 Effect of GSH on blood biochemical indices of GIFT Oreochromis niloticus
2.4 谷胱甘肽对罗非鱼血清和肝脏生长激素水平的影响
6组罗非鱼血清和肝脏的生长激素水平如表5所示。血清和肝脏中生长激素（GH）随谷胱甘肽添加量的增加呈先升高后降低的趋势，其中G240组水平最高，比对照组分别升高16.8%和2.1%。血清和肝脏中类胰岛素生长因子Ⅰ（IGF-Ⅰ）水平变化一致，各添加组均高于对照组，其中G160～G400显著高于G0和G80组（P<0.05）。血清和肝脏三碘甲腺原氨酸（T3）水平均高于对照组，且随着谷胱甘肽添加量的增加呈先升高再降低的趋势，但差异不显著（P>0.05）。
Table 5 Effect of GSH on serum and liver growth hormones of GIFT Oreochromis niloticus
2.5 谷胱甘肽对吉富罗非鱼血清和肝脏非特异性免疫相关酶活性的影响
由表6可知，除G80外，其他添加组血清溶菌酶（LZM）活性均高于对照组，当添加量为240 mg/kg 及其以上时，显著升高（P<0.05）；各添加组肝脏LZM活性随谷胱甘肽添加量的增加逐渐升高，其中G320组和G400组显著高于其他各组（P<0.05）。各添加组血清碱性磷酸酶（AKP）、肝脏AKP和酸性磷酸酶（ACP）活性均高于对照组，但未达到显著性水平（P>0.05）。当谷胱甘肽添加量为320 mg/kg 时，血清一氧化氮合成酶（NOS）活性显著高于对照组（P<0.05），肝脏中NOS活性随着谷胱甘肽添加量的增加呈先升高再降低的趋势，但组间差异不显著（P>0.05）。血清酚氧化酶（PO）活性随GSH添加量的增加呈先升高再降低的趋势，最高值出现在G320组，比对照组升高15.3%。
Table 6 Effect of GSH on serum and liver non-specific immune related enzymes of GIFT Oreochromis niloticus
3 讨论
3.1 谷胱甘肽对罗非鱼生长性能的影响
本试验结果表明，饲料中添加一定量的谷胱甘肽能显著提高吉富罗非鱼幼鱼的增重率、特定生长率和蛋白质效率，显著降低饲料系数，表明谷胱甘肽对罗非鱼有促生长作用。这一结果与焦彩虹［12］的研究结果相似。赵红霞等［13］在草鱼（Ctenopharyngodon idellus）、Zambohino等［14］ 在鲈鱼（Lateolabrax japonicus）亦报道，谷胱甘肽能提高草鱼、鲈鱼的生长性能。刘晓华等［7］报道，饲料中添加适量的谷胱甘肽能提高凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）的成活率、增重率和饲料转化率。本试验以增重率为评价指标，计算出吉富罗非鱼幼鱼饲料中谷胱甘肽的最适添加量为355.13 mg/kg，这与赵红霞等在草鱼得到的结果（350 mg/kg 饲料）很接近。
有研究指出，鱼体肌肉中核糖核酸（RNA）与脱氧核糖核酸（DNA）比值可以用来判别鱼类生长发育的优劣，是一个良好的生长指标［15-16］。梁萌青等［17］指出，红鳍东方纯（Fugu rubripes）肌肉RNA/DNA比值与增重率呈线性关系，能非常灵敏的反应鱼类生长状况。本试验中，添加谷胱甘肽各组肝脏RNA/DNA比值均高于对照组，其中320 mg/kg 组显著升高，这与增重率、特定生长率和蛋白质效率的变化相吻合，可能原因是谷胱甘肽有助于罗非鱼肝脏细胞RNA表达，进而促进蛋白质的合成，其具体作用机理有待于进一步研究。
鱼类的肝体比是对长期和短期营养方式均较敏感的指标之一［18］。Olivateles等［19］在对鲑（Oncorhynchus tschawytscha）、Alarcon等［20］在笛鲷（Lutjanus argentimaculatus）的研究表明，大豆蛋白可引起鱼肝体比增大。本试验中，摄食添加GSH饲料的各组罗非鱼肝体比均有所升高，部分原因可能是GSH促进了罗非鱼肝脏细胞生长［12］。
本试验结果表明，饲料中添加适量谷胱甘肽可显著影响罗非鱼的粗蛋白和粗脂肪含量。赵红霞等［13］在草鱼亦有相似的报道，但梁春梅［21］在奥尼罗非鱼的饲料中添加谷胱甘肽发现，鱼体成分并没有显著性差异。关于谷胱甘肽对罗非鱼体成分的影响有待进一步深入研究。
3.2 谷胱甘肽对罗非鱼血清生化指标的影响
本试验中，添加谷胱甘肽各组血清胆固醇和甘油三酯含量均高于对照组，其中400 mg/kg 组胆固醇含量最高，比对照组升高15.5%，240 mg/kg 组甘油三酯含量最高，比对照组高12.5%。这与赵红霞［13］等在草鱼体内的研究结果相似。部分原因可能是谷胱甘肽促进生长激素分泌，增强脂肪酸的氧化作用，从而增加动物体内胆固醇和甘油三酯含量。Kaushik等［22］研究指出，用植物蛋白全部替代鱼粉时，动物出现低胆固醇血。Go’mez-Requeni［23］研究表明，使用不同蛋白源时出现低胆固醇血。结合本试验的研究结果，在植物蛋白源代替鱼粉时添加谷胱甘肽有可能维持罗非鱼的胆固醇水平，有关谷胱甘肽在植物蛋白源替代鱼粉中的作用值得关注。
本试验结果显示，添加谷胱甘肽时，血清尿素氮均低于对照组，其中320mg/kg组显著降低。这与李清等［24］在鲤鱼（Cyprinus carpio）饲料中添加活性肽后血液尿素氮显著降低的结果相似。由本试验的蛋白质效率、肝脏RNA/DNA比值数据综合分析，当添加量为320 mg/kg 时，罗非鱼的蛋白质效率、肝脏RNA/DNA比均显著高于对照组。这表明，饲料中谷胱甘肽添加量为320 mg/kg 时，能促进吉富罗非鱼的蛋白质合成，血清中尿素氮含量显著降低。另外，本试验中，尿素氮在320 mg/kg 组含量最低，之后随着谷胱甘肽添加量的增加呈现上升趋势，可能表明高剂量谷胱甘肽不利于蛋白质的吸收和 合成。
3.3 谷胱甘肽对罗非鱼生长激素水平的影响
生长激素（GH）、类胰岛素生长因子Ⅰ（IGF-Ⅰ）和三碘甲腺原氨酸（T3）等对鱼类的生长起着重要的调控作用［25］。GH发挥对生长的调控作用，主要是通过介导IGF实现的［26］。Meister等［27］报道，外源谷胱甘肽可促进小鼠葡萄糖介导的胰岛素分泌。在本试验中，饲料中添加谷胱甘肽能提高血清和肝脏中GH、IGF-Ⅰ含量，其中GH最高值出现在240 mg/kg 添加水平，当添加量在160 mg/kg 及其以上时，血清和肝脏中IGF-Ⅰ含量显著高于对照组。这一结果与刘平祥［5］在蓝塘仔猪中的研究结果相似，该试验还指出谷胱甘肽可促进离体垂体细胞分泌GH，从而推测外源谷胱甘肽促进了罗非鱼血清和肝脏GH的分泌，提高IGF-Ⅰ的分泌。有研究表明，在攀鲈（Anabas testudineus）［28］体内注射T3后可提高鱼体内的谷胱甘肽含量，表明谷胱甘肽与T3的分泌之间存在内在联系。另外有研究指出，T3水平与北极红点鲑（Salvelinus alpinus）的特定生长率具有很强的相关性［29］。本试验中，饲料中添加谷胱甘肽一定程度上提高了罗非鱼血清和肝脏中T3含量，且随着谷胱甘肽添加量的增加呈先升高后降低的趋势，这表明适量谷胱甘肽能促进罗非鱼T3分泌。生长激素的变化与生长性能的变化趋势一致，这表明生长激素的含量与生长性能有较好的相关性，其具体机制有待深入研究。
3.4 谷胱甘肽对罗非鱼非特异性免疫相关酶活性的影响
本试验结果表明，饲料中添加一定量的谷胱甘肽可显著提高罗非鱼血清和肝脏中溶菌酶活性，各添加组的碱性磷酸酶和酸性磷酸酶活性也高于对照组。这与曹俊明等［4］在凡纳滨对虾的研究结果相似。外源谷胱甘肽提高罗非鱼血清和肝脏溶菌酶和磷酸酶的具体机制尚不清楚，是否谷胱甘肽作为抗氧化剂提高机体的抗氧化水平从而激发罗非鱼的非特异性免疫能力还需要深入研究。
本试验中，各添加组血清NOS活性均高于对照组，当添加量为320 mg/kg 时显著升高，肝脏中NOS活性随谷胱甘肽添加量的增加呈先升高再降低的趋势，这表明适量的谷胱甘肽可诱导机体NOS表达，产生适量的NO，增加机体的非特异性免疫能力。朱春华等［31］运用精氨酸在凡纳滨对虾的研究结果亦表明，适量L-精氨酸能显著提高血淋巴液中NO含量，且变化趋势与NOS、AKP活性升高趋势相一致。
本试验中，血清酚氧化物酶（PO）活性随着谷胱甘肽添加量的增加先升高后降低。由于鱼类不能特异性地产生抗体，对异物的刺激主要表现为吞噬反应和产生一系列抗菌物质，这些酶类活性的提高意味着谷胱甘肽可提高罗非鱼的非特异性免疫能力。
4 结论
饲料中添加一定量的谷胱甘肽能显著促进吉富罗非鱼的生长性能，提高全鱼粗蛋白与粗脂肪含量、血清和肝脏IGF-Ⅰ水平以及非特异性免疫相关酶活性。以增重率为评价指标，计算出吉富罗非鱼幼鱼饲料中谷胱甘肽的最适添加量为355.13mg/kg。
参考文献31篇略。
饲料中添加谷胱甘肽对凡纳滨对虾非特异性免疫因子和相关酶活性的影响
华中农业大学学报，2007，26（4）：528-532
饲料中联合添加硒和谷胱甘肽对凡纳滨对虾生长、饲料系数和体成分的影响
饲料工业，2008，29（12）：28-31
饲料中添加谷胱甘肽对吉富罗非鱼抗氧化性能和抗亚硝基氮应激能力的影响
1 材料与方法
1.1 试验饲料
以酪蛋白和明胶为主要蛋白源、玉米淀粉为主要糖原、豆油和磷脂为主要脂肪源配制基础饲料，其配方和营养组成如表1所示。在基础饲料中分别添加80、160、240、320和400mg/kg GSH（购自美国AMRESCO公司，纯度＞98.0%） 配制5种饲料。饲料原料粉碎后过60目筛，微量成分采取逐级扩大法添加，GSH先溶于水，然后混入各组饲料中。全部混合均匀后用SLX-80型双螺杆挤压机制成直径为2.5mm颗粒饲料，在55℃下烘干，冷却后放入密封袋中，于-20℃冰箱中保存待用。
Table 1 Ingredient and nutrient levels of the basal diet （air-dry basis）%
1.2 试验鱼与饲养管理
吉富罗非鱼苗购自广州市番禺罗非鱼良种场。鱼苗先在室外水泥池中饱食投喂基础饲料暂养至3 g左右。养殖试验在广东省农业科学院水产研究中心室内循环水养殖系统中进行。养殖玻璃纤维桶容积为350L（直径80cm，高70cm，水体容积300L），养殖水为经过活性炭、珊瑚石过滤的自来水。试验开始时，选取平均体重（3.27±0.04）g罗非鱼720尾，随机分为6组，每组4个重复，每个重复30尾鱼，分别投喂6种试验饲料，记作G0、G80、G160、G240、G320 和G400。每天投喂2次（9：00时和17：00时），投喂率为体重的6%，每2周称重一次，并相应调整投喂量。每天排污一次，每2天换一次水，换水量为30%左右。每天观察罗非鱼健康及摄食状况，记录死亡情况。饲养期为49d。试验期间，循环水进水速率约为5L/min，自然光照，水温（30.1±1.48）℃，溶氧（5.24±0.15）mg /L，pH（8.0±0.2），氨氮（0.02±0.01）mg /L，亚硝酸盐（0.19±0.01）mg /L。
1.3 样品采集与分析
试验结束时禁食24h。每个重复随机选取5尾鱼，尾静脉取血，置于无菌Eppendrof管中，4℃冰箱静置1h后以5 000r/min 离心10min，取上清液，置-80℃冰箱中保存备用。剥离肝脏，置于-80℃冰箱中保存备用。
饲料粗蛋白含量采用凯氏定氮法（GB/T6432—1994） 、粗脂肪含量采用乙醚抽提法（GB/T6433—1994） 、灰分含量采用550℃灼烧法（GB/T6438—1992）、水分含量采用105℃烘箱干燥法（GB/T6435—1986）进行测定。血清和肝脏中GST、谷胱甘肽还原酶（GR）、SOD、过氧化氢酶（CAT） 活性、GSH含量、T-AOC、抗超氧阴离子（抗O-2）活性和肝脏中MDA含量的测定参照南京建成生物工程研究所的试剂盒说明书。
1.4 抗亚硝基氮应激试验
养殖试验结束后，每组随机取15 尾鱼进行应激试验。应激期间停止循环水，向水族系统中添加NaNO2使NO2-N 浓度为3mg /L，每天9：00时和17：00时投喂原饲料，记录1h、12h、24h、48h、96h内鱼累积死亡情况，计算累计死亡率和相对保护率。
累积死亡率（AMR）=应激后养殖结束时死亡鱼尾数/应激鱼尾数×100%
相对保护率（RPS）=1-（试验组鱼的死亡率/对照组鱼的死亡率）］×100%
1.5 数据统计与分析
试验数据用平均值±标准差（x±SD）表示。采用SPSS 17.0版软件进行数据分析和统计，先对数据作单因子方差分析（ANOVA），若处理间有显著差异，再作Duncan’s多重比较。显著性水平为0.05。
2 结果
2.1 GSH对吉富罗非鱼血清和肝脏抗氧化酶活性的影响
由表2可知，各添加组罗非鱼血清和肝脏GST活性均高于对照组，其中G320血清和G160、G240肝脏GST活性显著升高。血清和肝脏GR活性随GSH添加量的增加呈先升高后降低的趋势，其中G160、G240血清和G320肝脏GR活性显著高于对照组。各添加组血清和肝脏SOD活性均高于对照组，其中血清SOD活性最高值出现在G320（比对照组升高9.5%），肝脏SOD活性在G240与对照组相比显著升高。血清和肝脏CAT活性随GSH添加量的增加先升高后降低，其中G320血清和G240肝脏CAT活性显著高于对照组。
Table 2 Effects of GSH on antioxidant enzyme activities in serum and liver of GIFT O.niloticus
2.2 GSH 对吉富罗非鱼血清和肝脏GSH、TAOC、抗O-2和MDA含量的影响
由表3可以看出，各添加组血清和肝脏GSH含量均高于对照组，但差异未达到显著水平。各添加组血清和肝脏T-AOC均高于对照组，其中G240～G400血清和G240肝脏T-AOC分别显著升高。各添加组血清和肝脏抗O-2活性均高于对照组，其中G320血清抗O-2显著高于G0～G240，肝脏抗O-2活性最高值出现在G320，比对照组升高8.7%。各添加组肝脏MDA含量随GSH添加量的增加先降低后升高，其中G80～G320显著低于对照组。
Table 3 Effects of GSH on GSH，T-AOC，anti-O-2 and MDA content in serum and liver of GIFT O.niloticus
2.3 GSH对吉富罗非鱼抗亚硝酸盐应激能力的影响
亚硝酸盐应激96h内各组罗非鱼的AMR和RPS如表4所示。各添加组AMR均低于对照组，其最低值出现在G320，与对照组相比显著降低。RPS最高值出现在G320，为33.3%。
Table 4 Effects of GSH on resistance to nitrite exposure of GIFT O.niloticus
3 讨论
3.1 谷胱甘肽对吉富罗非鱼抗氧化酶活性的影响
水产动物的健康状况与组织产生的氧自由基密切相关，体内有许多清除自由基的抗氧化酶。GST、GR、SOD和CAT是动物体内与GSH相关的抗氧化酶，这些酶活性的提高有助于缓解多不饱和脂肪酸氧化、亚硝酸盐应激、饥饿应激和感染等［9-11］。Mourente等［12］认为，从SOD和CAT的作用机理可以推测这两种酶活性变化应该保持同步，SOD/CAT比值是动物体内一个重要的抗氧化指标，它的升高标志着抵制反应性氧中间产物的抗氧化物酶系统的激活。
已有报道指出，饲料中添加GSH能显著提高凡纳滨对虾（Penaeus Vanmamei）血清、肝胰腺GR和SOD活性［4-5］。与此相似，在草鱼（Ctenopharyngodonidellus）饲料中添加400mg/kg GSH，肝胰脏GR活性与对照组相比显著提高［6］。饲料中添加一定量GSH能提高奥尼罗非鱼血清和肝脏GR活性［7］。在本试验中，适量的GSH能显著提高吉富罗非鱼血清、肝脏GST和GR活性，这与其他关于GR的结果类似，究其原因，可能是外源GSH促进了鱼虾体内GSH有关的代谢反应，需要的GSH增多，而GR作为GSSG转化为GSH的关键酶，其活性相应增强［13］。
目前，关于外源性GSH对罗非鱼SOD活性影响的结果存在差异。在奥尼罗非鱼中，适宜的GSH能提高肌肉SOD活性［8］，但焦彩虹［7］报道GSH对血浆和肝脏中SOD活性无显著性影响。本试验结果表明，血清和肝脏SOD活性均随饲料中GSH添加量的增加呈现先升高后降低的趋势，CAT活性变化与之相似，而且这两种酶的活性在血清和肝脏中均表现出平行的变化趋势，这与关于这二种酶活性变化规律的预测相一致［21］。本试验结果与焦彩虹［7］的结果不一致的原因，可能与不同种类罗非鱼对GSH的吸收、代谢利用差异和养殖条件（水温、溶氧、pH、氨氮等） 有关；也可能与饲料营养水平有关，本试验中饲料蛋白质含量接近于实用饲料（30.41%），而焦彩虹［7］的研究中饲料蛋白为37.77%，这可能表明，GSH对罗非鱼SOD等抗氧化酶的作用效果与饲料蛋白质水平有关，其影响和机制有待于深入研究。
3.2 GSH对罗非鱼GSH、T-AOC、抗O-2和MDA含量的影响
本试验结果表明，饲料中添加GSH能一定程度提高血清和肝脏GSH含量。这一结果与梁春梅［14］在奥尼罗非鱼中的研究结果相似。在本试验中，饲料中添加GSH能提高罗非鱼血清和肝脏的总抗氧化能力，当添加量240mg/kg 及以上时，血清和肝脏T-AOC均显著高于对照组，其原因可能是饲料中添加的GSH减少了抗氧化剂在体内因为代谢所造成的损失，从而表现出更高的抗氧化能力。
超氧自由基会直接或间接的损害细胞，引起细胞结构和功能的破坏，从而危害正常的生命活动［15］。MDA 是脂质过氧化产物，可导致生物膜结构和功能异常，其含量既可以衡量机体的抗氧化状态又间接反映细胞损伤水平。抗O-2对超氧阴离子有拮抗作用。本试验结果表明，血清和肝脏抗O-2活性随GSH添加量的增加呈先升高后降低的趋势，各添加组肝脏中MDA含量变化与之相反。这表明，适量的外源GSH能提高罗非鱼机体抗超氧阴离子的含量和降低肝脏MDA含量。
3.3 GSH对罗非鱼抗亚硝基氮应激能力的影响
亚硝酸盐是水产养殖中一种环境应激因子，影响体内氧的运输、重要化合物的氧化及器官损害，机体的免疫力下降，从而引发各种疾病［16］。研究指出，GSH可提高动物的抗亚硝酸盐应激［17］和抗氨氮应激［18］。在本试验结果中，亚硝酸盐应激后96h时，添加GSH各组罗非鱼的死亡率均低于对照组，其中320mg/kg 组显著降低。这一结果与储霞玲［13］的结果相似。推测GSH能降低亚硝酸盐应激下罗非鱼的死亡率，可能原因是GSH提高罗非鱼的抗氧化酶活性，从而提高其抗氧化能力，降低氧化损伤，减少死亡率。有关应激后罗非鱼体内抗氧化酶活性的动态变化规律以及与死亡率之间的关系，有待深入研究。
参考文献18篇略。
饲料中添加谷胱甘肽对吉富罗非鱼肝脏生长及抗氧化相关基因mRNA表达量的影响
1 材料与方法
1.1 试验饲料
以酪蛋白和明胶为主要蛋白源、玉米淀粉为主要糖源、豆油和磷脂为主要脂肪源配制基础饲料，其配方和营养组成如表1所示。在基础饲料中添加谷胱甘肽（购自美国AMRESCO公司，纯度>98.0%）配制5种试验饲料，其添加量分别为80、160、240、320和400 mg/kg 饲料。饲料原料粉碎后过60目筛，微量成分采取逐级扩大法添加，谷胱甘肽先溶于水，然后混入各组饲料中。全部混合均匀后用SLX—80型双螺杆挤压机制成直径为2.5 mm颗粒饲料，在55℃下烘干，冷却后放入密封袋中，于-20℃冰箱中保存待用。
表1 基础饲料组成及营养水平（风干基础）
1.2 试验鱼与饲养管理
吉富罗非鱼苗购自广州番禺罗非鱼良种场。试验鱼先在室外水泥池中暂养至3g左右，每天饱食投喂基础饲料2次。饲养试验在广东省农业科学院畜牧研究所水产研究中心室内循环水养殖系统中进行。养殖玻璃纤维桶容积为350 L（直径80 cm，高70 cm，水体容积300 L），养殖水为经过活性炭、珊瑚石过滤的自来水。试验开始时选取体重约3.3 g的罗非鱼720尾，随机分成6组，每组4个重复，每个重复30尾鱼，分别投喂基础饲料和5种试验饲料，记作G0、G80、G160、G240、G320和G400。每天分别在9：00和17：00投喂，投喂率为体重的6%，每2周称重一次，并相应调整投喂量。每天排污一次，每2天换一次水，换水量为30%左右。每天观察罗非鱼健康及摄食状况，记录死亡情况。饲养期为7周。试验期间，循环水进水速率为5 L/min，水温28～32 ℃，自然光照，养殖过程中不断充氧曝气，溶氧＞5 mg/L，pH 7.8～8.2，氨氮≤0.02 mg/L、亚硝酸盐≤0.2 mg/L。
1.3 样品采集
试验结束时，禁食24 h。每个重复随机选取3尾鱼，取出肝脏后立即剪成小块放入装有RNAlater的去核酸酶的离心管中，然后放入液氮中速冻，-80℃保存备用。
1.4 总RNA提取和cDNA合成
采用Trizol 试剂盒提取肝脏中总RNA，紫外吸收法（岛津UVmini—1240型紫外可见分光光度计）测定RNA溶液浓度和纯度。
取1μg总RNA按照SuperScript cDNA 第一链合成试剂盒（美国Invitrogen生命技术公司）操作说明反转录得到cDNA。
1.5 引物的设计和合成
三、微生态制剂
酶制剂在水产动物饲料中的应用
1 植酸酶在水产动物日粮中的应用
植酸酶是畜禽饲料中应用最普遍的酶制剂，尽管影响植酸酶应用效果的因素很多（黄燕华和冯定远，2004）。同样，植酸酶可能是水产动物饲料中应用最多的酶制剂，特别是在提高动物生长性能和降低水体的磷污染方面有双重效能。在许多情况下，动物只能利用植物饲料中有限的磷，其中绝大部分的植酸磷是无法利用的。植酸酶可有效水解植酸态有机磷，使植酸磷降解成肌醇和磷酸，释放出机体可直接吸收利用的无机磷酸及其铁、钙、锌等盐类。一系列以条纹石瓦（Hughes和Sores，1998）、鲤鱼（Schafer等，1995）、鲶鱼（Jackson等，1996；Eya 和Lovell，1997；Li 和Robinson，1997）、虹鳟（Cain和Garling，1995；Rodehutscord和Pfeffer，1995；Linari等，1998；Vielma等，1998）以及大西洋鲑（Storebakken等，1998）等多种鱼类的研究表明，植酸酶对提高磷的消化利用率非常有效。受植酸酶水平和饲料原料的影响，对磷吸收率和存留率的改善范围在15%～45%，对磷排泄的降低在30%～88%（Schafer等，1995；Jackson等，1996；Li和Robinson，1997）。Sain等（1995）通过植酸酶预处理大豆粉作为鲤鱼饲料以降低孵化场流出水的磷浓度，饲料中磷含量较低使水中磷降低了65%～88%。Papatryphons（2001）指出条纹鲈饲料中添加无机磷和植酸酶，鱼的生长、饲料转换率、脊柱和鱼鳞的灰分含量显著增加，明显提高鱼对P、Cu、Fe和Zn的吸收率，而且豆粕饲料中磷的利用率提高23%。Eya和Loyell（1997）等报道了在斑点叉尾鮰饲料中添加植酸酶，可以明显提高鱼体增重和骨骼中磷的沉积，有效提高鱼的植酸磷生物利用，降低粪中磷的浓度。Storebakkon（1998）在鲑鱼试验，Ferster等（1999）在虹蹲鱼苗试验，01iva-Teles（1998）在舌齿纱鱼苗试验中均证实，植酸酶对改善蛋白的营养价值和磷的利用率有明显作用，大大降低了磷的排放量。Jouni（2000）用植酸酶处理的大豆饲喂大鲑鱼，发现加或不加植酸酶对体重由0.25kg生长至2kg的大鲑鱼体增重没有影响，且骨灰分的含量也无明显增加。Riche和Brown（1996）在虹鳟饲料中添加1 000U/kg的植酸酶，结果可使豆粕中磷的利用率从25%增加到57%，提高了128%。可以看出，应用的效果差异比较大。
国内对植酸酶在水产动物饲料中应用也有很多研究和报道。但是，值得注意的是，鲤科鱼类是我国养殖量最大的鱼类，其消化道pH为中性，因此能够在鲤鱼饲料中使用的植酸酶应该是最适pH在中性范围的中性植酸酶。曾虹等（2001）进行了中性植酸酶在鲤鱼饲料中的试验，在鲤鱼饲料中添加1000U/kg的中性植酸磷可以将鲤鱼对饲料的磷利用率提高41%～59.4%，单位增重的磷排泄降低32%。余丰年（2001）报道了在异育银鲫饲料中添加7000U/kg的植酸酶，可以降解大豆粉中80%植酸磷，促进异育银鲫对饲料中营养物质的消化吸收，显著提高平均增重和鱼体中磷量。研究表明，饲料中添加植酸酶可使鲤鱼对总磷的利用率提高105%～122%，植酸磷的利用率提高74%～89%，对钙的利用率提高132%以上，蛋白质和脂肪的利用率分别提高11%和12%（2002；2003）。添加植酸酶可以增加氮、钙、铁、锌等物质的表观吸收率，并显著提高斑点叉尾、鲤鱼体增重和骨磷的沉积，降低粪中磷的浓度（王正凯等，1998；白东清等，2002）。
对于无胃鱼，由于消化道pH偏高，添加中性植酸酶合适，在无胃鱼中使用植酸酶的另一有效方法是预先用植酸酶处理饲料，既可以避免饲料加工过程中过高的温度对酶活力的破坏，又可以防止鱼消化道内过高的pH值对酶活力的破坏。余丰年等（2001）先在体外将豆粕用植酸酶进行处理，再加入到其余的饲料原料中，充分混合后进行分析，结果表明，在异育银鲫体外，植酸磷就已经在植酸酶的作用下发生了有效的降解，添加植酸酶促进了异育银卿对饲料中营养物质的吸收，提高了增重率。
2 非淀粉多糖酶在水产动物日粮中的应用
非淀粉多糖酶包括不溶性非淀粉多糖酶（如纤维素酶）和可溶性非淀粉多糖酶（如木聚糖酶、β-葡聚糖酶）。非淀粉多糖酶在畜禽方面已经有了深入的研究和广泛的应用，黄燕华（2004）和于旭华（2004）分别对纤维素酶和木聚糖酶进行了比较系统的讨论。同样，纤维素酶是降解纤维素的生物催化剂，能够部分降解水产饲料中的纤维素和半纤维素，破坏饲料中的植物细胞壁，改善饲料的营养价值，提高水产动物对植物性饲料的消化率和利用率，从而促进水产动物的生长（刘维得等，2000；胡喜峰等，2004）。余年丰等（2001）在以豆饼、菜籽饼为主的饲料中添加2400U/kg纤维素酶饲喂团头鲂，提高了鱼体对饲料营养物的利用率，纤维素酶能促进动物胃肠到蠕动，刺激内源消化酶分泌。纤维素酶能将菜籽饼、豆粕中的植物纤维分解，破坏植物细胞壁，释放内容物，综合提高饲料利用率。
在饲料中添加以纤维素酶、木聚糖酶为主的酶制剂明显促进鲤鱼、草鱼、彭泽鲫和鲫鱼的生长（韩如政等，1999；陈应华，2001；张满隆等，2001；张满隆等，2002）。宋桂红等人（1986）的试验，用秸秆粉代替部分玉米和小麦，用纤维素酶处理后投喂罗非鱼，鱼体增重提高12%～16%。添加酶制剂可使草鱼的生长速度提高6.6%，饲料系数降低29%。阎有利等（1994）在鲤鱼饲料中添加酶制剂纤维素酶0.1%，饲养27d后其试验组增重率比对照组提高11.96%，饵料系数降低16.36%，饵料成本降低14.63%。
徐国武等在含大麦粉41.3%的饲料中添加β-葡聚糖酶饲喂鲤鱼，结果表明，添加β-葡聚糖酶于含大麦（35%）的饲料中，能提高鲤鱼的增重率和降低饵料系数。提高饵料粗蛋白、粗脂肪、干物质的消化率。大麦含有大量的β-葡聚糖，这些β-葡聚糖可在肠道中部分溶解，使肠道食糜黏性增加，结果使肠黏膜表面不动水层增厚，营养物质的扩散受阻。鲤鱼肠道中缺乏β-葡聚糖酶，从而影响营养物质的消化吸收。
3 外源性消化酶在水产动物日粮中的应用
单一使用外源性消化酶的情况比较少，多数是几种外源性消化酶组成复合酶，或者与非淀粉多糖酶结合组成复合酶。由于水产动物的生物学和生理特点及其体内消化酶的特性，导致水产动物对脂肪消化率最高，其次为蛋白质，最次为淀粉（叶元土，2005；冯俊荣等，2005）。在水产饲料中由于蛋白质和淀粉的含量比较高，所以在水产饲料用酶制剂产品中，不仅要添加水产动物自身不能分泌的非消化酶类，而且需要添加外源性消化酶类。首先在水产动物饲料中添加蛋白酶，能够提高蛋白质的消化吸收率，降低日粮蛋白水平，从而降低饲料成本；其次在水产饲料中添加α-淀粉酶和糖化酶，有利于提高对淀粉的利用，从而达到节约蛋白质的效果。因为鱼类肠道为中性或微碱性环境，故饲料中以添加中性蛋白酶和碱性蛋白酶为宜（邓岳松等，2004）。孙建友（1990）报道，在鱼饲料中使用淀粉酶，显著地提高了鲤鱼、鲫鱼和草鱼的增重。叶元士等（1995）报道，从猪胃黏膜、胰脏中分离出蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶，按一定比例制成复合酶制剂，再按0.5%、1.0%的比例加入到鲤鱼基础饵料中，使鲤鱼增重率提高12.3%～27.5%，饵料系数降低18.70%～10.89%，而且对鲤鱼品质无显著不良影响。在我们最近的试验中，淀粉酶可以提高南美白对虾幼虾非特异免疫力（黄燕华等，2009）。水产动物的酶制剂含有蛋白酶、淀粉酶、糖化酶为主的外源性消化酶应该有发展前景。
4 复合酶制剂在水产动物日粮中的应用
目前，国内应用于水产动物的酶制剂大多以复合酶的形式出现，仲军（1994）进行饲料酶喂对虾生产试验和大水面养虾生产试验结果表明，添加饲料酶，个体增重率提高12.13%，单产提高13.87%，饲料系数降低12.02%。刘文斌等（1999）在异育银鲫饲料中添加0.75g/kg酶制剂，异育银鲫的增重率提高26.98%，饵料系数降低了19.85%。周小秋等（2001）在含豆粕、菜籽粕、棉仁粕为主的饲料中添加酶制剂，提高了饲料利用率，降低了鲤鱼消化道的黏性，有利于营养物质吸收。对鲤鱼的增重、饵料系数有显著的影响。张满隆等的试验结果表明，添加酶制剂（含纤维素酶3000U/g，木聚糖酶4300U/g，蛋白酶2500U/g）能使鱼的生长速度明显加快，饵料系数降低。在草鱼饲料中添加1%，试验组的生长速度比对照组提高了6.6%，饲料系数降低了0.29。试验组的鱼体粗蛋白质比对照组略高；而粗脂肪略低。该酶制剂使草鱼对无机盐转化利用率提高，对各种营养物质的吸收均衡有效，表明该酶制剂能促进鱼体内各种生化反应，增强鱼体内蛋白质转化率。乔秀亭等研究了添加酶制剂后，对鲤鱼消化酶活性的影响。白东清等（2002）研究了添加酶制剂后对鲤鱼消化酶活性的影响发现，添加复合酶制剂后各试验组酶活性均比对照组有所提高，起到减少蛋白质作为能量消耗，间接节约蛋白质的作用。饲料酶也有提高虾（仲军，1994；李其才，1997）的产量以及中华鳖生产性能的作用（周嗣泉等，2000）。以上说明酶制剂具有促进水产动物生长，提高饲料利用率等作用。
低鱼粉或高鱼粉日粮中添加复合酶特威宝SSF可提高日粮营养物质的利用率和鲶鱼的生长性能。特威宝SSF弥补了低鱼粉日粮品质低下的特点，充分挖掘日粮中营养物质的利用潜力，改善了日粮总体的利用效果。因此，添加使用特威宝SSF有助于减少特拉鲶鱼日粮中鱼粉的使用比例，对特拉鲶鱼的生长和饲料利用效率有明显的促进作用。巴沙鲶鱼的饲养试验获得了与特拉鲶鱼类似的结果，但高鱼粉日粮中添加特威宝SSF酶制剂的效果则没有低鱼粉日粮好。消化率结果表明，添加特威宝SSF后日粮营养物质的消化率大大改善。鱼饲料中添加特威宝SSF 0.02%足以提高鱼的生长性能和饲料利用效率，鱼粉的使用比例可降低至5%。
参考文献38篇略。
乳酸菌对凡纳滨对虾幼虾生长性能、消化酶活性和非特异性免疫的影响
1 材料与方法
1.1 试验材料
乳酸菌制剂：由山东益生源微生物技术有限公司提供的液态菌剂，为嗜酸乳杆菌属（Lactobacillus acidophilus），有效活菌总数≥2.0×109CFU/mL。
1.2 日粮配方及制备
基础日粮组成及营养水平见表1。原料经粉碎后过60目，人工预混合后用小型三维运动混合机混匀，用MM12型绞肉机挤压制粒，粒径为1.5 mm，置烘箱内于90℃熟化40min后晾干，置于-20℃冰箱保存备用。在养殖的前1周进行饲料发酵处理，采用单因子试验设计，在基础日粮中分别添加0、0.5%、5%、10%和15%乳酸菌液（记为Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组、Ⅳ组和Ⅴ组），搅拌均匀，装入密封袋中，尽量排出空气，放入纸箱保持温度30℃左右对混合的饲料进行发酵，发酵时间为72h。
Table 1 Composition and nutrient levels of basal diet
1.3 试验条件与饲养管理
试验在珠海市农业科学研究中心的室内循环水养殖系统中进行。试验所用虾苗由斗门海南和兴虾苗场（珠海基地）提供，虾苗运回后于暂养池暂养4周，挑选450尾大小一致、活力好的对虾平均分配到15个水族箱中，即5个组，每组3个重复，每重复30尾虾，循环流水过滤玻璃纤维桶容积为350 L（直径80cm，高70cm，水体体积300L），进水速率为1.6L/min。饲养期为8周，试验期间水温18.1～27.5℃、pH7.7～8.0、盐度3.4‰～5.5‰、溶氧＞5mg/L、氨氮≤0.02mg/L、亚硝酸盐≤0.2mg/L。每天投料4次，投料时间为07：00、11：30、16：30和21：00，早晚的投喂量占60%，同时根据摄食情况及时调整投饲量，每天回收剩料，计算采食量和饲料系数。从第5周开始收集粪便，用虹吸法收集新鲜、完整的粪便，每天收集1次，完成后于60℃下烘干备用。
1.4 样品采集与制备
试验结束前，禁食24h后，分别称量每缸虾的总重，每箱取接近平均体重的15～20尾虾，用1mL无菌注射器插入心脏取血，合并置于无菌Eppendorf管，4℃冰箱静置过夜后10 000 r/min离心10min，移出血清分装，于-20℃保存备用。将采血后的对虾置于冰盘内玻璃平面皿上解剖，取出虾的胃、肠道和肝胰脏，然后剪开胃、肠道和肝胰脏，再用预冷超纯水（4℃，pH7.0）清洗胃、肠道内容物，滤纸吸干表面水分后分别称质量，将胃，肝胰脏、肠道样本，按其质量分别加入10倍体积（W/V）预冷超纯水，用玻璃匀浆器在冰浴中匀浆，取部分匀浆液直接用于测定脂肪酶活性，其余部分以5 000r/min，4℃离心10 min，然后立即取上清液（即酶粗提取液）置于-20℃冰箱中保存，用于测定蛋白酶和淀粉酶活性。生长性能指标及计算公式如下：
增重率（%）［（末均重-初均重）/初均重］×100
特定生长率（%）{［ln（末均重）-ln（初均重）］/饲养天数}×100
存活率（%）（试验结束虾尾数/试验开始虾尾数）×100
饵料系数=摄食量/（终末虾体重+试验中死亡虾体重-初始虾体重）
1.5 测定指标与方法
蛋白酶活性：按Folin-酚法［6］，在一定温度和pH条件下，底物酪蛋白浓度为5 mg/mL，1 g消化器官鲜活组织内蛋白酶1min水解酪蛋白产生1μg酪氨酸的酶量为1个蛋白酶活力单位（U）。
淀粉酶活性：按3，5-二硝基水杨酸显色法（DNS法）［7］，在一定温度和pH条件下，以可溶性淀粉为底物，1g鲜活组织内淀粉酶1 min水解淀粉产生1 mg麦芽糖的酶量为1个淀粉酶活力单位（U）。
脂肪酶活性：按聚乙烯醇橄榄油乳化液水解法［8］，在一定温度和pH条件下，以聚乙烯醇橄榄油为底物，1g鲜活组织内脂肪酶1 min水解脂肪产生1μmol脂肪酸的酶量为1个脂肪酶活力单位（U）。
以上酶的活性以比活力表示，比活力（U/mg prot）=酶活力/蛋白质含量。
血清蛋白质含量的测定：蛋白质含量测定以牛血清白蛋白作为标准曲线，用考马斯亮蓝G-250法测定［9］。
血清酶活性：溶菌酶（LSZ）、血清过氧化物酶（POD）和超氧化物歧化酶（SOD）活性均用南京建成生物的试剂盒检测。血清酚氧化酶（PO）活性的测定参考Ashida［10］的方法，以L-多巴为底物，把10μL血清加入96孔酶标板中，然后向各孔中加入200μL浓度为0.1 mol/L、pH为6.0的磷酸盐缓冲液，最后向各样品孔中加入10μL浓度为0.01 mol/L的L-多巴液，振荡4次，在酶标仪中每隔4min读取490nm处的吸光值。酶活力以试验条件下，OD490值每分钟增加0.001为1个酶活力单位。
1.6 数据分析
试验数据采用平均值±标准差表示，采用SPSS 11.5软件进行数据分析和统计，先对数据作单因素方差分析（One-way ANOVA），若组间差异显著，再用LSD进行多重比较，P＜0.05表示差异显著。
2 结果
2.1 生长性能指标
由表2可知，Ⅳ组的效果最好，与对照组（Ⅰ组）相比，增重率和特定生长率分别提高了7.13%（P>0.05）和4.23%（P>0.05），饵料系数降低了8.38%（P>0.05），且显著低于Ⅲ组（P<0.05），其他各组间差异不显著（P>0.05）。Ⅲ组效果最差，末均重、存活率和增重率等稍逊于对照组。
Table 2 Growth performance of Litopenaeus vannameiin all groups
2.2 消化酶活性
由表3可知，从不同种类消化酶活性的统计结果看，淀粉酶活性的影响程度最大，其次是蛋白酶，脂肪酶活性的影响程度最小；从不同器官中的消化酶活性的统计结果看，肠道消化酶活性的影响程度最大，其次是肝胰脏的消化酶，胃的消化酶活性的影响程度最小，即添加乳酸菌后能够一定程度地增加凡纳滨对虾的肝胰脏和肠道中的蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶的活性，仉不存在明显的剂量效应，也就是消化酶活性没有随着乳酸菌浓度的递增而增加，试验组肝胰脏和肠道中蛋白酶和淀粉酶活性都高于对照组，其中Ⅱ组肝胰脏中蛋白酶，淀粉酶和肠道中的淀粉酶活性最高，且显著高于对照组（P<0.05），Ⅲ组的肠道蛋白酶活性显著高于对照组（P<0.05）。
Table 3 Digestive enzyme activities in digestive organ of all groups
2.3 非特异性免疫指标
由表4可知，试验组LSZ活性都高于对照组，且Ⅳ和V组的显著高于对照组（P<0.05），血清中PO活性、SOD活性和蛋白质含量各组之间差异不显著（P>0.05），但血清蛋白质含量试验组都高于对照组，PO活性除Ⅱ组外试验组都高于对照组，SOD活性是先逐步增加后降低至稍低于对照组；POD活性对照组最低，并显著低于Ⅳ组（P<0.05）。
Table 4 Non-specific immunity indices in serum of all groups
3 讨论
大量研究资料表明，微生物制剂作为饲料添加剂，可以促进对虾的生长［11-16］、提高消化酶活性［13-14］和增强免疫力［11-12，15-16］。而在鱼类方面，Son等［3］在石斑鱼饲料中添加植物乳杆菌饲喂4周，可以显著提高石斑鱼的增重率和饲料效率。Aly等［4］在罗非鱼饲料中添加乳酸菌饲喂1个月或2个月可以显著提高体增重，改善成活率。Suzer等［5］报道在黑鲷的仔鱼发育阶段使用乳酸菌，可以提高仔鱼的生长性能和消化酶活性，尤其是添加于仔鱼的活饵料或者活饵料及水体中，效果达显著水平。本次研究结果表明饲喂乳酸菌能够促进凡纳滨对虾的生长，提高对虾成活率，降低饵料系数，与前人报道结果相似。然而本试验结果显示Ⅲ组的存活率、饵料系数与其他组间存在着负面差异，具体原因有待进一步的研究验证。水生动物因其生长发育及机体所需营养成分的不同，其消化酶活性也随之发生变化［17］。一般消化道内营养物质的消化作用主要是化学消化，其实质是酶消化，所以消化酶在水生动物消化过程中起到极其重要的作用。同时水生动物的消化主要在消化道中进行，因此消化道中消化酶的活性可以反映其消化能力［18-19］。本试验结果表明，饲料中添加乳酸菌后能改善消化酶活性，尤其是肝胰脏和肠道的蛋白酶和淀粉酶，这与鲤鱼（Cyprinus carpioL.）［20］、斑节对虾（Penaeus monodon）［16］、印度明对虾（Fenneropenaeus indicus）［14］的研究结果相似。各试验组胃中消化酶活性跟对照组接近，说明乳酸菌不能刺激其消化酶的分泌，试验组消化酶活性的提高与益生菌在肠道中的定植和分泌消化酶可能有关。消化酶活性大小与对虾生长之间存在一定的正向关系，但其酶活性高低与生长速度并没有表现出线性关系，而Ziaei等［14］在印度明对虾，Moriarty等［16］在斑节对虾及丁贤等［13］对凡纳滨对虾的研究结果为酶活性与生长的相关性相对要强，可能是因为芽孢杆菌与乳酸菌的不同，有待进一步验证。乳酸菌的促生长机理可能与饲喂微生物后对鱼虾消化道消化酶活性的提高有关［20］；另外乳酸菌能在体内发挥代谢活性，为宿主提供可利用的必需氨基酸和各种维生素，甚至提高矿物元素的生物学活性，进而为宿主提供必需营养，增强动物的营养代谢，起到促进生长的作用［2］。
对虾的免疫系统不完善，主要依靠非特异性免疫来提高对疾病的抵抗力。LSZ、PO是反映对虾免疫能力的一个重要指标，在对虾防御体系中发挥重要的作用［21-22］。血清LSZ能破坏和消除侵入体内的异物，从而担负起机体防御的功能［23］。PO原激活系统在甲壳动物中起着重要的异物识别和防御功能［24-25］。添加益生菌后，可能使对虾的PO原系统被激活，PO活性提高，增强对虾对异物的识别和防御能力，从而提高对虾的抗逆能力。SOD是重要的抗氧化酶之一，可以清除体内多余的自由基，反映对虾的抗应激能力［21］。研究发现，SOD活性与生物的免疫水平呈密切相关［26］。因此，SOD可作为机体非特异性免疫指标，来评判免疫刺激剂对机体非特异性免疫力的影响［27-29］。刘树青等［30］认为POD可以减少自由基对正常细胞的损伤，对细胞生理代谢过程中的活性氧有清除作用，从而提高机体的解毒免疫功能和防病抗病能力。对虾血淋巴中的蛋白质是其主要的化学物质之一，其含量的变化与机体的生理活力密切相关。罗日祥［31］试验表明，已感染黑斑病的中国对虾血淋巴蛋白质含量明显下降。刘树青等［32］和周遵春等［33］也证实血清蛋白质含量的提高可以使血清中溶菌物质、杀菌物质含量升高，通过LSZ活性衡量免疫功能。本文试验组凡纳滨对虾血清LSZ、PO、SOD、POD和血清蛋白质含量都有不同程度的提高，其中LSZ和POD个别组较对照组达显著水平，也就是乳酸菌只对部分体液免疫因子产生积极影响，而且不同免疫因子的最佳作用剂量有差别。Son等［3］报道在石斑鱼饲料中添加植物乳杆菌能够显著增强替代途径补体活力，提高LSZ和谷胱甘肽过氧化物酶活性，增强其对链球菌和虹彩病毒的抵抗力：乳酸菌添加于罗非鱼饲料中也可显著提高免疫力及对荧光假单孢菌核连锁状球菌的抵抗力［4］，说明乳酸菌可以提高鱼的免疫力及抗病力。本文结果也表明乳酸菌可以提高对虾的免疫力，但没有做抗病力的研究，有待更多的研究。Gullian等［15］从对虾中肠腺分离出3种益生菌——弧菌P62、P63和芽孢杆菌P64，能显著提高对虾血清PO活性；Rengpipat等［21］用芽孢杆菌S11菌株喂养斑节对虾，提高了其血细胞数、血清PO活性和抗菌活性，这些益生菌可以提高对虾的免疫力，与本研究结果相似。
4 结论
饲料中添加一定量的乳酸菌后饲喂凡纳滨对虾，可一定程度地提高对虾的生长性能，提高肝胰脏和肠道中的蛋白酶和淀粉酶的活性，改善对虾的非特异性免疫力。
参考文献35篇略。
5种乳酸菌对罗非鱼生长性能、体成分、血清生化指标及肠道菌群的影响
1 材料与方法
1.1 试验材料
试验选用5种乳酸菌，其中嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）由广东省农科院蚕业鱼农产品加工研究所提供，植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）购于广东省微生物研究所微生物菌种保藏中心，戊糖乳杆菌（Lactobacillus pentosus）和鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus）购自北京北纳创联生物技术研究院，粪肠球菌（Enterococcus faecalis）由华中农业大学提供。
1.2 试验饲料
基础饲料组成及营养水平见表1。以基础饲料为对照，在基础饲料中分别添加嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、戊糖乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、粪肠球菌，配制乳酸菌数量不小于108 CFU/g［9-10］的5种试验饲料。制粒后测得基础饲料及添加嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、戊糖乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、粪肠球菌的5种试验饲料中乳酸菌数量分别为1.30×103、5.10×108、2.97×108、3.03×108、2.30×108和3.47×108 CFU/g。饲料原料经粉碎过40目筛，混合均匀后用F—75型双螺杆挤条机（华南理工大学科技实业总厂生产）制成直径为2.0 mm的颗粒饲料，在空调房阴干，冷却后放入密封袋中，于-20℃冰箱中保存待用。
1.3 动物饲养与管理
养殖试验在广东省农业科学院动物科学研究所水产研究室室内循环水养殖系统（水体容积150L）中进行。试验开始时，选择平均体重（3.49±0.01）g的健康奥尼罗非鱼480尾，随机分成6组，每组设4个重复，每个重复20尾鱼。其中，对照组（G0组）饲喂基础饲料；另外5组分别饲喂在基础饲料中添加嗜酸乳杆菌（G1组）、植物乳杆菌（G2组）、戊糖乳杆菌（G3组）、鼠李糖乳杆菌（G4组）、粪肠球菌（G5组）的试验饲料。每天在09：00和16：30各投喂1次，控制投喂量为体重的4%～6%，并收集残饵，试验期为8周。每2周称重1次，并相应调整投喂量。试验期间自然光照，水温为25～28℃，溶氧浓度>5mg/L，pH 7.8～8.2，氨氮浓度≤0.02mg/L，亚硝酸盐浓度≤0.2mg/L。
Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet（DM basis）
表1 基础饲料组成及营养水平（干物质基础）（续）-1
1.4 样品采集与指标测定
1.4.1 样品采集
养殖试验结束后禁食24h，称重，统计存活率。每个重复随机取5尾鱼，用于体成分分析。每个重复另随机取5尾鱼，尾静脉取血，合并置于无菌离心管中，于4℃下放置2h，然后经5 000 r/min离心10 min，取血清分装后于-80℃冰箱保存备用；采血后解剖取内脏、肝胰脏、肠道，内脏、肝胰脏称重，用乙醇擦拭肠道外部后用剪刀剪下后肠，再用无菌生理盐水冲洗2～3次后放入无菌离心管中，备用。
1.4.2 生长性能指标计算公式
增重率（weight gain rate，WGR，%）=100×（第2、4、6或8周时鱼重一初始鱼重）/初始鱼重；
饲料系数（feed conversion ratio，FCR）=摄食量/（第2、4、6或8周时鱼重+对应阶段内死亡鱼重-初始鱼重）；
蛋白质沉积率（protein deposition ratio，PDR，%）=100×（终末鱼体蛋白质含量-初始鱼体蛋白质含量）/摄入蛋白质量；
存活率（survival rate，SR，%）=100×终末鱼尾数/初始鱼尾数；
肝胰指数（hepatosomatic index，HSI，%）=100×肝胰脏重/体重；
内脏指数（viscerasomatic index，VSI，%）=100×内脏重/体重；
肥满度（condition factor，CF，g/cm3）=100×体重/体长3。
1.4.3 体成分分析
粗蛋白质、粗脂肪、粗灰分、水分含量分别采用凯氏定氮法（GB/T 6432—1994）、索氏抽提法（GB/T 6433—1994）、550℃灼烧法（GB/T6438—1992）、105℃烘箱干燥法（GB/T 6435—2006）进行测定。
1.4.4 血清生化指标测定
血清中胆固醇（cholesterol，CH）、甘油三酯（triglyceride，TG）、尿素氮（urea nitrogen，UN）、葡萄糖（glucose，GLU）含量委托广州市金域医学检验中心进行检测。血清中谷丙转氨酶（glutamic-pyruvic transaminase，GPT）、谷草转氨酶（glutamic-oxalacetic transaminase，GOT）活性采用南京建成生物工程研究所生产的试剂盒进行测定，测定方法按照试剂盒说明书进行。1.4.5 肠道菌群的测定
在无菌超净工作台上称取肠道0.5 g左右，按1∶9（质量体积比）加入到无菌生理盐水中，冰浴中匀浆制成浓度为10-1的原液，再依次进行10倍系列稀释，根据预试验选择适宜稀释度的匀浆液测定乳酸菌、双歧杆菌、大肠杆菌的数量及细菌总数，具体测定方法如下：取100μL匀浆液涂布接种于所需培养基［肠道细菌总数测定采用TTC营养琼脂培养基，大肠杆菌数量测定采用山梨醇麦康凯琼脂基础（SMAC）培养基，双歧杆菌数量测定采用双歧杆菌（BBL）琼脂培养基，乳酸菌数量测定采用MRS乳酸菌琼脂培养基］中，置于培养箱培养（肠道大肠杆菌在37℃培养箱中培养24 h，总细菌、双歧杆菌和乳酸菌在37℃培养箱中培养48 h），培养结束后，选取平均菌落数为30～300的稀释度进行菌落计数，计算方法为每克肠道菌落形成单位，即CFU/g（平均菌落数×稀释倍数×10），结果采用其对数值，即lg（CFU/g）表示。每个稀释度在每种培养基上做3个重复，取其平均值。
1.5 数据处理与分析
试验数据用平均值±标准误（mean±SE）表示。采用SPSS 17.0软件对数据进行统计分析，先对数据进行单因素方差分析（one-way ANOVA），若组间有显著差异，再用Duncan氏法进行多重比较。显著性水平为P<0.05。
2 结果
2.1 5种乳酸菌对罗非鱼生长性能的影响
由表2可知，第2周时，相较于G0组，各乳酸菌添加组的增重率均升高，饲料系数均降低，但差异不显著（P＞0.05）。第4周时，G1组的增重率显著低于GO组（P＜0.05）；G2、G3、G4和G5组的饲料系数均低于G0组，其中G2和G5组的差异达显著水平（P＜0.05），而G1组的饲料系数则显著高于G0组（P＜0.05）。第6周时，除G1组外，各乳酸菌添加组的增重率均显著高于G0组（P＜0.05）；G2、G3、G4和G5组的饲料系数显著低于G0组（P＜0.05）。第8周时，与GO组相比，G2、G3、G5组的增重率显著升高（P＜0.05），G1组的增重率显著降低（P＜0.05）；G2、G3、G4和G5组的饲料系数均低于G0组，其中G3和G5组的差异达显著水平（P＜0.05），而G1组的饲料系数则显著高于G0组（P＜0.05）。试验结束（第8周）时，G2、G3、G4和G5组的蛋白质沉积率显著高于G0和G1组（P＜0.05）；与G0组相比，各乳酸菌添加组的内脏指数均有不同程度下降，其中G4组显著降低（P＜0.05）；与G0组相比，各乳酸菌添加组的肥满度无显著变化（P＞0.05），但5个乳酸菌添加组间表现为G1、G2和G3组显著高于G4和G5组（P＜0.05）；各组间肝胰指数和存活率差异不显著（P＞0.05）。
Table 2 Effects of 5 kinds of Lactobacilluson growth performance of tilapia（Oreochromis niloticus×O.aureus）
表2 5种乳酸菌对罗非鱼生长性能的影响（续）-1
2.2 5种乳酸菌对罗非鱼体成分的影响
由表3可知，饲料中添加不同乳酸菌均可降低鱼体的水分含量，其中G3组鱼体的水分含量显著低于G0组（P＜0.05）。饲料中添加不同乳酸菌均能增加鱼体的粗蛋白质含量，其中G3和G4组显著高于G0组（P＜0.05）。与G0组相比，各乳酸菌添加组鱼体的粗脂肪和粗灰分含量无显著变化（P>0.05），但5个乳酸菌添加组问存在一些差异，其中粗脂肪含量表现为G4组显著低于G1和G3组（P＜0.05），粗灰分含量表现为G4组显著高于G2组（P＜0.05）。
2.3 5种乳酸菌对罗非鱼血清生化指标的影响
由表4可知，G1、G2、G4和G5组血清胆固醇含量均显著低于G0组（P＜0.05）。与G0组相比，各乳酸菌添加组血清甘油三酯、尿素氮含量及谷丙转氨酶活性均有不同程度降低，其中G2组尿素氮含量显著低于G0组（P＜0.05），G4和G5组甘油三酯含量和谷丙转氨酶活性显著低于G0组（P＜0.05）。G4组血清葡萄糖含量显著低于G0、G1和G2组（P＜0.05）。各组血清谷草转氨酶活性无显著差异（P＞0.05）。
2.4 5种乳酸菌对罗非鱼肠道菌群的影响
由表5可知，饲料中添加不同乳酸菌后肠道乳酸菌和双歧杆菌数量均有所增加，其中G1、G2和G5组乳酸菌数量显著高于G0组（P＜0.05），G1组双歧杆菌数量显著高于G0组（P＜0.05）。饲料中添加不同乳酸菌对罗非鱼肠道细菌总数和大肠杆菌数量的影响不显著（P＞0.05），但能够不同程度降低大肠杆菌的数量。
Table 3 Effect of 5 kinds of Lactobacilluson body composition of tilapia（Oreochromis niloticus×O. aureus）（wet weight basis）
表3 5种乳酸菌对罗非鱼体成分的影响（湿重基础）（续）-1
Table 4 Effect of 5 kinds of Lactobacilluson serum biochemical indices of tilapia（Oreochromis niloticus×O. aureus）
Table 5 Effect of 5 kinds of Lactobacilluson intestinal microflora of tilapia（Oreochromis niloticus×O. aureus）
3 讨论
3.1 5种乳酸菌对罗非鱼生长性能的影响
微生物制剂作为活菌类饲料添加剂，可改善肠道菌群组成［11-12］，调节营养物质的代谢平衡［13-14］，改善鱼体成分［9，15］，促进动物的生长［16-20］。刘玉林等［21］在对草鱼的研究中发现，粪肠球菌能显著提高草鱼存活率、增重率及特定生长率，并显著降低饲料系数。Son等［2］。在对石斑鱼的研究中发现，植物乳杆菌可显著提高石斑鱼的增重率并降低饲料系数。本试验结果表明，饲料中添加植物乳杆菌、戊糖乳杆菌、粪肠球菌均能促进罗非鱼的生长，降低饲料系数，与以上研究结果一致。本试验还发现，嗜酸乳杆菌组在试验前期的生长效果优于对照组，而在中后期的生长效果则要低于对照组及其他乳酸菌添加组；鼠李糖乳杆菌组在试验前中期的生长效果优于对照组，而在后期的生长效果则要低于对照组。吴志宏等［22］研究发现，在大菱鲆（Scophthalmus maximusL.）饲料中添加嗜酸乳杆菌（嗜酸乳杆菌饲料添加剂的活菌数为2.0×109 CFU/g），其试验初期效果优于对照组，试验中后期生长效果差于对照组，本试验结果与其类似。这可能是由于饲料中乳酸菌长时间投喂，致使其在肠道代谢过程中产生过量的酶，抑制鱼体内内源酶的活性，降低内源酶对营养物质的分解，从而降低了生长性能［23］，该组罗非鱼肠道消化酶活性较对照组降低（数据未列出）也验证了这一点。目前，关于乳酸菌对水产动物生长性能影响的结果不一致［9］，大多数研究认为这是由于菌种不同造成的，其中菌种的来源、活菌数量、生物活性、作用方式的不同都可能产生不同的结果［24］。因此，关于不同乳酸菌在罗非鱼饲料中的适宜添加量及其投喂方式等问题有待进一步研究。
3.2 5种乳酸菌对罗非鱼体成分的影响
目前，关于乳酸菌对水产动物体成分影响的报道较少。一般认为，乳酸菌在进入消化道后，能够分解产生动物生长过程中所必需的营养物质。也有报道称，益生菌（芽孢杆菌）能够提高肠道消化酶活性，促进水产动物对营养物质的消化吸收，增强机体对蛋白质的沉积［25］。本试验结果显示，饲料中添加乳酸菌能够增加奥尼罗非鱼鱼体粗蛋白质含量以及降低鱼体水分含量，其中戊糖乳杆菌和鼠李糖乳杆菌能显著提高鱼体粗蛋白质含量，前者还可显著降低鱼体水分含量，且其蛋白质沉积率的增加与鱼体粗蛋白质含量的增加趋势一致，这与杨奇慧等［26］在奥尼罗非鱼研究中所得结果一致。艾炎军等［27］。在泥鳅（Misgurnus anguillicaudatus）和华雪铭等［28］。在暗纹东方纯（Takifugu obscurus）的研究中也有类似报道。
3.3 5种乳酸菌对罗非鱼血清生化指标的影响
鱼类的血清生化指标能够反映出鱼类营养状况的好坏，被广泛的用来评价鱼体的新陈代谢水平和生理状况［29-30］。袁丰华等［31］在尖吻鲈（Lates calcarifer）的研究中发现，摄食地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniforrmis）的尖吻鲈，其血液中的葡萄糖和尿素氮含量显著降低。血清尿素氮含量可以较准确地反映动物体内蛋白质代谢和氨基酸之间的平衡状况，氨基酸平衡良好时血清尿素氮含量下降［32］。本试验结果表明，植物乳杆菌能够显著降低血清尿素氮含量，说明其能够改善蛋白质的代谢，提高蛋白质的利用率，与鱼体粗蛋白质含量增加相吻合。葡萄糖是机体主要的能量物质，也是细胞的重要组成成分。在正常情况下，机体内合成代谢增强时，血清葡萄糖含量下降［33］。李亚杰等［34］研究益生菌·黄芪多糖微胶囊制剂对肉仔鸡的作用时发现，同一时间内各添加组肉仔鸡的增长幅度与血清葡萄糖含量的降低程度保持一致。而本试验中各乳酸菌添加组血清中葡萄糖含量均有不同程度下降，说明添加乳酸菌能够增强罗非鱼的合成代谢活动，有利于营养物质的积累。这与本试验中鱼体干物质含量增加的结果相吻合。血清中胆固醇和甘油三酯含量的变化情况是反映机体脂质代谢功能正常与否的主要指标［35］。本试验中，各乳酸菌添加组血清中胆固醇和甘油三酯含量均有不同程度的降低，其中嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌和粪肠球菌组血清胆固醇含量显著降低，后二者的血清甘油三酯含量也显著降低。外源乳酸菌可能是通过调控机体的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A（HMG-CoA）还原酶及胆固醇7α-水解酶（CYP7A1）的合成和表达、降低胆固醇的重吸收等方式达到降低机体胆固醇含量的［36］，也有体外试验结果表明乳酸菌菌体细胞通过吸收、共沉淀、酶解转化等途径降低介质中胆固醇的含量［37］，具体机制需要进一步验证。
谷丙转氨酶和谷草转氨酶是广泛存在于动物线粒体中的重要氨基酸转移酶，在机体蛋白质代谢中起着重要的作用［38］。机体在正常状态下血液中谷丙转氨酶活性极低，但鱼体肝脏受损时血液中谷丙转氨酶和谷草转氨酶活性会升高［39］。本试验中，各乳酸菌添加组血清谷丙转氨酶、谷草转氨酶活性均低于对照组，其中鼠李糖乳杆菌和粪肠球菌组血清谷丙转氨酶活性与对照组的差异达到显著水平，表明乳酸菌能够在一定程度上对肝脏起到保护作用，这与朱学芝等［40］在凡纳滨对虾上取得的结果一致。
3.4 5种乳酸菌对罗非鱼肠道菌群的影响
益生菌可以通过生物夺氧、黏附、竞争排斥和产生抑菌代谢产物等方式调节肠道菌群的组成，抑制致病菌的过度生长，维持肠道的微生态平衡［41］。许程森［42］在对草鱼的研究中发现，投喂乳酸菌活菌制剂后，草鱼肠道中乳酸菌数量增加，养殖水体和消化道中弧菌数量降低，表明乳酸菌具有调节养殖水体和肠道菌群构成的作用。研究发现，在凡纳滨对虾的饲料中添加益生菌能够降低肠道细菌总数，并显著降低肠道弧菌总数［12］。本试验结果显示，饲料中添加乳酸菌后肠道双歧杆菌和乳酸菌的数量增加，大肠杆菌的数量减少，说明在罗非鱼饲料中添加乳酸菌可以促进肠道有益菌的生长，抑制有害菌的生长，调节肠道菌群的平衡，从而改善肠道微环境。
4 结论
综合分析认为，本试验条件下，粪肠球菌在罗非鱼中的应用效果最好。饲料中添加一定量的粪肠球菌能够提高罗非鱼的增重率和饲料利用率，降低血清胆固醇和甘油三酯含量及谷丙转氨酶活性，同时增加肠道乳酸菌数量，改善肠道微环境。
参考文献42篇略。
5种乳酸菌对奥尼罗非鱼免疫和抗病力的影响
1 材料与方法
1.1 试验材料
嗜酸乳杆菌菌株（Lactobacillus acidophilus）由广东省农科院蚕业鱼农产品加工研究所保藏，植物乳杆菌菌株（Lactobacillus plantarum）由购于广东省微生物研究所微生物菌种保藏中心，戊糖乳杆菌菌株（Lactobacillus pentosus）和鼠李糖乳杆菌菌株（Lactobacillus rhamnosus） 购自北京北纳创联生物技术研究院，粪肠球菌菌粉（Enterococcus faecalis）来源于华中农业大学。
1.2 试验饲料
饲料组成及营养水平见表 1。以基础饲料为对照组，在基础饲料中分别添加嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、戊糖乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、粪肠球菌，配制菌含量不小于108CFU/g饲料的5种试验饲料，实测饲料乳酸菌数分别为1.30×103、5.10×108、2.97×108、3.03×108、2.30×108和3.47×108 cfu/g。饲料原料经粉碎过40目筛，混合均匀后用SLX-80型双螺杆挤压机制成直径为2.0 mm的饲料，在空调房阴干，冷却后放入密封袋中，于-20℃冰箱中保存待用。
表1 试验饲料组成及营养水平（干物质基础）%
1.3 动物饲养与管理
养殖试验在广东省农业科学院动物科学研究所水产研究室室内循环水养殖系统（水体容积150 L）中进行。试验开始时，选择平均质量（3.49±0.01）g健康均匀的奥尼罗非鱼（Oreochromis niloticus × O. aureu）随机分成6组，每组设4个重复，每个重复20尾鱼，分别投喂基础饲料和5种试验饲料，记作空白组、嗜酸乳杆菌组、植物乳杆菌组、戊糖乳杆菌组、鼠李糖乳杆菌组和粪肠球菌组。每天分别在9：00和16：30投喂饲料，投饲量为体质量的4%～6%，饲养8周。每2周称重一次，并相应调整投喂量。试验期间自然光照，水温为25～28℃，溶氧量>5 mg/L，pH在7.8～8.2，氨氮≤0.02 mg/L、亚硝酸盐≤0.2 mg/L。
1.4 样品采集与测定
1.4.1 样品采集
养殖试验结束时，禁食24h，称重，统计存活率。每个重复随机取5尾鱼，用1mL无菌注射器尾静脉取血，合并置于无菌Eppendrof管中，于4℃下放置2h，经5 000r/min离心10min并分装，分装后于-80 ℃超低温冰箱保存备用。
1.4.2 血清免疫指标测定
碱性磷酸酶、抗超氧阴离子自由基、丙二醛、总超氧化物歧化酶采用南京建成生物工程研究所的试剂盒进行测定，测定方法按照试剂盒说明书进行。
溶菌酶活性的测定方法：取血，断尾或腹主动脉采血，在室温下静置1h，然后4℃冰箱中保持4h，2000r/min离心10min，取上层血清备用；用0.1mol/L的磷酸缓冲液（PBS，pH6.4）将溶壁微球菌（Micrococcus lysodeikticus）配制成一定浓度的菌悬液（OD570=0.1～0.3，菌浓度为4×106cfu/mL）；取3.0 mL该悬液于离心管中，再加入50μl血清混匀，570nm下测初始光密度值（A0）；然后将试液移于37℃水浴30 min；取出后立即置于冰浴10 min以终止反应，测反应后的光密度值（A）；计算溶菌酶的活性。
U=（A0-A）/A
式中：U为溶菌活力；A0为反应前光密度值；A为反应前光密度值。
1.4.3 感染试验
试验用嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）的菌种取自珠海市农科中心。菌种用营养肉汤琼脂培养基在37 ℃培养箱中培养24 h，复壮两次，用灭菌生理盐水清洗，集菌，4 000 r/min 离心15min，收集沉淀细菌体，进行梯度稀释，确定适当攻毒浓度（5.7 × 108 cfu /mL）后，置4 ℃冰箱中保存备用。养殖试验结束后，每组取10 尾鱼进行感染试验，每尾腹腔注射嗜水气单胞菌液0.4 mL，每组继续投喂原来的试验饲料饲养，记录7h、12h、24h、36h、48h、72h内的累积死亡情况，计算存活率。
1.5 数据统计分析
试验数据用平均值±标准误（M±SE）表示。采用SPSS17.0版软件进行数据分析和统计，先对数据作单因子方差分析（One-way ANOVA），若处理间有显著差异，再用Duncan’s多重比较。
2 结果与分析
2.1 5种乳酸菌对奥尼罗非鱼血清免疫及抗氧化指标的影响
由表可知：除粪肠球菌组显著低于空白组（P＜0.05）外，其他各组血清溶菌酶活性均有不同程度升高，其中鼠李糖乳杆菌组比空白组提24.21%，差异显著（P＜0.05）。各添加组血清碱性磷酸酶活性以戊糖乳杆菌组最高，比空白组升高42.85%，显著高于嗜酸乳杆菌组（P＜0.05），但各组间差异不显著。鼠李糖乳杆菌组和粪肠球菌组血清抗超氧阴离子自由基显著高于其他各组（P＜0.05），分别比空白组高93.61%和93.02%。鼠李糖乳杆菌组血清超氧化物歧化酶显著低于对照组（P＜0.05），其他各组间差异不显著。除嗜酸乳杆菌组外，各添加组血清丙二醛含量略有升高，但差异不显著。
表2 5种乳酸菌对奥尼罗非鱼血清免疫及抗氧化指标的影响
2.2 5种乳酸菌对奥尼罗非鱼抗嗜水气单胞菌感染能力的影响
从表3可知：注射嗜水气单胞菌7h时，各添加组罗非鱼已经出现零星死亡情况，但各组间无显著性差异。随着感染时间的延长，罗非鱼的死亡数量明显增多，存活率开始快速下降，其中G0组存活率降低程度最大，G1组次之，G2和G3组再次之，G4和G5组存活率降低趋势平缓。在感染12h时，其他各组罗非鱼存活率均高于G0组，其中G4组和G5组最高。注射嗜水气单胞菌24h时，G4和G5组的存活率高于其他各组，差异显著（P<0.05）。从24h到48h时，G0组不再出现罗非鱼死亡情况，其存活率保持不变；G1、G2和G3组存活率下降趋于平缓，而G5组的存活率降低幅度略大。此时，G4和G5组的存活率依然显著高于G0（P<0.05）。感染72 h时，G4组的存活率显著高于其他各组（P<0.05），而此时G0组的存活率降低至2.50%，比各添加组低77.50%、83.64%、85.94%、96.05%和92.98%。
表3 5种乳酸菌对奥尼罗非鱼攻毒后成活率的影响
3 讨论
3.1 不同乳酸菌对奥尼罗非鱼血清免疫及抗氧化指标的影响
研究发现，乳酸菌能够提高水产动物的免疫力［10-11］，增强其抗病原菌感染能力［12-13］。鱼类是较低等的脊椎动物，其特异性免疫机制还不完善，与其他脊椎动物不同的是鱼类的非特异性免疫机制在其防御外来病原入侵的过程中起着非常重要的作用。溶菌酶作为水产动物体内的重要非特异性防御因子，广泛存在于鱼类的黏液、血清、吞噬细胞和单核细胞的胞浆内［14］，它是衡量鱼类生理防御水平的重要标志之一，其在鱼体内的水平及活性直接关系到鱼类的免疫功能和健康。碱性磷酸酶是血细胞溶酶体的特征酶，对细菌等异物在溶酶体内的消化降解起着重要的作用［15］。潘雷等［16］在大菱鲆幼鱼（Scophthalmus maximus）中的研究发现，饲料中单一益生菌［枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）、嗜酸乳酸菌、双歧杆菌（Bifidobacterium inopinatum）］和复合益生菌均能显著提高血清溶菌酶活性。宫魁等［17］对刺参（Apostichopus japonicus）的研究表明，饲料中添加乳酸菌及其代谢产物能使刺参肠道酸性磷酸酶和碱性磷酸酶活力显著升高，提高溶菌酶活性。本试验结果显示，投喂不同乳酸菌后，部分添加组血清溶菌酶及碱性磷酸酶活性有不同程度提高，其中鼠李糖乳杆菌组血清溶菌酶活性差异显著。另外出现个别添加组血清溶菌酶及碱性磷酸酶活性低于对照组的情况，其中粪肠球菌组溶菌酶活性差异显著。吴桂玲［18］在饲料中添加复合微生态制剂长期投喂花鲈（Lateolabrax japonicus），发现饲喂42d时实验组血清溶菌酶活性与对照组无显著性差异，84d时，实验组血清溶菌酶活性显著低于对照组。本试验的研究结果与其长期饲喂的结果相似。粪肠球菌投喂的时间长短可能影响了溶菌酶的表达，需要进一步研究。
超氧阴离子自由基（O-2·）作为机体中第1个生成的氧自由基，是引起细胞脂质和蛋白质氧化的最主要的自由基，其能够进一步与其他分子作用，产生其他种类的氧自由基。从而导致机体损伤。本实验结果表明，除植物乳杆菌组外，其他各添加组血清抗超氧阴离子自由基均高于对照组。翟玲［19］在肉鸡的试验研究中发现，枯草芽孢杆菌能够显著提高其血清抗超氧阴离子自由基的含量。超氧化物歧化酶能够专一性地清除生物氧化过程中产生的超氧化物自由基，是生物抗氧化系统的重要酶类之一，能够消除自由基，防止生物分子损伤的作用［20］。丙二醛是机体被自由基氧化的产物之一，其含量的多少可以反映膜脂质过氧化的程度，也可间接的反应机体抗氧化作用的强弱。试验研究发现，除鼠李糖乳杆菌组外，其他添加组血清超氧化物歧化酶活性和丙二醛含量差异不显著。吴桂玲［18］在花鲈的研究中发现，在长期饲喂复合微生态制剂42d和84d时，微生态制剂添加组花鲈肝脏的超氧化物歧化酶活力皆显著低于对照组。说明乳酸菌对部分免疫指标的使用效果与投喂时间存在一定的关系，长时间的投喂可能会产生免疫疲劳现象，从而影响机体的免疫力。因此，投喂乳酸菌的时间对奥尼罗非鱼免疫力的影响有待进一步研究证明。
3.2 不同乳酸菌对感染嗜水气单胞菌后奥尼罗非鱼成活率的影响
研究发现，嗜水气单胞菌是引起淡水鱼类绝大多数细菌性疾病的病原菌由，其引起的死亡率可达80%，给淡水鱼养殖带来了重大的经济损失。因此，采用嗜水气单胞菌作为攻毒实验的感染毒种，能较好地评价乳酸菌对奥尼罗非鱼抗病力的影响。另外，在攻毒实验中，罗非鱼的累积死亡率具有较好的规律性和重复性，能实时反映出罗非鱼对特定病原的抵抗力，可作为衡量免疫刺激物质对机体免疫作用的重要指标［21］。Rengpipat等［22］用含有乳酸菌的饲料投喂尖吻鲈（Lates calcarifer），发现其可以显著地提高对的嗜水气单胞菌感染抵抗能力。Lee等［13］在日本鳗鲡（Anguilla japonica）的饲料中添加一定比例的戊糖乳杆菌发现其能提高生长性能和免疫系统功能，增加对迟缓爱德华氏菌感染的抵抗能力。Nikoskelainen等［23］用含有不同剂量的鼠李糖乳杆菌饲料喂养虹鳟（Oncorhynchus mykiss）51d，然后用杀鲑气单胞菌（Aeromonassalmonicida）进行攻毒，结果发现添加组的死亡率均显著低于对照组，表现出良好的抗病原菌感染能力。李桂英等［24］在凡纳滨对虾的研究中和杨奇慧等［25］在奥尼罗非鱼的研究中，发现饲料中添加微生态制剂均能提高动物的抗病力。本攻毒试验的结果显示，在感染试验进行的12 h 后各添加组的存活率一直高于对照组，且各添加组的最终存活率与血清抗超氧阴离子自由基的含量的大小趋势一致，说明乳酸菌能够提高奥尼罗非鱼注射嗜水气单胞菌后的存活率，奥尼罗非鱼的抗病力的高低与血清中抗超氧阴离子自由基含量存在较好的关联性。可能是由于乳酸菌刺激肠黏膜免疫的表达，从而提高了血清抗氧化和免疫力，特别是抗氧化能力，增强了奥尼罗非鱼机体的抗病原感染能力，从而提高了奥尼罗非鱼的存活率。关于乳酸菌对奥尼罗非鱼的抗病菌感染的作用机制有待于进一步研究。
参考文献25篇略。
嗜酸乳酸菌对吉富罗非鱼生长、非特异性免疫酶活性和肠道菌群的影响
1 材料与方法
1.1 试验饲料
以鱼粉、豆粕和菜籽粕为主要蛋白源，豆油和磷脂为主要脂肪源，次粉为主要糖原，配制基础饲料，其配方和营养成分见表1。在基础饲料中添加嗜酸乳酸菌配制含量分别为0、8×105、4×106、2×107和1.5×108 cfu/g的5种试验饲料。各种原料粉碎后通过60目筛，混合均匀，加入嗜酸乳酸菌（由广东省农业科学院生物研究所提供），搅拌混匀。用SLX-80型双螺杆挤压机制成直径为2.5 mm颗粒饲料，在空调房低温阴干，冷却后放入密封袋中于-20℃冰箱中保存备用。
表1 基础饲料配方及营养组成（%）
1.2 试验鱼及饲养管理
吉富罗非鱼苗购自广州番禺罗非鱼良种场。试验鱼先暂养于室外循环水泥池中，每天饱食投喂2 次，驯养1 周。饲养试验在广东省农业科学院动物科学研究所水产研究中心的室内循环水养殖系统进行。试验开始时选取平均体重为（2.43±0.03）g的健康幼鱼600 尾，随机分成5组，每组4 个重复，每个重复30 尾鱼。分别投喂5种试验饲料，记作G0、G1、G2、G3和G4。每天在09：00 和17：00分2次投喂饲料，投饲率为6%～8%。饲养的玻璃纤维桶容积为350 L（直径80 cm，高70 cm，水体容积300 L），养殖水源为经过活性炭、珊瑚石过滤后的自来水，流水速率为5L/min。以自然光为光源，水温为22.0～32.0℃，pH 7.8 ～ 8. 2，溶氧为＞5mg /L，氨氮≤0.02 mg /L，亚硝酸盐≤0.2 mg /L。饲养期为6周。每天观察罗非鱼健康状态，记录死亡情况。
1.3 样品采集与测定
1.3.1 样品采集
养殖试验结束时，禁食24 h，分别统计每个重复的存活率，称量每缸鱼的总重。每个重复选取5尾全鱼置于- 20 ℃冰箱中用于测定全鱼体水分、粗蛋白、粗脂肪、灰分含量。每个重复随机取5尾鱼，用1mL无菌注射器尾静脉取血，合并置于无菌Eppendrol管中，4 ℃冰箱静置12h后5 000 r/min离心10 min并分装，置于-80℃冰箱保存备用。每个重复随机选取5尾鱼，无菌操作下打开鱼体腹腔，用乙醇擦拭肠道外部，无菌生理盐水冲洗2～3次，剪下肠道放入无菌离心管中备用。
1.3.2 生长指标计算
增重率（Weight gain rate，WGR，%）=100×（末体重-初体重）/初体重
特定生长率（Specific growth rate，SGR，%/d）=100×［ln（末均重）－ln（初均重）］ /饲养天数
饲料系数（Feed coefficient，FC）=摄食量/（终末鱼体重＋死亡鱼重－初始鱼重）
蛋白质效率（Protein efficiency ratio，PER，%）=100×（终末鱼体重＋死亡鱼体重－初始鱼体重）/摄入蛋白量
肝体比（Hepatosomatic index，HSI，%）=（肝脏重/体重）×100
肥满度（Condition factor，CF，g/cm3）= 100×鱼体重/鱼体长3
1.3.3 常规成分测定
粗蛋白含量采用凯氏定氮法（GB/T 6432—1994）、粗脂肪含量采用乙醚抽提法（GB/T 6433—1994）、灰分含量采用550℃灼烧法（GB/T 6438—1992）、水分含量采用105℃烘箱干燥法（GB/T 6435—1986）进行测定。
1.3.4 血清指标测定
溶菌酶（lysozyme，LZM）、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，AKP）、酸性磷酸酶（acid phosphatase，ACP）和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性的测定采用南京建成生物工程研究所的试剂盒进行测定，测定方法按照试剂盒的说明进行。
1.3.5 肠道菌群测定
称取0.5g左右的肠道，按1∶9（重量/体积）加入无菌生理盐水，冰浴中200r/min匀浆制成浓度为10-1原液，再依次以10倍系列稀释，选择合适的稀释度测乳酸菌、双歧杆菌、大肠杆菌及细菌总数。乳酸菌通过涂布MRS琼脂培养基测定；双歧杆菌通过涂布BBL琼脂培养基测定；大肠杆菌通过涂布SMAC琼脂培养基测定；总菌通过涂布TTL琼脂培养基测定；置37℃培养箱中培养48h。每种培养基每个稀释度做3个重复。培养结束后，选取平均菌落为30～300的用于菌落计数。计算方法采用每克肠道菌落形成单位即cfu/g（平均菌落×稀释倍数×10）。
1.4 数据统计与分析
试验数据用平均值±标准差（±SD）表示。采用SPSS17.0版软件进行数据分析和统计，先对数据作单因子方差分析（One-way ANOVA），若处理间有显著差异，再用Duncan’s 多重比较。差异显著度为0.05。
2 结果与分析
2.1 嗜酸乳酸菌对吉富罗非鱼生长性能的影响
由表2可知，G3和G4罗非鱼的增重率（WGR）和特定生长率（SGR）均高于G0，但差异不显著（P>0.05）。蛋白质效率（PER）以G3最高，饲料系数（FC）以G3最低，各组之间差异不显著（P>0.05）。各组罗非鱼的肝体比和肥满度没有显著性差异（P>0.05）。
表2 乳酸菌对吉富罗非鱼生长性能的影响
2.2 嗜酸乳酸菌对吉富罗非鱼体组成的影响
由表3可见，与对照组相比，饲料中添加乳酸菌对罗非鱼体常规成分中水分和灰分含量没有显著影响（P>0.05）。各添加组全鱼粗蛋白和粗脂肪含量均高于对照组，其中G1粗蛋白含量和G2粗脂肪含量显著升高（P<0.05）。
表3 乳酸菌对吉富罗非鱼体组成的影响
2.3 嗜酸乳酸菌对吉富罗非鱼血清非特异性免疫相关酶活性的影响
由表4可知，G2～G4罗非鱼血清中SOD活性均高于对照组，其中G3比对照组升高20.97%，差异显著 （P<0.05）。罗非鱼血清LZM活性以G3最高，但组间差异不显著（P>0.05）。与对照组相比，各添加组罗非鱼血清AKP活性和ACP活性均升高，其中G4的AKP活性与对照组相比有显著性差异（P<0.05）。
表4 乳酸菌对吉富罗非鱼血清非特异性免疫相关酶活的影响
2.4 嗜酸乳酸菌对吉富罗非鱼肠道菌群的影响
由表5可知，饲料中添加乳酸菌能降低罗非鱼肠道细菌总数，其中G2和G3显著低于对照组（P<0.05）。G2～G4罗非鱼肠道大肠杆菌数量与对照组相比显著降低（P<0.05）。饲料中添加不同水平乳酸菌对罗非鱼肠道双歧杆菌和乳酸菌数量的影响不显著（P＞0.05），但后者呈现升高的趋势，在G3达到最高水平。
表5 乳酸菌对吉富罗非鱼肠道细菌总数、双歧杆菌、大肠杆菌和乳酸菌数量的影响
3 讨论
研究表明，微生物制剂作为一种新型绿色饲料添加剂，可以促进水产动物的生长［7-9］、增强动物的免疫力［10-12］。Byun等［13］对牙鲆（Paralichthys olivaceus）投喂含乳酸杆菌饲料30d后发现，其增重率和特定生长率显著提高。Son等［14］在斜带石斑鱼（Epinephelus coioides）的研究中报道，植物乳酸杆菌可显著提高石斑鱼的增重率和降低饲料系数。Suzer等［15］的研究表明，在黑鲷（Sparus macrocephalus）的仔鱼发育阶段使用乳酸菌，可以提高仔鱼的生长性能，尤其是添加于仔鱼的活饵料或者水体中，可达显著水平。本试验结果表明，饲料中添加嗜酸乳酸菌对吉富罗非鱼的生长性能影响不显著，但4×106cfug -1和2×107cfug -1组增重率均高于对照组，表现出升高的趋势。这与王国霞等［16］的研究结果相似，在凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）饲料中添加嗜酸乳酸菌，对对虾的增重率没有显著性影响，增重率表现出一定程度的升高趋势。乳酸菌的促生长作用效果不完全一致，可能与水产动物的种类、大小、食性、饲养时间、投喂剂量以及乳酸菌的种类和来源有关。关于嗜酸乳酸菌的促生长机理及其对吉富罗非鱼的适宜添加量等问题尚有待进一步深入研究。
关于益生菌对水产动物体常规成分的影响研究较多，但有关嗜酸乳酸菌在这方面的报道较少。本试验结果显示，饲料中添加嗜酸乳酸菌对吉富罗非鱼全鱼水分和灰分含量影响不显著，各添加组的粗蛋白和粗脂肪含量有不同程度的升高。这与芽孢杆菌的研究结果相似，陈晓瑛等［17］研究结果表明，饲料中单独添加芽孢杆菌可显著提高凡纳滨对虾粗脂肪含量。华雪铭等［18］在以芽孢杆菌为主导菌的益生素投喂暗纹东方鲀（Takifugu obscurus）的研究中发现，可增加鱼体蛋白，降低鱼体脂肪。但王国霞等［19］在凡纳滨对虾饲料中添加嗜酸乳酸菌发现，对虾的体成分并没有显著性差异。本试验结果与上述报道不完全不一致，说明乳酸菌和其他益生菌对不同动物的作用效果可能存在差异，有待进一步探讨。
超氧化物歧化酶（SOD）、溶菌酶（LZM）、酸性磷酸酶（ACP）和碱性磷酸酶（AKP）是反映动物免疫力的重要指标。SOD可抑制氧自由基的形成，在一定程度上反映出机体内氧自由基的代谢情况及机体的抗氧化能力［20］。LZM是吞噬细胞杀菌的物质基础，是一种广泛分布的阳离子酶，能水解革兰氏阳性细菌的细胞壁中黏肽的乙酰氨基多糖，并使之裂解、释放出来，形成一个水解酶体系，破坏和消除侵入体内的异物，从而负担起机体的防御功能［21］。免疫酶活性的提高可以增强动物机体的免疫和防御功能。Son等［14］研究表明，饲料中添加植物乳酸杆菌可提高石斑鱼血清溶菌酶活性，显著提高吞噬细胞的活性、吞噬指数及头肾白细胞呼吸爆发。Balcazar等［22］用含106 cfug-1的乳酸杆菌和串珠杆菌的混合物喂养虹鳟（Oncorhynchus mykiss） 14～21d，结果显示能显著增加血清中溶菌酶的活性。王国霞等［16］在饲料中添加嗜酸乳酸菌对凡纳滨对虾血清溶菌酶、过氧化物酶活性有显著性影响，可不同程度提高超氧化物歧化酶、酚氧化酶活性。本试验结果表明，饲料中添加乳酸菌可不同程度的提高罗非鱼血清超氧化物歧化酶、酸性磷酸酶和碱性磷酸酶活性，其中4×106 cfug -1组超氧化物歧化酶活性和2×107 cfug -1组碱性磷酸酶活性分别显著升高。这与上述研究结果相似，推其原因，可能是乳酸菌菌体或其代谢产物对肠道黏膜具有免疫刺激作用［2］，从而提高动物的非特异性免疫力，其具体机制有待深入研究。
肠道微生物对肠道组织的形态、代谢和功能的影响极大。良好的肠道微生物菌群在机体内构成了一道天然屏障，对动物的营养、生长、消化、防病、免疫等方面起着重要作用［23］。胡毅等［24］研究发现，饲料中添加益生菌能一定程度降低凡纳滨对虾肠道细菌总数，可显著降低肠道弧菌总数。陈营等［25］对牙鲆稚鱼投喂添加由单一鼠李糖乳杆菌P15制备的微生态制剂和黄霉素，结果表明，在投喂乳酸菌液和冻干菌粉后，养殖水体和牙鲆肠道的乳酸菌数均呈上升趋势，在30d后乳酸菌数量达到稳定并在肠道内定植。同时，由于乳酸菌的抑制作用，弧菌的数量下降，以肠道中的弧菌最明显。尹军霞等［26］报道对鲫鱼（Carassius auratus）投喂益生菌剂的饲料后，益生菌剂组能显著增加鲫鱼肠道的厌氧菌、双歧杆菌和乳酸杆菌，显著降低鲫鱼肠道的好氧菌。本试验结果表明，饲料中添加适量的嗜酸乳酸菌能降低罗非鱼肠道细菌总数，显著降低大肠杆菌总数。推测其原因，可能是乳酸菌在代谢过程中产生了大量有机酸等酸性物质，从而使得胃肠道保持偏酸性环境，降低了肠道pH，抑制病原微生物的生长，从而降低大肠杆菌数量。本试验结果与上述报道相似，但也有研究发现，饲料中添加益生菌对斑节对虾（Penaeus monodon）肠道弧菌影响不显著［27］，说明益生菌抑菌的作用效果与试验动物有关。
参考文献28篇略。
酶制剂对南美白对虾幼虾生长性能及消化酶活性的影响
第三届全国酶制剂在饲料工业中应用学术与技术研讨会论文集
酶制剂对南美白对虾幼虾生长、体组成及非特异免疫的影响
第三届全国酶制剂在饲料工业中应用学术与技术研讨会论文集
乳酸菌对南美白对虾保鲜效果的初步探讨
广东农业科学，2010（10）：117-119
四、氨基酸、维生素、微量元素
（一）氨基酸
A Study on Dietary L-lysine Requirement of Juvenile Yellow Catfish Pelteobagrus fulvidraco
Introduction
It is true that the survival，health，growth and efficiency of feed utilization of fish depend on the nutritive value of feeds.Protein，providing the body with energy and participating in the synthesis of hormones，antibodies，enzymes and tissues，is essential for growth and development of fish and is considered to be the most important nutrient in fish feeds（Keembiyehetty & Gatlin，1992）.From the perspective of digestive physiology，the study on requirement for protein which mainly consists of 20 kinds of amino acids in fish is the study on requirement for amino acids in nature.All species of fish studied so far have been proved to require 10 essential amino acids （EAAs） in their diets for the optimum growth （Wilson，1985）.Studies have been conducted on requirements for all the 10 EAAs of a few kinds of cultured fish such as common carp （Nose，1979），Nile tilapia （Santiago & Lovell，1988），Indian major carp （Ahmed & Khan，2004），catla （Catla catla） （Ravi & Devaraj，1991），coho salmon （Arai & Ogata，1993），chum salmon （Akiyama & Arai，1993），milk fish （Chanos chanos） （Borlongan & Coloso，1993），Chinook salmon，channel catfish and Japanese eel（NRC，1993）.
Evaluation of lysine requirement is of particular importance in the research of fish nutrition（Hauler & Carter，2001），because lysine is the EAAs found in the highest concentration in the carcass of many species of fish （Wilson & Cowey，1985；NRC，1993） and the first-limiting EAA in protein sources commonly used in fish feeds，especially in many plant feedstuffs （Forster & Ogata，1998） such as soybean meal and cereal grain generally utilized to replace all or a portion of fishmeal for low-cost and economical diet formulation for fish.Protein is usually the most expensive feed component and fishmeal has become increasingly expensive in recent years.Therefore，the increased reliance on protein sources with poorer lysine content gives rise to the need to pay greater attention to the essential lysine requirement of fish.Several investigations have been conducted to estimate the requirement for lysine of various fish species （Nose，1979；Griffin et al，1992），and the reported requirements ranged from 12.0 to 24.9 g/kg of diet or from 32.0 to 63.2 g/kg of dietary protein （Wilson，2002；Zhang et al，2007）.
Yellow catfish （Pelteobagrus fulvidraco） is one of the most highly valued freshwater food fish in China，and recently，its culture has become more extensive.It has been known that the successful intensive fish farming depends on the development of low-cost but nutritionally efficient artificial diets and the improvement of production technology.Currently，the lack of data on nutrient requirement of juvenile yellow catfish is one of the major technical constraints for developing low-cost and nutritionally rich diet for yellow catfish.So far，no information on EAA requirement of this species is available.Thus，in practical diet formulation，it is essential to learn the quantitative lysine requirement of this fish.
This study was aimed to determine the lysine requirement of juvenile yellow catfish through the study of nutrient-response relationship by using diets containing fish meal and soybean protein concentrate （SPC） as protein sources and fish oil together with soybean oil as lipid sources，which were supplemented with six graded levels of crystalline L-lysine.
Materials andm ethods
Experimental diets
Table 1 shows the composition of the experimental diets that were formulated to contain 405 g/kg crude protein and 71 g/kg crude lipid and the analysed chemical composition.Amino acid composition （g/kg dry diet） of the experimental ingredients and diets is presented in Table 2.Six isonitrogenous and isoenergetic diets containing fish meal（FM） and SPC as protein sources and fish oil together with soybean oil as lipid sources were formulated and supplemented with six graded levels of crystalline L-lysine （16.3-41.3 g/kg of dry matter with an increment of 5 g/kg）.Dietary lysine concentrations of the six experimental dietwere confirmed by reversed-phase high-performance liquid chromatography （HPLC） as 17.3，21.8，26.0，31.3，35.5 and 41.9 （g/kg dry diets），and the six experimental diets were marked with D17.3，D21.8，D26.0，D31.3，D35.5 and D41.9，respectively.The experimental dietary protein level was controlled below the optimum protein requirement （420-445 g/kg） of juvenile yellow catfish to ensure the maximum utilization of lysine for growth and limit catabolism of energy.Diet 1 （D17.3） containing 250 g/kg fish meal，120 g/kg soybean protein and mixture of 143.9 g/kg crystalline L-amino acid without crystalline L-lysine was used as the control diet.The other diets （D21.8，D26.0，D31.3，D35.5 and D41.9） were supplemented with different levels of crystalline L-lysine.Mixture of cellulose，glycine and aspartic acid were added to ensure all the diets being isonitrogenous and isoenergetic.
Diet ingredients were ground into fine powder through 250-μm mesh.Micro-components were added in a progressively enlarging manner.During the mixing of dietary ingredients，6 N NaOH was added to adjust the pH to 7-8，because it was conducive to promote the utilization efficiency of amino acids when dietary pH was 5 or higher （Murai et al，1983）.The pH of the diets was obtained by homogenizing a portion of 10 g diet with 100 mL of distilled water with a glass electrode pH meter on the supernatant （Luo et al，2006）.The mixture of crystalline L-amino acids （CAA） was precoated with carboxymethyl cellulose （CMC），and then，the CMC-coated CAA mixture was added to micro-components and was then mixed until the mixture became homogenous.In order to improve the water stability of the diets，25 g/kg dry diet carrageenan was added to the mixture.Fish oil，soybean oil and distilled water （300 g/kg）were added to the premixed dry ingredients gradually and were mixed thoroughly until the mixture became homogenous.The 2.5-mm-diameter pellets were made with single screw extruder and were air-dried until moisture content was less than 100 g/kg .The dry pellets were put into plastic bags and stored at -20℃ for use.
Fish and experimental conditions
The experiment was conducted in an indoor re-circulating aquaculture system in Guangdong Academy of Agricultural Sciences，Guangzhou，China.Juvenile yellow catfish were obtained from a commercial farm in Guangzhou，China.Before the experiment，juvenile yellow catfish were reared in three tanks and fed with the control diet D17.3 for 2 weeks to acclimatize them to the experimental diets and conditions.At the beginning of the experiment，the fish was fasted for 24 h and then weighed.Fish of similar sizes （initial weight being 1.48±0.01 g） were randomly distributed into 24 circular tanks （0.3 m3） with freshwater，and each tank was stocked with 40 fish.Each of the diets was assigned to four identical tanks.Water replacement rate in the system was about 20%per day，and water flow through the tanks was 8-10 L/min.The fish were fed to apparent satiation twice a day.The amount of diet consumed by fish in each tank was recorded each day，and the daily amount was adjusted according to the amount consumed the day before.The feeding trial lasted for 8 weeks.During the experimental period，average water temperature was 28.0±0.1℃，pH was 7.40-7.80，ammonia nitrogen was lower than 0.03 mg/L and the dissolved oxygen was not less than 7.0 mg/L.At 10：00 and 16：00 each day，fish manure was siphoned out of the tanks and water temperature was recorded.The water quality was monitored every 2 weeks.
Table 1 Formulation and proximate composition of the experimental diets
Table 1 Formulation and proximate composition of the experimental diets（续）-1
Sample scollection and chemical analysis
At the end of the 8-week feeding trial，all fish were counted and weighed to determine weight gain （WG），specific growth rate （SGR），feed efficiency （FE），protein efficiency （PE） and survival rate （SR）.Ten fish from each group were killed and stored at -20℃ for the analysis of whole-body composition，and five fish from each tank were individually weighed and their length of body，weights of the viscera，and mesenteric fat were determined for the calculation of condition factor（CF），viscerosomatic index （VSI），hepatosomatic index （HSI）and intraperitoneal ratio （IPR）.White muscle from fish-back and viscera of five fish from each group were sampled，sealed in plastic bags and frozen at -20℃ for the analysis of muscle nutrient composition，amino acids profile and viscera nutrient composition.Blood samples were collected from caudal vein of five fish from each tank approximately 24 h after the last feeding，and the plasma was separated by centrifugation and stored at -80℃ for analysis.
Table 2 Amino acid and analysed amino acid composition （g/kg dry diet） of the experimental ingredients for lysine requirement study
Crude protein，crude lipid，moisture and ash content in diets，liver，muscle and whole body were determined by standardized methods ［Association of Official Analytical Chemists （AOAC） 1995］. Moisture content was determined by oven-drying at 105℃ until the weight was constant.Crude protein content （N×6.25） was determined by the Kjeldahl method using semi-automatic Kjeldahl System （1030 Auto-analyzer，Tecator，Hoganos，Sweden） after acid digestion.Crude lipid content was determined by the etherextraction method using Soxhlet System HT6 （Soxtec System，Tecator，Sweden）.Ash content was determined by burning samples at 550℃ in muffle furnace for 24 h.The amino acid composition of ingredients，diets，white muscle and plasma of all samples were analysed with the automatic amino acid analyzer （Hitachi835-50，Hitachi Co，Ltd，Tokyo，Japan）after the acid hydrolysis.Plasma protein，cholesterol，triacylglycerol and glucose were determined by using an automatic blood analyzer （Hitachi 7170A，Japan） provided by a clinical laboratory （The First Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University，Guangzhou，China）.
Calculations
The variables were calculated as follows：
Weight gain （WG，%）=100×（final body weight×initial body weight）/initial body weight.
Specific growth rate（SGR，% per day）=100×［ln （final average body weight）-ln（initial average body weight）］/days of the experiment.
Feed efficiency （FE）=100×WG（g）/total feed intake（dry matter，g）.
Protein efficiency ratio（PER）=body WG（g）/protein intake （g）.
Survival rate （SR，%）=100×（final amount of fish）/（initial amount of fish）.
Hepatosomatic index（HSI）=100×（liver weight，g）/（body weight，g）.
Intraperitoneal ratio（IPR）=100×（intraperitoneal fat weight，g）/（whole-body weight，g）.
Condition factor（CF）=100×whole-body weight（g）/［body length （cm）］3
Viscerosomatic index （VSI）=100×Viscera weight（g）/whole-body weight （g）.
水产动物抗氧化与免疫的营养调控研究进展
Lysine intake（LI）=MFI×（Dietary lysine content，%）.
Statistical analysis
Results were presented with mean±SD All data were analysed by one-way analysis of variance （ANOVA） and tested by Duncan’s Multiple Rang Test using SPSS software （Version13.0）to determine the effect of experimental diets.Significance levels applied P＜0.05.One-slope，quadratic broken-line analysis model in SAS software（Version 8.1）（Portz et al，2000；Parr et al，2003；Robbins et al，2006）was used to estimate the dietary L-lysine requirement.
Results
Growth performance
Live WG，SGR，FE，PER，mean feed intake（g per fish per day），lysine intake（g per fish per day） and SR of yellow catfish fed with graded levels of dietary lysine are presented in Table 3.No pathological signs were observed during the trial，and no anomalies were occurred at the end of feeding experiment.It could be seen from the table that dietary lysine levels significantly affected WG and SGR of juvenile yellow catfish in this trial.Fish fed with the diet including 31.3 g/kg lysine （D31.3） had the highest WG and SGR and had no significant difference from those fed with diet containing 26.0，35.5 and 41.9 g/kg lysine （D26.0，D35.5 and D41.9），respectively，while fish fed with diet containing 17.3 and 21.8 g/kg lysine （D17.3 and D21.8） had relatively lower WG and SGR.Similar trends were also observed for FE and PER.According to the analysis of one-slope，quadratic broken-line analysis model，the relation equation between SGR and the dietary lysine level was y=3.6778-0.2416×（z1）×（z1）-0.1446×（z2）［If（x<3.3124，y=3.6778-0.24*（z1）（z 1），y= 3.6778-0.1446*（z2）］（z1=3.3124-x；z2=x-3.3124） （r =0.9856） （Figure 1）.Based on this equation，the optimum requirement for dietary lysine was estimated to be 33.1 g/kg of diet（83.2 g/kg of the dietary protein）.SRs of fish among all dietary treatments ranged from 86.9% to 93.8%，indicating that it was not significantly affected by the dietary lysine level.
Table 3 Initial body weight （g），final body weight （g），weight gain （WG，%），specific growth rate（SGR，% per day），protein efficiency ratio（PER），feed efficiency（FE），mean feed intake（g per fish per day），lysine intake（g per fish per day）and survival rate（SR，%）at the final sampling for juvenile yellow catfish fed with experimental diets of different lysine levels（mean±SD，n=4）
Table 3 Initial body weight （g），final body weight （g），weight gain （WG，%），specific growth rate（SGR，% per day），protein efficiency ratio（PER），feed efficiency（FE），mean feed intake（g per fish per day），lysine intake（g per fish per day）and survival rate（SR，%）at the final sampling for juvenile yellow catfish fed with experimental diets of different lysine levels（mean±SD，n=4）（续）-1
Figure 1 Relationship between the dietary lysine level and specific growth ratio （SGR）of juvenile yellow catfish based on One-slope，quadratic broken-line analysis model（Portz et al，2000；Parr et al，2003；Robbins et al，2006；）
Whole body，white muscle，viscera composition and morphometry index
Table 4 Moisture，crude protein，crude lipid，ash content in whole body，white muscles and viscera of the juvenile yellow catfish fed with experimental diets of different lysine levels （all values are g/kg dry diet unless otherwise indicated，mean±SD，n=4）
Table 4 Moisture，crude protein，crude lipid，ash content in whole body，white muscles and viscera of the juvenile yellow catfish fed with experimental diets of different lysine levels （all values are g/kg dry diet unless otherwise indicated，mean±SD，n=4）（续）-1
Table 4 shows the moisture，crude protein，crude lipid，ash content in whole body，white muscle，viscera of the juvenile yellow catfish fed with graded levels of dietary lysine.Significant differences in moisture，crude protein and ash content of whole body were observed among all the dietary treatments，while the crude lipid content of whole body was relatively similar among all the groups.The crude protein content of whole body increased with the increase in dietary lysine level from 17.3 g/kg up to 31.3 g/kg and then declined beyond the dietary lysine of 31.3 g/kg，but showed no significant difference when the dietary lysine level was 26.0-41.9 g/kg .The moisture and crude protein content in muscle were significantly affected by the dietary lysine level，while the crude lipid and ash content in muscle did not significantly decrease as the dietary lysine level increased.No significant differences were observed for viscera in the abovementioned parameters except for moisture content.
Viscerosomatic index，HSI，CF and IPR of the juvenile yellow catfish fed with graded levels of lysine are presented in Table 5.There were no significant differences in VSI，HSI and IPR among all the groups，but fish fed with the diet containing low lysine content had higher HSI and IPR.Significant differences in CF were observed among fish fed with different levels of lysine ranging between 17.3 and 41.9 g/kg，and the best CF occurring in the group fed with the diet containing 31.3 g/kg dietary lysine.
Table 5 Hepatosomatic index （HSI），viscerosomatic index （VSI），condition factor （CF），intraperitoneal ratio （IPR） of the juvenile yellow catfish fed with experimental diets of different dietary lysine levels（all values are g/kg dry diet unless otherwise indicate，mean±SD，n=4）
Plasma biochemical parameters
Amino acid profile in the muscle and the plasma
The amino acid profile in muscle and plasma of the juvenile yellow catfish fed with graded levels of dietary lysine is shown in Tables 7 & 8，respectively.It could be seen from Table 7 that，except for serine and glycine，the muscle amino acid profile of yellow catfish fed with the experimental diets containing different levels of lysine was not significantly affected by the dietary lysine concentration，while concentrations of arginine，lysine，aspartic acid，glutamic acid，tyrosine and alanine increased with the increase in dietary lysine level from 17.3 g/kg to the optimum lysine requirement and then declined thereafter.From Table 8，it was known that dietary lysine had significant impact on some free amino acid in plasma such as isoleucine，leucine，threonine，methionine，lysine，valine，tyrosine，glutamic acid，cystine and alanine （P<0.05），and concentrations of these acids，to some extent，all increased with the increase in dietary lysine level and then declined when dietary level reached the optimum lysine requirement.For concentrations of the rest of the free amino acid in plasma，no significant difference was observed between all the dietary treatments.
Table 7 Amino acid profile in the muscle of the juvenile yellow catfish fed with experimental diets of different dietary lysine levels （all values are g/kg dry diet unless otherwise indicate，mean±SD，n=4）
Table 7 Amino acid profile in the muscle of the juvenile yellow catfish fed with experimental diets of different dietary lysine levels （all values are g/kg dry diet unless otherwise indicate，mean±SD，n=4）（续）-1
Table 8 Amino acid profile in plasma of the juvenile yellow catfish fed with experimental diets of different dietary lysine levels （10-1μmol per100 mL，mean±SD，n=4）
Discussion
In this study，WG，SGR，FE and PER were improved as the crystalline L-lysine in diets increased and then declined when the crystalline L-lysine further increased when dietary level reached the optimum dietary lysine requirement.Fish fed with the diet containing 31.3 g/kg lysine （77.3 g/kg of dietary protein） showed better growth performance and FE than other fish fed with diets containing 17.3，21.8，26.0，35.5 and 41.9 g/kg lysine，respectively.The results indicated that lysine was one of the EAAs for the growth and nutrition retention of juvenile yellow catfish and juvenile yellow catfish could make good use of lysine in crystalline form.This result was similar to those of the previous studies on some other species such as Chinook salmon，Japanese seabass and juvenile cobia （Arai，1972；Wang et al，2005；Mai et al，2006；Zhou et al，2007）.The quantitative lysine requirements of several cultured fish species were different because of the differences in the species，age and size of fish，the nature of the dietary protein sources in the test diets，the reference protein which amino acid pattern is being mimicked （Forster & Ogata，1998），feeding practices and rearing conditions（Tacon & Cowey，1985；Forster & Ogata，1998；Mai et al，2006）.In addition，digestibility，assimilation rate amino acid profile and energy content may also bring about variable effects in amino acid requirement studies （De Silva et al，2000）.Furthermore，variations might also be attributed to the statistical method （Mai et al，2006；Zhou et al，2006）.
Dose-response experiment with increasing supplies of amino acid has been accepted in principal as a method for determining dietary amino acid requirements （Cowey，1995）.According to the second-order polynomial regression analysis model，the relation equation of SGR and dietary lysine level was y=0.1988x2+1.3717x+1.3142（R2=0.9524） and dietary lysine requirement of juvenile yellow catfish was 34.5 g/kg of dry diet （86.7 g/kg dietary protein），and the value of SGR would not increase when dietary lysine level was less than or beyond this requirement. However，according to the one-slope，straight broken-line analysis model，the relation equation of SGR and dietary lysine level was Y=3.643-0.496 （2.82-X（r=0.97） and the optimum dietary lysine level was determined to be 28.2 g/kg （70.9 g/kg of the dietary protein）；according to the oneslope，quadratic broken-line analysis model of the relationship between SGR of juvenile yellow catfish and varying levels of dietary lysine，the relation equation of SGR and dietary lysine level was y=3.6778-0.2416×（z1）×（z1）-0.1446×（z2）［If（x<3.3124，y=3.6778-0.24*（z1）（z 1），y=3.6778-0.1116*（z2）］（z1=3.3124-x；z2=x-3.3124） （r=0.9856）and the optimum dietary lysine level was determined to be 33.1 g/kg of dry diet （83.2 g/kg of the dietary protein）. The value obtained from the relation equation of SGR and dietary lysine using broken-line analysis method was relatively lower than those obtained by using the second-order polynomial regression analysis model （Baker，1986）. This might be attributed to the difference in analysis methods that could result in different values of dietary lysine requirement （Zhou et al，2007）.Taking the correlation coefficient in this study into consideration，the coefficient of estimation （R2） of one-slope，quadratic broken-line analysis model （0.971） was higher than that of the one-slope，broken-line analysis model （0.941） and the second-order polynomial regression analysis （0.952）.Besides，Parr et al（2003） evaluated the isoleucine requirement of growing （25-45 kg） pigs and concluded that use of the straight broken-line model was likely to underestimate the isoleucine requirement. Those researchers observed that the growth response to lower levels of isoleucine was curvilinear，and they suggested that the abscissa of the intersection of the straight broken line with a quadratic regression curve was a more accurate estimate（Robbins et al，2006）.The result of this study was similar with that by Robbins et al（2006），and that was the reason why this analysis model was also adopted in this study. Therefore，the value of dietary lysine requirement obtained with one-slope，quadratic broken-line analysis model was regarded as the optimum dietary lysine requirement of juvenile yellow catfish，being 33.1 g/kg of dry diet （83.2 g/kg dietary protein）. This result of dietary lysine requirement was within the range of 29.1-37.4 g/kg of the diet in the study conducted byWang（2004）who calculated the optimum requirement of lysine of juvenile yellow catfish based on amino acid pattern in the muscle of Wuhan Yellow Catfish （Hubei，China） （Huang et al，1999），Poyang Lake Yellow Catfish （Jiangxi，China） （Zhang et al，2001） and Guijiang Yellow Catfish （Guangxi，China） （Huang et al，2001）. Some studies pointed out that the research results of amino acid requirement of fish should be reported as a percentage of dietary protein （Santiago & Lovell，1988）. The lysine requirement of juvenile yellow catfish （83.2 g/kg of the dietary protein）was higher than the requirement reported for common carp at 57.0 g/kg （Nose，1979），catla at 62.0 g/kg （Ravi & Devaraj，1991），rohu at 58.8 g/kg （Khan & Jafri，1993），Indian major carp （Cirrhinus mrigala） at 57.5 g/kg （Ahmed & Khan，2004），Nile tilapia at 51 g/kg （Santiago & Lovell，1988），yellowtail at 38.5 g/kg （Ruchimat et al，1997），juvenile Japanese seabass at 58.0±0.12 g/kg （Mai et al，2006） but lower than gibel carp at 85.2 g/kg （Zhou et al，2006）. The above-mentioned results suggested that juvenile yellow catfish seemed to have higher lysine requirement than that of other species with a requirement of 33.2-66.1 g/kg of dietary protein. The explanation for this might be contributed to that juvenile yellow catfish is the carnivorous animal and fish demanding high dietary protein requirements usually need relatively higher lysine content in diet than fish demanding low dietary protein （Zhou et al，2007）.
Some studies reported that the values of WG，SGR and PER of fish fed with high dietary lysine were high and then remained relatively constant or decreased when reaching the optimum lysine requirement （Forster & Ogata，1998；Luo et al，2006；Mai et al，2006；Zhou et al，2007），which was consistent with the findings of this study.The reason for this might be the lysine deficiency，inhibiting effect and new imbalance caused by excessive dietary lysine.Lysine deficiency caused loss of appetite，resulting in low feed intake and reduced growth rate as shown in milkfish （Borlongan & Benitez，1990），Indian major carp （Khan & Jafri，1993；Ahmed & Khan，2004），Japanese sea bass （Mai et al，2006）and Juvenile cobia（Zhou et al，2007）.Meanwhile，excessive dietary lysine might also cause new imbalance between AA and induce inhibiting effect which negatively affected the growth performance and feed utilization （Walton et al，1984a；Ahmed & Khan，2004）.
The data of whole-body composition in this study was partially in accordance with some studies on some other species，and it was believed that lysine supplementation positively increased the protein content of whole body of fish （Zarate & Lovell，1997；Rodehutscord et al，2000a；Rodehutscord et al，2000b；Ahmed & Khan，2004；Luo et al，2006；Zhou et al，2007）.There were no significant differences observed in VSI，HSI and IPR among all the dietary treatments，which was similar to the studies by Walton et al（1984a）and Zhou et al（2007），and fish fed with the dietcontaining low lysine content had higher HSI and IPR.However，Luo et al（2006） observed that grouper fed with low lysine diets tended to have lower HSI than those fed with high lysine diets.
As far as we know，there is little information about the impact of dietary lysine level on plasma total protein，cholesterol，triacylglycerol and glucose content of juvenile yellow catfish.In this study，total protein content in plasma was greatly affected by different levels of dietary lysine，which was similar to the finding of our previous study that total protein in plasma was significantly affected by different levels of dietary methionine （to be published）.Wang et al（2005），Luo et al（2006） and Zhou et al（2007） observed in the studies of grass carp，grouper and cobia that dietary lysine level had significant effect on total protein，cholesterol，triacylglycerol and glucose concentration in plasma.Ruchimat et al（1997）found that in the study of quantitative lysine requirement of yellowtail，the dietary lysine level had a remarkable impact on the composition of plasma except for phospholipids and cholesterol.
In this study，to verify the dietary requirement determined by growth response，muscle AA contents （EAA and NAA） and plasma-free AA contents of cultured juvenile yellow catfish were analysed.This study indicated that supplementary lysine not only significantly affected the plasma lysine content but also affected the lysine concentration in muscle of this fish.Similar results have been reported for juvenile yellowtail，Japanese sea bass and juvenile cobia （Ruchimat et al，1997；Mai et al，2006）.Zhou et al（2007） described that the serum lysine concentration in cobia increased with the dietary lysine requirement and had no further increase when dietary lysine level beyond the optimum requirement.In this study，the significant difference in free lysine in the plasma might be because of the fact that at a deficient level of lysine，the metabolic demand for this kind of amino acid would be greater in relation to the dietary quantity furnished.Therefore，it was not surprising that lysine content would be in a rather low concentration in the plasma as a result of dietary lysine deficiency.Once the dietary lysine requirement was met，it could be expected that the lysine would accumulate in the plasma.The plasma-free lysine content was shown to decrease as the dietary lysine level exceeded the optimum lysine requirement might be because of the fact that the absorption of crystalline amino acid were more rapid compared with that of protein bound-AA （Plakas & Katayama，1981） and the fact that the capacity of AA pool in fish waslimited or the buffering ability for single AA was limited in a short time （Ye，2005）.As a result，AA required for protein synthesis might not all be available at the same time in the AA pool with the required proportions，causing an AA imbalance and inhibiting effect in the tissues while promoting AA catabolism or energy consumption rather than protein synthesis （Griffin et al，1992）.In addition，the time needed for tissue-free amino acid to reach maximal levels and to return to fasting levels was a critical factor for such measurement （Berge et al，1998）.In some studies，they took more than 48 or 24 h for EAA to return to starting levels （Mai et al，2006；Walton & Wilson，1986）.It was not strange to find in this study that the free lysine in the plasma of juvenile yellow catfish that had been fasted for 24 h before sampling was still significantly influenced by dietary lysine level.In muscle，the difference in total lysine was not significant，which was probably due to the difference in free lysine in the amino acid pool of the muscle as similarly observed in the studies of rainbow trout，gilthead sea bream and Japanese seabass （Go′ mez-Requeni et al，2004；Mai et al，2006）.Although in some studies such as in the study of Cowey （1995） who considered the free amino acid in the plasma was unsuitable for the determination of amino acid requirement as no correlation existed between intake and concentration in animal tissues，the level of certain EAA in fish muscle，blood or other tissue is usually used as an index of dietary amino acid status in fish nutrition studies （Wilson，1985；Walton & Wilson，1986；Berge et al，1998；Go′ mez-Requeni et al，2004；Mai et al，2006；Zhang et al，2007）.More information would be obtained from the future studies about the relationshipbetween the dietary lysine level and the fish muscle，blood or other tissues and it is worthy of estimation.
In conclusion，according to the one-slope，quadratic broken-line analysis model analysis of SGR and the dietary lysine levels，the dietary L-lysine requirement of juvenile yellow catfish was 33.1 g/kg of dry diet （83.2 g/kg dietary protein）.
Acknowledgements
This study was financed by the State Spark Plan Project of Comprehensive Development and Utilization of Safe Feed Additives for Healthy and Environment-friendly Aquaculture’（2007EA780011），Guangdong Science and Technology Research Project of‘The Development of Micro-capsules of Crystalline Amino Acids and its Application in Aquaculture Feed’（2007A0201000052）and the Guangzhou Municipal Science and Technology Project.Thanks are given to my senior and junior classmates with the same mentors and staff of Guangzhou Fishery Aquatic Technology Co.，Ltd.，Scientific R&D Center，Institute of Animal Science，Guangdong Academy of Agricultural Sciences，for their help in preparing the diets used in this study and assisting in sample collection.
References：47 references omitted.
The Dietary L-Methionine Requirement ofJuvenile Yellow Catfish Pelteobagrus fulvidraco
Introduction
Protein is the most important nutrient in fish feed.The gross dietary protein requirement is directly affected by the composition of amino acids in the diet.Determining the essential amino acid （EAA） requirements of cultured fish is of importance because of the effects of these nutrients on growth，feed costs and nitrogen pollution （Small and Soares，1998）.Methionine is an essential amino acid that is required by various fish species and terrestrial vertebrates for normal growth and metabolic function，and it is the most limited amino acid other than lysine in plant protein sources.With the rising cost of fish meal，the reduction of fish meal in the diet of fish is a priority.Alternative plant protein sources，such as soybean meal，peanut meal and copra meal，are generally used to replace all or part of fish meal because of their higher levels of protein，steady supply，low cost and lower nitrogen excretion.The supplementation of methionine （and/or other essential amino acids if necessary） to plant protein diets can improve the growth response of many fish species （Mukhopadhyay et al，2001；Takagi et al，2001）.
The yellow catfish Pelteobagrus fulvidracois a popular food fish cultured in China and a potentially important aquaculture species because of its strong adaptability and fast growth.Yellow catfish are also economically important and regarded as a good candidate for export （Pan et al，2008）.However，few studies have been conducted on the nutrient requirements of this species.In a previous study，we found that dietary lysine could improve the growth performance of this fish，and the dietary requirement was 33.1 g/kg of the dry diet （83.2 g/kg of dietary protein） （Cao et al，2012）.Until now，the quantitative requirement of this species for any of all the 10 essential amino acids，other than lysine，has remained unknown.Hence，the objective of this study was to investigate the effect of dietary methionine levels on the growth，feed utilization，body composition，hematological parameters and morphometrical parameters of juvenile yellow catfish at a constant level of cysteine and determine the dietary methionine requirement.
Materials and Methods
Diets.Six isonitrogenous and isoenergetic diets containing fish meal，soybean protein concentrate（SPC）and crystalline amino acids（CAA）as protein sources and fish oil together with soybean oil as lipid sources were formulated to contain 40.50 % crude protein and 18.0 kJ/g gross energy.A diet containing 22.5 % fish meal，10.8 % soybean protein and 18.0 % CAA mixture without crystalline L-methionine was used as the basal diet for comparison with the other diets.The other diets were supplemented with graded levels of crystalline L-methionine（0-0.75% of dry matter with an increment of 0.15%）at a constant level of cysteine.Using an automatic amino acid analyzer，the methionine levels in the six experimental diets were measured to be 0.55，0.67，0.75，0.87，0.95 and 1.13% of the dry diet，marked as D0.55，D0.67，D0.75，D0.87，D0.95 and D1.13，respectively.A mixture of glycine and aspartic acid was added to all the diets to make them isonitrogenous and isoenergetic.The ingredient composition and analyzed chemical composition are shown in Table 1.
Table 1 Formulation and proximate chemical composition of the experimental diets
Table 1 Formulation and proximate chemical composition of the experimental diets（续）-1
The dietary ingredients were ground into fine powder through a 250-μm mesh.The dry ingredients for diets were mixed by starting with the small ingredients and adding larger ingredients during the mixing progress.As the dietary ingredients were mixed，6 N NaOH was added to adjust the pH to 7.0-8.0.Fish oil，soybean oil and distilled water （0.3 L/kg）were slowly added to the premixed dry ingredients with thorough mixing until the mixture became homogenous.The 2.5-mm pellets were wet-extruded and air-dried until the moisture content was less than 10.0%.The dry pellets were placed into plastic bags and stored at -20.0℃until use.
Fish and feeding conditions.The experiment was conducted in an indoor re-circulating aquaculture system at the Guangdong Academy of Agricultural Sciences（Guangzhou，China）.Experimental fish were obtained from a commercial farm in Guangzhou，China and acclimated to the laboratory conditions before the experiment using the basal diet without supplemented methionine for 2 wk.After acclimation，fish with similar sizes （with an initial weight of 1.4±0.0 g） were selected and randomly distributed into 24 tanks （0.3 m3）provided with flow-through freshwater at 28.0±0.1℃，and each tank was stocked with 40 fish.Each diet was assigned to 4 tanks in a completely randomized design.The fish were fed to apparent satiation twice a day at 09：00 and 16：00.The amount of diet consumed in each tank was recorded daily and adjusted according to the amount consumed the day before.The feeding trial lasted for 8 wk.During the experimental period，the average water temperature was 28.0±0.1℃.The pH level was maintained within the range of 7.4 to 7.8.The ammonia nitrogen level was lower than 0.03 mg/L，and the dissolved oxygen content was not less than 7.0 mg/L.Excess diet and feces were removed from the tanks daily，and one-third of the culture water was replaced.
Sample collection and chemical analysis.This study was approved by the Guangdong Academy of Agricultural Science.At the end of the 8-wk feeding trial，all fish were euthanized by spinal cord dislocation （Nickum et al，2004），counted and weighed to calculate the weight gain （WG），specific growth rate （SGR），protein efficiency ratio （PER），feed efficiency （FE） and survival rate （SR）.Ten fish euthanized by cold shock （Nickum et al，2004） from each group were stored at -20.0℃ for whole body composition analysis.Five fish from each tank were individually weighed，and their body length and the weight of the viscera，hepatopancreas and mesenteric fat were determined for the calculation of the condition factor （CF），viscerosomatic index （VSI），hepatosomatic index （HSI） and intraperitoneal ratio （IPR）.White muscle from the backs of 5 fish from each tank was sampled，sealed into plastic bags and then frozen at -20.0℃ for analysis of the muscle nutrient composition.
The crude protein，lipid，moisture and ash contents in the diets，hepatopancreas，muscle and whole body were measured in triplicate.The moisture content in the diets was determined via oven drying at 105℃ for 24 h，and the moisture contents in the muscle，whole body and hepatopancreas were determined after these tissues were lyophilized，pulverized and stored at -80℃.The crude protein （N×6.25） content was determined by the Kjeldahl method using a semi-automatic Kjeldahl System （1030 Autoanalyzer，Tecator，Hoganos，Sweden） after acid digestion.The crude lipid content was determined by an ether extraction method using a Soxhlet System HT （Soxtec System HT6，Tecator，Sweden），and the ash content was determined by burning the samples at 550℃ in a muffled furnace for 24 h （AOAC，1995）.
To determine the methionine and cysteine contents in diets，the samples were oxidized with performic acid ［30% hydrogen peroxide：88% formic acid；1：9（v/v）］for 18 h at 0℃，which resulted in the stable formation of cysteic acid and methionine sulphon.The samples were then hydrolyzed with 7.2 N HCl for 24 h at 110℃ and analyzed with an automatic amino acid analyzer（Hitachi 835-50，Japan）（China National Feed Quality Control center，Beijing，China；Guangdong Academy of Agricultural Sciences，Guangzhou，China）.The gross energy content was determined on an IKA ballistic bomb calorimeter（C2000，Germany）.
Statistical analysis.The results were presented as the mean±SD .All data were analyzed by a one-way analysis of variance（ANOVA）and tested with Duncan’s multiple range test using SPSS software （Version 13.0） to determine the effect of experimental diets.The significance level was P<0.05.A one-slope quadratic broken-line analysis model in SAS software （Version 8.1） （Portz et al，2000；Parr et al，2003） was used to estimate the dietary L-methionine requirement.
Results
Growth performance.During 8 wk，no pathological signs were observed during the trial，and no anomalies occurred at the end of the feeding trial.Table 2 shows the WG，SGR，FE，PER，MFI （mean feed intake），MI （methionine intake） and SR of juvenile yellow catfish fed with different graded levels of dietary methionine.At the end of 8 wk，the WG varied from 626.4 to 798.5%，and the SGR varied from 3.54 to 3.92 %/d for dietary methionine levels ranging from 0.55 to 1.13 %.The lowest WG and SGR were observed in yellow catfish fed the basal diet （diet 0.55；0.55 % dry diet methionine from intact protein）.The highest WG and SGR were observed in yellow catfish fed the D0.87 diet containing 0.87 % dry diet methionine.The PER and FE showed the trends similar to those of WG and SGR.The SR among all dietary treatments was high with a range of 85.0 to 96.3 %，and it was not significantly affected by the methionine levels.
Table 2 Effect of dietary methionine levels on growth and feed utilization in juvenile yellow catfish （mean±SD，n= 4）
Figure 1
The growth curve showed increased WG in yellow catfish with increasing dietary methionine levels up to the breakpoint.Beyond the breakpoint，the WG tended to decrease as the dietary methionine content further increased （Figure 1）.According to the analysis of the one-slope quadratic broken-line model，the optimal requirement of dietary methionine was estimated to be 1.05 % of the diet （accounting for 2.60% of dietary protein）.Taking the dietary cysteine content （0.39%）into consideration，the requirement for sulfur-containing amino acids（methionine+cysteine）of this fish species was estimated to be 1.44% of the diet，which corresponded to 3.56% of the dietary protein.
Whole body，white muscle，hepatopancreatic composition and morphometry index.The whole body，white muscle and hepatopancreatic compositions of the juvenile yellow catfish fed with graded levels of dietary methionine are shown in Table 3.A higher protein content （P<0.05），lower lipid and lower ash content （14.44，6.88 and 3.54%，respectively） were observed in the whole body of fish fed the D0.87 diet compared with the other dietary treatments.For the other dietary treatments，the protein content increased with increasing dietary methionine levels but decreased when the dietary methionine level reached the optimal value，and the moisture，lipid and ash contents showed the opposite trend.Protein，lipid and ash contents of the white muscle of fish fed the D0.87 diet were higher than that of fish fed the other diets and moisture content of the white muscle of fish fed the D0.87 diet was the opposite；the protein and ash contents increased and moisture content decreased with increasing levels of dietary methionine（P<0.05）.The protein and ash contents of the white muscle decreased and the moisture content increased when the dietary methionine level reached the optimal value.The lipid content of the white muscle was not affected by dietary methionine levels.No significant effect of dietary methionine levels was observed on the moisture，crude protein and crude lipid contents of the hepatopancreas.
Table 3 Effect of dietary methionine levels on chemical composition of whole body，white muscle and hepatopancreas in juvenile yellow catfish （%，mean±SD，n=4）
Table 4 Effect of dietary methionine levels on several morphology parameters in juvenile yellow catfish （mean ± SD，n=4）
VSI，HSI，CF and IFR.Table 4 shows that a significant effect of dietary methionine levels on HSI，CF and IFR （P<0.05） was found，but there was no significant difference in the VSI among all of the dietary treatments.The HSI decreased from 2.11 to 1.59 as the methionine level increased from 0.55 to 0.87 % （P<0.05），and increased from 1.59 to 2.36 with an increase of the dietary methionine level from 0.87 to 1.13 %.The same trend was observed for IFR.The CF significantly increased from 0.91 to 1.11 as the dietary methionine level increased from 0.55 to 0.87 %，and significantly decreased from 1.11 to 0.96 when the dietary methionine level increased from 0.87 to 1.13 %.
Discussion
In the present study，the juvenile yellow catfish fed the diets with lower methionine levels had slower growth and lower feed efficiency.Significantly higher values of WG，SGR and FE were observed in fish fed with certain dietary methionine level，but these values declined as the methionine exceed that level in diets.These results indicate that methionine is one of the essential amino acids for the growth of juvenile yellow catfish can make good use of methionine in its crystalline form.The results of this study are similar to those of channel catfish Ictalurus punctatus（Murai et al，1982），yellow tail Seriola quinqueradiata（Watanabe et al，2001），and yellow croaker Pseudosciaena crocea R（Mai et al，2006）.A previous study indicated that balanced amino acid content in the diet is necessary for the optimal growth of fish （Wilson and Halver，1986）.The growth response of yellow catfish fed increasing methionine diets was consistent with previous studies that reported that the growth of fish increases with an increase up to a certain followed by a decrease when an excessive amount of methionine is provided.This trend may be attributed to the following reasons：toxicity of ketones and other toxic metabolites；imbalanced amino acids；poor palatability resulting from excessive total sulfur amino acids （TSAA） （Griffin et al，1994）；and different utilization and absorption rates between CAA and dietary intact proteins with adverse effects on growth.
The dose-response experiment with increasing contents of amino acids has been accepted as a method for determining the amino acid requirement.The equation according to the one-slope quadratic broken-line analysis model of the relationship between the SGR and dietary methionine level was as follows：Y=3.8708-1.4246×z1×z1-1.0193 ×z2（if X<1.05159，Y=3.8708-1.4246×z1×z1，Y= 3.8708-1.0193×z2）；where z1=1.05159-X；z2=X-1.05159；and R2=0.9356.Moreover，the methionine requirement was calculated to be 1.05 % of the diet （accounting for 2.60 % of dietary protein）.This result was similar to the results previously reported for other fish species，such as the red drum Sciaenops ocellatus（1.06 %） （Moon and Gatlin，1991） and yellow tail （1.11 % of the diet） （Ruchimat et al，1997）.Fish have a TSAA requirement rather than a specific methionine or cysteine requirement （Ravi and Devaraj，1991）.In the present study，if the cysteine level （0.39 %） was considered，the calculated TSAA requirement of juvenile yellow catfish was 1.44 % of the diet，which corresponded to 3.56 % of the dietary protein.The requirement for TSAA of juvenile yellow catfish （3.56 % of dietary protein） was similar to that of Catla catla（3.6 %） （Ravi and Devaraj，1991），lower than that of milkfish Chanos chaos （Forsskal） （4.37 %） （Borlongan and Coloso，1993） and yellow croaker （4.02 %） （Mai et al，2006），higher than that of juvenile grouper Epinephelus Coioides（2.73 %） （Luo et al，2005） and channel catfish （2.34 %） （Harding et al，1977）.These differences may occur because juvenile yellow catfish are carnivorous fish with a high dietary protein requirement that results in a relatively higher methionine requirement compared with fish with lower dietary protein requirements （Zhou et al，2006）.In addition，we considered that the analysis model had an important role in determining the dietary methionine for this fish.In the present study and in our previous study on the dietary lysine evaluation of juvenile yellow catfish （Cao et al，2012），we selected the optimal analysis model by comparing the correlation coefficient of different analysis models，such as a second-order polynomial regression analysis model，one-slope straight broken-line analysis model and one-slope quadratic broken-line analysis model.The best analysis model was the one-slope quadratic broken-line analysis model.More studies are needed to determine the required dietary amino acids for fish using the above analysis models to confirm that the model used for the analysis is the optimal analysis model for determining the dietary amino acid requirement of fish as found in the present study.Some studies have reported that diets containing high amounts of CAA frequently result in much lower growth rates in fish compared with diets in which all amino acids are derived from intact protein （Robinson et al，1981；Walton and Wilson，1986）.Mai et al（2006） supplied 84.0 % dietary protein in experimental diets using a mixture of fish meal，soybean meal，yeast and wheat meal；16.0 % dietary protein of the experimental diets was provided by CAA.Compared with other studies （Moon and Gatlin，1991；Alam et al，2001），the higher dietary intact protein levels observed by Mai et al（2006） may have resulted in a relatively higher growth rate and feed conversion efficiency.In the present experiment，the intact protein was derived from fish meal and soybean meal and constituted 63.7 % of dietary protein for the diets，and the CAA were supplemented and accounted for approximately 37.3 % of dietary protein.These diet compositions may have affected the dietary methionine requirement of juvenile yellow catfish to some extent.The conversion of methionine to cysteine in the diets，which has been previously studied （Moon and Gatlin，1991），may influence the calculation of the dietary methionine requirement of fish.This issue was not determined in the current study and is worth future investigation.
In this study，the dietary methionine level significantly affected the whole body protein content but had no significant effect on the moisture，ash and crude lipid contents.These results were similar to those of previous studies in other species （Kim et al，1992；Ruchimat et al，1997）.In the present study，the dietary methionine levels had a significant effect on the HSI and CF but did not affect the VSI.Luo et al（2005） observed that the HSI in the juvenile grouper increases as the dietary methionine level increases to the optimal required level and then remains unchanged beyond the optimal requirement.Walton et al（1982） observed higher HSI values in rainbow trout fed with a low-methionine diet，which suggests that dietary methionine and cystine levels affect the HSI.However，Coloso et al（1999） suggested that there is no correlation between the dietary methionine content and HSI in juvenile Asian sea bass.In the present study，the values of IFR were variable among the different dietary treatments and were not related to the dietary methionine levels.
In conclusion，according to the one-slope quadratic broken-line analysis model of the specific growth rate and dietary methionine levels，the dietary L-methionine requirement of juvenile yellow catfish was 1.05% of the diet （accounting for 2.60% of the dietary protein）.With regard to the cysteine content in the dry diet （0.39%），the sulfur-containing amino acid （methionine+cysteine）requirement for the juvenile yellow catfish was estimated to be 1.44% of the diet，which corresponded to 3.56% of the dietary protein.
Acknowledgements
This study was financed by the State Spark Plan Project of “Comprehensive Development and Utilization of Safe Feed Additives for Healthy and Environment-friendly Aquaculture”（2007EA780011），Guangdong Science and Technology Research Project of “The Development of Micro-capsules of Crystalline Amino acids and its Application in Aquaculture Feed” （2007A0201000052），and the Guangzhou Municipal Science and Technology Project.The authors would like to thank the members of Drs.Cao and Chen’s laboratories in Guangzhou Fishery Aquatic Technology Co.，Ltd.，Scientific R&D Center，Institute of Animal Science，Guangdong Academy of Agricultural Sciences，for their help in diet preparation and in sample collection.
References：28 references omitted.
饲料中添加赖氨酸及蛋氨酸对罗非鱼生长的影响
1 材料与方法
1.1 实验饲料
以鱼粉、豆粕、菜粕、棉粕为主要蛋白原，次粉为糖原，豆油为脂肪源配制8种实用饲料，配方和营养组成如表1所示。No.2以喷雾干燥血粉替代No.1中羽毛粉，补充0.15%结合态赖氨酸（protein bound lysine，PBL）以提高配方赖氨酸水平，No.3、No.4则是在No.1的基础上分别添加0.15%晶体赖氨酸（uncoated lysine，UCL）或0.15%包膜赖氨酸（coated lysine，CL）使赖氨酸水平和No.2一致；No.5、No.6分别以No.3和No.4为基础，分别补充0.1%晶体蛋氨酸（uncoated methionine，UCM）和0.1%包膜蛋氨酸（coated methionine，CM），No.7、No.8以No.2为基础，分别补充0.1%UCM和0.1%羟基蛋氨酸钙（methionine hydroxy analog Ca，MHA-Ca）以使配方赖氨酸∶（蛋氨酸+胱氨酸）≈100∶63，所有不用羽毛粉的试验组均按比例补充晶体胱氨酸。包膜赖氨酸及蛋氨酸按国家发明专利方法［9］制备，由广州飞禧特水产科技有限公司提供，含量分别为32%及38%，全通60目筛。
饲料原料粉碎过40目筛，混合均匀后用SLX—80型挤压机制成直径为2.0mm的饲料，在45℃烘干冷却后放入密封袋中于-20℃冰箱中保存待用。
Table 1 Ingredients and proximate compositions of the experimental diets
1.2 试验鱼和饲养方法
罗非鱼幼鱼由中山大学鱼类研究室所属渔场提供，饲养试验在本研究所室内循环水养殖系统中进行。试验鱼先在室外水泥池中驯养2周，然后选用720尾平均体质量约5.0g罗非鱼幼鱼随机分箱，在300L玻璃钢水族箱（水体积240L左右）中进行养殖试验。每组饲料设3个重复，每个重复放鱼30尾。微流水饲养，水源为经活性炭脱氯后曝气后的自来水，空压泵增氧。试验期间定量投喂，每日分别在8：30、15：30分2次饱食投喂，实验周期为56d。每天观察鱼只健康状况，记录死亡情况，水温24～30℃，pH 7.5，溶氧＞5mg/L，氨氮<0.02mg/L。试验结束时，停饲24h后称重，计算存活率、相对增质量率、饲料效率。
1.3 样品采集
养殖试验结束后，每个重复随机取10尾鱼，其中4尾用作测定全鱼组成，余下6尾解剖鱼体取肝脏，去鳞取两侧肌肉，0.2～1.0g，在预冷的匀浆介质（W/V =1/9）中匀浆，在4℃以4000g离心15min，取上清液，分装，保存于-20℃备用。
1.4 分析测定
粗蛋白采用凯氏定氮法，总脂用索氏抽提法，水分采用105℃烘干法，灰分用550℃马福炉灼烧法测定。氨基酸分析参照GB/T 18246—2000，经6mol/L浓盐酸水解等处理后，在氨基酸分析仪上测定。
1.5 数据分析
数据采用SPSS 11.0软件进行分析，所有实验数据先用ANOVA进行单因素方差分析，若存在显著差异，则进行Duncan氏多重比较法确定组间差异，显著性水平P<0.05。
2 结果与讨论
2.1 试验结果
见表2，和对照组相比，以血粉替代羽毛粉，补充0.15%PBL，提高配方赖氨酸含量后，罗非鱼增质量率317.99%提高到326.93%，但差异不显著（P＞0.05），同样在对照基础上补充0.15%UCL或0.15%CL，提高配方赖氨酸水平，增质量率也有提高趋势，分别从317.99%提高到337.02%和329.41%，但同样差异均不显著（P＞0.05），与此相应的是，无论添加0.15%PBL还是0.15%UCL或0.15%CL，饲料系数均呈现下降趋势，其中补充0.15%UCL组达到显著性水平（P＜0.05）。在对照组基础上，同时补充0.15%UCL和0.1%UCM后，增质量率从317.99%降低到304.15%，饲料系数呈现上升趋势，从1.75增加到1.83，但差异均不显著（P＞0.05），而同时补充0.15%CL和0.1%CM，增质量率则提高到353.22%，饲料系数则降低到1.61，均达到显著性水平（P＜0.05），统计分析还表明，这个组罗非鱼的生长速度也显著高于补充0.15%PBL或同时补充0.15%UCL和0.1%UCM组（P＜0.05），并显著降低饲料系数（P＜0.05）。同时补充0.15%PBL和0.1%UCM组的罗非鱼和仅补充0.15%PBL组或对照组相比，增质量率（308.78%）有降低趋势，饲料系数（1.80）则有升高趋势（P＞0.05），同时补充0.15%PBL和0.1%MHA-Ca组则有提高增质量率水平（337.19%）降低饲料系数（1.68）趋势（P＞0.05）。本次实验中，配方组成的调整对肝体比（2.84～3.22）没有显著性影响（P＞0.05）。
Table 2 Effect of different source of lysine/methionine on the growth，feed performance and heptosomatic index of Oreochromis niloticus[2]
Table 3 Effect of different source of lysine/methionine on body proximate composition of Oreochromis niloticus （% dry basis）[3]
Table 4 Effect of different source of lysine/methionine on the amino acid concentrations in muscle of Oreochromis niloticus
补充不同形式外源性氨基酸对罗非鱼常规组成如表3所示，其中肝脏因样品数量关系，没有测定粗脂肪及粗灰分。补充外源氨基酸对全鱼及肌肉的水分含量无显著影响，但肝脏水分降低了3%～4%（P＜0.05），对全鱼、肌肉及肝脏的粗蛋白含量无显著影响，对全鱼及肌肉的粗灰分也无明显影响，不影响肌肉的粗脂肪含量，但添加血粉并同时补充晶体蛋氨酸组的全鱼粗脂肪含量有一定下降（P <0.05）。补充不同形式外源性氨基酸对罗非鱼肌肉氨基酸组成结果如表4所示，结果表明，本试验中外源氨基酸的添加对罗非鱼肌肉氨基酸组成无显著影响（P >0.05）。
2.2 讨论
2.2.1 补充赖氨酸对罗非鱼生长的影响
罗非鱼的赖氨酸需要量为1.54%，蛋氨酸和胱氨酸的合计需要量为0.96%（饲料蛋白质量分数30%）［11］，本试验中对照组赖氨酸仅为1.24%，蛋氨酸和胱氨酸合计0.77%，明显低于所报道的需要量，通过3%的喷雾干燥血粉（替代3%的羽毛粉）补充结合态赖氨酸，提高赖氨酸水平到1.39%，鱼的生长速度没有显著性差异，同样补充包膜赖氨酸或晶体赖氨酸等游离态赖氨酸至饲粮赖氨酸含量为1.39%，鱼的生长也没有显著性变化。这和Ehab（12）在虹鳟上的有关研究不相一致，Ehab［12］在赖氨酸含量为1.5%虹鳟基础饲粮中补充晶体赖氨酸或喷雾干燥血粉将饲粮赖氨酸水平提高至1.8%及2.2%（虹鳟赖氨酸最适需要量2.3%～2.7%），均显著提高虹鳟的生长速度，这种差异和可能除了与鱼的品种有关，可能还和饲粮中蛋氨酸水平有关，通过计算Ehab［12］虹鳟试验的配方不难发现，作者所用饲粮的蛋氨酸含量达到0.82%，已满足了虹鳟0.7%的蛋氨酸需要量要求，而在本研究中对照组以及补充外源赖氨酸的试验组，蛋氨酸和胱氨酸合计仅0.77%，明显低于罗非鱼0.96%的需要量，更为值得注意的是，按照虞予［13］推荐的罗非鱼饲粮中蛋氨酸和赖氨酸适宜比例为0.63的模式，试验组尽管提高了赖氨酸水平，但由于没有同步提高蛋氨酸水平，蛋氨酸和赖氨酸的比例却因此从对照组的0.62下降为0.55，这就意味着对照组的赖氨酸水平尽管较低，但蛋氨酸和赖氨酸的比例为0.62，更接近0.63理想模式。按照氨基酸需要的“水桶板块”理论，这可能在某种程度上降低了试验组所补充赖氨酸沉积效率，也因此和对照相比未取得显著的促生长效果。
2.2.2 同时补充赖氨酸和蛋氨酸对罗非鱼生长的影响
试验No.5至No.8在补充外源赖氨酸的同时，进一步提高配方中蛋氨酸的量，确保配方中蛋氨酸和赖氨酸的比值按罗非鱼的理想蛋白模式保持在0.63，这种情况下再和对照组相比较，可以发现，同时补充包膜赖氨酸及蛋氨酸显著提高了鱼的生长速度，增质量率提高11%左右，而同时补充晶体赖氨酸和蛋氨酸，或者以3%血粉补充结合态赖氨酸再补充晶体蛋氨酸，鱼的生长速度和未补充的对照相比则均无明显变化，这表明：晶体氨基酸在罗非鱼体内的吸收利用效果存在一定问题，晶体氨基酸经包膜后在相当程度上提高了晶体氨基酸的吸收利用率。
本研究的结果表明，无论是结合态赖氨酸还是包膜赖氨酸虽然在吸收上存在一定优势，但要取得显著的生物学效价，在添加补充时要兼顾补充其他所缺少的必需氨基酸，才能最大程度提高氨基酸的沉积效率，例如Alam（7）也发现在日本对虾饲粮中按最适氨基酸比例同时补充包膜赖氨酸及蛋氨酸，生长效果要优于同时补充晶体赖氨酸和蛋氨酸，或者单独补充晶体赖氨酸或蛋氨酸的情况。
2.2.3 以羟基蛋氨酸钙形式补充蛋氨酸对罗非鱼生长的影响
对于蛋氨酸而言，除了包膜形式外，本研究还探讨了蛋氨酸的化学衍生物羟基蛋氨酸钙的应用效果，在以3%血粉补充结合态赖氨酸基础上，分别以晶体蛋氨酸以及羟基蛋氨酸钙两种形式补充蛋氨酸，和对照组（No.1）相比，前者生长速度基本没有改变，而后者则有较好的提高趋势，两者相比，补充羟基蛋氨酸钙时鱼的生长速度显著高于同样条件下补充晶体蛋氨酸的生长效果。有关羟基蛋氨酸钙的在水产动物上生物学效价研究不多，沈晓芝［13］的研究表明，在豆粕为蛋白源的饲粮中添加羟基蛋氨酸钙，仅在添加量为0.135%的显著提高鲤的生长及蛋白质效率，其他添加量（0.045%、0.09%、0.18%）与不添加的对照组无显著差异。值得注意的是，作者所用饲粮的赖氨酸水平仅为1.8%，不同羟基蛋氨酸钙添加水平下，含硫氨基酸总量也始终小于或等于0.944%，两者均分别低于鲤鱼的最适需要量（赖氨酸2.2%，含硫氨基酸1.2%），这些条件和本研究中补充羟基蛋氨酸钙时饲粮赖氨酸及含硫氨基酸的含量情况比较相似，因此，本研究中添加羟基蛋氨酸钙未取得显著效果的原因，除了鱼的品种有关外，也许和所试验的羟基蛋氨酸钙添加的剂量大小不适合有关。本研究的结果提示，羟基蛋氨酸钙在罗非鱼体内吸收利用上可能比晶体蛋氨酸有一定优势，但其生物学效价还有待进一步试验。
2.2.4 补充氨基酸对罗非鱼体组成的影响
本试验中添加外源氨基酸有降低肝脏水分的趋势，对全鱼及肌肉的粗蛋白，粗脂肪及灰分没有明显影响，也不影响肝脏的粗蛋白含量。Alam［7］在日本对虾日粮中同时补充赖氨酸及蛋氨酸也没有发现对脂肪及蛋白含量有显著性影响。同样在海鲈［15］、斑点叉尾［16］、遮目鱼［17］饲料中添加蛋氨酸也不影响实验鱼的鱼体成分。但在鲤［14］、拟石首鱼［18］和草鱼［19-20］饲料中添加外源蛋氨酸或赖氨酸能够提高肌肉中粗蛋白含量，氨基酸对鱼体成分的影响可能因鱼的种类、氨基酸的剂型、饲料加工工艺和饲料原料的氨基酸利用效率而异。
对肌肉的氨基酸组成分析表明，本试验中补充外源氨基酸的方式对肌肉氨基酸组成没有影响（占肌肉湿基质量百分数），但Abboudi［21］在研究大西洋鲑（Salmo salar）赖氨酸需要量时，发现饲粮赖氨酸水平显著影响全鱼蛋白中赖氨酸含量（%总氨基酸），其中原因有下述3种可能：①和氨基酸组成的表示方式有关，Helland［22］在大西洋比目鱼（Hippoglossus hippoglossus）饲粮中以谷朊粉替代不同比例鱼粉，发现配方氨基酸组成的改变会直接影响全鱼蛋白的某些氨基酸组成比例，但变化的显著性和氨基酸组成的表示方法有很大关系，3种表示形式中（占总氨基酸质量百分数、占湿基质量百分数、占粗蛋白质量百分数），以占总氨基酸质量百分数的结果来揭示变化趋势最为灵敏；②和饲粮氨基酸变化的区间有关，Helland［22］发现，在配方中以谷朊粉部分替代鱼粉，当赖氨酸含量从4.0%降低到3.6%，大西洋比目鱼的全鱼赖氨酸含量显著降低（占总氨基酸质量分数），但随着谷朊粉用量加大，配方赖氨酸含量从3.6%降低到2.6%时，全鱼赖氨酸含量没有显著变化，同样当配方中蛋氨酸含量从1.7%降低至1.3%时，全鱼蛋氨酸含量没有显著变化，但如果进一步降低到1.2%，则会显著降低全鱼蛋氨酸含量（%占总氨基酸含量）；③本试验中试验组和对照组的饲粮氨基酸组成差异不够大，例如赖氨酸仅相差0.2%，蛋氨酸仅相差0.1%，而在Abboudi［21］的试验中，赖氨酸含量在不同试验组之间的差异不低于0.5%。综合上述分析，作者认为，配方氨基酸组成可能会影响鱼体氨基酸组成，但要针对具体试验情况分析才能确定。
3 结语
综合本试验结果，我们认为罗非鱼饲粮中添加外源性氨基酸，一方面要注意添加的形式，例如采用包膜形式，另一方面最好能结合限制性氨基酸间的比例关系，这两个方面同时兼顾可能会取得比较理想的补充效果，同时低剂量的补充外源氨基酸不会对体组成产生明显影响。
参考文献22篇略。
军曹鱼幼鱼对饲料中精氨酸的需要量
华南农业大学学报，2007，28（4）：87-90
军曹鱼（Rachycentron canadum）幼鱼对赖氨酸的需要量
长江大学学报（自科版），2005，2（2）：50-52
军曹鱼幼鱼对蛋氨酸的需要量
饲料工业，2006，27（4）：32-34
饲料添加不同剂型蛋氨酸对凡纳滨对虾生长性能和生化指标的影响
饲料工业，2011，（S2）：30-33
日粮中添加不同形式赖氨酸对南美白对虾生长及肌肉成分影响的研究
饲料工业，2008，29（12）：28-31
（二）维生素
军曹鱼幼鱼维生素C需要量的研究
1 材料与方法
1.1 试验日粮
基础日粮组成及营养水平见表1，在基础饲料中分别添加维生素C-2-单磷酸酯0、37.5、75、150和300mg/kg配制成5种等氮等能饲料。维生素C-2-单磷酸酯为罗氏公司产品，维生素C含量为35%。饲料原料全部通过60目筛，通过单螺杆挤压机制成直径4.0mm的颗粒，于45℃下烘干冷却后入密封袋中于-20℃冰箱中保存待用。
Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet
每千克预混料中含有Provided per kg of premix：VA 4 000 000.0 IU；VD 200 000.0 IU；VE 30.0 g；VK 3.0 g；VB1 8.0 g；VB2 15.0 g；VB6 12.0 g；VB12 0.09g；烟酸nicotinic acid 90.0 g；泛酸钙calcium pantothenate 12.0 g；叶酸f olic a cid 1.2 g；生物素biotin 0.04 g；肌醇inositol 80.0 g；Ca 382.0 g；K 28.0 g；Mg 41.5 g；Fe 16.0 g；Zn 2.6 g；Mn1.1 g；Cu 1.0 g；Co 0.10 g；I 0.10 g；Se 0.045 g。
1.2 试验鱼及饲养管理
军曹鱼幼鱼由广东恒兴集团有限公司东海岛试验场（863海水鱼南方种质基地）提供。饲养试验在湛江特呈岛进行。试验鱼先置于网箱（3.0 m×3.0m×3.0m）中暂养2周，其间投喂基础饲料。然后选择体重为25.85g 左右的健康鱼225尾进行试验，随机分成5组，每组设3个重复，每个重复15尾，以重复为单位放养在网箱中（网箱规格1.0m×1.0m×3.0m）。每天分别于09：00及16：00投喂试验饲料2次，投喂量为5%初始体重，并根据实际摄食量每2周调整投喂量。试验期间水温25～31℃，盐度28‰～34‰。试验持续56d。
1.3 样品采集和分析
试验结束后，计数、称各网箱鱼体重量，计算增重率、特定生长率和存活率。每口网箱随机取5 尾鱼断尾取血，10 000r/min冷冻离心10min，得血清样品；同时解剖采集脑、肝脏和肾脏。另外每箱随机取鱼2尾，留作全鱼水分、粗蛋白质、粗脂肪和灰分分析，样品保存于-20℃冰箱。血清总抗氧化能力、溶菌酶活性和肾脏抗氧离子自由基能力使用南京建成生物研究所的试剂盒进行测定和计算。血清、肝脏和脑中维生素C含量采用二硝基苯肼分光光度法测定。饲料和全鱼的粗蛋白质测定用半微量凯氏定氮法，水分用105℃烘干失重法，粗脂肪用索氏抽提法，灰分用马福炉550℃高温灼烧失重法测定。
1.4 数据统计
试验结果用平均值±标准误表示，组间平均值间差异显著性通过One-way ANOVA分析后利用Duncan氏法进行多重比较，显著性水平P<0.05。分析统计软件为STATISTIC 12.0。
2 结果
2.1 军曹鱼幼鱼的增重率、特定生长率和存活率
由表2可知，饲料中维生素C添加量从0升高到75mg/kg时，军曹鱼的特定生长率和增重率呈现出上升趋势，达到最高值，显著高于未添加组（P<0.05）；当饲料中维生素C添加量从75mg/kg升高到300mg/kg时，军曹鱼的特定生长率和增重率呈现下降趋势（P<0.05）。各试验组军曹鱼幼鱼的存活率没有显著差异（P>0.05）。
以饲料中维生素C添加水平与增重率作回归直线，可得y=1.778 8x+380.23（R2=1）和y=-0.501 2x+539.84（R2=0.936 6），通过折线法求得这两条直线相交点值，即军曹鱼获得最佳生长效果时饲料维生素C最低添加量为70mg/kg（图1）。
Table 2 WGR，SGR and SR of juvenile cobia
Figure 1 Effect of dietary vitamin C levels on WGR of Cobai（Rachycentron canadum）
2.2 军曹鱼幼鱼干物质、粗蛋白质、粗脂肪和灰分含量
由表3可以看出，随着饲料中维生素C添加量的升高，鱼体粗蛋白质含量逐渐增加，在75mg/kg时达到最高，占全鱼干物质的62.05%，而后下降，各组之间差异不显著（P＞0.05）。各组之间干物质、粗脂肪和灰分含量没有明显变化。
Table 3 DM，CP，EE and Ash content of whole body of juvenile cobia
2.3 军曹鱼幼鱼体组织中维生素C积累量
由表4可见，军曹鱼幼鱼血清中维生素C积累量随饲料中维生素C添加量增加呈现先上升后下降趋势，当饲料中维生素C添加量为150mg/kg时，血清中维生素C含量达到最高值，显著高于未添加组。饲料中维生素C添加量从0mg/kg增加到300mg/kg时，脑和肝脏中维生素C积累量呈现上升趋势，在300mg/kg时达到最高值，显著高于未添加组。
Table 4 Vit amin C concentrations of serum，liver and brain in juvenile cobia
2.4 军曹鱼幼鱼非特异性免疫功能
军曹鱼幼鱼血清溶菌酶活性、总抗氧化能力和肾抗氧离子自由基能力见表5。随着饲料中维生素C添加量的增加，溶菌酶活性呈现先上升后下降趋势，在75mg/kg达到最高，显著高于0、37.5和300mg/kg组。随着饲料中维生素C添加量的增加，血清总抗氧化能力呈先上升后下降趋势，在75、150和300mg/kg组显著高于未添加组。添加维生素C的各试验组军曹鱼肾抗氧离子自由基能力均高于未添加组，在150mg/kg组达到最高，但各组之间没有显著差异。
Table 5 T-AOC and lysozyme activity of ser um and anti O2- activity of kidney in juvenile cobia
以饲料中维生素C添加水平与血清溶菌酶活性作回归直线，可得y=0.412 5x+20.183（R2=0.917）和y=-0.137x+64.54（R2=0.998 6），通过折线法求得这两条直线相交点值，即当饲料中维生素C添加量为80.72mg/kg时，军曹鱼血清中溶菌酶水平最高（图2）。
Figure 2 Effect of dietary vitamin C levels on lysozyme activity of serum in juvenile cobia（Rachycentron canadum L.）
3 讨论
3.1 维生素C对军曹鱼幼鱼生长的影响
本试验结果表明，饲料中添加适量的维生素C-2-单磷酸酯对军曹鱼具有显著的促生长作用，但过量添加维生素C对军曹鱼生长并无促进作用，这样的生长反应与部分同类研究结果相一致［4，10-13］。以增重率为指标，军曹鱼幼鱼饲料中维生素C适宜添加水平为70mg/kg。这一结果同大菱鲆仔鱼（Scopht halmus maximus）、罗非鱼（Oreochromis niloticus×O.aureus）、致点带石斑鱼幼鱼（Epinephelus coioides）、翘嘴鲌鱼种（Cul ter alburnus）的研究结论一致［14-17］。Wang 等以维生素C-2-单磷酸酯（0～2 000mg/kg）为维生素C源对鹦嘴鱼（Oplegnathus fasciatus）和以维生素C-2-单磷酸钠/钙及维生素C-2-单磷酸钙（0～800mg/kg）为维生素C源对朝鲜石头鱼（Sebastes schlegeli）的研究表明，增重率随着饲料中维生素C添加水平的提高而显著上升［27-28］，但依据增重率回归分析表明，鹦嘴鱼维生素C适宜需要量为118mg/kg，朝鲜石头鱼维生素C适宜需要量则分别为101和112mg/kg。除存活率略低于维生素C各添加组外，本试验未观察到维生素C缺乏症的其他症状，如贫血、脊椎弯曲、鳍条糜烂、体表充血等现象，可能军曹鱼幼鱼具备一定的合成维生素C能力。
由于研究者所用的维生素C剂型不同，由此得出鱼类对维生素C的需要量结论差异较大。一般来说早期的试验多采用晶体维生素C，得出的鱼类维生素C需要量较高［18-19］；以稳定化处理的维生素C源，确定的鱼类维生素C需要量较低［20-22］。对同一种鱼类维生素C需要量的研究结果表明，在一定范围内，添加维生素C磷酸酯比添加同等剂量的包膜维生素C具有更高的增重率［23］。王广军等［24］采用正交设计法研究军曹鱼饲料中维生素E、维生素C、胆碱、肌醇适宜添加量，在军曹鱼饲料中添加500、750、1 000mg/kg维生素C多聚磷酸酯，发现军曹鱼饲料中维生素C的适宜添加剂量为750mg/kg。本试验以维生素C-2-单磷酸酯（35%）为维生素C源，得出的维生素C最适需要量数值明显低于维生素C多聚磷酸酯，可能是因为两者的结构、维生素C含量和吸收效率不同，最终导致军曹鱼维生素C需要量出现差异。
3.2 维生素C对军曹鱼幼鱼体组成的影响
对军曹鱼幼鱼体组成的分析表明，鱼体中干物质、蛋白质、粗脂肪和灰分含量不受饲料中维生素C添加水平的影响。这与对罗非鱼（Oreochro misspilurus）、金头鲷（Sparus aurata）和翘嘴鲌（Culter alburnus）的研究结果一致［25-26，17］。但对致点带石斑鱼（Epinephelus coioides）［16］的研究显示，饲料中维生素C缺乏或过高的均可导致体脂含量下降，本研究结果与之不同。
3.3 维生素C对军曹鱼幼鱼组织维生素C含量的影响
一些研究表明，鱼体维生素C的积累部位主要是肌肉、肝脏、鳃部和脑部，而在这些组织中的维生素C积累量由高到低的次序为脑、鳃、肝脏和肌肉［27-28］。然而，本试验所测定的军曹鱼幼鱼3种组织中维生素C含量由高到低次为肝脏、脑和血清，血清维生素C积累量随饲料维生素C添加水平提高呈先上升后下降趋势，脑和肝脏中维生素C积累量则随饲料维生素C添加水平提高显著上升，对杂交罗非鱼（Oreochromis niloticus ×O.aureus）、致点带石斑鱼（Epinephelus coioides）和中华鲟（Acipenser sinensis）等的研究也得出相同的结论［15-16，29］。鱼类对维生素C的需要量一般以肝脏中维生素C含量、生长速度、相关酶活性、存活率及是否出现缺乏症作为研究鱼类对维生素C需要量最严格的反应指标。Dabrowski等［30］认为鱼类摄入的维生素C主要用于维持体内组织中维生素C恒定，因此鱼类对维生素C的需要就等同于维持组织最大累积量的需要，通过这个指标确立的需要量与通过生长率确立的需要量存在一定差异。Foumier等［31］进一步强调，肝脏维生素C饱和浓度是估算欧洲鲈鱼对维生素C需要量的最可信的指标。本试验中，饲料维生素C添加量达300mg/kg时军曹鱼肝脏维生素C积累量仍未达到饱和，说明肝脏达到饱和时维生素C需要量要高于以生长速度作为评价指标的数值。这与Gouillou-Coustans［32］、李爱杰［33］和陈建明等［17］报道一致，即以肝脏饱和浓度为标准得出的结果要比用生长速度、相关酶活性、存活率等作为评价指标时要高一些。
3.4 维生素C对军曹鱼幼鱼非特异性免疫的影响
多数养殖鱼类对维生素C酯的最适生长需要量为50～100mg/kg饲料，但不同养殖鱼类对饲料维生素C的最适免疫需要量不同［34］。鱼类在应激和病害侵袭条件下需要更多的维生素C来维持其生理功能和抗病力，因此当以免疫学指标来确立需要量时，需要量往往高于通过生长指标确立的值［35-36］。Montero等［37］以血清皮质醇含量、溶菌酶活力和补体活性为指标，认为金头鲷（Sparus aurata）摄食维生素C 250mg/kg饲料时耐密集和抗病力较强；摄食含维生素C300～500mg/kg时，头肾白细胞的吞噬活性、呼吸爆发活力较强；饲料中维生素C含量在250和300mg/kg时，大菱鲆（Scopht halmus maximus）和异育银鲫（Carassius auratus gibelio ♀×Cyprinus carpio ♂）血清溶菌酶活力分别达到最高［4，38］。本试验发现，饲料中适量添加维生素C能显著提高军曹鱼幼鱼血清溶菌酶活性和总抗氧化能力。血清中溶菌酶来源于大量的中性粒细胞、单核细胞和吞噬细胞，是鱼类抵抗病原菌感染的重要的非特异性体液免疫因子。总抗氧化能力和抗氧子自由基能力是评价机体抗氧化和清除自由基的指标，其数值升高表明生物清除自由基能力提高，抗氧化防御能力增强。因此，饲料中添加维生素C能够提高军曹鱼幼鱼非特异性免疫能力。
4 结论
在本试验条件下，饲料中添加适量的维生素C能够促进军曹鱼幼鱼的生长，提高鱼体组织中维生素C的积累量，增强非特异性免疫功能。以鱼体增重率和血清溶菌酶含量为评价指标，军曹鱼幼鱼饲料中维生素C的适宜添加量分别为70和80.72mg/kg（维生素C-2-单磷酸酯）。
参考文献38篇略。
凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）维生素B1需要量的研究
1 材料与方法
1.1 试验日粮
以酪蛋白（不含维生素）、明胶、鱼粉作为蛋白源，玉米淀粉作为糖源，鱼油及大豆油作为脂肪源，并补充无机盐、维生素（不含维生素B1）等配制成基础日粮（见表1）。在基础日粮中分别添加0、20、40、60、80、120、200和400 mg/kg 盐酸硫胺素（购自上海伯奥生物科技有限公司）。经实际测定，8种试验日粮中硫胺素的含量分别为：0.83、19.70、37.40、50.80、65.30、94.20、163和323 mg/kg。另外，在基础日粮的基础上，配制1组不含有鱼粉和维生素的驯养日粮（见表1）。原料经粉碎过60目筛，按配方标准称重，均匀混合后，用小型双螺杆机挤压成直径为1.0 mm的颗粒，于-20 ℃冰箱中保存，备用。
1.2 试验对虾及饲养管理
试验对虾取自广州虾苗厂，虾苗运回后，先在养殖系统中培育至0.5 g左右。试验之前，先在室内循环系统盐度为6‰的海水中用不含维生素的驯养日粮驯化暂养1周。试验开始时，取体重（0.55±0.03）g的健康活泼的凡纳滨对虾虾苗960尾，随机分为8组，每组3个重复，每个重复40尾，分别投喂8种不同的试验日粮（分别记作G0.83、G19.70、G37.40、G50.80、G65.30、G94.20、G163、G323）。试验期间每天分别在8：30、14：30和20：00各投喂1次，投喂率为6%～17%（根据虾的摄食情况来调节投喂率，并及时捞出剩饵）。采用循环过滤水系统，养殖水源为经过活性炭过滤、消毒、稀释后的海水，盐度控制在5‰～6.5‰。养殖过程中不间断充氧曝气，溶解氧高于6.0 mg/L，pH保持在7.8～8.2，水温26.0～31.0 ℃。每日观察对虾的摄食、游动、蜕皮及死亡情况，及时捞出死虾。生长试验的饲养周期为6周。
Table 1 Composition and nutrient levels of basal diet and conditioning diet （air-dry basis，%）
表1 基础日粮和驯养日粮组成及营养水平（风干基础）（续）-1
1.3 样品采集及前处理
饲养试验结束时，对虾空腹24 h，称终末体重，统计死亡率。随机取5尾虾，备测虾体水分、灰分、粗脂肪和粗蛋白。随机取10尾虾剥离肝胰脏并采血，采血用1 mL无菌注射器自对虾头胸甲后缘围心窦入针取血，注入Eppendorf管中置于4 ℃冰箱，24 h后10000 rpm 离心10 min，取上清液于-80℃冰箱中保存备用。肝胰脏取出后放入Eppendorf管中置于-80 ℃冰箱中保存备用。
1.4 样品分析
1.4.1 常规营养成分分析
日粮及对虾的水分、灰分、粗蛋白和粗脂肪含量按照国标方法进行测定［13］。
1.4.2 生长性能计算
成活率（Survival rate，SR，%）=终末虾尾数/初始虾尾数×100
特定生长率（Specific growth rate，SGR，%/d）=（ln终末平均体重-ln初始平均体重）/饲养天数×100
饲料效率（Feed efficiency，FE，%）=总体重增加量/总日粮投喂量×100
1.4.3 血清转酮醇酶活性（TKA）测定
血清TKA的测定采用比色法，参照Warnock等［14］和Brin等［15-16］的方法略有改动。取50 μL血清，加入等量0.1 mol/L磷酸缓冲液（pH 7.2），充分混合后静置，再加入100 μL D-5磷酸核糖（0.012mol/L），涡旋充分混合l min。然后在37 ℃下反应1 h，再加入100 μL 15%三氯乙酸终止反应。在4 ℃下，6000×g离心10 min，取上清液加入预先备好的氯化铁-苔黑酚试剂，在100 ℃下水浴40 min，然后用UV/VIS可见光分光度计，在580 nm和670 nm处测定其吸光度。TKA通过Horeker ［17］计算，血清酶活性单位为μmol景天庚酮糖（mL·h）。
1.4.4 日粮中维生素B1测定
根据GB/T 5009.197—2003，于中国广州分析测试中心采用HPLC法测定。称取粉碎过的日粮样品2 g左右，精确至0.001 g，加入5 mL 0.01 mol/L HCl再加入20 mL蒸馏水，摇匀后，于121 ℃加压水解30 min，冷却后用蒸馏水定容至50 mL，用0.45 μm滤膜过滤后上机检测。色谱条件，高效液相色谱仪：Agilent Hp 1100，紫外检测器；色谱柱：Ultimate column（XB-C18，5 μm，4.6 nm×250 nm）；流动相：磷酸盐溶液（1%）+乙腈（15%）+含离子对试剂的水溶液（1 g/850 mL）；流速：1.0 mL/min；检测器：紫外波长280 nm；柱温：35 ℃。
1.4.5 肝胰脏中淀粉酶活性和肝胰脏匀浆上清液总蛋白测定
肝胰脏中的淀粉酶活性采用碘-淀粉比色法测定，肝胰脏匀浆上清液总蛋白采用考马斯亮蓝法测定，方法均参照南京建成生物工程研究所试剂盒测定说明书。
1.5 数据统计分析
结果用平均数±标准误（±SE）表示。数据分析采用SPSS 13.0 统计软件，经方差分析后有显著差异后再做组间Duncan氏多重比较，显著水平P为0.05。通过折线模型［18］确定维生素B1的最适需求量。模型的方程为Y=L+U（R-X LR），其中Y是用于估计需要量的指标，R、L 为折点的坐标（R，L），R 为要计算的需要量，XLR是小于R的自变量（X）值，U是直线的斜率；当X>R 时，定义（R-X LR）=0。
2 结果
2.1 日粮中添加维生素B1对凡纳滨对虾生长性能、饲料效率和存活率的影响
各组凡纳滨对虾的终末体重、特定生长率、饲料效率和存活率见表2。凡纳滨对虾的终末平均体重、特定生长率、饲料效率在未添加组（0.83 mg/kg）最低，显著低于其他各添加维生素B1组（P<0.05），而其他各组间差异不显著（P>0.05）。未添加组（0.83 mg/kg）的存活率最低，显著低于19.70、37.40、50.80和323mg/kg组，与其他组间差异不显著（P>0.05）。以凡纳滨对虾特定生长率为评价指标，通过折线［18］模型分析了凡纳滨对虾的维生素B1需要量（见图1）。结果显示，特定生长率（Y）与日粮维生素B1含量（X）回归方程为：Y=3.73-0.0281（23.9-X）（R2=0.81），得到凡纳滨对虾维生素B1需要量为23.90mg/kg日粮。
Table 2 Effects of dietary thiamin supplementation on growth performance，survival rate and FE of juvenile prawn （Litopenaeus vannamei）（n=3）
2.2 日粮中维生素B1对凡纳滨对虾体成分的影响
饲养42d后，凡纳滨对虾的体成分见表3。各组凡纳滨对虾的水分之间差异不显著（P>0.05）；粗蛋白质、粗灰分和粗脂肪含量以未添加组（0.83 mg/kg）最低，各添加组有不同程度的提高，但各组间差异未达到显著水平。
Table 3 Effect of dietary thiamin supplementation on body composition of juvenile prawn（Litopenaeus vannamei）（%，n=3）
2.3 日粮中添加维生素B1对凡纳滨对虾血清TKA和肝胰脏淀粉酶活性的影响
由表4可见，半纯化日粮中添加50.80mg/kg维生素B1组的血清TKA最高，显著高于无添加（0.83 mg/kg）组，与其他添加组间差异不显著。凡纳滨对虾肝胰脏淀粉酶活性在无添加组（0.83 mg/kg）最低，65.3 mg/kg 组最高，比无添加组（0.83 mg/kg）高14.24%，但各组间差异不显著。以凡纳滨对虾血清的TKA为评价指标，通过折线［18］模型分析了凡纳滨对虾的维生素B1需要量（图2）。结果显示，血清的TKA（Y）与日粮维生素B1含量（X）回归方程为：Y=30.75-0.6826（23.7-X）（R2=0.97），得到凡纳滨对虾维生素B1需要量为23.70mg/kg日粮。
通过6周的饲养试验发现日粮中维生素B1的缺乏导致了凡纳滨对虾生长性能的下降。除此之外，没有发现其他明显的缺乏症状。
Table 4 Effects of dietary thiamin supplementation on Serumal transketolase activity（TKA）and hepatopancreatic amylase of juvenile prawn（Litopenaeus vannamei）（n=3）
Figure 1 Relationship between SGR and dietary thiamine supplementation in the prawn Litopenaeus vanname
Figure 2 Relationship between serum TKA and dietary thiamine supplementation in the prawn Litopenaeus vanname
3 讨论
3.1 凡纳滨对虾维生素B1需要量的确定与分析
维生素B1是水生动物机体维持正常生长和健康所必需的水溶性维生素之一。到目前为止，国内外关于水生动物的维生素B1需要量已有不少报道。在鱼类方面，Morito等［6］以生长、存活以及组织的TKA为指标，得到虹鳟对维生素B1的需要量为l mg/kg 日粮。Murai和Andrews［7］研究发现斑点叉尾获得最佳生长和预防缺乏症状的维生素B1需要量为l mg/kg 日粮。Cowey等［8］研究表明大菱鲆获得最佳生长的维生素B1需要量为0.6～2.6 mg/kg。Aoe等［9］认为鲤鱼的维生素B1需要量为0.5 mg/kg。赵智勇［3］以生长、饵料系数以及肝脏维生素B1含量为评价指标得到草鱼维生素B1需要量分别为1.19、1.16和4.49 mg/kg 日粮。李爱杰等［5］指出牙鲆的维生素B1需要量为18.2 mg/kg 日粮。在软体类方面，Zhu等［2］以生长、肝脏TPP含量以及TPP效应为评价指标，得到皱纹盘鲍的维生素B1需要量分别为51、61和58 mg/kg 日粮。在甲壳类方面，Deshimaru和Kuroki ［10］以生长指标和虾体维生素B1含量为评价指标，得到日本对虾维生素B1的适宜添加量分别为60和120 mg/kg 日粮。徐志昌和李爱杰［11］研究发现，日粮中含60 mg/kg 的维生素B1时，中国对虾的增长率、存活率、淀粉酶活力以及组织中的维生素B1含量最高，维生素B1过量或者缺乏均会降低组织维生素B1含量，阻碍对虾的生长和代谢。Chen等［12］以生长、存活率以及血淋巴的维生素B1含量为评价指标，得到斑节对虾维生素B1需要量为13～14 mg/kg 日粮。由以上报道可见，鱼类的维生素B1需要量在0.5～20 mg/kg，软体类鲍鱼的维生素B1需要量在51～61 mg/kg，虾类的维生素B1需要量在13～120 mg/kg。
本试验中添加维生素B1能显著提高凡纳滨对虾的特定生长率和饲料效率，这与Chen等［12］在斑节对虾的研究中所得结果相似，表明日粮中添加适量的维生素B1能显著促进凡纳滨对虾的生长。而无添加组，可能是由于缺乏维生素B1而导致凡纳滨对虾体内糖代谢受阻，抑制了糖类正常的氧化供能以及体内脂肪的合成，导致体内蛋白质的消耗供能，从而最终导致对虾的生长缓慢。本试验中以特定生长率为评价指标，通过折线回归分析得到维生素B1的需要量为23.90mg/kg日粮。这一结果比已报道的鱼类维生素B1需要量（0.5～20 mg/kg 日粮）要高，比皱纹盘鲍的维生素B1需要量（51～61 mg/kg）要低，在已报道的虾类维生素B1需要量（13～120 mg/kg 日粮）范围之内。不同种类的水生动物维生素B1需要量明显不同，与鱼类不同，水生甲壳纲动物由于其抱食、采食缓慢的摄食食性，日粮从投喂到完全采食，在水中浸泡的时间比较长，饲喂期间虾对日粮颗粒的选择将进一步提高养分的溶失，包括水溶性维生素如维生素B1，因此甲壳纲动物维生素B1的需要量较鱼类高［12］。在甲壳类中，维生素B1与糖代谢有密切的关系，因此，虾类对维生素B1的需要量会因日粮中的碳水化合物的水平而有所变化［10］。Goldsmith［19］认为，维生素B1作为碳水化合物代谢中丙酮酸氧化脱羧和戊糖磷酸途径的转羟乙醛酶反应中一种辅酶，当饲喂高碳水化合物时陆生动物的维生素B1需要量升高。本试验中所用碳水化合物水平为23%，较斑节对虾的20%［12］和日本对虾的5%［10］要高，但是本试验得到凡纳滨对虾的维生素B1需要量（23.90mg/kg），却比斑节对虾的（13～14 mg/kg 日粮）［12］要高，比日本对虾的（60 mg/kg 和120 mg/kg 日粮）［10］要低。另外，试验种苗、试验日粮的组成、试验条件以及评定指标的不同都会造成所测营养需要量的差异。
先前，关于人类和老鼠的研究已经表明，组织和（或）血清的TKA是发现维生素B1缺乏和评价机体维生素B1营养状况的敏感指标［15-16，20-21］。在鱼类及软体类方面，Cowey等［8］用血淋巴的TKA来评价大菱鲆的维生素B1需要量。Morito等［6］以肾脏和肝脏的TKA为指标来评价虹鳟的维生素B1需要量，并指出伴随着缺乏症的出现，TKA也出现明显的变化，因此他认为TKA是虹鳟机体维生素B1状况的较敏感指标。而在甲壳类方面，Chen等［22］以肌肉、血淋巴和肝中TKA来评估斑节对虾的维生素B1营养状况。本试验中，半纯化日粮中添加适量的维生素B1能显著提高凡纳滨对虾血清的TKA。这一结果与皱纹盘鲍［2］、斑节对虾［22］，虹鳟［6］等研究结果相似。本试验以血清TKA为指标得到凡纳滨对虾维生素B1需要量23.70mg/kg日粮与以生长性能为指标得到的23.90mg/kg日粮相近，因此笔者认为生长性能指标和血清TKA是评价凡纳滨对虾维生素B1营养需要状况的合适指标。在本试验条件下，满足凡纳滨对虾最佳生长所需要的维生素B1的量为24 mg/kg 日粮。本实验中，对虾血清转酮醇酶活性是根据Warnock等［14］和Brin等［15-16］方法测定的，该方法通过人为添加TPP到缺乏硫胺素的血清中，刺激血清中的转酮醇酶由无活性变为有活性，其原理可用来评价机体硫胺素的营养状况。该方法的灵敏性、可靠性以及测定过程中酶的稳定性已由始创者反复验证，并应用于临床研究。该方法也多次应用于水产研究，Zhu等［2］关于皱纹盘鲍、Cowey等［8］关于大菱鲆和Masumoto等［23］关于虹鳟的研究中都应用了该法。据此，该方法在测定过程中酶活稳定，可靠性高。
3.2 日粮中添加维生素B1对凡纳滨对虾体成分和肝胰脏淀粉酶活性的影响
对虾摄食维生素B1后，在肝胰脏中将硫胺素磷酸化而转变成为活性的辅酶，即焦磷酸硫胺素（辅羧酶TPP）。从而参与糖代谢过程中α-酮酸（如丙酮酸，α-酮戊二酸）的氧化脱羧反应，此反应是体内代谢的中间步骤，作为辅羧酶促进糖类代谢，并为糖异生、蛋白质合成、三羧酸循环等代谢途径提供部分原料，提供维持机体正常生长和发育的能量及物质需要［24］。本试验研究发现，半纯化日粮中添加维生素B1能提高凡纳滨对虾肝胰脏淀粉酶活性，在添加量为50.8 mg/kg 时，淀粉酶活性达到最大值，但各组间差异不显著。与此相似，许实荣等［24］关于中国对虾的研究发现，日粮中添加60 mg/kg 的维生素B1能明显提高中国对虾肝胰脏的淀粉酶活性，日粮中不足或过多的维生素B1都会降低肝胰脏淀粉酶的活性。徐志昌和李爱杰［11］研究发现，日粮中含有60 mg/kg 的维生素B1时，中国对虾肝胰脏的淀粉酶活性最大。这表明，日粮中添加适量的维生素B1能提高凡纳滨对虾淀粉酶活力，促进糖代谢，使对虾能更好地利用日粮中的糖源。
本试验中，添加维生素B1对凡纳滨对虾体粗蛋白、粗脂肪以及粗灰分含量均无显著影响，但有增高趋势，而且未添加维生素B1组的日粮效率显著低于添加组，这可能是维生素B1的缺乏，抑制了糖类的代谢，减少糖酵解过程所供给蛋白质和脂类合成的营养物质，最终降低了凡纳滨对虾对体内蛋白质和脂类的吸收利用，从而也减少了其他营养物质如钙、磷等的沉积［3］。
3.3 凡纳滨对虾维生素B1缺乏症
在鱼类的研究中发现，维生素B1缺乏会引起鱼类厌食、生长缓慢、出血、神经过敏、不正常抽搐、体色变暗、肌肉萎缩、失去平衡感和运动失调等症状［6，7，25-26］。而本实验中，经过6周的养殖，饲喂无添加维生素B1（0.83 mg/kg）组日粮的凡纳滨对虾除生长缓慢之外，并没有发现明显的缺乏症状，这一结果与大菱鲆［8］、斑节对虾［12］以及皱纹盘鲍［2］的研究相似。Cowey等［8］和Chen等［12］认为底栖生活的鱼类和虾类长时间静置水底，不易出现像自由游动的鱼类所出现的典型缺乏症状，这个解释也适用于底栖生活的凡纳滨对虾，而且由于虾的外壳的包围，也妨碍了对虾缺乏症状的观察。另外，也可能是由于无添加组中含有的0.83 mg/kg 维生素B1或对虾胃肠道合成的维生素B1足以阻止机体出现明显的缺乏症状。
4 结论
①半纯化日粮中添加适量的维生素B1能显著促进凡纳滨对虾的生长和日粮效率，显著提高血清的TKA。
②本试验条件下，生长指标和血清TKA是评价凡纳滨对虾维生素B1营养需要状况的合适指标，以上述两者为评价指标，分析得到凡纳滨对虾维生素B1需要量分别为23.90mg/kg和23.70mg/kg日粮。
参考文献26篇略。
维生素E和硒互作对凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）抗氧化系统的调节作用
1 材料和方法
1.1 饵料的配制
Table 1 Composition of the basal diet（g/kg）
1.2 试验分组及管理
凡纳滨对虾购于广东肇庆某养殖场。挑选体长3cm左右的虾用于试验，试验前暂养1周，养殖于具有循环盐水的玻璃水族箱（70cm×45cm×30cm）中，每箱放养25尾，每个梯度设3个重复，养殖水体盐度为8‰～10‰，由海水晶配制。箱中放置遮蔽物以防止对虾互相残杀，每天早晚各投饵1次，投饵量根据对虾的摄食情况进行调整，饵料以不剩余为准，每天及时清除残饵和排泄物。饲养期为4周，在取样前24h停止投饵。在0周时，从各处理组3个重复共随机抽取10只虾，第2、4周时从每个处理组的2个重复中各随机抽取10只虾，然后从第3个重复中补足前2组所取的尾数，使前2组保持25尾/箱。用250μL的灭菌玻璃注射器自对虾头胸甲后部插入凡纳滨对虾围心腔取血，置于2mL Eppenddorf管中于4℃冰箱中过夜，然后于4℃低速离心10min （3000转/min）取血清放入-80℃超低温冷冻冰箱，备用。在冰浴条件下，用小剪刀和镊子取出对虾肌肉和肝胰腺0.5g加入5mL 生理盐水，进行超声波冰浴匀浆，然后将匀浆液冷冻离心（0℃，10000r/min，30min），取上清液保存在-80℃冰箱中待测。
1.3 超氧阴离子（O2-，Reactive oxygen intermediates）的测定
2mL离心管中加入200μL MHBSS、30μL Alsever氏抗凝剂和20μL 虾血，在25℃下培养30min，加入50μL 0.3%NBT37℃室温培养2h，再加入300μL纯甲醇，离心（6500 r/min，10min）取上清液。将沉淀用70%的甲醇洗2次，在干燥器内干燥后，加700μL的2mol/L KOH和800μl的二甲基亚砜溶解后，在波长620nm处测定OD值。
1.4 酚氧化酶（PO，Phenoloxidase）活力测定
0.01mol/L的二甲砷酸钠缓冲溶液（Na-CAC buffer，PH 7.0）50μL置于96孔酶标板中，加20μL血清，100μL多巴（L-dopa），在490nm下用酶标仪测定吸光度，每两分钟读数一次。酶活力单位定义为每分钟每毫克蛋白OD490增加0.001。
1.5 谷胱甘肽过氧化物酶（GSH，glutathione peroxidase）活力测定
DTNB直接法，即测定底物谷胱甘肽（GSH）被氧化的程度来表示酶活。
1.6 总抗氧化能力（T-AOC，total anti-oxidant activity） 活力测定
采用试剂盒的方法，总抗氧化能力试剂盒购于南京建成生物有限公司，严格按照试剂盒的方法操作。
1.7 统计分析
采用SPSS11.5统计软件两因素方差分析和LSD法多重比较对所得数据进行分析处理，认为P<0.05差异显著，所有的结果均以平均值±标准差来表示。
2 结果
2.1 血细胞O2-含量的变化
Table 2 Effect of vitamin E and selenium on the reactive oxygen intermediates（O2-）（OD） in hemocytes（mean±SD，n=3）
O2-含量的变化见表2。饲料中不同浓度的VE以及VE和Se 对O2-有显著的影响（P<0.05），Se 对O2-无显著的影响（P>0.05），但VE和Se有交互作用。第2和第4周时G8组血细胞中O2-生成量最多（P<0.05），第4周时产生的O2-与第2周相比有所降低。
2.2 PO活力变化
PO活力的变化见表3。第2周时饲料中不同浓度的VE、Se以及VE和Se 对PO有显著的影响（P<0.05），但第4周时Se的影响作用不显著（P>0.05）。第2周时，G9组PO活力达到最高，其次是G5组，但差异不显著（P>0.05）。第4周时，G7组PO活力最高（P <0.05），其次是G6、G8组但与G7组无显著性差异（P>0.05），各组PO与第2周相比也有降低的趋势。
Table 3 Effect of vitamin E and selenium on the PO（U/mL）activity in serum （mean±SD，n=3）
Table 4 Effect of vitaminE and selenium on the total anti-oxidant activity（T-AOC） （IU/mL） in serum（mean±SD，n=3）
2.3 血清T-AOC活力的变化
血清T-AOC活力的变化见表4。饲料中不同浓度的VE、Se以及VE和Se 对血清T-AOC有显著的影响（P<0.05）。第2周时G2组T-AOC活力最高，其次是G4、G8组，但组间差异不显著（P>0.05）。第4周G9组T-AOC活力最高（P<0.05），其次是G5、G3组。
2.4 肝胰腺GPx活力的变化
Table 5 Effect of vitaminE and selenium on the glutathione peroxidase（GPx）（U/mg prot）in hepatopancreas （mean±SD，n=3）
肝胰腺GPx活力的变化见表5。饲料中不同浓度的VE、Se以及VE和Se 对凡纳滨对虾肝胰腺GPx有显著影响（P<0.05）。第2周时，G3组GPx活力最高（P<0.05），其次是G5、G2组，但3组间差异不显著（P>0.05）。第4周时，G7组GPx活力最高（P<0.05），其次是G4组，但与G7组差异显著（P<0.05）。
2.5 肝胰腺T-AOC活力的变化
肝胰腺T-AOC活力的变化见表6。第2周时，饲料中不同浓度的VE、Se以及VE和Se 对凡纳滨对虾T-AOC活力有显著影响（P＜0.05），但第4周时，VE对T-AOC影响不显著（P＞0.05）。第2周时，G3组T-AOC活力最高（P＜0.05），第4周时G9组最高（P＜0.05），其次是G5组，但两组间差异不显著（P＞0.05）。
Table 6 Effect of vitamin E and selenium on the total anti-oxidant activity（T-AOC） （IU/mL）in hepatopancreas（mean ±SD，n=3）
表6 VE和Se 对凡纳滨对虾肝胰腺中总抗氧化能力（T-AOC）（IU/mL）的影响（续）-1
3 讨论
3.1 VE和Se对血细胞O2-的影响
在需氧生物利用氧气代谢过程中，会产生一类含有氧的比氧气性质还活泼的物质—活性氧（reactive oxygenspecies，ROS），它包括过氧化氢（H2O2）、超氧阴离子（O 2-）、羟自由基（·OH）等［29］。活性氧为活化的吞噬细胞功能之一与黏附、趋化、吞噬、脱颗粒等功能共同保证吞噬细胞发挥其正常的防御作用［30］，适量的活性氧能够杀死侵入机体的有害微生物，对机体起到防御保护作用。Sharp研究发现，呼吸爆发产生的活性氧能够作为吞噬细胞杀死气单胞菌（A.salmonicida）的机制［31］，皱纹盘鲍血细胞经刺激诱导吞噬活动中有明显的呼吸爆发现象和很强的O2-产生，皱纹盘鲍血细胞在吞噬防御反应中能够通过产生活性氧对外源病原进行杀灭［32］。试验中发现VE和Se 对O2-有交互作用，这与在肉鸡上的研究结果具有一致性［25］，但单独的Se 对O2-却无显著影响，Wang等也发现在体长2cm的凡纳滨对虾上，Se不能降低由氨氮应激引起的自由基损伤［6］，所以在刺激活性氧产生方面，Se可能是VE的辅助因子，加强了VE的免疫刺激作用。试验过程中，第2周产生的O2-比第4周多，这可能是短时间内外源物质会刺激呼吸爆发作用增强，但在添加量未产生细胞毒负效应时，随着时间延长外源刺的作用会趋于缓和。
3.2 VE和Se对PO的影响
甲壳动物中的酚氧化酶系统（proPO系统）是一种与脊椎动物补体系统类似的酶级联系统，该系统中的因子以非活化状态存在于血细胞的颗粒中［33］。酚氧化酶原系统（proPO系统）经活化产生的酚氧化酶（PO） 广泛存在于无脊椎动物体内，是非特异性免疫系统的主要成员之一。中国对虾（Fenneropenaeus chinensis）血淋巴、血清和凡纳滨对虾血清中都存在PO［34-35］，幼虾（幼体） 体内的PO活性，对虾血清PO活性，血浆上清液PO性和血细胞内PO活性常常被用作对对虾健康状况的评估指标［36］。在本试验中同样能检测到凡纳滨对虾血清中PO的活性。VE、Se以及VE和Se 在第2周时对PO有显著的影响，但第4周时Se作用不显著。第2周G5和G9酶活性最高无显著差异，第四周G6和G7酶活性最高，说明在短时间内添加中剂量的VE和Se足以使PO活性达到较高水平，但随着养殖时间的延长，对虾饵料中需要配合高剂量的VE或Se来维持高水平的PO活性。在整个过程中VE对PO一直有影响，但低Se持续的时间相对较短。王宝杰发现EDTA及Cu2+能较强地抑制中国对虾酚氧化酶的活性，该酶很可能是一种Cu2+金属蛋白酶［37］。叶星等也发现，铜原子是否结合在PO上以及铜离子的价态对PO活力有着深远的影响［38］，适量地增加VE是否会通过影响体内铜的吸收或铜离子的价态来影响PO活性或随着Se添加时间的延长是否会对铜的吸收产生拮抗作用，还有待进一步研究。
3.3 VE和Se 对T-AOC的影响
总抗氧化能力（totalantioxidative capacity，T-AOC）是近年研究发现的用于衡量机体抗氧化系统功能状况的综合性指标。T-AOC的大小可代表和反映机体抗氧化酶系统和非酶促系统对外来刺激的代偿能力以及机体自由基代谢的状态［39］。用硫辛酸和N-乙酰半胱氨酸两种抗氧化剂饲喂高脂饲料大鼠，发现血清和组织T-AOC、SOD活性、GSH含量显著上升［40］。朱选等发现，在低浓度氨氮应激下，添加中草药饲料的凡纳滨对虾血清T-AOC升高［41］，以上研究都为T-AOC作为衡量抗氧化能力的指标提供了有力的佐证。试验发现第2周时，VE、Se以及VE和Se 对血清和肝胰腺T-AOC有显著的作用，但第4周时VE对肝胰腺T-AOC影响不显著。随时间的延长维持高水平T-AOC所需的VE和Se的量无明显变化，添加量都在中剂量左右，第4周时G9组酶活力也达到了最高，至于随时间的延长高VE和Se组是否会对细胞产生毒性或中剂量的VE和Se能否满足抗氧化需求还需进一步验证。在本试验中从提高T-AOC活性来讲Se是一种有效的因子，它可能从多种酶来整体调控T-AOC的强弱，这与方展强等关于Se在一定程度上拮抗汞对剑尾鱼机体T-AOC的降低具有一致性［42］，但与赵吉伟等在虹鳟上得出的结论却相反［8］。
3.4 VE 和Se 对GPx的影响
GPx是生物机体内重要的抗氧化酶之一，它可以消除机体内的过氧化氢及脂质过氧化物，阻断活性氧自由基对机体的进一步损伤，是生物体内重要的活性氧自由基清除剂，它以硒代半胱氨酸（Se）的形式发挥作用，以谷胱甘肽（GSH）为还原剂分解体内的脂质过氧化物，因而可防止细胞膜和其他生物组织免受过氧化损伤。研究发现，动物机体在一定范围内的硒含量与谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）的活性成正相关［43-46］。第2周时，VE、Se以及VE和Se对GPx作用显著，这与Shinde等在雄性水牛上的研究结果具有一致性［47］，并且G3组效果显著；第4周G7组效果最好，当Se的添加量超过一定范围或随着养殖周期的加长，VE对GPx的保护作用可能更大，这与刘丽华对仓鼠的研究结果有一致性，对仓鼠VE和Se都有明显的抗氧化作用，VE的作用却更加明显［48］，但Burk等却发现，缺Se而不是VE导致细胞溶质的过氧化反应，并且两种营养素无交互作用［49］，对于以上研究结果取得的异同，今后还需要从营养和免疫调控机理等方面进行更深入和全面的探讨。
4 结论
由于VE和Se对抗氧化系统的保护机制不同，导致VE、Se以及VE和Se在不同时间阶段对凡纳滨对虾体内各种抗氧化酶的作用效果不同，但从整体而言在一定剂量范围内VE、Se以及VE和Se的抗氧化作用显著。在养殖周期相对短时间（1个月）内，体长3cm左右的虾饲料中VE和Se的添加量以400、0.4mg/kg最佳。
参考文献20篇略。
维生素C对水生动物生长、繁殖及免疫的调节作用
水产科学，2009，28（1）：40-46
（三）微量元素
Effect of Supplemental Dietary Zinc Sources on the Growth and Carbohydrate Utilization of Tilapia Smith 1840，Oreochromis niloticus×Oreochromis aureus
1 Introduction