前言
一、鲤春病毒血症病原检测能力验证报告
1　前言
由全国水产技术推广总站负责实施的“水生动物防疫系统实验室检测能力验证”，从2014—2017年，已经连续开展了4年，旨在加强水生动物防疫系统实验室能力建设，推动实验室能力认证认可，提升水生动物疫病检测水平，建立和完善考核管理机制。根据《农业农村部（原农业部）办公厅关于开展水生动物防疫系统实验室检测能力验证的通知》的要求，深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心水生动物检验检疫实验室负责“鲤春病毒血症”水生动物疫病能力验证的样品制备、发放，并对测试结果进行评价。
根据全国水产推广总站的有关要求，每次能力验证于每年的3月制订计划方案，4—5月制备样品，并对样品的均一性和稳定性进行检验；5月初电话通知、确认参试单位信息，并在5月底、6月初发出第一轮测试样品；6月底、7月初收回第一轮测试结果，并在7月初对结果进行了统计分析；7月底发出第二轮测试样品，8月底收回第二轮测试结果；9月底完成最终能力验证技术报告。
本报告总结了“鲤春病毒血症”四年来的能力验证工作的概况，对实验室反馈的测试结果进行了统计，并分析了检测中存在的技术问题，提出了建议。本项目是参照《能力验证样品均匀性和稳定性评价指南》（CNAS—GL03：2006）等标准和规范性文件而开展的。
2　计划概述
2.1　项目简介
鲤春病毒血症（SVC）是一种由弹状病毒科水泡性病毒属鲤春病毒血症病毒（SVCV）引起的一种急性、出血性鲤科鱼类的传染性疾病。该病主要在欧洲、美国、日本流行，常在水温10～15℃时感染鲤科鱼类，并导致很高的死亡率，最高可达90%以上，造成巨大的经济损失。鉴于该种疾病对养殖业的巨大影响，世界动物卫生组织（OIE）将其列入水生动物疫病名录，我国农业农村部（原农业部）在2008年12月将其列为一类动物疫病。
本次能力验证计划，主要目的是全面了解参加测试的实验室对“鲤春病毒血症”水生动物疫病的检测水平，以及检测中存在的问题，便于政府和其他相关方了解实验室的技术能力，为选择实验室承担《国家水生动物疫病监测计划》疫病检测任务提供依据。
2.2　参加实验室概况
2014年，报名参加能力验证的实验室主要是承担全国水生动物疫病监测工作的实验室，来自全国19个省（自治区、直辖市）报名参加“鲤春病毒血症”能力测试的实验室有27个，实际参加第一轮能力测试的实验室有24个。其中，有10个来自地方渔业部门、水生动物疫病预防控制机构实验室（占41.67%），有4个大专院校的实验室（占16.67%），有7个研究所的实验室（占29.17%），还有3个实验室属于出入境检验检疫系统（占12.5%）。
2015年，参加“鲤春病毒血症”能力验证的实验室共有33个，较2014年增长了37.50%，来自全国22个省（直辖市）。其中，有15个地方渔业部门、水生动物疫病预防控制机构实验室（占45.45%），有5个大专院校的实验室（占15.15%），有7个研究所的实验室（占21.21%），有6个出入境检验检疫系统实验室（占18.18%）。
2016年，参加“鲤春病毒血症”能力验证的实验室共有36个，较2015年增长了9.09%，来自全国20个省（直辖市）。其中，有16个地方渔业部门、水生动物疫病预防控制机构实验室（占44.44%），有4个大专院校的实验室（占11.11%），有8个研究所的实验室（占22.22%），有7个出入境检验检疫系统实验室（占19.44%）。
2017年，参加“鲤春病毒血症”能力验证的实验室共有30个，与2016年相比有所减少，来自全国16个省（直辖市）。其中，有15个地方渔业部门、水生动物疫病预防控制机构实验室（占50%），有5个大专院校的实验室（占16.67%），有3个研究所的实验室（占10%），有7个出入境检验检疫系统实验室（占23.33%）（表1，图1、图2）。
表1　2014—2017年参加SVC能力验证实验室行业分布情况
图1　2014—2017年参加SVC能力验证实验室情况
图2　2014—2017年参加SVC能力验证实验室行业分布比较
2.3　方法设计
2.3.1　样品设计
本次能力验证样品为含有活病毒的鱼组织悬液，添加了冻干保护剂后，真空冷冻干燥制成。每个参试实验室5份样品，包含2份阳性和3份阴性样品。其中，3份阴性样品为：1份阴性样品、1份干扰病毒样品、1份病毒核酸样品。所有样品按阳性、阳性、阴性、干扰病毒、病毒核酸的顺序，依次每5个进行顺序编号，每个参试实验室发放的样品编号不连续，以保证每个参试实验室间检测结果没有可比性，防止实验室间互相比对结果。
2.3.2　样品制备、包装、标识和发放
2.3.2.1　样品的制备
本次能力测试所使用材料：
SVCV毒株：SVCV—20040978，实验室分离，GenBank中可检索到病毒基因序列。
IHNV毒株：IHNV—20101008，实验室分离，GenBank中可检索到病毒基因序列。
鱼组织悬液：鲤组织悬液，充分匀浆后备用。
冻干保护剂：制备20%乳清蛋白水溶液，过滤后备用。
病毒悬液的制备：将贴壁生长状况良好的鲤上皮瘤细胞（epithelioma papulosum cyprini，EPC）传代于4个75cm2细胞培养瓶（每瓶加入20mL培养液），培养过夜后，每2瓶分别各加入1mLIHNV和SVCV病毒悬液，然后分别置于15℃、20℃的生化培养箱中培养。每天观察细胞病变（CPE）情况，直至细胞病变完全。当细胞病变出现完全后，反复冻融3次，并将2瓶中的病毒悬液混匀。取1mL混匀后的病毒悬液接种EPC细胞系，分别测定IHNV和SVCV的滴度（TCID50），其余冻存于-80℃备用。另外，准备1瓶未接种病毒的细胞培养物作为阴性对照。
阳性样品的制备：取制备好的病毒悬液、鲤组织悬液、冻干保护剂，按1:1:8比例混匀。每瓶2mL分装于5mL安瓿瓶中，安瓿瓶外面贴上标签，注明测试项目和编号。轻轻盖上胶盖，放入-80℃冰箱冷冻过夜。待样品完全冷冻后，置于冻干机中真空冻干48h。待安瓿瓶中的液体干燥完全后，压实胶盖，取出安瓿瓶，再用铝盖封口，保存于4℃冰箱中备用。
阴性样品的制备：取未接种病毒的细胞培养物、鲤组织悬液、冻干保护剂，按照1:1:8比例进行混匀后，分装、预冻、冻干后备用。
干扰病毒样品的制备：取IHNV病毒悬液、鲤组织悬液、冻干保护剂，按照1:1:8比例进行混匀后，分装、预冻、冻干后备用。
病毒核酸样品的制备：为了灭活病毒制备病毒核酸，预实验时，采用了3种方法：56℃热灭活病毒悬液、Trizol灭活病毒悬液、加入含有目的病毒基因片段的质粒。实验结果表明，56℃热灭活病毒的效果不稳定，用细胞进行病毒分离时，个别孔出现阳性反应，同时长时间的高温对病毒核酸有一定的影响；用Trizol灭活病毒后，用细胞进行病毒分离时，出现细胞毒性反应，细胞变形、脱落，与细胞病变类似，容易对实验者造成误导；加入病毒质粒，细胞分离病毒未出现细胞病变，用磁珠法、滤膜法、酚／氯仿等方法抽提核酸后，进行RT-PCR扩增，均可以扩增出目的片段。最终根据预实验结果，取未接种病毒的细胞培养物、鱼组织悬液、冻干保护剂，按照1:1:8比例进行混匀后，然后再分别加入SVCV质粒（含有SVCV全长G基因的重组质粒pMD18T-SVC，2μL/1mL），分装、预冻、冻干后备用。
根据全国水产推广总站的要求，此次能力验证还为有需要的实验室制备了阳性参考物质。
阳性参考物质的制备：取SVCV病毒悬液、冻干保护剂，按照2:8比例进行混匀后，分装、预冻、冻干后备用（图3）。
图3　样品制备
2.3.2.2　样品的包装、标识与发放
制备好的样品分为4组：阳性、阴性、干扰病毒、病毒核酸样品，按照阳性、阳性、阴性、干扰病毒、病毒核酸样品的顺序，每5个依次顺序编号。从每组中随机抽取样品，每个实验室5份样品，包括2份阳性样品、1份阴性样品、1份干扰病毒样品、1份病毒核酸样品。
装有样品的安瓿瓶用泡沫固定后放入样品盒内，装入密封袋内，再放入装有冰袋的隔热泡沫箱内，附作业指导书，交快递邮寄至各参试实验室（图4）。
图4　样品包装和发放
2.3.3　样品均匀性和稳定性检验
2.3.3.1　冻干前后病毒悬液滴度的测定
取制备好的冻干前和冻干后的SVC阳性参考物质、SVC阳性样品、IHN阳性样品（干扰病毒样品），分别测定病毒滴度（表2）。
表2　冻干前、后病毒滴度的测定
2.3.3.2　制备样品均匀性检验
从制备好的各组样品：阳性、阴性、干扰病毒、病毒核酸中分别取4份样品，按照GB/T 15805.5—2008的方法，用敏感细胞系分离病毒，同时提取核酸做RT-PCR检测，进行均匀性实验，结果见图5，表3。
图5　制备的样品均匀性实验结果
表3　制备的样品均匀性实验结果
表3　制备的样品均匀性实验结果（续）-1
2.3.3.3　制备样品稳定性检验
从制备好的各组样品：阳性、阴性、干扰病毒、病毒核酸样品中分别抽取12份样品，每4份1组，分别储存于-20℃、4℃、25℃、37℃下，每间隔3天、5天和7天后，随机从各组中抽取1管，用敏感细胞系分离病毒，同时提取核酸做RT-PCR，检测制备样品的稳定性，结果见表4。
表4　制备的样品稳定性实验结果
以上实验结果显示，制备的各组样品均一性良好，置于37℃下存放7天，均可以保持良好的稳定性。
制备好的冻干组织样品，我们采用泡沫箱中加冰袋的方式运输。正常情况下，冰袋能使内部温度保持在25℃以下，也不会受运输过程中阳光的照射而使内部温度过高。通过EMS邮寄样品，大约4天以内可到达各参试实验室。因此，采用预定的运输方式，能够保证样品到达参试实验室具有良好的活性。
2.3.4　检测方法
本次能力验证指定了检测方法：采用《鱼类检疫方法第5部分鲤春病毒血症病毒（SVCV）》（GB 15805.5—2008）检测“鲤春病毒血症”。按照标准的要求，先对样品用敏感细胞系分离病毒，再用RT-PCR对分离物进行鉴定。
2.4　统计设计与评价方法
本次能力验证每个实验室共5份样品，检测项目为定性检测“鲤春病毒血症”，对测试的结果进行直接评价。样品中检出“鲤春病毒血症”报告为“阳性（P）”，样品中未检出“鲤春病毒血症”报告为“阴性（N）”。所有5份样品的检测结果均符合预期结果的为满意，否则为不满意。检测结果报告单上，要求实验室分别填写细胞分离和RT-PCR结果，并对每份样品做出最终结果判定。同时，需附检测方法及检测的关键步骤及主要试剂、电泳图等。有条件的实验室，建议对RT-PCR结果进行测序分析，测定病毒的滴度。
第一轮测试结果不满意的实验室，可以申请参加第二轮测试。第二轮测试样品设计和评价方式与第一轮测试相同。
3　检测结果统计和能力评定
3.1　2014年SVC能力验证情况
2014年，报名参加“鲤春病毒血症”能力验证的实验室有28个。第一轮实际参加的实验室有24个，第一轮反馈有效结果的实验室有21个（占87.5%），反馈的结果与预期结果相符、结果为满意的实验室有14个（占66.67%）（图6）。有2个报名实验室在第一轮测试时，实验室不具备试验条件，要求直接参加第二轮测试。
图6　2014—2017年实验室参加SVC能力测试情况比较
参加第二轮能力验证的实验室有5个，包括：1个第一轮测试结果不满意的实验室、2个未参加第一轮测试的实验室、2个第一轮未提交结果的实验室。第二轮测试有1个实验室仍未提供结果，1个测试结果不满意，其余3个实验室测试结果均为满意（表5）。
表5　2014—2017年实验室参加第二轮SVC能力验证情况
两轮能力验证共发出145个样品，其中，阳性样品检测正确率为84.48%，阴性样品检测正确率为82.76%，干扰病毒检测正确率为79.31%，病毒核酸检测正确率为72.41%（图7）。
图7　2014—2017年SVC能力验证样品检测情况比较
3.2　2015年SVC能力验证情况
2015年，参加“鲤春病毒血症”能力验证的实验室共有33个。两轮测试结果满意的实验室有29个，占87.88%（图6）。
参加第一轮能力验证的实验室有25个，反馈有效结果的实验室有23个（占92%），有2个实验室（8%）未反馈结果（按不满意统计），第一轮测试结果为满意的实验室有18个（占72%）。
参加第二轮能力验证的实验室有14个，包括：6个第一轮测试结果不满意的实验室、8个直接参加第二轮测试的实验室。第二轮测试结果满意的实验室有11个（占78.57%）（表5）。
两轮测试共发出195个样品，其中，阳性样品检测正确率为85.89%，阴性样品检测正确率为89.74%，干扰病毒检测正确率为94.87%，病毒核酸检测正确率为84.62%（见图7）。
3.3　2016年SVC能力验证情况
2016年，参加“鲤春病毒血症”能力验证的实验室共有36个。两轮测试结果满意的实验室有32家，满意率为88.89%（图6）。
参加第一轮“鲤春病毒血症”能力测试的实验室有33个，反馈有效结果的实验室有30个（占88.24%），有3个实验室（9%）未反馈结果（按不满意统计），第一轮测试结果为满意的实验室有27个（占82%）。
参加第二轮“鲤春病毒血症”能力测试的实验室有8个，包括：5个第一轮测试结果不满意的实验室、3个直接参加第二轮测试的实验室。第二轮测试结果满意的实验室有4个（占50%）（表5）。
两轮测试共发出205个样品，其中，阳性样品检测正确率为80.49%，阴性样品检测正确率为85.37%，干扰病毒检测正确率为87.80%，病毒核酸检测正确率为78.05%（图7）。
3.4　2017年SVC能力验证情况
2017年，参加“鲤春病毒血症”能力验证的实验室共有30个。未报送结果的实验室有2个，结果不满意的实验室有1个，测试结果满意的实验室有27个，满意率为90%（图6）。
此次能力验证共发出测试150个样品，其中，SVC阳性样品检测正确率为93.33%，阴性样品检测正确率为93.33%，干扰病毒检测正确率为93.33%，病毒核酸检测正确率为90.00%（图7）。
4　技术分析和建议
4.1　参试实验室采用的检测方法
本次能力验证绝大部分实验室都能按照指定标准的要求，采用标准中推荐的敏感细胞系先进行病毒分离后，再对分离物进行鉴定。有个别实验室未按照要求进行检测，仅采用了PCR方法进行检测，结果不仅核酸样品检测为阳性，阴性样品也检测为阳性，可能操作中存在污染的情况。2014、2015年能力验证，有实验室采用了市售的检测SVC的商品化的检测试剂盒进行检测，结果阳性、病毒核酸样品检测为阴性，与预期不符。建议该实验室应对该试剂盒进行必要的比对、验证后，方可用于实验室的检测工作中。
4.2　细胞分离病毒的检测能力
本次能力验证要求采用指定标准，对活病毒盲样先进行病毒分离。从反馈结果来看，大部分实验室都能按照标准的要求，采用标准中推荐的敏感细胞系进行病毒分离。但仍有部分实验室未能按照标准要求先用敏感细胞系进行病毒分离，由于测试盲样样品中添加了病毒核酸，因此，这些实验室测试结果均为不满意。有些实验室在SVC测试中，对干扰病毒样品（添加了IHNV活病毒，与SVCV培养温度不同）培养时观察到细胞病变，与预期结果也不符；有实验室在病毒核酸样品、阴性样品中观察到了细胞病变，除了可能存在污染的情况外，也可能是细胞系的生长状态不好，或者是接种组织样品带来的细胞毒性反应，被误认为是细胞病变；还有实验室在做细胞分离病毒时，阴性对照细胞的状态就非常不好，随着培养时间的延长，出现拉长、变形、空洞。以上这些情况均说明，参试的部分实验室在利用细系分离病毒上存在一定的问题，不具备用细胞系分离病毒的能力。
2017年，能力验证提供测试样品时给出了病毒的滴度，推荐有能力的实验室自行测定病毒滴度，与参考值比较，以确定实验室细胞的敏感性。最后只有2家单位提供了检测结果，说明实验室在日常细胞的维护方面还存在一定的问题，很多实验室不了解测定细胞敏感性的重要性，甚至有些实验室根本不会测定，而此项工作对于IHN的监测工作尤为重要。此次能力测试推荐按Reed-Muench两氏法，测定病毒滴度，利用公式：距离比例=（高于50%病变率的百分数-50%）/（高于50%病变率的百分数-低于50%病变率的百分数），lgTCID50=距离比例×稀释度对数之间的差+高于50%病变率的稀释度的对数，进行计算。采用细胞分离病毒进行检测的实验室，应定期对实验室的细胞敏感性进行测定。
4.3　分子生物学检测能力
按照标准的要求，对细胞分离物应采用分子生物学方法进行鉴定。从测试结果来看，大部分实验室可以正确运用标准中推荐的嵌套式RT-PCR方法进行检测，并按照要求对扩增结果进行测序、比对，但部分实验室RT-PCR灵敏度达不到要求。有些实验室在对出现细胞病变的阳性样品进行PCR检测时，第一步PCR扩增没有条带，阳性对照也扩增不出条带，而要到套式PCR才能扩增出条带；有实验对出现细胞病变的阳性样品进行PCR鉴定，结果为阴性，完全没有扩增出条带。一般来讲，经过细胞培养后，病毒大量扩增，尤其是可以明显观察到细胞病变的样品，不需要做套式PCR，在第一步PCR均能扩增出相应的条带。这说明，这些实验室的PCR灵敏度存在一定的问题。建议可以组织一次不同浓度核酸比对试验，比较一下不同实验室间的PCR检测灵敏度。
4.4　处理样品时污染的控制
本次能力验证在制备样品时，为了尽量模拟天然样品的状态，特意将阴性的鱼组织悬液充分混匀，取悬浊液加入到病毒悬液中制备能力验证样品。制备好的样品在做均匀性和稳定性实验时，在细胞分离病毒实验中出现细胞污染的情况。经过反复实验，将样品稀释1000倍时，接种样品的孔大约会有一半不再出现污染的情况。但在整个能力测试中，只有3家实验室反馈有细胞污染的情况。在实际的监测过程中，常常会出现污染的情况，为了尽量减少污染，要做好以下几点：①取样时应尽量避开体表、鳃、肠道等部位，取脑、脾、肾等内脏组织；②处理样品时，应按照标准的要求加双抗处理过夜；③如果样品存在比较明显的细菌污染，双抗处理后的样品可以先离心，再吸取上清液过滤后接种细胞；④接种样品时，要接种足够多的数量的孔，同时可以多稀释几个稀释度；⑤盲传时可以吸取没有污染的孔的细胞悬液，或者吸取全部的细胞悬液，离心后过滤再接种细胞。
4.5　实验中的质量控制
本次能力验证过程中，对检测质量的控制非常重要。本次能力测试样品为添加了活病毒的组织样品，同时按照全国水产推广总站的要求，我们为有需要的实验室提供了阳性参考物质。在试验过程中，要注意不同样品之间的交叉污染，使用阳性对照的实验室更应注意操作的规范性，防止样品与阳性对照之间的交叉污染。从反馈结果看，有实验室将阴性样品检测为阳性（细胞分离病毒、PCR结果均为阳性），说明存在污染的可能；有些实验室在检测阴性样品时，在第一步PCR或在套式PCR中扩增出了条带，说明PCR的检测过程中也可能存在着污染情况。建议在处理样品时，可以只打开外层铝盖，不打开内层胶盖，用注射器吸取细胞培养液后，直接刺破胶盖注入安瓿瓶中，待样品完全溶解后，再用注射器吸出。加样和做PCR时也应特别小心，注意器具、环境的消毒、灭菌，避免交叉污染。
4.6　对标准的理解与运用
标准中要求对样品进行病毒分离时，如果第一次分离没有观察到细胞病变，则盲传1次；如果有细胞病变，则用RT-PCR进行鉴定；如果依然没有细胞病变，则判断为阴性。从反馈的测试结果来看，只有少部分实验室按照标准的要求，在盲传后依然没有观察到细胞病变时，直接判定为阴性；而大部分实验室在病毒分离后，无论是否出现细胞病变，均做了RT-PCR进行鉴定。这可能是在实际检测工作中，通常样品的带毒量较低，或者由于细胞敏感性的不确定，采用分子生物学方法进一步确认检测结果。因此，建议实验室应定期对细胞的敏感性进行检查，以确定细胞分离病毒的可靠性。
标准中还要求，当出现可疑细胞病变时，用PCR方法进行鉴定。标准中规定“待测样品PCR扩增后能在相应714bp的DNA位置上有带，并且套式PCR扩增后能在相应606bp位置上有带，可确认为阳性；仅在PCR扩增后有714bp的DNA带，但套式PCR重复两次仍不能扩增出606bp的DNA带的样品也判为阴性”。从反馈结果来看，大部分实验室都做了套式PCR，但仍有少部分实验室忽略了这一点，仅仅只做了第一步扩增，扩增出带后，不经测序，直接判定为阳性结果。这样做可能会存在假阳性的结果，嵌套式PCR在这里的作用是对第一步扩增结果的确认，相当于测序的作用。
另外有实验室，在检测核酸样品时，未观察到可疑细胞病变，但PCR检测结果为阳性，据此做出了阳性结果的判定，这也不符合标准中的规定。以上情况说明，有些实验室对标准的理解有偏差，不能正确地运用标准对检测结果进行判定。
4.7　作业指导书的重要性
本次能力验证，随样品附带了“参加作业指导书”，对样品的状态及处理方法做了详细的说明。但个别实验室对作业指导书的重视不够，没有仔细阅读、理解作业指导书中的内容，导致没有按照说明对样品进行处理，没有及时对样品状态进行确认和回传《样品接受确认表》，从而影响了后续的测试工作。建议实验室今后在试验前一定仔细阅读“参加作业指导书”，有不理解或不明确的及时与制样单位沟通联系。
4.8　原始记录的规范与严谨
从反馈的测试结果报告单来看，绝大部分参试实验室的检测结果内容详细、具体，并附了细胞病变图、电泳图、测序结果等，部分实验室还附上了实验过程的原始记录，详细记录了实验步骤及每一步的实验结果，但也有个别实验室的结果报告和原始记录不够规范和严谨。
例如，有些实验室提供的检测记录并不是实际的操作记录，基本是抄了标准中的方法描述；有的实验室提供的检测记录过于简单，仅提供了PCR的电泳图，而对于细胞分离病毒的结果，既没有图示，也没有文字的表述；有些实验室提供的细胞病变图没有标注样品编号，有实验室仅提供了2张细胞图，标注为“阴性对照”和“细胞病变”；有实验室提供的细胞图虽然标注了编号，却与参加的另一个项目的编号搞混了；有些实验室提供的图中样品编号与实际发放样品编号不符，但结果报告单中的样品编号又是正确的；有些实验室提供的细胞图极不清晰，无法判断细胞病变和阴性阳性的结果；有些实验室电泳图既不标注样品编号，也不标准Marker的大小，测序的结果也不标注样品编号，无法进行一一对应。这样的记录，当出现结果不满意时，无法及时进行追溯、查找原因，即使提交的检测结果正确，也无法对实验室检测能力进行正确评定。
原始记录是记录实验过程的第一手资料，应该客观、详细、规范地记录整个实验过程。作为出具检测报告的依据，还应该具有可追溯性，当出现结果不满意时，可以查找原因。CNAS-CLO1《检测和校准实验室能力认可准则》中，对技术记录进行了规定，“每项检测或校准的记录应包含充分的信息，以便在可能时识别不确定度的影响因素，并确保该检测或校准在尽可能接近原条件的情况下能够重复”。希望参试实验室能充分认识其重要性，尤其在日常监测工作中，不断完善原始记录中的信息，并规范详实的进行记录，保证记录的清晰、明了、及时、规范、严谨（图8）。
图8　参试实验室反馈结果时提供的详细的实验记录
5　总结
能力验证是利用实验室间的比对，对参加测试实验室的能力进行评价，它是实验室认可里的一个重要内容。在CNAS-RLO2《能力验证规则》里，对能力验证做了非常详细的说明，对不同领域参加能力验证的频次也做出了规定。OIE手册中也推荐在实验室之间，每年至少进行2次水平测试，以保证检测实验室的检测水平。但目前国内关于水生动物病的能力验证较少，主要以核酸检测为主，不能全面反映水生动物疫病检测实验室的检测能力，主要还是依靠国外一些参考实验室组织的水生动物疫病的能力验证。
本能力验证，是农业农村部（原农业部）组织开展的国内规模较大的水生动物疫病检测能力验证工作，不仅有核酸的检测，还有病毒的分离检测，可以全面地了解参试实验室的检测能力，同时，为承担每年全国水生动物重大疫病监测任务筛选实验室。因此，能力验证样品在制样时，特意将阴性的鱼组织悬液充分混匀，取悬浊液加入到病毒悬液中，尽量模拟监测中的送检样品的真实状态。在样品的制备过程中，遇到了很多问题，设计方案在实施的过程中不断的修改，中间经过大量实验与测试，包括样品的设计、样品的制备、如何保证样品的均一性和稳定性，以及最后的样品分组、包装，发送、运输等都经过了多次的试验，最终才确定了最优的方案，保证了样品的可靠性、公正性，以及运输过程中的安全性。整个过程虽然复杂，但实验室从不断的实验和测试中得到了大量的数据与经验，这些对以后实验室再次承担该类的工作打下了坚实的基础。
从2014—2017年，参加能力验证的实验室数量，每年都有较大的增加。参加“鲤春病毒血症”能力验证的实验室，由2014年的24个增加至最多一年有36个（2016年），增长了50%。从测试结果来看，4年中2016年参加“鲤春病毒血症”能力测试结果满意率最高，为88.89%，较2014年的67.86%有大幅提高。2017年的能力验证，所有参试实验室均采用标准中推荐的敏感细胞系先进行病毒分离后，再对分离物进行鉴定的方法，没有直接做PCR，或者单纯使用市售的试剂盒进行检测的情况出现。另外，参试实验室的原始记录越来越规范、越来越详细，均附有清晰明确的细胞图和电泳图，大部分参试实验室都能提供测序和比对结果，且结果正确记录。说明经过4年的能力验证计划，尤其是每次能力验证工作结束后的技术培训，参试实验室无论是在检测能力、标准的运用、实验室的质量控制等方面均有很大程度的提高。同时，有更多的实验室有意愿通过参加能力验证计划，对自己实验室的检测能力进行评价，对存在的问题进行分析、改进，以满足水生动物疫病监测的要求。
本次能力验证按照总站的要求，向有需要的实验室提供了阳性参考物质和细胞系，以及检测试剂盒、引物等，在对实验室的检测能力进行测试的同时，也为实验室进行水生动物疫病检测提供了必要的技术支持，帮助实验室搭建、完善了水生动物疫病检测平台，进一步提升了实验室的水生动物疫病检测能力。
6　能力验证计划组织者、协调者
6.1　计划组织者
全国水产技术推广总站
6.2　政策顾问及计划协调者
李清　全国水产技术推广总站疫病防控处　处长
余卫忠　全国水产技术推广总站疫病防控处　副处长
6.3　技术顾问
花群义　深圳海关食品检验检疫技术中心（原深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心）研究员
刘荭　深圳海关食品检验检疫技术中心（原深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心）研究员
6.4　技术实施人员
史秀杰　深圳海关食品检验检疫技术中心（原深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心）研究员
王津津　深圳海关食品检验检疫技术中心（原深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心）兽医师
郑晓聪　深圳海关食品检验检疫技术中心（原深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心）高级兽医师
于力　深圳海关食品检验检疫技术中心（原深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心）助理兽医师
何俊强　深圳海关食品检验检疫技术中心（原深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心）兽医师
贾鹏　深圳海关食品检验检疫技术中心（原深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心）兽医师
兰文升　深圳海关食品检验检疫技术中心（原深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心）高级兽医师
杨锦舜　深圳海关食品检验检疫技术中心（原深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心）技师
7　依据
（1）农办渔[2014]20号《农业农村部（原农业部）办公厅关于开展2015年水生动物防疫系统实验室检测能力测试的通知》
（2）农办渔[2015]18号《农业农村部（原农业部）办公厅关于开展2015年水生动物防疫系统实验室检测能力测试的通知》
（3）农办渔[2016]24号《农业农村部（原农业部）办公厅关于开展2016年水生动物防疫系统实验室检测能力测试的通知》
（4）农办渔[2017]32号《农业农村部（原农业部）办公厅关于开展2017年水生动物防疫系统实验室检测能力测试的通知》
（5）《鱼类检疫方法第5部分：鲤春病毒血症病毒（SVCV）》（GB/T 15805.5—2008）
（6）《能力验证样品均匀性和稳定性评价指南》（CNAS—GL03：2006）
二、传染性造血器官坏死病病原检测能力验证报告
1　前言
由全国水产技术推广总站负责实施的“水生动物防疫系统实验室检测能力验证”，从2014—2017年，已经连续开展了4年，旨在加强水生动物防疫系统实验室能力建设，推动实验室能力认证认可，提升水生动物疫病检测水平，建立和完善考核管理机制。根据《农业农村部（原农业部）办公厅关于开展水生动物防疫系统实验室检测能力验证的通知》的要求，深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心水生动物检验检疫实验室负责“传染性造血器官坏死病”水生动物疫病能力验证的样品制备、发放，并对测试结果进行评价。
根据总站的有关要求，每次能力验证于每年的3月制订计划方案，4—5月制备样品，并对样品的均一性和稳定性进行检验；5月初电话通知、确认参试单位信息，并在5月底、6月初发出第一轮测试样品；6月底、7月初收回第一轮测试结果，并在7月初对结果进行统计分析；7月底发出第二轮测试样品，8月底收回第二轮测试结果；9月底完成最终能力验证技术报告。
本报告总结了“传染性造血器官坏死病”4年来的能力验证工作的概况，对实验室反馈的测试结果进行了统计，并分析了检测中存在的技术问题，提出了建议。本项目是参照《能力验证样品均匀性和稳定性评价指南》（CNAS-GL03：2006）等标准和规范性文件而开展的。
2　计划概述
2.1　项目简介
传染性造血器官坏死病（IHN）是由传染性造血器官坏死病毒（IHNV）引起的鲑鳟鱼类的一种严重的鱼类传染性疾病，病鱼大批急性死亡，造成严重的经济损失。该病最早于20世纪40～50年代发现于美国西北部的太平洋地区，之后由于进出口受感染的鱼及鱼卵蔓延至全北美以及日本。1988年，在欧洲首次报道了IHN的流行，随后扩散德国、法国和比利时，在我国北方也曾报道IHN的暴发。该病一直被世界动物卫生组织（OIE）列入水生动物疫病名录，我国农业农村部（原农业部）在2008年12月将传染性造血器官坏死病列为二类动物疫病。
本次能力验证计划，主要目的是全面了解参加测试的实验室对“传染性造血器官坏死病”水生动物疫病的检测水平，以及检测中存在的问题，便于政府和其他相关方了解实验室的技术能力，为选择实验室承担《国家水生动物疫病监测计划》疫病检测任务提供依据。
2.2　参加实验室概况
2014年，报名参加“传染性造血器官坏死病”能力验证的实验室有16个，实际参加能力测试的实验室有15个。其中，有7个实验室属于地方渔业部门、水生动物疫病预防控制机构实验室（占46.67%），有5个大专院校的实验室（占33.33%），以及3个研究所的实验室（占20.00%）。
2015年，参加“传染性造血器官坏死病”能力验证的实验室共有26个，来自全国22个省（直辖市）。其中，有12个地方渔业部门、水生动物疫病预防控制机构实验室（占46.15%），有4个研究所的实验室（占15.38%），有5个大专院校的实验室（占19.23%），有5个出入境检验检疫系统实验室（占19.23%）。
2016年，参加“传染性造血器官坏死病”能力测试的实验室共有28个，来自全国20个省（直辖市）。其中，有10个地方渔业部门、水生动物疫病预防控制机构实验室（占35.71%），有6个研究所的实验室（占21.43%），有5个大专院校的实验室（占17.86%），有6个出入境检验检疫系统实验室（占21.43%）（表1，图1、图2）。
表1　2014—2017年参加IHN能力验证实验室行业分布情况
图1　2014—2017年参加IHN能力验证实验室情况
图2　2014—2017年参加IHN能力验证实验室行业分布比较
2.3　方法设计
2.3.1　样品设计
本次能力测试样品为含有活病毒的鱼组织悬液，添加了冻干保护剂后，真空冷冻干燥制成。每个参试实验室5份样品，包含2份阳性和3份阴性样品。其中，3份阴性样品为：1份阴性样品、1份干扰病毒样品、1份病毒核酸样品。所有样品按阳性、阳性、阴性、干扰病毒、病毒核酸的顺序，依次每5个进行顺序编号，每个参试实验室发放的样品编号不连续，以保证每个参试实验室间检测结果没有可比性，防止实验室间互相比对结果。
2.3.2　样品制备、包装、标识和发放
2.3.2.1　样品的制备
本次能力测试所使用材料：
IHNV毒株：IHNV-20101008，实验室分离，GenBank中可检索到病毒基因序列。
IPNV毒株：IPNV-sp株，实验室保存。
鱼组织悬液：鲑组织悬液，充分匀浆后备用。
冻干保护剂：制备20%乳清蛋白水溶液，过滤后备用。
病毒悬液的制备：将贴壁生长状况良好的鲤上皮瘤细胞（epithelioma papulosum cyprini，EPC）传代于2个75cm2细胞培养瓶（每瓶加入20mL培养液），培养过夜后，分别各加入1mLIHNV病毒悬液，然后分别置于15℃的生化培养箱中培养。每天观察细胞病变（CPE）情况，直至细胞病变完全。当细胞病变出现完全后，反复冻融3次，并将2瓶中的病毒悬液混匀。取1mL混匀后的病毒悬液接种EPC细胞系，分别测定IHNV的滴度（TCID50），其余冻存于-80℃备用。另外，准备1瓶未接种病毒的细胞培养物作为阴性对照。IPNV使用大鳞大麻哈鱼胚胎细胞（chinook salmon embryo，CHSE-214）进行扩增，15℃培养至细胞病变完全，反复冻融3次后测定病毒滴度，-80℃冻存备用。
阳性样品的制备：取制备好的病毒悬液、鲑组织悬液、冻干保护剂，按1:1:8比例混匀。每瓶2mL分装于5mL安瓿瓶中，安瓿瓶外面贴上标签，注明测试项目和编号。轻轻盖上胶盖，放入-80℃冰箱冷冻过夜。待样品完全冷冻后，置于冻干机中真空冻干48h。待安瓿瓶中的液体干燥完全后，压实胶盖，取出安瓿瓶，再用铝盖封口，保存于4℃冰箱中备用。
阴性样品的制备：取未接种病毒的细胞培养物、鲑组织悬液、冻干保护剂，按照1:1:8比例进行混匀后，分装、预冻、冻干后备用。
干扰病毒样品的制备：取IPNV病毒悬液、鲑组织悬液、冻干保护剂，按照1:1:8比例进行混匀后，分装、预冻、冻干后备用。
病毒核酸样品的制备：为了灭活病毒制备病毒核酸，预实验时，采用了3种方法：56℃热灭活病毒悬液、Trizol灭活病毒悬液、加入含有目的病毒基因片段的质粒。实验结果表明，56℃热灭活病毒的效果不稳定，用细胞进行病毒分离时，个别孔出现阳性反应，同时长时间的高温对病毒核酸有一定的影响；用Trizol灭活病毒后，用细胞进行病毒分离时，出现细胞毒性反应，细胞变形、脱落，与细胞病变类似，容易对实验者造成误导；加入病毒质粒，细胞分离病毒未出现细胞病变，用磁珠法、滤膜法、酚／氯仿等方法抽提核酸后，进行RT-PCR扩增，均可以扩增出目的片段。最终根据预实验结果，取未接种病毒的细胞培养物、鱼组织悬液、冻干保护剂，按照1:1:8比例进行混匀后，然后再分别加入IHNV质粒（N蛋白重组质粒pMD18 T-IHN-N，1μL/1mL），分装、预冻、冻干后备用。
根据全国水产推广总站的要求，此次能力测试还为有需要的实验室制备了阳性参考物质。
阳性参考物质的制备：IHNV病毒悬液、冻干保护剂，按照2:8比例进行混匀后，分装、预冻、冻干后备用（图3）。
图3　样品制备
2.3.2.2　样品的包装、标识与发放
制备好的样品分为4组：阳性、阴性、干扰病毒、病毒核酸样品，按照阳性、阳性、阴性、干扰病毒、病毒核酸样品的顺序，每5个依次顺序编号。从每组中随机抽取样品，每个实验室5份样品，包括2份阳性样品、1份阴性样品、1份干扰病毒样品、1份病毒核酸样品。
装有样品的安瓿瓶用泡沫固定后放入样品盒内，装入密封袋内，再放入装有冰袋的隔热泡沫箱内，附作业指导书，交快递邮寄至各参试实验室（图4）。
图4　样品包装和发放
2.3.3　样品均匀性和稳定性检验
2.3.3.1　冻干前后病毒悬液滴度的测定
取制备好的冻干前和冻干后的SVC阳性参考物质、IHN阳性参考物质、IPN阳性样品（干扰病毒样品），分别测定病毒滴度，详见表2。
表2　冻干前后病毒滴度的测定
2.3.3.2　制备样品均匀性检验
从制备好的各组样品：阳性、阴性、干扰病毒、病毒核酸中分别取4份样品，按照GB/T 15805.2—2008的方法，用敏感细胞系分离病毒，同时提取核酸做RT-PCR检测，进行均匀性实验，结果见图5，表3。
图5　制备的样品均匀性实验结果
表3　制备的样品均匀性实验结果
表3　制备的样品均匀性实验结果（续）-1
2.3.3.3　制备样品稳定性检验
从制备好的各组样品：阳性、阴性、干扰病毒、病毒核酸样品中分别抽取12份样品，每4份1组，分别储存于-20℃、4℃、25℃、37℃下，每间隔3天、5天和7天后，随机从各组中抽取1管，用敏感细胞系分离病毒，同时提取核酸做RT-PCR，检测制备样品的稳定性，结果见表4。
表4　制备的样品稳定性实验结果
以上实验结果显示，制备的各组样品均一性良好，置于37℃下存放7天，均可以保持良好的稳定性。
制备好的冻干组织样品，我们采用泡沫箱中加冰袋的方式运输。正常情况下，冰袋能使内部温度保持在25℃以下，也不会受运输过程中阳光的照射而使内部温度过高。通过EMS邮寄样品，大约4天以内可到达各参试实验室。因此，采用预定的运输方式，能够保证样品到达参试实验室具有良好的活性。
2.3.4　检测方法
本次能力验证指定了检测方法：采用标准《鱼类检疫方法第2部分：传染性造血器官坏死病毒（IHNV）》（GB15805.2—2008）检测“传染性造血器官坏死病”。按照标准的要求，先对样品用敏感细胞系分离病毒，再用RT-PCR对分离物进行鉴定。
2.4　统计设计与评价方法
本次能力验证每个实验室共5份样品，检测项目为定性检测“传染性造血器官坏死病”，对测试的结果进行直接评价。样品中检出“传染性造血器官坏死病”的报告为“阳性（P）”，样品中未检出“传染性造血器官坏死病”的报告为“阴性（N）”。所有5份样品的检测结果均符合预期结果的为满意，否则为不满意。检测结果报告单上，要求实验室分别填写细胞分离和RT-PCR结果，并对每份样品做出最终结果判定。同时，需附检测方法及检测的关键步骤及主要试剂、电泳图等。有条件的实验室，建议对RT-PCR结果进行测序分析，测定病毒的滴度。
第一轮测试结果不满意的实验室，可以申请参加第二轮测试。第二轮测试样品设计和评价方式与第一轮测试相同。
3　检测结果统计和能力评定
3.1　2014年IHN能力验证情况
2014年，第一轮实际参加“传染性造血器官坏死病”能力验证的实验室有14个，第一轮反馈有效结果的实验室有12个（占85.71%），反馈的结果与预期结果相符，结果为满意的实验室有5个（占41.67%）（图6）。有1个报名实验室在第一轮测试时，实验室不具备试验条件，要求直接参加第二轮测试。
图6　2014—2017年实验室参加IHN能力测试情况比较
参加第二轮能力验证的实验室有6个，包括：3个第一轮测试结果不满意的实验室、1个未参加第一轮测试的实验室、2个第一轮未提交结果的实验室。第二轮测试有1个实验室仍未提供结果，1个测试结果不满意，其余4个实验室测试结果均为满意（表5）。
表5　2014—2017年实验室参加第二轮IHN能力验证情况
两轮能力验证共发出95个样品，其中，阳性样品检测正确率为84.21%，阴性样品检测正确率为84.21%，干扰病毒检测正确率为63.16%，病毒核酸检测正确率为84.21%（图7）。
图7　2014—2017年IHN能力验证样品检测情况比较
3.2　2015年IHN能力验证情况
2015年，参加“传染性造血器官坏死病”能力验证的实验室共有26个。两轮测试结果满意的实验室有22个，满意率为84.62%（图6）。
参加第一轮能力验证的实验室有20个，反馈结果全部有效，第一轮测试结果为满意的实验室有13个（占65%）。
参加第二轮能力验证的实验室有12个，包括：6个第一轮测试结果不满意的实验室、6个直接参加第二轮测试的实验室。第二轮测试结果满意的实验室有9个（占75%）（表5）。
两轮测试共发出160个样品，其中，阳性样品检测正确率为90.91%，阴性样品检测正确率为84.85%，干扰病毒检测正确率为96.97%，病毒核酸检测正确率为74.07%（图7）。
3.3　2016年IHN能力验证情况
2016年参加“传染性造血器官坏死病”能力验证的实验室共有28个。两轮测试结果满意的实验室有24个，满意率为85.71%（图6）。
参加第一轮能力验证的实验室有26个，反馈结果的实验室有23个（占88.46%），有3个实验室（11.54%）未反馈结果（按不满意统计），第一轮测试结果为满意的实验室有19个（占73.08%）。
参加第二轮能力验证的实验室有8个，包括：6个第一轮测试结果不满意的实验室、2个直接参加第二轮测试的实验室。第二轮测试结果满意的实验室有5个（占62.5%）（表5）。
两轮测试共发出170个样品，其中，阳性样品检测正确率为83.82%，阴性样品检测正确率为88.24%，干扰病毒检测正确率为88.24%，病毒核酸检测正确率为73.53%（图7）。
3.4　2017年IHN能力验证情况
2017年，参加“传染性造血器官坏死病”能力验证的实验室共有24个。未报送结果的实验室有1个，结果不满意的实验室有3个，测试结果满意的实验室有20个，满意率为83.33%（图6）。
此次能力验证共发出测试120个样品，其中，IHN阳性样品检测正确率为93.75%，阴性样品检测正确率为91.67%，干扰病毒检测正确率为83.33%，病毒核酸检测正确率为95.83%（图7）。
4　技术分析和建议
4.1　参试实验室采用的检测方法
本次能力验证绝大部分实验室都能按照指定标准的要求，采用标准中推荐的敏感细胞系先进行病毒分离后，再对分离物进行鉴定。有个别实验室未按照要求进行检测，仅采用了PCR方法进行检测，结果不仅核酸样品检测为阳性，阴性样品也检测为阳性，可能操作中存在污染的情况。2014、2015年能力验证，有实验室采用了市售的检测IHN的商品化的检测试剂盒进行检测，结果阳性、病毒核酸样品检测为阴性，与预期不符。建议该实验室应对该试剂盒进行必要的比对、验证后，方可用于实验室的检测工作中。还有实验室采用了自己实验室建立的检测方法，检测结果正确，但仍然建议应与标准方法进行比对后，方可用于日常检测工作。如果用于监测工作，建议实验室仍应采用指定的监测方法，只有这样才能保证监测结果的可靠性、可比性。
4.2　细胞分离病毒的检测能力
本次能力验证要求采用指定标准，对活病毒盲样先进行病毒分离。从反馈结果来看，细胞分离病毒的检测能力不够，依然是主要的不满意原因。有些实验室在IHN测试中，有实验室在检测阳性样品时，未观察到细胞病变，但PCR结果为阳性；对干扰病毒样品（添加了IPNV活病毒，与IHNV可以共感染）进行细胞培养时，未观察到细胞病变，与预期结果不符；有实验室在病毒核酸样品、阴性样品中观察到了细胞病变，除了可能存在污染的情况外，也可能是细胞系的生长状态不好，或者是接种组织样品带来的细胞毒性反应，被误认为是细胞病变；还有实验室在做细胞分离病毒时，阴性对照细胞的状态就非常不好，随着培养时间的延长，出现拉长、变形、空洞。以上这些情况均说明，参试的部分实验室在利用细系分离病毒上存在一定的问题，不具备用细胞系分离病毒的能力。
2017年，能力验证提供测试样品时给出了病毒的滴度，推荐有能力的实验室自行测定病毒滴度，与参考值比较，以确定实验室细胞的敏感性。最后只有2家单位提供了检测结果，说明实验室在日常细胞的维护方面还存在一定的问题，很多实验室不了解测定细胞敏感性的重要性，甚至有些实验室根本不会测定，而此项工作对于IHN的监测工作尤为重要。此次能力测试推荐按Reed-Muench两氏法，测定病毒滴度，利用公式：距离比例=（高于50%病变率的百分数-50%）/（高于50%病变率的百分数-低于50%病变率的百分数），lgTCID50=距离比例×稀释度对数之间的差+高于50%病变率的稀释度的对数，进行计算。采用细胞分离病毒进行检测的实验室应定，期对实验室的细胞敏感性进行测定。
4.3　分子生物学检测能力
按照标准的要求，对细胞分离物应采用分子生物学方法进行鉴定。从测试结果来看，大部分实验室可以正确运用标准中推荐的嵌套式RT-PCR方法进行检测，并按照要求对扩增结果进行测序、比对，但部分实验室RT-PCR特异性和灵敏度均达不到要求。有些实验室在用RT-PCR对IHN测试中的干扰病毒IPNV进行检测时，结果为阳性，即扩增出了IHNV的目的片段，说明该实验室的RT-PCR特异性不够，不能很好地识别干扰病毒。个别实验室分子生物学检测的灵敏度也达不到要求。有些实验室在对出现细胞病变的阳性样品进行PCR检测时，第一步PCR扩增没有条带，阳性对照也扩增不出条带，而要到套式PCR才能扩增出条带；有实验对出现细胞病变的阳性样品进行PCR鉴定，结果为阴性，完全没有扩增出条带。一般来讲，经过细胞培养后，病毒大量扩增，尤其是可以明显观察到细胞病变的样品，不需要做套式PCR，在第一步PCR均能扩增出相应的条带。这说明这些实验室的PCR灵敏度存在一定的问题。建议可以组织一次不同浓度核酸比对试验，比较一下不同实验室间的PCR检测灵敏度。
4.4　处理样品时污染的控制
本次能力验证在制备样品时，为了尽量模拟天然样品的状态，特意将阴性的鱼组织悬液充分混匀，取悬浊液加入到病毒悬液中制备能力验证样品。制备好的样品在做均匀性和稳定性实验时，在细胞分离病毒实验中出现细胞污染的情况。经过反复实验，将样品稀释1000倍时，接种样品的孔大约会有一半不再出现污染的情况。但在整个能力测试中，只有3家实验室反馈有细胞污染的情况。在实际的监测过程中，常常会出现污染的情况，为了尽量减少污染，要做好以下几点：①取样时应尽量避开体表、鳃、肠道等部位，取脑、脾、肾等内脏组织；②处理样品时，应按照标准的要求加双抗处理过夜；③如果样品存在比较明显的细菌污染，双抗处理后的样品可以先离心，再吸取上清过滤后接种细胞；④接种样品时，要接种足够多的数量的孔，同时可以多稀释几个稀释度；⑤盲传时可以吸取没有污染的孔的细胞悬液，或者吸取全部的细胞悬液，离心后过滤再接种细胞。
4.5　实验中的质量控制
本次能力验证过程中，对检测质量的控制非常重要。本次能力验证样品为添加了活病毒的组织样品，同时按照全国水产推广总站的要求，我们为有需要的实验室提供了阳性参考物质。在试验过程中，要注意不同样品之间的交叉污染，使用阳性对照的实验室更应注意操作的规范性，防止样品与阳性对照之间的交叉污染。从反馈结果看，有实验室将阴性样品检测为阳性（细胞分离病毒、PCR结果均为阳性），说明存在污染的可能；有些实验室在检测阴性样品时，在第一步PCR或在套式PCR中扩增出了条带，说明PCR的检测过程中也可能存在着污染情况。建议在处理样品时，可以只打开外层铝盖，不打开内层胶盖，用注射器吸取细胞培养液后，直接刺破胶盖注入安瓿瓶中，待样品完全溶解后，再用注射器吸出。加样和做PCR时也应特别小心，注意器具、环境的消毒、灭菌，避免交叉污染。
4.6　对标准的理解与运用
标准中要求对样品进行病毒分离时，如果第一次分离没有观察到细胞病变，则盲传1次；如果有细胞病变，则用RT-PCR进行鉴定；如果依然没有细胞病变，则判断为阴性。从反馈的测试结果来看，只有少部分实验室按照标准的要求，在盲传后依然没有观察到细胞病变时，直接判定为阴性；而大部分实验室在病毒分离后，无论是否出现细胞病变，均做了RT-PCR进行鉴定。这可能是在实际检测工作中，通常样品的带毒量较低，或者由于细胞敏感性的不确定，采用分子生物学方法进一步确认检测结果。因此，建议实验室应定期对细胞的敏感性进行检查，以确定细胞分离病毒的可靠性。
标准中还要求，当出现可疑细胞病变时，用PCR方法进行鉴定。标准中规定“待测样品PCR扩增后能在相应786bp的DNA位置上有带，并且套式PCR扩增后能在相应323bp位置上有带，可确认为阳性；仅在PCR扩增后有786bp的DNA带，但套式PCR重复两次仍不能扩增出323bp的DNA带的样品也判为阴性”。从反馈结果来看，大部分实验室都做了套式PCR，但仍有少部分实验室忽略了这一点，仅仅只做了第一步扩增，扩增出带后，不经测序，直接判定为阳性结果。这样做可能会存在假阳性的结果，嵌套式PCR在这里的作用是对第一步扩增结果的确认，相当于测序的作用。
另外有实验室，在做细胞培养时，第一次接种细胞，培养7天后均出现细胞病变，接着全部样品盲传，培养7天后只有2个样品出现细胞病变，但在报告结果填写“细胞分离病毒”结果时，所有样品均填写为“阳性”，这与标准中的规定不符。以上情况说明，有些实验室对标准的理解有偏差，不能正确地运用标准对检测结果进行判定。
4.7　作业指导书的重要性
本次能力验证，随样品附带了“参加作业指导书”，对样品的状态及处理方法做了详细的说明。但个别实验室对作业指导书的重视不够，没有仔细阅读、理解作业指导书中的内容，导致没有按照说明对样品进行处理，没有及时对样品状态进行确认和回传《样品接受确认表》，从而影响了后续的测试工作。建议实验室今后在试验前一定仔细阅读“参加作业指导书”，有不理解或不明确的及时与制样单位沟通联系。
4.8　原始记录的规范与严谨
从反馈的测试结果报告单来看，绝大部分参试实验室的检测结果内容详细、具体，并附了细胞病变图、电泳图、测序结果等，部分实验室还附上了实验过程的原始记录，详细记录了实验步骤及每一步的实验结果，但也有个别实验室的结果报告和原始记录不够规范和严谨。
例如，有些实验室提供的检测记录并不是实际的操作记录，基本是抄了标准中的方法描述；有的实验室提供的检测记录过于简单，仅提供了PCR的电泳图，而对于细胞分离病毒的结果，既没有图示，也没有文字的表述；有些实验室提供的细胞病变图没有标注样品编号，有实验室仅提供了2张细胞图，标注为“阴性对照”和“细胞病变”；有实验室提供的细胞图虽然标注了编号，却与参加的另一个项目的编号搞混了；有些实验室提供的图中样品编号与实际发放样品编号不符，但结果报告单中的样品编号又是正确的；有些实验室提供的细胞图极不清晰，无法判断细胞病变和阴性阳性的结果；有些实验室电泳图既不标注样品编号，也不标准Marker的大小，测序的结果也不标注样品编号，无法进行一一对应。这样的记录，当出现结果不满意时，无法及时进行追溯、查找原因，即使提交的检测结果正确，也无法对实验室检测能力进行正确评定。
原始记录是记录实验过程的第一手资料，应该客观、详细、规范地记录整个实验过程。作为出具检测报告的依据，还应该具有可追溯性，当出现结果不满意时，可以查找原因。CNAS-CLO1《检测和校准实验室能力认可准则》中，对技术记录进行了规定，“每项检测或校准的记录应包含充分的信息，以便在可能时识别不确定度的影响因素，并确保该检测或校准在尽可能接近原条件的情况下能够重复”。希望参试实验室能充分认识其重要性，尤其在日常监测工作中，不断完善原始记录中的信息，并规范详实的进行记录，保证记录的清晰、明了、及时、规范、严谨（图8）。
图8　参试实验室反馈结果时提供的详细的实验记录
5　总结
能力验证是利用实验室间的比对，对参加测试实验室的能力进行评价，它是实验室认可里的一个重要内容。在CNAS-RLO2《能力验证规则》里，对能力验证做了非常详细的说明，对不同领域参加能力验证的频次也做出了规定。OIE手册中也推荐在实验室之间，每年至少进行2次水平测试，以保证检测实验室的检测水平。但目前国内关于水生动物病的能力验证较少，主要以核酸检测为主，不能全面反映水生动物疫病检测实验室的检测能力，主要还是依靠国外一些参考实验室组织的水生动物疫病的能力验证。
本能力验证，是农业农村部（原农业部）组织开展的国内规模较大的水生动物疫病检测能力验证工作，不仅有核酸的检测，还有病毒的分离检测，可以全面地了解参试实验室的检测能力，同时，为承担每年全国水生动物重大疫病监测任务筛选实验室。因此，能力验证样品在制样时，特意将阴性的鱼组织悬液充分混匀，取悬浊液加入到病毒悬液中，尽量模拟监测中的送检样品的真实状态。在样品的制备过程中，遇到了很多问题，设计方案在实施的过程中不断的修改，中间经过大量实验与测试，包括样品的设计、样品的制备、如何保证样品的均一性和稳定性，以及最后的样品分组、包装，发送、运输等都经过了多次的试验，最终才确定了最优的方案，保证了样品的可靠性、公正性，以及运输过程中的安全性。整个过程虽然复杂，但实验室从不断的实验和测试中得到了大量的数据与经验，这些对以后实验室再次承担该类的工作打下了坚实的基础。
从2014—2017年，参加能力验证的实验室数量，每年都有较大的增加。参加“传染性造血器官坏死病”能力验证的实验室，由2014年的14个增加至最多一年有28个（2016年），增加了100%。从测试结果来看，4年中2016年参加“传染性造血器官坏死病”能力验证结果满意率为85.71%，较2014年的41.67%有大幅提高。2017年的能力验证，所有参试实验室均采用标准中推荐的敏感细胞系先进行病毒分离后，再对分离物进行鉴定的方法，没有直接做PCR，或者单纯使用市售的试剂盒进行检测的情况出现。另外，参试实验室的原始记录越来越规范、越来越详细，均附有清晰明确的细胞图和电泳图，大部分参试实验室都能提供测序和比对结果，且结果正确记录。说明经过4年的能力验证计划，尤其是每次能力验证工作结束后的技术培训，参试实验室无论是在检测能力、标准的运用、实验室的质量控制等方面均有很大程度的提高。同时，有更多的实验室有意愿通过参加能力验证计划，对自己实验室的检测能力进行评价，对存在的问题进行分析、改进，以满足水生动物疫病监测的要求。
本次能力验证按照全国水产推广总站的要求，向有需要的实验室提供了阳性参考物质和细胞系，以及检测试剂盒、引物等，在对实验室的检测能力进行测试的同时，也为实验室进行水生动物疫病检测提供了必要的技术支持，帮助实验室搭建、完善了水生动物疫病检测平台，进一步提升了实验室的水生动物疫病检测能力。
6　能力验证计划组织者、协调者
6.1　计划组织者
全国水产技术推广总站
6.2　政策顾问及计划协调者
李清　全国水产技术推广总站疫病防控处　处长
余卫忠　全国水产技术推广总站疫病防控处　副处长
6.3　技术顾问
花群义　深圳海关食品检验检疫技术中心（原深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心）研究员
刘荭　深圳海关食品检验检疫技术中心（原深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心）研究员
6.4　技术实施人员
史秀杰　深圳海关食品检验检疫技术中心（原深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心）研究员
王津津　深圳海关食品检验检疫技术中心（原深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心）兽医师
郑晓聪　深圳海关食品检验检疫技术中心（原深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心）高级兽医师
于力　深圳海关食品检验检疫技术中心（原深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心）助理兽医师
何俊强　深圳海关食品检验检疫技术中心（原深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心）兽医师
贾鹏　深圳海关食品检验检疫技术中心（原深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心）兽医师
兰文升　深圳海关食品检验检疫技术中心（原深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心）高级兽医师
杨锦舜　深圳海关食品检验检疫技术中心（原深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心）技师
7　依据
（1）农办渔[2014]20号《农业农村部（原农业部）办公厅关于开展2015年水生动物防疫系统实验室检测能力测试的通知》
（2）农办渔[2015]18号《农业农村部（原农业部）办公厅关于开展2015年水生动物防疫系统实验室检测能力测试的通知》
（3）农办渔[2016]24号《农业农村部（原农业部）办公厅关于开展2016年水生动物防疫系统实验室检测能力测试的通知》
（4）农办渔[2017]32号《农业农村部（原农业部）办公厅关于开展2017年水生动物防疫系统实验室检测能力测试的通知》
（5）《鱼类检疫方法第2部分：传染性造血器官坏死病毒（IHNV）》（GB/T 15805.2—2008）
（6）《能力验证样品均匀性和稳定性评价指南》（CNAS-GL03：2006）
三、白斑综合征病原检测能力验证报告
1　前言
为加强水生动物防疫系统实验室能力建设，推动实验室能力认证认可，加快建立本系统实验室考核管理制度，提高疫病监测检测准确性，2014—2017年全国水产技术推广总站组织实施了“水生动物防疫系统实验室检测能力验证”。中国水产科学研究院黄海水产研究所养殖生物疾病控制与分子病理学研究室、世界动物卫生组织（OIE）WSD和IHHN参考实验室承担了测试项目白斑综合征的相关任务，负责提供测试样品，评估测试结果等。
根据全国水产技术推广总站的总体要求，本承担单位于2014—2017年，每年3月制定了测试项目计划方案；4—5月开展了样品制备工作，包括均一性和稳定性测试；6月初向第一轮参测单位发送了测试样品；6月底第一轮测试结果反馈；7月初对第一轮测试结果进行整理、总结、分析和汇报；8月初向第二轮参测单位发送了测试样品；8月底第二轮测试结果反馈；9月完成能力测试项目结果汇总；10月完成技术总结报告。
经统计，2014年共有78个实验室参加了“白斑综合征”能力验证，每个参测单位对6份盲样进行测试；2015年共有53个实验室参加了“白斑综合征”能力验证，每个参测单位对6份盲样进行测试；2016年共有78个实验室参加了“白斑综合征”能力验证，每个参测单位对6份盲样进行验证；2017年共有131个实验室参加了“白斑综合征”能力验证，每个参测单位对4份盲样进行验证。本报告总结了“白斑综合征”能力验证工作的情况、统计并分析参测单位提交结果及检测工作中存在的技术等问题，提出了意见和建议。
2　计划概述
2.1　项目简介
白斑综合征（white spot syndrome，WSS）俗称白斑病，是对虾的严重传染性疾病，20世纪90年代以来一直严重威胁着全世界对虾的养殖安全。该病的特点是感染率高，发病急，死亡率高，死亡速度快。2008年，农业农村部（原农业部）公告第1125号将其列为一类动物疫病，世界动物卫生组织（OIE）将其列为疫病名录。
2014—2017年，水生动物防疫实验室能力验证测试项目的开展，旨在全面了解和掌握各参测单位针对对虾病毒的检测能力和水平，以便项目组织单位更好地把握国内检疫实验室整体情况，为全国水生动物专项监测项目的顺利实施提供参考依据。
2.2　参加实验室概况
2014年，能力验证计划项目共有78个实验室参加“白斑综合征”病毒的测试。其中，地方渔业、技术推广部门、水生动物防疫检测实验室为55个，大专院校实验室4个，科研院所实验室11个，进出境检验检疫系统实验室8个。
2015年，共有53个实验室参加“白斑综合征”病毒的测试，其中，地方渔业、技术推广部门、水生动物防疫检测实验室为34个，大专院校实验室4个，科研院所实验室10个，进出境检验检疫系统实验室5个。
2016年，有78个实验室参加“白斑综合征”病毒的测试。其中，地方渔业、技术推广部门、水生动物防疫检测实验室为55个，大专院校实验室4个，科研院所实验室11个，进出境检验检疫系统实验室8个。
2017年，共有131个实验室参加“白斑综合征”病毒的测试。其中，地方渔业、技术推广部门、水生动物防疫检测实验室为106个，大专院校实验室4个，科研院所实验室12个，进出境检验检疫系统实验室7个，其他2个（表1）。
表1　参测单位统计
2.3　方法设计
2.3.1　样品设计
能力测试样品为含有病毒的对虾组织匀浆液，保存于含有85%的乙醇溶液中。每个WSSV参试实验室6份样品，包含2份强阳性、1份阳性和3份阴性样品。其中，3份阴性样品为：阴性对虾组织；所有样品按（强／弱）阳性、阴性类别，及实验室序号，实行6位代码，每个参试实验室发放的样品编号不连续，从而保证能力验证项目的测试效果，防止实验室间互相比对结果。
2.3.2　样品制备、包装、标识和发放
2.3.2.1　样品的制备
（1）组织选取
WSSV阴性组织病料制备：从-80℃取出未感染WSSV的对虾，在冰上剥离甲壳，取肌肉，总重计40g。
WSSV阳性组织病料制备：从-80℃取出感染WSSV的组织病料，在冰上剥离敏感组织，每尾对虾只取鳃丝和步足，总重计20g。
（2）组织研磨
先将阴性肌肉组织放在冰上预冷的研钵中，加入液氮，初步捣碎至糊状，均分为6份，保存于50mL离心管中，添加85%乙醇，使组织块浸润其中。将50mL离心管置于冰浴环境中，高速匀浆细化研磨组织至浆状，-20℃保存。
为防止样品间交叉污染，先进行阴性组织研磨，再以同样的方法处理阳性组织病料。同时，采用转头独立使用原则，即阴性和阳性样品制备分别使用不同的转头。
（3）WSSV小体系配比预实验
本次能力验证中设立强、弱阳性组，为选择合适的组织稀释度，预先在1.5mL离心管中对原始母液进行小体系配比预实验。以WSSV阴性组织研磨液为底物，对WSSV阳性样品进行倍比稀释。根据《白斑综合征（WSD）诊断规程　第2部分：套式PCR检测法》（GB/T 28630.2—2012）标准方法的检测结果，分别作3倍、9倍和72倍稀释，每个稀释度分别对5个平行样品提取DNA，再利用Nested-PCR方法检测，将第一轮PCR检出的判为强阳，第二轮检出的判为弱阳，最终确定合适的比例，作为大体系制备样品的参照。
（4）阳性制备样品
综合小体系配比预实验结果，进一步缩小稀释比例，WSSV最终确定9倍和72倍稀释度作为强、阳测试样品，进行大体系预混。预混组织样品倒入500mL烧瓶中，冰浴环境下磁力搅拌30min，保证样品均匀度。
（5）样品的分装
经预先称量，每个样品管吸取60μL组织悬液（约含组织量150mg），匀分至带有螺纹盖的样品管内，补85%乙醇溶液至1mL。管口以封口膜进一步封闭。
（6）标准物质的制备
提取WSSV感染的阳性对虾组织核酸，每份100μL体积，150～200ng/μL，约2000次反应。85%乙醇保存。推荐使用方法为12000r/min离心1min后，弃上清液，沉淀室温晾干，加无菌水或TE60～100μL溶解后-20℃贮存备用。
（7）样品中病毒含量的测定
见表2。
表2　样品中病毒含量的测定
2.3.2.2　样品的包装、标识与发放
制备好的样品分组为：阴性、（强／弱）阳性。从每组中随机抽取样品，2014—2016年，每个WSSV参试实验室6份样品，包含2份强阳性、1份阳性和3份阴性样品。2017年，每个WSSV参试实验室4份样品，包含2份阳性、2份阴性样品。
根据参测单位申请的项目不同，制作样品盒标签和样品独立编号标签，包含有参测单位编号、申请测试项目种类和盲样对应的唯一编号等信息。待测样品管放入分隔的塑料样品盒内，以冰袋包裹密封，再放入隔热泡沫箱内，附作业指导书。根据参测单位的申请，同时附阳性参考物质一并包装，交快递邮寄至各参试实验室，并申请货物接收短信回馈业务等跟踪服务。
2.3.3　样品均匀性和稳定性检验
2.3.3.1　制备样品均匀性检验
从制备好的各组样品：阴性、（强／弱）阳性中分别抽取10份样品，按照GB/T 28630.2—2012、GB/T 25878—2010的方法，提取核酸做PCR检测，进行均匀性实验，每个组别各设20个平行。结果见表3，结果显示，各组样品的均一性良好。
表3　制备的样品均匀性实验结果
表3　制备的样品均匀性实验结果（续）-1
2.3.3.2　制备样品稳定性检验
从制备好的各组样品：WSSV阳性、阴性样品中分别抽取48份样品，每份4个平行，分别储存于-20℃、4℃、25℃、37℃下，每间隔3天、5天、7天和10天后，提取核酸做PCR，检测制备样品的稳定性，结果见表4。
表4　制备的样品稳定性实验结果
表4的实验结果显示，制备的各组样品均一性良好，置于37℃下存放7天，均可以保持良好的稳定性。
我们采用泡沫箱中加冰袋的方式运输，正常情况下，冰袋能使内部温度保持在25℃以下，且不会受运输过程中阳光的照射而使内部温度过高。通过快递公司寄送样品，大约4天以内可到达国内参测实验室。因此，采用预定的运输方式，能够保证样品到达参测实验室具有良好的活性。
2.3.4　检测方法
能力测试指定了标准检测方法：“对虾白斑综合征”病毒检测采用《白斑综合征（WSD）针对规程第2部分：套式PCR检测法》（GB/T 28630.2—2012）标准中的方法要求，先对样品提取核酸，再用PCR进行鉴定。
2.4　统计设计与评价方法
对测试的结果进行直接评价，根据实验态度、结果正确性、电泳图示等内容进行等级评定。共分为2级：1满意；2不满意。具体判定标准见表5。第一轮测试结果不满意的实验室，可以申请参加第二轮测试。第二轮测试样品设计和评价方式与第一轮测试相同。
表5　参测单位等级评定标准说明
3　检测结果统计及能力评定
3.1　第一轮能力测试结果
2014年，第一轮“白斑综合征”病毒能力测试项目共有74个参测单位参加。结果满意为66个实验室，结果不满意为9个实验室。结果不满意的5个实验室采标，但反馈的结果与预期结果不符，计划申请第二轮；1个实验室未提交测试结果，申请第二轮；3个实验室未提交测试结果，未申请第二轮（表6）。
表6　第一轮参测单位测试结果反馈统计
第一轮“白斑综合征”病毒能力测试项目共向参测单位发送测试样品444份，其中，阳性样品222份，阴性样品222份。参测单位结果统计阳性样品检测正确率为99.5%，阴性样品检测正确率为98.2%。
2015年，第一轮“白斑综合征”病毒能力测试项目共有45个参测单位参加。结果满意为34个实验室，结果不满意为11个实验室。结果不满意的10个实验室采标，但反馈的结果与预期结果不符，计划申请第二轮；1个实验室未提交测试结果，未申请第二轮（表6）。
第一轮“白斑综合征”病毒能力测试项目共向参测单位发送测试样品270份，其中，阳性样品135份，阴性样品135份。参测单位结果统计阳性样品检测正确率为93%，阴性样品检测正确率为90%。
2016年，第一轮“白斑综合征”病毒能力测试项目共有74个参测单位参加。结果满意为66个实验室，结果不满意为9个实验室。结果不满意的5个实验室采标，但反馈的结果与预期结果不符，计划申请第二轮；1个实验室未提交测试结果，申请第二轮；3个实验室未提交测试结果，未申请第二轮（表6）。
第一轮“白斑综合征”病毒能力测试项目共向参测单位发送测试样品444份，其中，阳性样品222份，阴性样品222份。参测单位结果统计阳性样品检测正确率为99.5%，阴性样品检测正确率为98.2%。
2017年，“白斑综合征”病毒能力测试项目共有131个参测单位参加。结果满意为111个实验室，结果不满意为20个实验室。结果不满意的7个实验室采标，但反馈的结果与预期结果不符，13个实验室未提交测试结果。
第一轮“白斑综合征”病毒能力测试项目共向参测单位发送测试样品524份，其中，阳性样品252份，阴性样品272份。参测单位结果统计阳性样品检测正确率为100%，阴性样品检测正确率为97%。
3.2　第二轮能力测试结果
2014年，第二轮“白斑综合征”病毒能力测试项目共有10个参测单位参加。其中，4个实验室为第一次参测，结果均满意（表7）。
表7　第二轮参测单位测试结果反馈统计
2015年，第二轮“白斑综合征”病毒能力测试项目共有18个参测单位参加。其中，8个实验室为第一次参测，结果均满意（表7）。
2016年，第二轮“白斑综合征”病毒能力测试项目共有10个参测单位参加。其中，4个实验室为第一次参测，结果均满意（表7）。
2017年，无第二轮测试。
4　技术分析和建议
2014—2016年，WSSV能力验证计划项目本单位承担的“白斑综合征”病毒能力测试项目，均按照组织核酸提取、PCR、电泳的技术方法判定结果。每个实验室设计为6份测试样品，包括3份阳性样品（其中，2份强阳、1份弱阳），3份阴性样品。同时，在样品的寄送包装中附有样品接收确认单、能力测试作业指导书和能力测试结果报告单纸质材料。结果报告单中要求每个参测实验室注明所使用的仪器设备、参考物质的种类及来源、采标情况、核酸制备方法、检测结果及测试中出现的问题等，同时需附电泳图片。上述信息的提供，用以考察和评定参测实验室的检测能力和水平：
（1）标准的运用　是否能正确熟练地掌握并使用标准，在WSSV第一步PCR为阴性结果时，通过二扩得出正确的判断。
（2）PCR的特异性　WSSV测试样品中的阴性设定为十足目的水生动物，用于考察参测实验室虾类组织的检测过程中特异性的把握及防污染的处理。
（3）PCR的灵敏度　测试样品中设定了强阳和阳性样品，参测实验室能否明确地区分相对的变化，用以判定检测体系的高效性、灵敏度。
（4）作业指导书的理解　此次能力测试项目开展过程中，随样品寄送了对应测试项目的“参加作业指导书”，对参测单位的代码、样品的保存方式、状态、采用标准、前处理和后处理等信息做了详尽的说明。绝大多数参测实验室均进行了认真阅读和理解。
存在的问题：
（1）标准的正确运用　WSSV测试标准中提到对DNA提取质量及反应体系监控，需要使用F3/R3引物，PCR电泳结果在848bp处会有一条特定条带。部分实验室并未添加该套引物，用以监控整个反应体系的正常运行。原因可能是没有理解该套引物的作用，或者嫌麻烦没有增加此扩增步骤。
核酸制备方法在标准中规定的是常规方法，目前商品化试剂盒应用比较普遍，便捷且提取质量较好，建议检测实验室在选择使用商品化核酸提取试剂盒时，应设立常规方法对比监控核酸提取质量，防止假阴性的错误判定。此次能力测试绝大多数单位核酸提取使用商品化核酸提取试剂盒：Sigma、天根、TAKARA、厦门鹭隆、北京艾德莱、东洋纺TOYOBO、YSY Biotech、Qiagen、BBI Life Science Molecular Biology。根据测试结果使用效果良好。
（2）标准物质的规范　对于WSSV标准物质大部分参测单位使用的是阳性核酸，来源有自己分离和其他单位提供，有的实验室标准物质使用质粒。标准物质作为整个检测质量体系运行情况的监控与指示起到非常重要的作用，它的使用和保存均应有规范的记录并应统一或者定期对其的有效性进行监控。对于使用质粒作为阳性对照的实验室需要在此特别提醒，在使用过程更应严格防止污染，避免因阳性对照的原因而导致被检样品假阳性结果的出现。
（3）体系质量控制
①实验室区域划分：能力测试活动结果不满意实验室中，假阳性的结果高于假阴性。其中，分析以上交叉污染或假性结果的出现，主要由以下几方面因素造成：硬件环境方面，核酸检测实验室应划分为5个独立的工作区，即试剂配制和贮存区、样品制备区、PCR反应配制区、扩增区和扩增产物分析区。每个区域应有明确的标记，进入各工作区域应尽量按单一方向进行，每个工作区域内都应有专项使用的设备。部分检测实验室空间布局和区域划分存在缺陷，为防止从PCR反应间的污染的扩散，最好将PCR实验室分区或者分成多个房间，严格从洁净区（前区）到污染区（后区）的单向流程；软件操作方面，操作过程不规范、人员技术等方面存在不足，防污染意识淡薄，因此，极容易出现假阳性或者假阴性结果的情况。
②试剂和技术环节：此外，还应保证试剂的可靠有效。个别实验室在检测过程中存在试剂失效的现象，引物干粉可以在-80℃条件下保存较长时间，-20℃条件下保存数月，干粉溶解后应分装，避免反复冻融。体系配制应在低温条件下进行，加模板时因体积微量，应确保添加入体系中。标准物质应分装并避免反复冻融。测试过程中部分参测单位通过电话咨询，以及在结果报告单的模糊分析，暴露了对WSSV检测流程中存在不规范和技术欠缺等问题。建议承担检测任务的实验室加强该方面培训，将检测误差风险降到最低。
按照规定，病原检测需要采标。对于长期承担检测任务的实验室，这就意味着需要长期固定使用一套或几套引物，造成实验室污染的风险较高，因此更加需要注重检测质量，防污染，降风险。
（4）实验室间检测能力的差异　实验室检测能力，除了测试预期结果相符满意外，其他的细节，如实验记录、沟通交流、问题处理等方面，也可以全面反映出一个实验室的综合能力。
为考察参测实验室在检测灵敏度方面的能力，样品制备过程中分别设计了强阳性和阳性的测试样。按照国标要求，WSSV的测试需要套式PCR方法，因此，根据一扩和二扩的结果，可以区分出灵敏度的强弱。但有些实验室对于一扩可以测出的测试样品，只能在二扩中出阳性结果，其检测灵敏度较预期低，在实际测样过程中会存在漏检的风险。
在提交结果环节，大部分实验室都能做到按照“参加作业指导书”的格式和要求进行，并附上了详细的原始记录。但个别实验室只简单地将结果报送，信息不够全面。
相比之下，对于测试样品检测为阳性结果的样品，有的实验室通过测序进行验证，结果的出具非常严谨。
5　总结
2014—2017年，能力验证项目执行过程中在诸多环节进行了技术改进和质量提高。难点一：由于目前对虾养殖现状，疾病的发生通常为多病原混合感染，因此，在选定单一病原感染的样品以及阴性样品筛选过程中遇到巨大的障碍。此次能力测试活动阴性样品的制备材料我们选择了凡纳滨对虾亲虾（编号：20130120001），该批样品经多次检测验证未含有WSSV，为避免在制样过程中受到环境中诸多因素的影响，我们选择在离实验室较远的、未接触过对虾病原的区域开展工作，同时所用物品尽量使用一次性，尤其是匀浆转头和磁力搅拌转子。阴性制备全程严格做到防污染，取得了预期的效果。难点二：2014—2017年，活动参测单位分别为27、53、78、131个实验室，呈每年递增。制样、发样等环节增加了很大的工作量，为保证样品的均一性和稳定性，进行了多次、大量的样品抽检测试，以保证覆盖比率，保证测试样品的质量。在实验中获得了宝贵的数据，积累了丰富的经验，也为持续承担该项目打下了坚实的基础。
在样品发送、结果反馈、数据分析等各环节，与参测实验室的交流中，也初步了解了其遇到的具体问题和处理措施，电话指导并帮助有需求的参测单位改进技术。在此过程中起到了相互促进的作用，同时，也深刻体会到参测实验室能力的差异，部分参测实验室缺乏规范的技术培训，结果正确率较低。根据农业农村部（原农业部）渔业渔政管理局、全国水产技术推广总站的统一要求，此次能力测试还为部分参测单位提供标准物质，为实验室的检测工作起到积极作用，检测能力有明显的提高。反映出该项目举办对各参测实验室能力水平的检验和提高，达到了提升国内水生动物防疫实验室病原检测能力的目的，初步呈现出了成效。通过举办此次能力测试项目，建议各承担检测项目的实验室间加强交流，希望组织单位能够将能力测试考察工作长期化，以期不断提升和维持各实验室的检测能力水平，为我国水生动物疫病防疫提供可靠数据。
6　能力验证计划组织者、协调者
6.1　计划组织者
全国水产技术推广总站
6.2　技术顾问
黄倢　中国水产科学研究院黄海水产研究所　研究员
6.3　技术实施人员
杨冰　中国水产科学研究院黄海水产研究所　副研究员
万晓媛　中国水产科学研究院黄海水产研究所　助理研究员
7　依据
（1）农办渔[2017]《农业农村部（原农业部）办公厅关于开展水生动物防疫系统实验室检测能力的通知》
（2）《白斑综合征（WSD）诊断规程　第2部分：套式PCR检测法》（GB/T 28630.2—2012）
（3）《对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒（IHHNV）检测PCR法》（GB/T 25878—2010）
（4）《能力验证样品均匀性和稳定性评价指南》（CNAS-GL03：2006）
（5）兽医实验室生物安全管理规范[农业农村部（原农业部）2003年10月15日发布]
（6）《医学实验室质量和能力认可准则在基因扩增检验领域的应用说明》（CNAS-CL36：2012）
（7）《实验室质量控制规范食品分子生物学检测》（GB/T 27403—2008）
四、传染性皮下和造血器官坏死病病原检测能力验证报告
1　前言
为加强水生动物防疫系统实验室能力建设，推动实验室能力认证认可，加快建立本系统实验室考核管理制度，提高疫病监测检测准确性，2014—2017年全国水产技术推广总站组织实施了“水生动物防疫系统实验室检测能力测试”活动。中国水产科学研究院黄海水产研究所养殖生物疾病控制与分子病理学研究室、世界动物卫生组织（OIE）WSD和IHHN参考实验室承担了测试项目传染性皮下和造血器官坏死病的相关任务，负责提供测试样品，评估测试结果等。
根据全国水产技术推广总站的总体要求，本承担单位于2014—2017年，每年3月制定了测试项目计划方案；4—5月开展了样品制备工作，包括均一性和稳定性测试；6月初向第一轮参测单位发送了测试样品；6月底第一轮测试结果反馈；7月初对第一轮测试结果进行整理、总结、分析和汇报；8月初向第二轮参测单位发送了测试样品；8月底第二轮测试结果反馈；9月完成能力测试项目结果汇总；10月完成技术总结报告。
经统计，2014年度共有20个实验室参加了“传染性皮下和造血器官坏死病”能力测试；2015年度共有38个实验室参加了“传染性皮下和造血器官坏死病”能力测试；2016年度共有60个实验室参加了“传染性皮下和造血器官坏死病”能力测试，每个参测单位5份盲样进行测试；2017年度共有83个实验室参加了“传染性皮下和造血器官坏死病”能力测试，每个参测单位4份盲样进行测试。本报告总结了“传染性皮下和造血器官坏死病”能力测试工作的情况、统计并分析参测单位提交结果及检测工作中存在的技术等问题，提出了意见和建议。
2　计划概述
2.1　项目简介
传染性皮下和造血组织坏死病（infectious hy podermal and haematopoietic necrosis，IHHN）可引起细角滨对虾（Litopenaeus stylirostris）90%以上的死亡率，其稚虾受危害最为严重；凡纳滨对虾（L. vannamei）患病后呈现慢性“矮小残缺综合征（RDS）”，主要是影响患病对虾生长缓慢而体型畸形，受感染存活对虾终生带毒。2008年，农业农村部（原农业部）公告第1125号将其列为一类动物疫病，OIE将其列为重要疫病。
2014—2017年，水生动物防疫实验室能力验证测试项目的开展，旨在全面了解和掌握各参测单位针对对虾病毒的检测能力和水平，以便项目组织单位更好地把握国内检疫实验室整体情况，为全国水生动物专项监测项目的顺利实施提供参考依据。
2.2　参加实验室概况
2014年，能力验证计划项目共有20个实验室参加“传染性皮下和造血组织坏死病”病毒的测试。其中，地方渔业、技术推广部门、水生动物防疫检测实验室为12个，大专院校实验室3个，科研院所实验室3个，进出境检验检疫系统实验室2个（表1）。
表1　参测单位统计
2015年，共有38个实验室参加“传染性皮下和造血组织坏死病”病毒的测试。其中，地方渔业、技术推广部门、水生动物防疫检测实验室为22个，大专院校实验室4个，科研院所实验室8个，进出境检验检疫系统实验室4个（表1）。
2016年，共有60个实验室参加“传染性皮下和造血组织坏死病”病毒的测试。其中，地方渔业、技术推广部门、水生动物防疫检测实验室为42个，大专院校实验室5个，科研院所实验室8个，进出境检验检疫系统实验室5个（表1）。
2017年，共有83个实验室参加“传染性皮下和造血组织坏死病”病毒的测试。其中，地方渔业、技术推广部门、水生动物防疫检测实验室为60个，大专院校实验室3个，科研院所实验室7个，进出境检验检疫系统实验室8个，其他5个（表1）。
2.3　方法设计
2.3.1　样品设计
本次能力测试样品为含有病毒的对虾组织匀浆液，保存于含有85%的乙醇溶液中。每个IHHNV参试实验室5份样品，包含3份阳性和2份阴性样品。所有样品按（强／弱）阳性、阴性类别及实验室序号，实行6位代码。每个参试实验室发放的样品编号不连续，从而保证能力验证项目的测试效果，防止实验室间互相比对结果。
2.3.2　样品制备、包装、标识和发放
2.3.2.1　样品的制备
（1）组织选取
IHHNV阴性组织病料制备：从-80℃取出未感染IHHNV的对虾，在冰上剥离甲壳，取肌肉，总重计60g。
IHHNV阳性组织病料制备：从-80℃取出感染WSSV的组织病料，在冰上剥离敏感组织，每尾对虾只取鳃丝和步足，总重计20g。
（2）组织研磨
先将阴性肌肉组织放在冰上预冷的研钵中，加入液氮，初步捣碎至糊状，均分为6份，保存于50mL离心管中，添加85%乙醇，使组织块浸润其中。将50mL离心管置于冰浴环境中，高速匀浆细化研磨组织至浆状，-20℃保存。
为防止样品间交叉污染，先进行阴性组织研磨，再以同样的方法处理阳性组织病料。
（3）阳性制备样品
IHHNV以阳性组织研磨母液作为阳性测试样品。预混组织样品倒入500mL烧瓶中，冰浴环境下磁力搅拌30min，保证样品均匀度。
（4）样品的分装
经预先称量，每个样品管吸取60μL组织悬液（约含组织量150mg），匀分至带有螺纹盖的样品管内，补85%乙醇溶液至1mL。管口以封口膜进一步封闭，为加以区别。
2.3.2.2　样品的包装、标识与发放
2014—2016年，每个IHHNV参试实验室5份样品，包含3份阳性和2份阴性样品。2017年4份样品，2份阴性、2份阳性。
根据参测单位申请的项目不同，待测样品管放入分隔的塑料样品盒内，以冰袋包裹密封，再放入隔热泡沫箱内，附作业指导书，交快递邮寄至各参试实验室。
2.3.3　样品均匀性和稳定性检验
2.3.3.1　制备样品均匀性检验
从制备好的各组样品：阴性、阳性中分别抽取10份样品，GB/T 25878—2010的方法，提取核酸做PCR检测，进行均匀性实验。结果见表2，结果显示，各组样品的均一性良好。
表2　制备的样品均匀性实验结果
2.3.3.2　制备样品稳定性检验
从制备好的各组样品：阳性、阴性、干扰病毒、病毒核酸样品中分别抽取64份样品，每4份1组，分别储存于-20℃、4℃、25℃、37℃下，每间隔3天、5天、7天和10天后，随机从各组中抽取4管，提取核酸做PCR，检测制备样品的稳定性，结果见表3。
表3　制备的样品稳定性实验结果
表3　制备的样品稳定性实验结果（续）-1
表3实验结果显示，制备的各组样品均一性良好，置于25℃下存放7天，均可以保持良好的稳定性。
我们采用泡沫箱中加冰袋的方式运输，正常情况下，冰袋能使内部温度保持在25℃以下，且不会受运输过程中阳光的照射而使内部温度过高。通过快递公司寄送样品，大约4天以内可到达国内参试实验室。因此，采用预定的运输方式，能够保证样品到达参试实验室具有良好的活性。
2.3.4　检测方法
本次能力测试指定了标准检测方法：采用《对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒（IHHNV）检测PCR法》（GBT 25878—2010）标准中的方法要求，先对样品提取核酸，再用PCR进行鉴定。
2.4　统计设计与评价方法
对测试的结果进行直接评价，根据实验态度、结果正确性、电泳图示等内容进行等级评定。共分为3级：1+非常满意；1满意；1-基本满意；2不满意；3不满意。具体判定标准见表4。第一轮测试结果不满意的实验室，可以申请参加第二轮测试。第二轮测试样品设计和评价方式与第一轮测试相同。
表4　参测单位等级评定标准说明
3　检测结果统计及能力评定
3.1　第一轮能力测试结果
2014年，第一轮“传染性皮下和造血组织坏死病”病毒能力测试项目共有19个参测单位参加。结果满意为13个实验室，结果不满意为6个实验室。其中，4个实验室采标但反馈的结果与预期结果不符；2个实验室采用非标方法（表5）。
表5　第一轮参测单位测试结果反馈统计
第一轮“传染性皮下和造血组织坏死病”病毒能力测试项目共向参测单位发送测试样品95份，其中，阳性样品57份，阴性样品38份。参测单位结果统计阳性样品检测正确率为93%，阴性样品检测正确率为82%。
2015年，第一轮“传染性皮下和造血组织坏死病”病毒能力测试项目共有31个参测单位参加。结果满意为27个实验室，结果不满意为4个实验室。结果不满意4个实验室采标但反馈的结果与预期结果不符，计划申请第二轮（表5）。
第一轮“传染性皮下和造血组织坏死病”病毒能力测试项目共向参测单位发送测试样品155份，其中，阳性样品62份，阴性样品93份。参测单位结果统计阳性样品检测正确率为95%，阴性样品检测正确率为94%。
2016年，第一轮“传染性皮下和造血组织坏死病”病毒能力测试项目共有58个参测单位参加。结果满意为54个实验室，结果不满意为4个实验室。结果不满意1个实验室采标但反馈的结果与预期结果不符，计划申请第二轮（表5）；1个实验室未提交测试结果，申请第二轮；2个实验室未提交测试结果，未申请第二轮（表5）。
第一轮“传染性皮下和造血组织坏死病”病毒能力测试项目共向参测单位发送测试样品290份，其中，阳性样品116份，阴性样品174份。参测单位结果统计阳性样品检测正确率为100%，阴性样品检测正确率为99.5%。
2017年，“传染性皮下和造血组织坏死病”病毒能力测试项目共有83个参测单位参加。结果满意为71个实验室，结果不满意为12个实验室。结果不满意的2个实验室采标但反馈的结果与预期结果不符，10个实验室未提交测试结果（表5）。
第一轮“传染性皮下和造血组织坏死病”病毒能力测试项目共向参测单位发送测试样品332份，其中，阳性样品156份，阴性样品176份。参测单位结果统计阳性样品检测正确率为98%，阴性样品检测正确率为100%。
3.2　第二轮能力测试结果
2014年，第二轮“传染性皮下和造血组织坏死病”病毒能力测试项目共有6个参测单位参加。结果满意为5个实验室，结果不满意为1个实验室（表6）。
表6　第二轮参测单位测试结果反馈统计
2015年，第二轮“传染性皮下和造血组织坏死病”病毒能力测试项目共有11个参测单位参加。其中，7个实验室为第一次参测，结果均满意（表6）。
2016年，第二轮“传染性皮下和造血组织坏死病”病毒能力测试项目共有5个参测单位参加。其中，2个实验室为第一次参测，结果均满意（表6）。
2017年度，无第二轮测试。
4　技术分析和建议
（1）作业指导书的理解
此次能力测试项目开展过程中，随样品寄送了对应测试项目的“参加作业指导书”，对参测单位的代码、样品的保存方式、状态、采用标准、前处理和后处理等信息做了详尽的说明。但部分实验室对作业指导书重视度不够，并未认真阅读和理解，导致样品测试过程中出现一些问题，从而影响后续的检测质量。
（2）标准的正确运用
核酸制备方法在标准中规定的是常规方法，目前商品化试剂盒应用比较普遍，便捷且提取质量较好，建议检测实验室在选择使用商品化核酸提取试剂盒时，应设立常规方法对比监控核酸提取质量，防止假阴性的错误判定。
（3）参考物质的规范
对于IHHNV参考物质大部分参测单位使用的是阳性核酸，有的实验室的参考物质使用质粒，来源有自己分离和其他单位提供。参考物质作为整个检测质量体系运行情况的监控与指示起到非常重要的作用，它的使用和保存均应有规范的记录并应统一或者定期对其的有效性进行监控。对于质粒阳性样品较核酸样品，在使用过程更应严格防止污染，避免假阳性结果的出现。
（4）体系质量控制
能力测试活动中结果不满意实验室存在阳性测试样品出现阴性，阴性测试样品出现阳性的结果。分析以上交叉污染或假性结果的出现，主要由以下几方面因素造成：硬件环境方面，部分检测实验室空间布局和区域划分存在缺陷，为防止从PCR反应间的污染的扩散，最好将PCR实验室分区或者分成多个房间，严格从洁净区（前区）到污染区（后区）的单向流程；软件操作方面，操作过程不规范、人员技术等方面存在不足，防污染意识淡薄，因此，极容易出现假阳性或者假阴性结果的情况；测试过程中部分参测单位通过电话咨询，以及在结果报告单的模糊分析，暴露了对IHHNV检测流程不够熟悉等问题。建议承担检测任务的实验室加强该方面培训，将检测误差风险降到最低。
按照规定，病原检测需要采标。对于长期承担检测任务的实验室，这就意味着需要长期固定使用一套或几套引物，造成实验室污染的风险较高，因此更加需要注重防污染。
（5）实验室间检测能力的差异
实验室检测能力，除了测试预期结果相符满意外，其他的细节，如实验记录、沟通交流、问题处理等方面，也可以全面反映出一个实验室的综合能力。通过能力测试活动，在参测实验室中确实存在能力参差不齐的情况。
在提交结果环节，大部分实验室都能做到按照“参加作业指导书”的格式和要求进行。但个别实验室只简单地将结果报送，信息不够全面。
相比之下，对于测试样品检测为阳性结果的样品，有的实验室通过测序进行验证，结果的出具非常严谨。
5　总结
2014—2017年，能力验证项目执行过程中在诸多环节进行了技术改进和质量提高。难点一：由于目前对虾养殖现状，疾病的发生通常为多病原混合感染，因此，在选定单一病原感染的样品以及阴性样品筛选过程中遇到巨大的障碍。此次能力测试活动阴性样品的制备材料我们选择了凡纳滨对虾亲虾（编号：20130120001），该批样品经多次检测验证未含有IHHNV，为避免在制样过程中受到环境中诸多因素的影响，我们选择在离实验室较远的、未接触过对虾病原的区域开展工作，同时所用物品尽量使用一次性，尤其是匀浆转头和磁力搅拌转子。阴性制备全程严格做到防污染，取得了预期的效果。难点二：2014—2017年，活动参测单位分别为20、38、60、83个实验室，呈每年递增。制样、发样等环节增加了很大的工作量，为保证样品的均一性和稳定性，进行了多次、大量的样品抽检测试，以保证覆盖比率，保证测试样品的质量。在实验中获得了宝贵的数据，积累了丰富的经验，也为持续承担该项目打下了坚实的基础。
在样品发送、结果反馈、数据分析等各环节，与参测实验室的交流中，也初步了解了其遇到的具体问题和处理措施，电话指导并帮助有需求的参测单位改进技术。在此过程中起到了相互促进的作用，同时，也深刻体会到参测实验室能力的差异，部分参测实验室缺乏规范的技术培训，结果正确率较低。根据农业农村部（原农业部）渔业渔政管理局、全国水产技术推广总站的统一要求，此次能力测试还为部分参测单位提供标准物质，为实验室的检测工作起到积极作用，检测能力有明显的提高。反映出该项目举办对各参测实验室能力水平的检验和提高，达到了提升国内水生动物防疫实验室病原检测能力的目的，初步呈现出了成效。通过举办此次能力测试项目，建议各承担检测项目的实验室间加强交流，希望组织单位能够将能力测试考察工作长期化，以期不断提升和维持各实验室的检测能力水平，为我国水生动物疫病防疫提供可靠数据。
6　能力验证计划组织者、协调者
6.1　计划组织者
全国水产技术推广总站
6.2　技术顾问
黄倢　中国水产科学研究院黄海水产研究所　研究员
6.3　技术实施人员
杨冰　中国水产科学研究院黄海水产研究所　副研究员
万晓媛　中国水产科学研究院黄海水产研究所　助理研究员
7　依据
（1）农办渔[2017]《农业农村部（原农业部）办公厅关于开展水生动物防疫系统实验室检测能力的通知》
（2）《白斑综合征（WSD）诊断规程第2部分：套式PCR检测法》（GB/T 28630.2—2012）
（3）《对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒（IHHNV）检测PCR法》（GB/T 25878—2010）
（4）《能力验证样品均匀性和稳定性评价指南》（CNAS—GL03：2006）
（5）兽医实验室生物安全管理规范（农业农村部（原农业部）2003年10月15日发布）
（6）《医学实验室质量和能力认可准则在基因扩增检验领域的应用说明》（CNAS—CL36：2012）
（7）《实验室质量控制规范食品分子生物学检测》（GB/T 27403—2008）
五、草鱼出血病病原检测能力验证报告
1　前言
草鱼出血病能力验证项目是由全国水产技术推广总站组织，中国检验检疫科学研究院负责具体实施的能力验证项目。本项目旨在了解各有关单位实验室在检测草鱼出血病的真实的整体水平，掌握实验室间差异，了解参加实验室的检测能力能否满足草鱼出血病检测的国家标准或行业标准的要求，帮助实验室发现在日常检测草鱼出血病存在的问题，为提高实验室的检测水平提供依据。
按照要求，对取得满意结果的实验室，建议有关部门在相应领域指定、授权、委托检验任务时优先选用。对于出现可疑和不满意结果的实验室，实验室应进行原因分析，采取有效的纠正措施。
本报告总结了草鱼出血病能力验证计划的概况，对实验室的反馈结果进行了评价，并分析了检测中存在的有关技术问题。
2　计划概述
2.1　项目简介
草鱼呼肠孤病毒（grassp carp reovirus，GCRV）为二十面体的球形颗粒，直径为70～80nm，具双层衣壳，无囊膜。病毒基因组为双股RNA，由11条片段组成。它是中国分离到的第一株鱼类病毒，是草鱼出血病的病原。该病流行范围广，发病季节长，发病率高，死亡率高，可达80%以上，对草鱼养殖业和进出口贸易造成了巨大威胁。很早以前，人们就发现该病毒存在不同的血清型，到目前为止，已经发现了三类不同的基因（血清）型。目前，GCRV引起的草鱼出血病已经在《一、二、三类动物疫病病种名录》中被列为二类疫病。农业农村部（原农业部）的鱼类苗种管理办法中要求检测草鱼出血病。有些国家如韩国，在从中国进口草鱼等一些鲤科鱼类时也要求检测GCRV。
为了控制和预防草鱼出血病的流行，对该病进行流行病学监测和诊断是十分重要的。因此，对草鱼呼肠孤病毒的检测能力及水平进行评估，有利于国内相关单位对草鱼出血病的暴发进行及时的监测、预防和控制，也是保证国内水产养殖业健康发展并促进出口贸易的有效手段。尽管目前已经建立了一些相关检测方法，也推广了疫苗的广泛应用并获得显著的成效，但是该病在中国部分地区仍然有局部流行。相关实验室对草鱼呼肠孤病毒的检测水平，是保障水产养殖业、避免该病毒暴发的重要技术支撑。因此，开展关于草鱼出血病的能力验证具有重要意义。通过开展该项目的能力验证计划，可以全面了解各有关实验室在检测草鱼出血病的技术水平，掌握实验室间差异；了解参加的实验室的检测能力能否满足草鱼出血病检测的国家标准或行业标准的要求，帮助实验室发现在日常检测草鱼出血病存在的问题，为提高实验室的检测水平提供依据，也为政府和其他相关单位在进一步控制和预防草鱼出血病方面提供有效数据。
2.2　参加实验室概况
2014年，该项目共有15个实验室报名参加。具体为首次报名参加14个参试实验室，二次补测时新申请参加1个实验室。这些参试实验室分布在全国12个省（自治区、直辖市），其中，来自农业农村部（原农业部）水生动物推广站和疫病预防控制方面的实验室7个，地方院校5个和其他研究院所的单位3个。
2015年，该项目共有29个实验室报名参加。具体为首次报名参加21个参试实验室，二次补测时新申请参加8个实验室。这些参试实验室分布在全国18个省（自治区、直辖市），其中，来自农业农村部（原农业部）水生动物推广站和疫病预防控制方面的实验室13个，地方院校5个，研究院所6个和外检系统参试实验室5个。
2016年，该项目共有25个实验室报名参加。具体为首次报名参加24个参试实验室，二次补测时新申请参加1个实验室。这些参试实验室分布在全国16省（自治区、直辖市），其中，来自农业农村部（原农业部）水生动物推广站和疫病预防控制方面的实验室11个，地方院校2个，研究院所6个和外检系统参试实验室6个。
2017年，该项目共有33个实验室报名参加。参试实验室分布在全国19省（自治区、直辖市），其中，来自农业农村部（原农业部）水生动物推广站和疫病预防控制方面的参试实验室17个，其他研究院所参试实验室8个和外检系统参试实验室8个。
地域分布上，四年来，共有102个次实验室参加该项目的能力验证。各参加实验室大部分分布于沿海省市，以及东北、北京地区和长江流域水产养殖业比较发达地区。
2.3　方法设计
2.3.1　毒株来源及增殖
本次能力测试所使用的病毒株由本单位自己保存。将贴壁生长状况良好的草鱼卵巢细胞系（grass carpovarycellline，CO）传代于4个75cm3细胞培养瓶（每瓶加入12mL培养液），培养过夜后基本长满单层，分别加入0.2mLGCRV病毒悬液，然后分别置于25℃的生化培养箱中培养。每天观察细胞病变（CPE）情况，直至细胞病变完全。当细胞病变出现完全后，反复冻融1次，并将4瓶中的病毒悬液混匀。根据Reed-Muench计算方法，测定GCRV的TCID50值。
2.3.2　样品制备
2014年能力验证的样品制备：制备3种类型样品，具体为含有活病毒（GCRV-9014）草鱼内脏组织悬液，含有活病毒（GCRV-873和GCRV-9014）的草鱼内脏组织悬液，含有活病毒（GCRV-9014）和灭活病毒（GCRV-873）草鱼内脏组织悬液。补测实验室样品制备3种类型样品，具体为无GCRV病毒的虹鳟内脏组织组织悬液，含有活病毒（GCRV-873）虹鳟内脏组织悬液，含有病毒（GCRV-873）质粒虹鳟内脏组织悬液。
2015年能力验证的样品制备：制备4种类型样品，具体为含有GCRV-873病毒鲇内脏组织悬液，无GCRV病毒鲇内脏组织悬液，含有非GCRV的水生动物病毒鲇内脏组织悬液，含有病毒（GCRV-873）质粒鲇内脏组织悬液。
2016年能力验证的样品制备：制备3种类型样品，具体为含有活病毒（GCRV-873）的鲇内脏组织悬液，含有病毒（GCRV-873）质粒的鲇内脏组织悬液，无GCRV病毒的鲇内脏组织悬液。
2017年能力验证的样品制备：制备两种类型样品，具体为含有活病毒（GCRV-873）的虹鳟内脏组织悬液，无GCRV病毒的虹鳟内脏组织悬液。
所有样品均分装于2mL冻存管内，保存备用。
2.3.3　样品包装、标识和发放
用2mL的冻存管封装试样。给每份样品编号，加贴唯一性标签，注明试样单位名称、编号和保存条件。
所有样品经过均一性和稳定性检测合格后，按照实验室名称和样品编号，装箱邮寄。样品加冰袋和干冰，用泡沫箱包装，以特快专递的方式邮寄至各个参试实验室，确保样品在运输过程中不会受到影响试验结果的改变。泡沫箱内附作业指导书、样品确认单和检测结果报告单。
2.3.4　检测方法
2014年，能力验证计划推荐使用OIE黄金标准方法，即细胞分离后，进行免疫学方法或者分子方法检测。2015—2017年，每年该项目指定了检测方法：《草鱼出血病检疫技术规范》（SN/T 3584—2013）。按照标准中的方法要求，先对样品用敏感细胞系分离病毒，再用RT-PCR或者其他检测方法对分离物进行鉴定。
2.4　统计设计与评价方法
检测项目为定性检测“草鱼出血病”。对测试的结果进行直接评价，样品中检出“草鱼出血病”的报告为“阳性”，样品中未检出“草鱼出血病”的报告为“阴性”。所有样品的检测结果均符合预期结果的为结果满意，否则为不满意。
3　检测结果统计和能力评定
除了2017年仅向参试实验室进行1次发样外，其他3年（2014—2016年），每年该项目均向参试实验室进行2次发样。具体结果如下：
2014年，第一轮测试14个参试实验室参加；第二轮测试5个参试实验室参加（4个补测参试实验室和1个新参加参试实验室），因此，实际参加实验室为15个。第一次测试发样后，参试实验室获得满意结果仅仅5个，满意率为35%。最终结果满意率为53%，具体见表1。
表1　参试实验室结果统计
2015年，第一轮测试21个参试实验室参加；第二轮测试17个参试实验室参加（9个补测参试实验室和8个新参加参试实验室），因此，实际参加实验室为29个。第一次测试发样后，参试实验室获得满意结果为11个，满意率为52%。最终结果满意率为83%，具体见表1。
2016年，第一轮测试24个参试实验室参加；第二轮测试7个参试实验室参加（6个补测参试实验室和1个新参加参试实验室），因此，实际参加实验室为25个。第一次测试发样后，参试实验室获得满意结果为17个，满意率为71%。最终结果满意率为88%，具体见表1。
2017年，参试实验室获得满意结果为27个，满意率为82%满意率，具体见表1。
4　技术分析和建议
4.1　样品设计分析
2014年，3种样品，每个参试实验室收到3个盲样，预期结果有且仅有1个阳性。具体为，设计含有活病毒的鱼内脏组织样品为阳性，鱼内脏组织样品为阴性，其目的是为了保证参试实验室能够使用正确方法进行检测样品，即先通过细胞分离后，使用分子生物学方法或者免疫学方法进行检测。设计含有病毒核酸片段质粒的鱼内脏组织样品，是为了发现有些实验室不做病毒分离而仅仅靠PCR结果来推测结果的行为。
考虑到2014年能力验证中，多数参试实验室最大问题是，不能准确识别草鱼出血病病原产生的细胞病变效应，所以在2015年的样品设计方面，增加了1个干扰病毒的样品。以期参试实验室能够通过观察不同病毒产生的不同细胞病变效应，来准确认识草鱼出血病病原产生的细胞病变效应。
2016年，3种样品，每个参试实验室会收到4份盲样，其中，可能有0～4个阳性样品。这样做是考虑到2014年和2015年，能力测试结果均为有且仅有1个阳性，容易使参试实验室形成固定思维，即做出1个样品为阳性后，就自然认为其他样品一定是阴性。
2017年，2种样品，每个参试实验室收到4份盲样，其中，阳性样品浓度比历年要低。目的是考察各个参试实验室通过3年能力测试，自身的检测草鱼出血病水平是否提高。
4.2　检测方法分析
2014年，为了真实反映全国各个实验室在草鱼出血病病原检测能力整体情况，在能力验证过程中，没有设定具体的检测方法。结果显示，15家参试实验室中，有10家采用了现行的行业标准（即先用敏感细胞系分离病毒，然后用分子生物学方法或者免疫学方法进行检测），剩下的5家仅仅使用PCR方法进行检测。为了能够使参试实验室在将来的检测或者监测计划中，对于样品检测能够有据可依，在2015—2017年的能力测试中，要求各参试实验室必须采用指定的检测方法，即《草鱼出血病检疫技术规范》（SN/T 3584—2013）。结果显示，除了个别没有细胞系的实验室（2015年有3家、2016年有1家）外，其他实验室均按规定使用了指定的检测方法。
4.3　参试实验室结果分析
2014—2017年，4年的草鱼出血病病原检测能力验证项目，从参试实验室数量和分布情况来看，2014年，对于草鱼出血病病原检测能力验证项目，无论是组织单位还是参试实验室，都是一次创新性的尝试。虽然参试实验室数目为15个，但其涵盖了包括广东省在内的10个省份（直辖市），这些地区均为草鱼的重要养殖区域，结果具有一定的代表性。
2015年，参试实验室数目为29个，涵盖了全国18个省份。相比2014年增加了14个；涵盖范围中缺少了新疆维吾尔自治区，但增加了8个省份，说明该次能力验证项目得到了全国相关单位的大力支持。2016年，参试实验室数目为25个，涵盖了全国16个省份。相比2014年增加了10个，涵盖范围中缺少了新疆维吾尔自治区，增加了6个省份；相比2015年减少了4个，涵盖范围缺少了福建省和黑龙江省。但从具体涵盖省份上看，2016年参试实验室范围依然涵盖了国内草鱼重要的养殖地区。2017年，参试实验室数目为33个，涵盖了全国19个省份。其参试实验室数目和涵盖省份都是历年最多的，涵盖了国内草鱼重要的养殖地区，参试实验室结果具有代表性，能够反映全国相关单位在草鱼出血病病原检测方面的整体水平。
从各个参试实验室反馈结果来看，2014年第一次测试发样后，参试实验室获得满意结果仅仅5个，满意率为35%。最终结果满意率为53%。这一结果表明，在草鱼出血病病原检测水平方面上，全国相关单位存在一定不足。2015年，第一次测试发样后，参试实验室获得满意结果为11个，满意率为52%，比2014年第一次测试满意率增加了17个百分点。最终结果满意率为83%，比2014年最终结果满意率提高了30个百分点。2016年，第一次测试发样后，参试实验室获得满意结果为17个，满意率为71%。最终结果满意率为88%，对比2014年的能力测试，第一次测试发样满意率上升了36个百分点，最终结果满意率提高了35个百分点；对比2015年的能力测试，第一次测试发样满意率上升了19个百分点，最终结果满意率提高了5个百分点。2017年，参试实验室获得满意结果为27个，满意率为82%满意率。对比2014年的能力测试，满意率比2014年提高了29个百分点；比2015年和2016年的能力测试情况相比，满意率稍有下降，但是2017年仅发了一次样品，对比其他3年，每年第一次发样品满意率，2017年满意率最高。总之，通过4年的能力测试项目，参试实验室最终满意率从53%上升至82%，说明全国各个实验室在草鱼出血病病原检测能力的整体水平方面得到了大幅度提升。
4.4　测试过程问题分析
在历年该项目中，取得不满意结果参试实验室主要的原因是实验室操作人员，缺乏基本的操作知识或者技能，导致病毒样品失活或者是不能有效识别细胞病变效应。如在样品处理过程中，样品离心问题，错误认识离心机rpm和g值为一一对应关系，选取超过转速处理测试样品，样品中活病毒损失，出现漏检，进而提交结果错误。所以，提请相关实验室加强技术培训，提高实验技能。
5　总结
5.1　2014—2017年能力验证的特点
（1）每次能力验证活动得到了全国重要养殖省份中各个相关实验室的大力支持和参与，具有充分的代表性。
（2）本次能力验证方案设计合理，样品设计时，考虑到各个实验室差异，所有检测样品中的阳性参试样品，均为本实验室验证的强阳性样品，保证检验中参试样品的可靠性。在作业指导书中，严格要求各参试单位在规定时间内反馈结果。另外，每个参试实验室得到的样品编号均为随机编号，有效地防止数据串通，保证了此次能力验证的检测结果可靠性和公正性。
（3）在本次能力验证中，指定操作方法，严格要求结果的准确性。通过本次能力测试能够使各参试实验室，充分认识到在检测中不仅要结果准确，还要再要有争议的时候，自己能够有理可说、有据可依。
（4）除了2014年第一次组织能力测试，参试实验室也是第一次参加能力测试，结果满意率稍低外，2015—2017年，在参试实验室数量上和满意率上都有大幅度的提高，特别是2017年只进行一次，没有补测机会，参试实验室满意率为82%。
5.2　建议
5.2.1　加强实验室人员操作技能培训
各个实验室是否能够具有草鱼出血病病原的检测能力，不仅基于实验室基本的实验条件，更依赖于操作人员具备基本的实验的技能。而人员的技能不是短期内能够提高的，其需要经过长期的培训积累才能获得的。所以，建议加强参试实验室相关操作人员的技能培训。
5.2.2　正确认识作业指导书的意义
为了保证草鱼出血病病原检测能力验证项目的顺利进行，承担单位提供了作业指导书。在作业指导书中，明确了包括收到样品后的处理办法和提交结果日期等内容。在项目进行过程中，一部分参试实验室却忽略了作业指导书的意义，特别是忽略最终提交结果的时间。考虑到监测草鱼出血病病原的技术支撑工作也对时效性具有严格的要求，所以，建议参试实验室在参加能力验证项目过程中，认真读取、理解作业指导书的内容，按照规定日期提交相应结果，为将来承担相应的技术支撑工作奠定坚实的基础。
5.2.3　继续参加能力测试项目
2014—2017年连续4年的草鱼出血病病原检测能力验证项目，结果表明，我国各个参试实验室在草鱼出血病病原检测能力方面，获得了很大成效。但是各个参试实验室在能力测试过程还是有些不足，建议继续参加该项目的能力测试。其意义在于，一方面是对参试实验室本身能力的一个检验；另一个方面，也是参试实验室人员一个培训交流，提高自身操作技能的过程。
6　能力验证计划组织者
6.1　计划组织者
全国水产技术推广总站
6.2　计划负责人
李清　全国水产技术推广总站　处　长
江育林　中国检验检疫科学研究院　研究员
6.3　技术顾问
吴绍强　中国检验检疫科学研究院动物检疫研究所　副所长／研究员
林祥梅　中国检验检疫科学研究院动物检疫研究所　所长／研究员
6.4　计划联络人
景宏丽　中国检验检疫科学研究院　工程师／水生组副主任
通讯地址：北京市大兴区亦庄经济开发区荣华南路11号6016室，电话：010-53897669
余卫忠　全国水产技术推广总站　副处长
通讯地址：北京市朝阳区麦子店街18号，联系电话：010-59195073
6.5　技术运作
景宏丽　中国检验检疫科学研究院　工程师／水生组副主任
张旻　中国检验检疫科学研究院　副研究员／水生组副主任
王娜　中国检验检疫科学研究院　副研究员
7　依据
（1）《能力验证结果的统计处理和能力评价指南》（CNAS—GL02：2006）
（2）《能力验证样品均匀性和稳定性评价指南》（CNAS—GL03：2006）
（3）《合格评定能力验证的通用要求》（GB/T 27043—2012）
（4）《草鱼出血病检疫技术规范》（SN/T 3584—2013）
六、锦鲤疱疹病毒病病原检测能力验证报告
1　前言
“锦鲤疱疹病毒病病原检测”能力验证项目由全国水产技术推广总站组织，中国检验检疫科学研究院具体承担和实施。开展此实验室能力验证活动的目的，旨在了解该病原检测的整体水平，加强农业农村部（原农业部）系统、出入境检验检疫系统及相关水生动物疫病诊断实验室检测该疫病病原的能力，提高疫病监测的准确性，确保相关领域的检测工作质量。
本报告对2014—2017年开展的4次“锦鲤疱疹病毒病病原检测”能力验证项目的具体实施情况进行了总结：本项目参照《合格评定　能力验证的通用要求》（GB/T 27043—2012）和CNAS/GL02：2006《能力验证结果的统计处理和能力评价指南》等标准和规范性文件开展。这4次能力验证项目的结果，不仅客观反映了相关实验室对锦鲤疱疹病毒（KHV）的检测能力，还可以帮助参加实验室发现管理和技术问题，并加以改正，有利于提高检测能力水平，保证实验室检测结果的准确性和可靠性。能力验证的结果是，实验室显示和证实自身实力的重要标志，是实验室互认的重要条件。
本项目所用检测样品，由中国检验检疫科学研究院研制并进行均匀性和稳定性检验。本项目的结果统计、技术分析和报告编写由项目组相关人员完成。
2　计划概述
2.1　项目简介
锦鲤疱疹病毒病（koi herpesvirus disease，KHVD），是严重威胁鲤和锦鲤养殖业安全的一种疾病。其病原是一种疱疹病毒（KHV），含双链DNA。世界动物卫生组织（OIE）将其列为必须申报的疾病，我国农业农村部（原农业部）在《一、二、三类动物疫病病种名录》中将其列为二类疫病。
为加强水生动物防疫系统实验室检测疫病病原的能力，提高疫病监测的准确性。2014—2017年，农业农村部（原农业部）分别4次组织开展水生动物防疫系统实验室检测能力的验证工作。中国检验检疫科学研究院负责“锦鲤疱疹病毒病病原检测能力验证”的技术工作。通过考核和比对，能力验证的结果可以客观反映参加实验室的检测能力，同时帮助和促进参加实验室发现管理和技术问题，并加以改正，促进检测能力水平的提高，保证各实验室KHVD检测结果的可靠性。
本项目要求各参加实验室按照标准《鲤疱疹病毒检测方法　第1部分：锦鲤疱疹病毒》（SC/T 7212.1—2011）中的技术参数要求进行检测，检测盲样是否含有KHV核酸，检测参数为KHV阳性或阴性。若检测结果与预设值符合，则结果满意，表明所参加实验室有能力对KHV进行检测。若不符合，则结果不满意，需要分析试验失败的原因并加以改正。
2.2　参加实验室概况
2014年，该项目共有26家实验室参加。其中，农业农村部（原农业部）省站实验室10家，高校实验室5家，水产和渔业研究所实验室5家，出入境检验检疫系统实验室2家，其他单位实验室4家。
2015年，该项目共有45家实验室参加，比2014年增加19家。其中，农业农村部（原农业部）实验室32家，高校及研究院实验室7家，出入境检验检疫系统实验室6家。
2016年，该项目共有55家实验室参加，比2015年增加10家。其中，农业农村部（原农业部）实验室40家（其中，县级水产推广站5家），高校及研究院实验室8家，出入境检验检疫系统实验室7家。
2017年，该项目共有71家实验室参加，比2016年增加16家。其中，农业农村部（原农业部）实验室50家，高校及研究院实验室11家，出入境检验检疫系统实验室9家，其他科研单位1家。
地域分布上，四年来，共有197家次实验室参加该能力验证。各参加实验室大部分分布于沿海省市，以及东北、北京地区和长江流域水产养殖业比较发达的地区。
2.3　方法设计
2.3.1　样品的描述
由于用活病毒做能力验证有病原泄漏和扩散的风险，我国也明令禁止随意转运。因此，本项目将鲤组织匀浆液与包含病毒核酸的重组质粒溶液混合，作为检测样品。重组质粒包含检测KHV的目的基因片段，因此，可以使用PCR方法进行检测；同时，核酸本身无感染性，无生物风险。
2.3.2　样品的制备
重组质粒KHV-TK和KHV-Sph由中国检验检疫科学研究院动物检疫研究所水生动物疫病实验室制备保存。KHV-TK包含标准《鲤疱疹病毒检测方法　第1部分：锦鲤疱疹病毒》（SC/T 7212.1—2011）中的TK基因序列（GenBankNo：AB375390），长度409bp；KHV-Sph包含标准中的Sph基因序列（GenBankNo：AY568950），长度292bp。
经检测未感染KHV的鱼，取脾、肾、肝、脑和鳃。按照组织质量，加入10倍体积的1×PBS缓冲液（例如：1g组织加入10mL1×PBS），将组织研磨均匀。
按照组织匀浆液：KHV-TK溶液：KHV-Sph溶液=2:1:1的体积比，将各溶液混匀。混合液作为阳性检测样品，等量分装后，-80℃保存；同时，将单独的鱼组织匀浆液作为阴性检测样品，同样分装保存。
2.3.3　样品发放方式设计
（1）样品设置
样品为盲样，拟每个参加实验室发放4份，其中，至少包括1份阴性样品（N）或1份阳性样品（P）。4份样品可有14种不同的N、P样品组合方式（表1），随机选定样品组合方式。例如，发放给某参加实验室的样品，随机选定A号样品组合方式，4份样品顺序分别为1（P）、2（P）、3（N）、4（N）。此方式可降低不同实验室间样品组合方式相同的几率，确保同一实验室不同年份样品组合方式不同。
表1　样品组合方式
（2）样品标签
样品标签为实验室的代码+样品编号。每个参加实验室均分配1个特有的实验室代码。例如，代码为K10的参加实验室，4份样品标签分别为K10-1、K10-2、K10-3、K10-4。
（3）将样品保存于灭菌离心管中，再放置于包装盒内
外包装写明项目编号、项目名称和实验室名称。根据稳定性检测结果，将包装盒放置于充满干冰和冰袋的泡沫塑料盒内，密封后通过特快专递发放至各实验室（图1）。
图1　检测样品包装
2.3.4　检测标准
检测方法使用水产行业标准《鲤疱疹病毒检测方法　第1部分：锦鲤疱疹病毒》（SC/T 7212.1—2011）推荐的方法检测。先提取样品总DNA，再使用PCR方法，检测病毒的DNA。根据扩增到的目的基因片段大小，来判断结果。参加实验室情况可自主选择样品DNA的抽提试剂和PCR反应试剂，或采用商品化试剂盒进行。
2.3.5　检测条件
本能力验证项目以KHV的目的基因片段和未感染病毒的鱼组织作为检测样品，样品本身不具备传染性和危险性，因此，也不需要灭活和感染性实验。实验步骤，包括样品DNA的提取和PCR检测。综上所述，只需要满足以下条件，就可以参加能力验证工作：
（1）实验室级别为P2实验室即可。必须有合格的分子生物学实验室，电泳区和样品制备区要在2间分开的房间，实验室拥有冰箱、冰柜、紫外观察仪或者凝胶成像仪等设备。
（2）具备核酸抽提和PCR操作经验。
2.4　统计设计与评价方法
2.4.1　检测样品结果判定方法
PCR产物电泳后，KHV阳性对照会出现1条409bp的DNA片段（TK基因）和292bp的DNA片段（Sph基因）；阴性对照和空白对照均没有该DNA带，否则说明有污染，必须重新进行试验。
若检测样品能扩增出409bp的TK基因片段和292bp的Sph基因片段，则KHV核酸阳性。
2.4.2　能力检测判定原则
同时满足以下两点，则检测结果判定为满意：
（1）参加实验室检测出的各盲样阴、阳性结果，与样品预先设置的阴、阳性完全一致。
（2）检测流程和结果判定方法符合标准（SC/T 7212.1—2011）中的规定。
出现以下三点中任一点情况，则检测结果判定为不满意：
（1）有1份（包括阴性样品）及以上的盲样检测结果与预设值不一致。
（2）检测流程和结果判定方法不符合标准（SC/T 7212.1—2011）中的规定。
（3）未按时提交检测结果。
3　检测结果统计与能力评定
3.1　检测方法
本能力验证要求按照SC行业标准《鲤疱疹病毒检测方法　第1部分：锦鲤疱疹病毒》（SC/T 7212.1—2011）中推荐的检测流程和技术参数进行检测。先提取样品总DNA；再分别使用扩增KHV TK基因片段和Sph基因片段的引物进行PCR方法检测；PCR产物电泳后，KHV阳性对照会出现1条409bp的DNA片段（TK基因）和292bp的DNA片段（Sph基因），阴性对照和空白对照均没有该DNA带。
3.2　历年能力评价结果
2014年，有26家实验室参加了该年度能力验证第一轮测试，其中，15家单位测试结果满意，占58%；11家单位不满意，占42%。有10家实验室参加了此次能力验证第二轮测试，其中，9家单位测试结果满意，占90%；1家单位不满意，占10%（表2）。综上所述，此次能力验证总共有26家单位参加，经过两轮测试，最终测试结果满意单位25家，占参加单位总数的96%；不满意单位1家，占4%（图2）。
表2　2014年能力验证实验室检测结果汇总
图2　2014年能力验证最终测试结果分布
2015年，有35家实验室参加了该年度能力验证第一轮测试，其中，27家单位测试结果满意，占77%；8家单位不满意，占23%。有18家实验室参加了此次能力验证第二轮测试，其中，13家单位测试结果满意，占72%；5家单位不满意，占28%（表3）。综上所述，此次总共有45家单位参加，最终测试结果满意单位40家，占参加单位总数的89%；不满意单位5家，占11%（图3）。
表3　2015年能力验证实验室检测结果汇总
图3　2015年能力验证最终测试结果分布
2016年，有52家实验室参加了本年度能力验证第一轮测试，其中，43家单位测试结果满意，占82.69%；9家单位不满意，占17.31%。有12家实验室参加了此次能力验证第二轮测试，其中，8家单位测试结果满意，占66.67%；4家单位不满意，占33.33%（表4）。综上所述，此次能力验证总共有55家单位参加；最终测试结果满意单位51家，占参加单位总数的92.73%，不满意单位4家，占7.27%（图4）。
表4　2016年能力验证实验室检测结果汇总
图4　2016年能力验证最终测试结果分布
2017年，总共有71家实验室参加了此次能力测试（表5）。此次能力验证只有1轮测试，57家单位测试结果满意，占80.28%；14家单位不满意，占19.72%（图5）。
表5　2017年能力验证实验室检测结果汇总
图5　2017年能力验证最终测试结果分布图
4　技术分析和建议
经分析，导致检测结果错误的原因主要有以下几点：
（1）假阳性是导致检测结果错误的主要原因。4年共52次不满意结果中有37次是假阳性导致，占71.2%。因此，各参加单位应在实验流程中注意避免产生假阳性，尤其在以下检测步骤中特别注意：
①DNA提取过程中样品交叉污染导致假阳性。注意更换移液器吸头和手指沾染样品液体。
②制备PCR体系时样品交叉污染导致假阳性。注意更换移液器吸头，先加阴性对照和空白对照，再加待检样品，最后加阳性对照。
③电泳点样时阳性样品过多，流入其他样品孔。样品量不宜过多，10μL即可；加样时手要稳，避免样品流入其他点样孔。
（2）52次不满意结果中，有7次无法按时提交检测报告。各参加单位应合理安排时间，提前准备能力验证所需的试剂、仪器，做好人员安排，避免错过提交结果报告单的截止日期。
（3）4次能力验证，大部分参加单位都严格按照标准中规定的实验流程进行检测。2014年，有3家实验室使用了非标方法进行检测，其中，1家结果出现假阴性，2家结果出现假阳性；2015年，有2家实验室未按照标准规定的流程进行检测。因此，各参加实验室应认真学习水产行业标准《鲤疱疹病毒检测方法第1部分：锦鲤疱疹病毒》（SC/T 7212.1—2011）中的内容，明确检测流程和结果判定方法，严格按照标准推荐的流程进行检测，不得省略检测步骤或使用非标方法。
5　总结
2014年、2015年、2016年和2017年，先后开展了4次“锦鲤疱疹病毒病病原检测”能力验证项目。检测样品为KHV-TK、KHV-Sph质粒与鲤组织匀浆液的混合液，检测标准为水产行业标准《鲤疱疹病毒检测方法第1部分：锦鲤疱疹病毒》（SC/T 7212.1—2011）。经验证，2014年有26家单位参加，满意率96%；2015年有45家单位参加，满意率89%；2016年有55家单位参加，满意率92.73%；2017年有71家实验室参加，满意率80.28%。4年来参加实验室共197家次，其中，能力测试结果满意实验室共173家次，结果不满意实验室共24家次，平均满意率约87.82%（表6）。共推荐141家次实验室为锦鲤疱疹病毒病监测实验室。
表6　2014—2017年能力验证结果对比表
纵观4次能力验证项目，参加单位数量逐年增加。2017年是2014年的2倍有余，说明我国锦鲤疱疹病毒的检测监测工作日益得到重视，测试数据能够客观反映我国实验室锦鲤疱疹病毒检测技术水平。2014—2016年，能力验证有二轮测试，第一轮不满意的实验室可以参加第二轮测试，最后的满意率除2015年稍低外，其余2年均超过90%。2017年只有一轮测试，实验室满意率80.28%，与2016年第一轮测试的满意率（82.36%）相近，而2015年是77%，2014年只有58%。说明通过近几年的能力验证，参加单位对锦鲤疱疹病毒的检测水平逐年提高。特别是2017年有十几家县市级实验室首次参加能力验证，第一轮测试仍有超过80%的满意率，说明我国相关系统对锦鲤疱疹病毒的检测能力，整体上保持了较高水平。
6　能力验证计划组织者、协调者
6.1　计划组织者
全国水产技术推广总站
6.2　计划负责人
江育林　中国检验检疫科学研究院　研究员
李清　全国水产技术推广总站　处长
6.3　技术顾问
吴绍强　中国检验检疫科学研究院　副所长／研究员
张利峰　北京出入境检验检疫局　主任／研究员
6.4　计划联络人
余卫忠　全国水产技术推广总站
联络地址：北京市朝阳区麦子店街18号，联系电话：010-59195371
张旻　中国检验检疫科学研究院
联络地址：北京市朝阳区惠新里241号楼中国检科院动检所612室，联系电话：15010585160
6.5　技术运作
江育林　中国检验检疫科学研究院　研究员
张旻　中国检验检疫科学研究院　副研究员
王娜　中国检验检疫科学研究院　副研究员
景宏丽　中国检验检疫科学研究院　工程师
7　依据
（1）《能力验证结果的统计处理和能力评价指南》（CNAS—GL02：2006）
（2）《能力验证样品均匀性和稳定性评价指南》（CNAS—GL03：2006）
（3）《合格评定能力验证的通用要求》（GB/T 27043—2012）
（4）水产行业标准《鲤疱疹病毒检测方法　第1部分：锦鲤疱疹病毒》（SC/T 7212.1—2011）