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《OIE出版物系列丛书》总序
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序言
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原著序
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前言
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撰稿人
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缩略语表
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术语表
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第一部分 总论
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第1.1篇 引言
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第1.1.1章 兽医检测实验室质量管理
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概要
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实验室检测结果的有效性对于疫病的诊断、监测及贸易至关重要。获得有效结果需要具备良好的管理、有效的测试和校准方法、恰当的技术，以及质量控制和质量保证措施，而且需要在一个共同的质量管理体系中完成。实验室质量管理包括用于检测及解释检测结果的技术、管理及操作要素。通过质量管理体系，实验室可表明有能力生成可满足需求、在技术上一致有效的结果。无论是在国际贸易中互认试验结果，还是采用诸如ISO/IEC[1]17025：2005《检测和校准实验室能力的通用要求》等国际标准，都需要具备良好的实验室质量管理体系。世界动物卫生组织（OIE）已就相关标准公布了详细要求（OIE，2008），故不在此重申。本章侧重于概述一个实验室（无论是否获得认可）在设计和维护质量管理体系中需着重考虑的因素及注意事项。
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实验室质量管理体系设计和维护中应着重考虑的因素
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为确保建立恰当有效的质量管理体系，在设计时必须思考缜密，如要获得实验室认可，则需满足相关质量标准的所有要求。本章分八点介绍应考虑的主要方面及每个方面的关键问题与工作内容。
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1 实验室的工作内容、责任和目标
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许多因素会影响到质量管理体系的必需要素和要求。这些因素包括：
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i）检测试验的类型；
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ii）检测结果的目的及要求；
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iii）有疑问的结果或错误结果造成的影响；
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iv）风险和责任的承受能力；
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v）客户需求（如试验方法的敏感性和特异性、费用、试验周期、菌株／基因型定性等）；
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vi）实验室在法律事务或监管计划中的作用；
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vii）实验室在协助、确认和／或监督其他实验室工作中的作用（如作为参考实验室）；
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viii）实验室的商业目标，包括获得任何第三方承认和／或认可的需要。
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2 标准、指南和参考资料
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实验室在设计质量管理体系时，应选择值得信赖的公认标准和指南。在这方面，OIE标准（OIE，2008）是一个非常有用的指南。对于拟申请认可的实验室而言，必须采用ISO/IEC 17025（ISO/IEC，2005）标准和／或OIE标准（2008）。此外，还可从各国国家标准委员会、国际实验室认可合作组织（ILAC）或诸如澳大利亚测试机构协会（NATA）、英国皇家认可委员会（UKAS）、美国实验室认可协会（A2LA）等认证机构获取更多有关各种标准的资料。一些国际技术组织，如国际分析化学家协会（AOAC International，前身为美国官方分析化学师协会）和国际标准化组织ISO等也发布了有价值的参考资料、指南和／或标准，用以补充ISO/IEC 17025标准的一般性要求。ISO 9001国际标准（ISO，2008）是一项质量管理体系认证标准。此标准虽可作为对质量体系的有益补充，但其要求并不一定能保证或表明相关机构具有相应的技术能力（见以下第3点）。ISO 9001认证工作应由经国家认可机构批准有资格从事此类评估工作的认证机构承担。一个实验室如满足ISO 9001国际标准的要求，则可被称为“注册”或“认证”实验室，但不可使用“认可”一词。
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3 认可
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如实验室决定申请对其质量管理体系及检测试验的正式承认，则需进行第三方验证，检验其是否符合选定的标准。国际实验室认可合作组织（ILAC）出版了针对实验室和认可机构的指南和具体要求。在该组织的体系下，ISO/IEC 17025标准可用于实验室检测及／或校准项目的认可工作。有关实验室认可的定义可参阅国际标准ISO/IEC 17000《合格评定——词汇与一般原则》。实验室认可与实验室能力紧密相关，其意义远大于单纯建立和遵循书面程序。“具有能力”指该实验室：
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i）拥有在技术上有效并经过验证的检测方法、程序及规范，并按照适用标准或指南的要求记录在案；
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ii）拥有接受过适当培训的合格人员，而且这些人员对技术知识的掌握程度与其职权相称；
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iii）拥有适当的设备，并制定了设备保养或校准时间表；
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iv）拥有合理的设施和环境控制能力；
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v）具备可确保结果准确可靠的程序和规范；
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vi）不断改进检测及质量管理工作；
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vii）能评估和实施所需的纠正或预防措施；
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viii）能准确估计并控制试验中出现的不确定性；
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ix）熟练掌握使用的检测方法（如定期参加能力验证）；
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x）证明具有获得有效技术结果的能力。
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4 选择认可机构
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为便于实验室检测结果在贸易交往中能够被接受，必须使用获得国际社会认可的标准，且认可机构是公认的有资格进行实验室认可的机构。在国际实验室认可合作组织的体系中，实验室认可机构的认证规程基于国际标准ISO/IEC 17011：《认可机构认证合格评定机构的一般要求》（ISO/IEC，2004）。有关人员可向亚太实验室认可合作组织（APLAC）、美洲认可合作组织（IAAC）、欧洲合作认可组织（EA）等机构咨询有关已获认证的认可机构信息。
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5 确定质量管理体系和／或实验室认可的范围
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质量管理体系应覆盖影响实验室检测的所有领域。认可实验室必须达到下述标准，这些标准也涉及其他所有检测实验室。
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获得ISO/IEC 17025标准认可的实验室拥有一份特定的认可试验清单，称为“认可明细表”或“认可范围”。新的试验方法只有在经过评估和认可后，才能被纳入该清单。在理想情况下，质量管理体系应覆盖影响在实验室内进行的全部检测试验的所有领域，但实验室可自行决定进行认可并纳入“认可范围”的试验。认可实验室如还从事其他未经认可的检测试验，则应在所有提及或声明其为认可实验室的报告中对此明确说明。影响实验室选择纳入“认可范围”检测试验的因素如下：
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i）初步认可在给定期限内对于资源的影响；
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ii）合同对认可检测试验的要求（如国际贸易、研究项目等）；
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iii）检测试验的重要性及错误结果产生的影响；
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iv）维持一项认可试验的成本；
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v）人员、设施及设备状况；
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vi）拥有的参照标准（如标准化试剂、内部质量控制样品、参考培养物等）及能力验证计划；
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vii）材料、试剂和培养基的质量保证；
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viii）试验方法的验证、技术复杂性及可靠性；
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ix）认可试验分包的可能性。
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6 质量保证、质量控制及能力验证
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质量保证（QA）是一套有系统、有计划的方法，旨在确保提供的服务在所有方面满足规定，包括实验室内部及认可或认证标准的规定。质量保证以过程为导向，确保以正确的方式做正确的事。
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质量控制（QC）是对生成结果进行有系统、有计划的监督，以保证达到最低质量标准。检验实验室的质量控制旨在保证正确开展检验工作，确保所得结果在预期参数及限度范围内。质量控制以检测试验为导向，确保获得预期检测结果。
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能力验证（PT）也称为外部质量保证（EQA），指通过盲样检测确定实验室性能的过程，最理想的是由独立外部机构进行能力验证。参加能力验证为实验室提供了与其他参加验证的实验室进行比较的机会，以评估并证明其检测结果的可靠性。
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在可能的情况下，所有实验室都应参加与其检测试验相应的外部能力验证计划。认可实验室必须参加此类能力验证，这为评价实验室采用的试验方法及其人员的能力水平提供独立的外部评估。如无相应的能力验证计划，可选择其他有效的替代方式，如由参考实验室组织的环比试验（ring trials）、实验室间测试、使用经认证的参考物质或内部质量控制样本、应用相同或不同方法进行重复检测、对残余物质进行重检、将同一样品的不同特性做结果相关性比较等。
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能力验证计划的提供者和运作者应按照ISO/IEC 17043：2010标准《合格评定——能力验证通用要求》（ISO/IEC，2010）的相关规定经过认可，此标准替代了以前作为OIE指南制定基础的（OIE，2008，指南4）ISO/IEC导则43-1：1997《利用实验室间比对进行能力验证》。
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经认可的能力验证机构提供的能力验证用材料都经过良好定性。完成能力验证后所剩材料可用于证明实验室人员的能力或用于相关试验的验证。
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7 检测方法
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7.1 检测方法的选择
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如要获得有效结果，首先需选择一个能满足实验室客户特定需求的检测方法。选择检测方法时需考虑的因素包括：
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i）在国际上能否被接受；
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ii）从科学角度能否被接受；
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iii）适当的或现有的技术；
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iv）方法的性能特点（如分析和诊断的敏感性和特异性、重复性、再现性、分离率、检出限、精确度、真实性和不确定性等）；
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v）是否适用于待检品种和群体；
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vi）样品类型（如血清、组织、奶样等）及样品抵达实验室时的预期质量或状况；
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vii）分析对象（如抗体、抗原、活病原体、核酸序列等）；
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viii）检测周转时间；
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ix）可用于建立、调整和评估检测方法的资源及时间；
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x）既定用途（如出口、进口、监测、筛查、诊断、确诊等）；
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xi）安全因素；
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xii）客户期望；
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xiii）所需的检测样品通量；
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xiv）每个样品的检测成本；
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xv）现有的参考标准、参考物质及能力验证计划。
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7.2 检测方法的优化和标准化
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选定检测方法后，必须在实验室建立起该方法。无论是由内部自建还是从外部引进的检测方法，都有必要进一步加以优化，针对特定实验室优化检测过程，制定关键技术参数和执行标准。优化工作应确定：
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i）设备和仪器的关键技术参数；
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ii）试剂（如化学品、生物制品等）、参考标准、参考物质及内部控制的关键技术参数；
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iii）稳定性：运用从统计学上可接受的程序，确定关键控制点和可接受的范围，以及关键控制点上的属性或行为；
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iv）监测关键控制点所需的质量管理工作；
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v）试验运行控制类型、数量、范围、频率及安排；
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vi）非主观地接受或拒绝一批检测结果的标准；
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vii）检测结果判读及报告标准；
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viii）实验室工作人员使用的书面检测方法及报告程序；
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ix）进行检测及结果判读人员所需的技术能力。
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7.3 检测方法的确认
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确认指评估检测方法是否适用于既定用途，主要通过建立如敏感性、特异性、分离率等试验性能特性及如阳性或阴性临界值、相关或有重要意义的滴度等诊断参数来完成。确认工作应遵循经过最优化并有文字记录的固定程序。确认过程的广度及深度取决于后勤供给和风险因素。确认程序带来的工作量和数据量不等，并需运用适当的统计学方法分析数据。确认工作可包括：
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i）实地和／或流行病学研究；
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ii）重复检测，以确定如操作者、试剂、设备等因素的影响；
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iii）与其他方法进行比较，最好是标准方法，如有参考标准，也应与参考标准进行比较；
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iv）与其他实验室共同对同一检测方法进行研究，最好由参考实验室主持此类工作，内容包括检测一组未透露成分或滴度的样品，然后由专家评定各实验室的检测结果，并将评定结果反馈给参与实验室；
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v）根据一个公认的标准方法或权威刊物文献再现数据；
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vi）实验性感染或疫病暴发研究；
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vii）分析内部质量控制数据。
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验证工作历来需要平衡成本、风险和技术可行性等各种因素。在某些情况下，只能简化给出诸如准确性、精确度等量化值。此外，还需就疫病状况诊断或监测检测结果的相关性制定标准及程序。在制定标准及程序时，应考虑到筛查方法、复检及确认检测。
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试验方法确认流程参见第1.1.2章。
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7.4 检测方法的不确定性
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测量不确定度（MU）是“一个与测量结果相关的参数，其测量值的分散性可合理归因于测量方法”（Eurachem，2000）。测量不确定度与其说是质疑某检测结果，不如说是为了增加检测结果有效性的置信度。测量不确定度不同于误差，因为这种不确定度来源于同一特定检测程序得到的所有结果。
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实验室必须对其每项认可的检测方法结果进行测量不确定度评估，还需测量设备标准方法的不确定度（ISO/IEC，2005）。
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检测试验可大致分成两类：定量试验（如生化试验、酶联免疫吸附试验ELISA、滴定、实时聚合酶链式反应试验PCR、病原计数法等）和定性试验（如细菌培养、寄生虫鉴定、病毒分离、终点PCR、免疫荧光法等）。
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在定量测量领域，测量不确定度的检查方法已比较完善（ANSI，1997）。不确定度以数字形式表达，通常为一个指定范围，标准偏差（SD）及置信区间（CI）是表达测量不确定度的两个例子。例如，酶联免疫吸附试验的光密度结果表达为±nSD，n值通常为1、2或3。置信区间是根据一组给定的检测数据估算出的范围，检测结果很可能在该范围内。
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测量不确定度原理在定性类试验中的应用相对不够明确。兽医（或医学、食品及环境）检测实验室尚未对不确定度的测定与表达进行标准化，但在这方面已制定完善的指南，并且由于实验室认可的重要性日益增加，不确定度的应用也在不断发展。ISO/IEC 17025标准承认一些检测方法可能会妨碍从计量学和统计学角度有效计算测量不确定度。在这种情况下，实验室必须根据其对检测方法性能的了解、以往的经验、验证数据及内部控制结果等，尽力确定并预测出造成不确定性的所有要素。
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许多技术组织和认证机构，如国际分析化学师协会（AOAC International）、国际标准化组织（ISO）、澳大利亚测试机构协会（NATA）、美国实验室认可协会（A2LA）、加拿大标准委员会（SCC）、英国皇家认可委员会（UKAS）、欧洲分析化学中心（Eurachem）、分析化学国际溯源联合组织（CITAC）等，都面向希望获得认可的实验室开设了有关测量不确定度的课程和／或提供相关指南。
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ISO/IEC 17025标准关于“试验有效性监督的质量控制程序”的规定，要求实验室必须使用覆盖所有不确定度主要来源的质量控制程序，但未要求分别覆盖每个要素。实验室可针对检测过程中每个要素的关键控制点，建立可接受的技术参数、标准、范围等。随后，实验室可在这些关键控制点上实施适当的质量控制措施，或力图减少或消除每个要素的不确定度所带来的影响。具有不确定性的检测试验要素包括：
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i）抽样；
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ii）污染；
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iii）样品运输及储存条件；
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iv）样品处理；
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v）试剂质量、制备及储存；
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vi）参考物质类型；
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vii）测定体积与称量操作；
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viii）环境条件；
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ix）设备的影响；
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x）分析者或操作者造成的偏差；
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xi）生物变异性；
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xii）未知或随机影响。
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必须校正在确认流程中测定的系统误差或偏差。校正手段包括改变方法、进行计算调整或在检测报告中记录偏差值。
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如为降低不确定度或纠正偏差而调整了检测试验或程序，则会产生一个新的不确定度来源（即纠正措施的不确定度），应将其作为不确定度估测的一部分加以评估。
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有关不确定度分析的信息参见欧洲分析化学中心（Eurachem）编写的《量化分析测量不确定度指南》（Eurachem，2000）及《不确定度信息在符合性评价中的应用》（Eurachem，2007）。
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7.5 检测方法的实施和使用
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实验室培训应是一项有计划、有组织的工作，并需要对人员培训进行有效监督。检测试验操作分析人员应能证明已熟练掌握了其使用的检测方法。
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实验室必须能够证明所有认可检测试验的可追溯性。此外，无论试验是否得到认可，可追溯性原则应适用于在实验室进行的所有试验，涉及所有与试验选择、建立、优化、标化、验证、实施、报告、实验室人员、质量控制及质量保证有关的工作。为确保试验的可追溯性，可应用有文字记录的项目管理、记录保存、数据管理及档案系统等。
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8 战略规划
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实验室应有证据证明其坚持不断地改进工作，这也是对认可实验室的一项强制性要求。实验室必须了解并掌握现行的质量和技术管理标准，以及可证明实验室能力的方法，以建立和保持技术的有效性。可显示实验室持续改进的证据包括：
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i）参加学术大会，组织诊断及质量管理方面的内部或外部会议；
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ii）参加地方性组织和国际组织；
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iii）参与编写国家标准和国际标准（如国际实验室认可合作组织和国际标准化组织委员会制定的标准等）；
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iv）随时了解、撰写和审阅关于诊断方法的出版物；
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v）组织培训，包括访问其他实验室；
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vi）开展研究；
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vii）参与合作项目（如美洲农业合作研究所的项目等）；
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viii）交流工作程序、方法、试剂、样品、人员、想法等；
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ix）有计划且持续开展专业发展和技术培训；
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x）管理审查；
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xi）分析客户反馈意见；
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xii）分析出现异常情况的根源，并实施纠正、预防及改进措施。
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参考文献
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ANSI (AMERICAN NATIONAL STANDARDS INSTITUTE) (1997). ANSI/NCSL[2]Z5402-1997, US Guide to the Expression of Uncertainty in Measurement, First Edition. American National Standards Institute, www.ansi.org.
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EURACHEM (2000). Eurachem/CITAC[3]Guide: Quantifying Uncertainty in Analytical Measurement, Second Edition. Eurachem Secretariat. www.eurachem.org.
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EURACHEM (2007). Eurachem/CITAC Guide: Use of Uncertainty Information in Compliance Assessment, First Edition. Eurachem Secretariat. www.eurachem.org.
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ILAC (2007). G13: 08/2007 Guidelines for the Requirements for the Competence of Providers of Proficiency Testing Schemes. International Laboratory Accreditation Cooperation (ILAC). www.ilac.org.
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ISO (2004) ISO/TS 21748. Guidance for the use of Repeatability, Reproducibility and Trueness Estimates in Measurement Uncertainty Estimation. International Organization for Standardisation (ISO), www.iso.org.
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ISO (2008). ISO 9001: 2008. Quality Management Systems-Requirements. International Organization for Standardization (ISO), www.iso.org.
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ISO/IEC (2004). ISO/IEC 17000: 2004. Conformity Assessment-Vocabulary and General Principles. International Organization for Standardization (ISO), www.iso.org.
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ISO/IEC (2004a). ISO/IEC 17011: 2004. Conformity Assessment-General requirements for accreditation bodies accrediting conformity assessment bodies. International Organization for Standardization (ISO), www.iso.org.
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ISO/IEC (2005). ISO/IEC 17025: 2005. General Requirements for the Competence of Testing and Calibration Laboratories. International Organization for Standardization (ISO), www.iso.org.
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ISO/IEC (2010). ISO/IEC 17043: 2010. Conformity Assessment-General Requirements for Proficiency Testing. International Organization for Standardization (ISO), www.iso.org.
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OIE (WORLD ORGANISATION FOR ANIMAL HEALTH) (2008). Standard for Management and Technical Requirements for Laboratories Conducting Tests for Infectious Animal Diseases. In: OIE Quality Standard and Guidelines for Veterinary Laboratories: Infectious Diseases, Second Edition. World Organisation for Animal Health (OIE: Office International des Epizooties), 12 rue de Prony, 75017Paris, France. www.oie.int.
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第1.1.2章 传染性疫病诊断方法的确认原则和方法
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引言
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确认一检测方法指判断某一经研发、优化和标准化的方法可否达到既定目的的过程，包括评价其分析和诊断等性能特点。本文章中，如果某一检测方法通过了包括性能特点在内的确认过程的前三个阶段（见图A.1），即可视之为“符合原既定目的”[5]。为保持确认检测方法的合格状态，实验室需认真监督该方法在日常工作中的性能，通过持续跟踪内部控制结果，确保检测方法始终保持最初验证时的性能特点。如该方法生成的结果与原评估数据不符，则可能不再适用于既定目的。因此，实验室应在每次使用确认的检测方法时进行内部控制，并评估控制结果，保证检测方法始终适用于既定目的。
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本章中的检测方法（assay）、试验方法（test method）和试验（test）三个词为同义词，可互换使用。
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检测个体或群体的方法所针对的目的各有不同，如证明在一个国家或地区内无某疫病、防止疫病通过贸易传播、根除一个地区或国家内的疫病感染、确诊临诊病例、估测感染率便于风险分析、为采取控制措施确定感染动物、按照群体卫生状况或免疫接种后的免疫状况进行动物分类等。对于同一检测方法，可通过适当优化其性能特点，针对一个或多个目的进行确认，如在用于初筛时设置较高的诊断敏感性（DSe）和较低的诊断特异性（DSp），或在用于确诊时设置较高的诊断特异性和较低的诊断敏感性。
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“有效”（valid或validity）指试验方法的估测性能特点与真正的参数值无偏差，适用于定量和定性测量。
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随着新型诊断试剂及检测平台和程序的不断推陈出新，引发了关于如何正确评价这些新方法的讨论。以简单的血清学方法为例（如酶联免疫吸附试验），它对于研发人员确认复杂的检测方法（如核酸检测试验）已不具有借鉴意义。为保证各种检测方法确认程序的一致性，本章着重介绍在建立及确认各种检测方法的过程中必须遵循的标准。将试验方法的建立工作纳入确认过程似乎有些违反常情，但在必须遵循的确认标准中，有三条都涉及试验方法的建立问题。因此，试验方法的建立与确认程序相辅相成，均需符合必须遵循的相关确认标准。本章附录中的最佳实践可作为各个标准的评价指导。它们是针对几种截然不同类型的检测方法（如检测核酸、抗体或抗原），逐一量身定制而成。
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直接和间接的确认方法
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传染性疫病的诊断有直接和／或间接检测传染性病原之分。直接方法是检测病原颗粒和／或其组成部分，如核酸、结构或非结构性蛋白、酶等；间接方法是检测因接触病原或其组分而产生的抗体或细胞介导免疫应答。最常见的传染性病原体间接检测方法是抗体法，如传统的病毒中和试验、抗体酶联免疫吸附试验（ELISA）、血凝抑制试验、补体结合试验，以及近期出现的生物传感器、生物荧光、荧光偏振、化学荧光等新方法。
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最常见的直接检测方法有分离或体外培养活生物体、电镜观察、免疫荧光、免疫组织化学、抗原酶联免疫吸附试验（ELISA）、免疫印迹法（Westernblot）、核酸检测系统（NAD）等。其中，核酸检测系统包括核酸杂交（NAH）、宏阵列和微阵列及聚合酶链式反应（PCR）等各种核酸扩增技术和核酸序列扩增（NASBA）、侵入式或环媒等温扩增（LAMP）等等温扩增方法。核酸检测系统方法正在迅速普及，并在许多情况下替代了病毒分离和细菌培养，特别是在病原培养困难或无法培养的情况下。核酸检测系统工具还可作为二级方法，在分离病毒、细菌和寄生虫后，高特异性地鉴定其株、群或亲缘关系。聚合酶链式反应等分子诊断方法具有以下非常实用的优点：a）无需复制病原生物体；b）无需昂贵的病毒分离设施；c）诊断无需耗时数周；d）无需特殊的专业技能（许多实验室往往不具备此类技能）。同时，这些技术现已相对安全、成本低廉且应用方便（BallagiPordány和Belák，1996；Belák，2005；Belák，2007；Belák和Thorén，2001；Burns等，2005；Bustin，2005；Huggett等，2005；Lauerman，2004；Louie等，2000）。各种实时聚合酶链式反应方法、核酸提取仪及用于核酸、抗体和抗原检测的自动工作站构成了大量高通量、稳定、迅速且可靠的检测方法。尽管与传染性病原分离鉴定或抗原酶联免疫吸附试验相比，核酸检测系统具有更高的诊断敏感性和分析特异性，但这也给确认此类检测方法带来更大的挑战。
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在检测方法的建立和确认工作中需考虑的因素
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首先应明确检测目的，检测目的决定着随后所有的确认步骤。通过确定影响检测方法性能的因素，可更为明确地认识到确认中应采用的标准。这些因素可分为三类，分别为：（a）样品：影响到目标分析物数量或性质的单个样或混合样、基质组成及宿主／微生物间的相互作用；（b）检测系统：影响到样品特定分析物检测能力的各种物理、化学和生物及与操作者相关的因素；（c）测试结果判读：根据分析物检测结果准确预测个体或群体状况的能力。
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检测方法确认标准（assay validation criterion）：检测方法的特征描述；可作为判定或决策基础的具有决定性的因素、量度或标准。
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含有目标分析物的基质（如血清、粪便、组织等）可能含有内源性或外源性抑制剂，会抑制如聚合酶链式反应、酶联免疫吸附试验等依赖酶的试验。还有一些因素会影响样品中分析物（主要是抗体）的浓度和组分，如宿主的内在因素（如年龄、性别、品种、营养状况、妊娠、免疫反应等）或后天因素（如被动获得抗体、因疫苗或感染而主动免疫产生抗体等）。样本污染或变质等非宿主因素也会影响到检测方法检出目标分析物的能力。
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干扰检测系统分析性能的因素有：仪器使用、操作员失误、试剂选择（包括化学试剂和生物试剂）、仪器校准、方法的准确性和可接受范围、反应容器和平台、水质、缓冲液和稀释液的pH和离子强度、培育温度和持续时间，以及因检测到密切相关的分析物而导致的误差。此外，保证生物试剂中无外来因子也很重要。
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干扰检测诊断性能的因素也与选择对照样本有关，即从已知感染／暴露动物或已知未感染动物中挑选对照样本，用于评估检测方法的诊断敏感性（DSe）和诊断特异性（DSp）。由于对照样本真实代表目标种群中所有宿主和环境因子的程度会直接影响到实验结果判读的置信度，因此选择对照样本是一个难度较大的问题。例如，经验丰富的血清学者会知道，使用以北欧牛血清样品确认的检测方法诊断非洲牛群时，未必能得到有效的结果。在无法获得已知感染状况的样本时，评估检测方法诊断性能的工作会更为复杂。在这种情况下，可在一定条件下采用潜类模型评估诊断敏感性和特异性（Enoe等，2000；Greiner和Gardner，2000；附录第1.1.4.5条）。
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建立和确认检测方法的标准
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从建立检测方法的最初阶段到应用于目标动物群体时的最终性能评估阶段，检测性能受到许多因素的影响。因此，一种检测方法只有在按照确认的一整套基本标准（见右侧方框），经定量或定性[6]测试和验证后，才能被视为得到确认。忽视任何一项确认标准都会导致检测方法在实现既定目的时置信度的降低。前四项标准通常在建立检测方法的过程（建立流程）中进行评估，其余八项标准在确认检测方法（确认流程）的前三个阶段进行评估。
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确认检测方法的标准
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1．既定目的适用性
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2．优化
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3．标准化
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4．稳定性
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5．可重复性
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6．分析敏感性
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7．分析特异性
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8．临界点或阈值（分界值）
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9．诊断敏感性
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10．诊断特异性
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11．可重现性
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12．耐久性
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A 检测方法建立流程
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1 确定检测方法的既定目的
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1.1 既定目的适用性
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最常见的目的如下：
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i）显示在某特定群体（国家／地区／生物安全隔离区／养殖场）中不存在感染（流行率为零）：
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a）免疫无疫和／或非免疫无疫；
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b）疫病暴发后重新建立无疫状态；
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ii）证明在用于贸易／调运的动物个体或产品中无感染或无病原存在；
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iii）在某特定群体中扑灭疫病或消除感染；
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iv）确诊可疑病例或临诊病例（包括确认筛检阳性结果）；
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v）评估流行率或感染率，以促进风险分析（如调查、种群卫生状况、疫病控制措施等）；
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vi）确定动物个体或群体的免疫状况（接种后）。
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为了达到这些目的，可以使用许多更具针对性的具体应用（详见附录中每个检测方法类型）。每个经过充分验证的检测方法应明确界定其相应的具体应用及既定目的（图A.1）。
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图A.1 检测方法建立和确认流程图，带有阴影的方块中着重标出了检测方法确认标准
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1.2 既定应用的适用性
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尽管本章主要从科学角度论述如何针对既定目的确认检测方法及其适用性，但其他因素也会影响检测方法在既定应用方面的适用性。这些因素不仅包括检测方法的诊断适用性，还包括科学界、监管部门和客户是否接受检测方法，以及根据实验室现有资源检测方法是否可行等问题。如实验室无法达到检测方法的操作要求，则该方法不适用于其既定用途。操作要求可包括执行费用、设备配置、技术精细度、判读能力、试剂盒／试剂供应、保质期、运输要求、安全性、生物安全性、样本通量、测试结果周转时间、质量控制和质量保证，以及该检测方法能否在其他实验室推广等。检测试剂盒方便易用，适于实地使用，但如不在实验室控制条件下进行，则需格外谨慎，以保证达到既定目的（Crowther等，2006）。
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2 建立检测方法——实验性研究
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2.1 基本前提：影响检测方法确认的因素
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2.1.1 质量保证
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无论是在实验室建立检测方法，还是分析临诊资料，其目标都是获得高质量的数据，这就要求实验室必须达到关键质量指标（见第1.1.2章兽医检测实验室的质量管理）。建立一个质量保证（QA）和质量控制（QC）体系、制定一套包括使用对照样本在内的质量规程至关重要，以此确保系统正常运作和数据质量及其可重现性。世界上许多实验室已建立了质量保证和质量控制体系，并拥有训练有素的合格人员。
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2.1.2 设备选择
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设备维护和校准不良会严重影响到检测方法的质量，必须按照实验室质量保证协议的要求，对各种仪器和设备（如冷藏库、加热室、培养箱、冰箱、色度计、热循环仪、洗板机、移液管等）进行校准。需要校准的设备还包括在常规诊断程序中用于整个或部分检测过程的自动化设备，例如，不应假定自动化提取核酸等同于以前使用的手工提取，或认为酶联免疫吸附试验自动洗板机能均匀洗涤板上的孔。相关设备必须进行校准和验证，以确认其有效性，保证在核酸分析系统中不会出现交叉污染，或在自动洗板机中不会出现清洗不充分的现象（见附录最佳实践介绍）。
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2.1.3 样本的选择与完整性
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选择、收集、制备和管理样品是设计、建立和确认检测方法时的重要因素。此外，运输、产销监管链、样品跟踪、实验室信息管理系统等因素也是产生变化／误差的重要来源。在把检测方法用于常规检测时，正确控制这些因素就变得尤其重要。在检测方法的建立和确认过程中，实验结果的完整性取决于在实验或常规诊断检测中使用的样品质量。在对检测方法进行确认前，必须首先明确可能会对样本质量产生负面影响的因素。检测方法的建立和确认过程中使用的对照样本应与检测中使用的样本基质相同（如血清、组织、全血等），且对于该方法检测的物种具有代表性。参考物质应可恰当地表示试验方法能检测到的分析物浓度范围。有关正确收集、制备、管理和运输样品的详情参见前言及第二部分的第2.2.0章、第2.3.0章和第2.4.0章。
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2.2 试验方法的设计和概念验证
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2.2.1 分析物对照样本
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建立任何检测方法都需依靠含有分析物的对照样本，这些样本应能反映出可在目标群体中检测到的目标分析物和基质。对照样本可为含有相关分析物的血清、体液和细胞组织或与目标分析物一致的基因组。这些参考材料可用于检测方法的建立和确认过程中的各项试验。
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分析物对照样本（analyte reference samples）含有不同浓度的相关分析物，可用于建立和评估检测方法的确认标准。
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2.3 检测方法的工作范围
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在建立检测方法的过程中，需要确定检测上下限。为正式设定这一范围，应选择一个强阳性对照样本（理想情况下，该样本应与下文“优化”一节中描述的三个样本中的一个相同）。使用与从目标动物群体采集的样本基质结构相同的分析物阴性基质，将强阳性样本连续稀释到减绝。其结果可以用分析物浓度（量）反应函数曲线（如OD值、Ct值等）表示。该曲线建立的检测范围是样本中分析物浓度（量）上、下限之间的区间，且已证实具有适当的精确度[8]和准确性。对于大多数诊断检测而言，反应是分析物与抗体或其他结合试剂相互作用的结果。此类试验被称为配体结合试验（ligand binding assays，LBAs）。其典型校准曲线为S形，下限（下渐近线）靠近背景反应值（非特异性结合），而上渐近线靠近最大反应值。配体结合试验的数据一般可被转化为反应结果和浓度之间的近似线性关系，这一转化使用线性回归分析，简化了数据插值，但会出现偏差。由于线性化具有欠准确的缺点，会影响到准确度和精确度估值，大量数据拟合算法已被应用于配体结合试验的实验校准曲线数据（Findlay和Dillard，2007）。目前，公认的配体结合试验校准参考模型为四参数计算模型。该模型通常能在最大可用校准范围优化准确度和精确度（Findlay和Dillard，2007）。现在，由于互联网上有许多用户友好型统计软件，这种转换运算对于一般用户而言较为实用。
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检测方法的工作范围（operating range of an assay）：指检测方法能提供适当精确度和准确性的分析物浓度（量）范围。
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精确度（precision）：指在特定条件下对同一样本进行一系列测量时的离散度（详见注解4）。
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准确度（accuracy）：指已知浓度或滴度的对照标准试剂的实测值与预期（真实）值的接近程度。
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2.4 优化
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应尽可能至少选择三个明确定义的对照样品，含有从阴性到强阳性（如阴性、弱阳性和强阳性）的分析物，并最好能代表检测方法针对的目标群体中已知感染和未感染的动物。然而有时无法获得此类对照样品，特别是对于核酸和抗原检测分析。虽然使用培养的病原（因子）或阳性血清来制备对照样本实属下策，因为实地采集的样本可能会和此类样本有很大差异，但如无其他选择，则只能使用通过培养得到的已知分析物含量的样品，或使用经同一物种的阴性血清稀释高滴度后的阳性血清。在这两种情况下，必须保证加入或稀释分析物的基质与在最后检测中所用的样本一致或尽量与之相似。应尽量通过一种或多种其他方法确定对照样品的特点。这些样本可用于试验，以确定检测方法能否区分分析物的不同含量，并可优化试剂浓度，完善检测程序。由于在整个建立和验证检测方法的过程中均会评估对照样本，因此在原则上，对于所有类型的检测，都有必要准备和存储数量充足的等分对照样本。在确认过程中更换对照样品会可严重影响对实验数据的判读，有损于检测方法建立和确认过程的完整性。
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优化（optimisation）：指对检测方法中最重要的物理、化学和生物参数进行评估和调整的过程，以确保该方法具备适用于既定应用的最佳性能特点。
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优化检测方法是一个劳动密集型的工作过程，是实现检测质量的关键所在。本章附录提供了相关最佳科学实践和科学判断，可用于指导检测方法所有要素的优化工作。这套做法为建立检测方法提供了坚实的基础，使其无论在任何实验室均可长期保持原有的“稳定性”和“耐用性”。通常情况下，检测方法的雏形是在实验室现有的试剂和设备基础上发展而成。然而，如检测方法拟应用于多个实验室的常规诊断，优化工作则变得非常重要。必须详细说明每个化学制剂和缓冲液，必须针对纯度和等级定义所有试剂（包括水），必须针对pH、摩尔浓度等参数建立可接受的工作范围。同样，对于生物制品，必须定义其质量标准、纯度、浓度和反应性质，还必须考虑到化学制剂和生物制品的保质期和存储条件，也需设定反应时间和温度的可接受范围。必须详细描述用于检测的关键设备，包括操作规范和校准。过程（质量）控制往往是检测方法研发末期的一个附加步骤，但应在进行优化工作初期即开展过程控制。此外，数据采集、处理和判读等后期工作也可能需要优化和标准化。所有经过优化的参数必须在试验方法报告中予以充分描述。
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对于某些类型的检测方法，检测结果的正确与否完全取决于是否正确执行了测试过程中的某一特定步骤，在优化过程中需要特别注意这一点，从样品中提取核酸就是一个典型的例子。商业方法（工作站、旋转操作、磁性提取等）和基于化学的标准方法均可用于提取脱氧核糖核酸（DNA）或核糖核酸（RNA）。至关重要的是，通过优化实验来确定重现性最佳且最有效的提取方法，需针对每种可能会作为检测对象的组织进行优化。如提取方法出现变化，应至少能证明修改后的方法具有等同的提取效率（更多有关更换试剂后确立等效性的信息，见下文第B.6节及附录第1.1.4.6条）。
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以下章节将分别介绍多种分析物对照样本和常规包括在任何检测系统中的过程控制，提供了检测方法监测工作的关键所在，在试验方法优化过程中需予以特别关注。此外，必须正确制备和储存所有生物试剂和参考物质，以确保其稳定性（见前言和第二部分的第2.2.0章、第2.3.0章和第2.4.0章）。
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在优化检测方法的实验中，应注意最佳检测性能参数范围较窄的情况，因为这是可能影响方法稳定性的关键所在（见第A.2.6节）。
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2.5 样品基质里的抑制因子
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检测血清中抗体的方法一般对抑制因子具有相当强的抵抗力，但某些情况除外，如病毒中和试验中的毒力因子，或在酶联免疫吸附试验中，某些样本里的内源性物质能抑制酶反应。对于核酸检测，从血液、血清、身体组织和拭子的样本材料中较易提取目标核酸，而粪便、自溶组织和精液样本由于含有抑制聚合酶链式反应试验等下游检测的因子，因此较难处理。
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2.6 稳定性
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稳定性指在某一实验室内进行试验的过程中当测试条件发生微小变化时检测方法不受其影响的能力，可通过故意改变检测参数进行评估（国际协调会议，2005）。在检测方法的建立和优化阶段，便应开始进行稳定性评估。可在确定最佳检测条件后，在实验中刻意改动检测方法参数。然而，当通过试剂多因子滴定优化检测方法时，可能会影响到稳定性。如试验条件或试剂浓度出现微小变化，引起检测结果发生不可接受的变化，该检测方法的稳定性很可能不足。在了解到这一情况时，可决定是否值得继续进行检测方法确认，因为如一个检测方法在实验室较理想的条件下都欠稳定，当转用于其他实验室后也很难表现出耐用性（即降低了可重复性）（有关耐用性的描述参见第B.4节）。
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稳定性（robustness）：用来衡量测试方法在其参数发生少量但可预料的改变时不受影响的能力，在正常使用中可显示方法的可靠性。
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最有可能影响检测方法稳定性的因素包括pH、温度等定量（连续性）因素、不同批次试剂或不同品牌微量滴定板等定性（类别）因素，以及水或有机基质等混合物相关因素（Dejaegher和Vander Heyden，2006）。对于配体结合试验（LBA），造成缺乏稳定性的原因不仅在于生物试剂低于检测方法中指定的最佳浓度（量），也在于生物试剂本身的特性（如单克隆抗体的亲和力或多克隆抗体的亲和力和／或化合价等）。因此，检测方法（尤其是基于配体结合试验的检测方法）的稳定性会受到系统性和／或随机性错误的影响（Thompson等，2002）。
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稳定性测试是一个方法渐进的过程。所有关键试剂均经过确认和评估，比较所有可能的试剂组合。例如，利用酶联免疫吸附试验检测抗体，相关因素可包括结合固相的抗原浓度、标记物稀释度、表现检测方法工作范围的若干测试血清特性等。检测中对这些微小变化的反应不应导致不可接受的结果变化。此外，还可通过因子设计实验证明稳定性（Dejaegher和Vander Heyden，2006；Youden和Steiner，1987）。
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在方法确认的第一阶段还会进一步验证稳定性。在常规实验室条件下第一次使用优化后的检测方法时，实际测量的稳定性被称为可重复性（见B.2.1）。在检测方法的整个有效期内，应持续监测方法的稳定性，并将其纳入过程控制程序（见B.6.1）
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2.7 针对标准试剂标定检测方法
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2.7.1 国际级和国家级分析物参考标准
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理想情况下，含有已知浓度分析物的国际参考标准试剂应作为所有检测方法标准化的参考试剂，此类标准试剂由国际参考实验室制备和分发。国家参考标准试剂应尽可能依照国际标准试剂予以校准，并由国家参考实验室制备和分发。在缺乏国际参考标准试剂的情况下，国家标准试剂即成为与待确认检测方法进行比较的标准试剂。这些标准试剂已经过大量分析，特性已很明确，其特性的测定方法及其制备和存储方法最好已在同行评审的出版物上公开发表。
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2.7.2 内部标准试剂
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内部参考标准试剂通常是在一个特定机构的特定场所内可使用的具有最高计量质量的试剂，并根据国际或国家标准予以校准。在缺乏校准用标准试剂的情况下，内部参考标准应尽量采用与国际和国家分析物标准同样的方式予以充分定性。由此，这类地区性内部标准试剂成为当地可使用的最佳标准试剂。同时，由于日常试验中使用的试剂会定期根据内部标准试剂进行校准，应准备数量充足的等分内部标准试剂备用。
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2.7.3 标准工作试剂
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标准工作试剂通常被称为分析物或过程控制用试剂，按照国际、国家或内部标准予以标定。其制备量较大并需等分存储，以供每次诊断检测使用。
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2.8 根据标准工作试剂“标准化”测试结果
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由于一个实验室多次使用同一检测方法，或不同实验室使用相同或相似方法获得的原始测试结果之间常存在一些内在差别，因此几乎无法直接比较这些（半）定量数据。为显著提高实验室内部和实验室之间测试结果的可比性，每次使用某一检测方法进行测试时，均需包含一个或多个标准工作试剂。由此，每个样品的原始测试值可被转换成和标准工作试剂相应的活性单位，这个转换过程名为“标准化”（normalisation）［注意不要和旨在实现“正常（normal）”（高斯）分布的数据转换相混淆］。“标准化”值可以多种方式表达，阳性对照百分比（如在酶联免疫吸附试验中）、源自某标准曲线的分析物浓度或滴度或在实时聚合酶链式反应试验中源于循环阈值（CT）标准曲线的目标基因组拷贝数等。在检测方法的建立和确认过程中，在每次运用该方法进行检测时都使用标准工作试剂（或至少使用定性较明确的样品）是一个很好的做法，以便进行数据“标准化”，从而可直接比较检测结果。此外，通过标准曲线或在实时聚合酶链式反应试验中报告突破循环阈值的循环数，自动测定系统可计算和报告“标准化”数据。欲了解更多相关信息，参阅附录1.1.4.1和附录1.1.4.3。
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B 检测方法确认流程
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1 “经确认的检测方法”的定义
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“确认”指判断为某特定目的而建立、优化和标准化的检测方法是否适用的过程，确认工作包括评估检测方法的分析和诊断性能特点。就本手册而言，一个测试方法如已完成确认流程（见图A.1）中包括性能特点评估在内的前三个阶段，即可被视为“经确认符合原既定目的”。
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为保持确认检测方法的有效状态，应保证该方法始终保持确认过程中定义的性能特点（见B.6）。要做到这一点，应建立质量保证程序，通过以内部控制为目的估计精确度和准确度及安排外部能力测试，认真监控检测方法在日常工作中的性能。一旦检测方法的结果与确认过的原始数据出现不一致，该方法就应被视为不再适用于既定目的。因此，应持续评估经确认的检测方法，以确保其始终适用于既定目的。
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2 第一阶段——分析性能特点
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2.1 可重复性
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在评估检测方法的可重复性时，可通过检测至少三个（最好五个）能体现方法测定范围内分析物活性的样本，并分析检测结果之间的差异。可将每个样本等分装入三个单独的容器里，作为与原始样本相同、包含原始分析物和基质浓度的复制样本。随后，将每个复制样本视为采集自目标群体的试验样本，根据检测方法的每个步骤逐项进行测试，包括稀释成工作浓度这一步。以下两种做法不可取：即分别为把等分样品在管子里稀释成工作浓度，然后用移液管加到反应容器里；或将一次抽提的核酸制备成复制样本，而不是在加入反应容器稀释前分别提取每个复制品。如此制备的样品无法作为有效的复制样本用于可重复性研究。确定批间变异时，由至少两位操作员分别在至少5d内多次（约20次）使用相同的样本进行检测。重复结果的变化可表示为标准差、置信度区间等（关于可重复性评估的不确定度测量，参见附录1.1.4.4）。
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可重复性（repeatability）：指在一个特定实验室内使用同一方法重复检测样本复制件所得结果之间的一致程度。
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2.2 分析特异性（ASp）
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第二部分 关于特定疫病的建议
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概述
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A 水生动物卫生管理总体建议
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B 目标病原体和疫病
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C 抽样
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1 抽样目的
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2 流行病学单位取样的数量
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2.1 为证明无疫而抽样
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为证明无疫病，水生动物的抽样方法应有利于发现病原体，以提高所用诊断方法的敏感性。例如，选择昏睡或接近池塘、水槽和水沟边缘的甲壳类或鱼类动物，会增加发现感染动物的概率。应优先选择具有某疫病病症的濒死动物，其余样本应包括从相关群体中随机挑选的动物。同样，若已掌握有关疫病或感染的风险因素信息，应在风险最大的地方采样，以增加检出病原体的可能性。
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这一目标抽样策略旨在增加抽取到感染个体样本的概率，引入“偏差”来达到检出疫病的目的。需注意，在抽样中引入偏差时，无法利用病原体阳性试验结果对相关种群的患病率作出准确的评价。例如，从含有100个濒死动物的样本中检出一个阳性个体，并不一定说明整个种群的患病率为1%。
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试验的敏感性和特异性对于计算样本量、分析结果和得出结论十分重要。证明无疫病时，试验的敏感性尤为重要。
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2.2 为评估疫病的发生和分布而抽样
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为了评估疫病的发生情况（如测算流行率或发病率），选择的流行病学单位应含有可用于评估参数的代表性样本，获得代表性样本只能利用概率取样。如只为方便起见，或为创造一个代表性样本而刻意选样，则不会产生有代表性的样本。
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虽可利用随机抽样法或地理抽样法选择养殖场代表性样本，但实际上，在水产养殖环境中选择真正随机样本的机会很少，如可标识和计算水生动物个体（这对于一些种群有时可行），就可采用简单的随机取样。
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为获得随机性应尽可能寻求创新方法。当可获得某种群所有个体时，有可能做到这一点。例如，在可单独处理每只动物的情况下，可设计出系统性的随机抽样计划。
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虽然在水产养殖中通常采用非随机抽样方法，但从技术角度看，这不可能用于统计分析。在无法正确收集到随机样本的情况下，可根据情况选择最方便的抽样方法或随意抽样，但无法获得真正具有代表性的样本，且参数评估也会出现难以预料的偏差。一些非随机抽样方法可产生相对有代表性的样本，如甲壳动物的投网采样等。应避免使用进料托盘或颗粒饲料，这是因为所选动物的健康状况相对较佳，从而会低估了相关疫病或病原的发生和流行。值得注意的是，因抽样操作引起的偏差，得出的结果数据在疫病流行率方面往往也存在着很大偏差，因此不能用来确定疫情暴发的风险或严重程度。风险评估需要一个真正的随机抽样计划。
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若为评价某一国家或地区养殖场的感染率，这一过程可分两步进行。第一步，利用诸如调查工具包（Survey Toolbox）[1]中所列方法选择代表性养殖场；第二步，利用《OIE水生动物卫生监测指南》（2009）中阐述的方法，对每个选定养殖场进行调查，评估养殖场是否存在疫病。此调查得出的感染养殖场比率可用于评价该国养殖场的感染率。
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2.3 为调查可疑疫病暴发而抽样
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调查临诊疫病暴发需要采用合理且系统的方法，根据临诊经验选择个体和恰当的诊断试验。应根据疫病临诊表现，选择足量的濒死（或高危）个体进行诊断试验。值得注意的是，许多疫病需要多种因素才能引发临诊表现，而且，仅凭在濒死动物个体中鉴定出病原并不能证实此病原是促成疫病暴发的原因，也不代表同一种群中非濒死个体未携带此病原。
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在临诊疫病事件中，应从活体或濒死动物中仔细选取具有代表性病变的样本。应尽一切努力保证用于诊断的样本具有相关疫病种群的代表性，并且是濒死或具有临诊病变的样本。应避免收集死亡样本。如养殖或野生种群出现某种流行性疫病病症，且符合或疑似OIE名录疫病中的任何一种，应以适当方式格外仔细地保存收集到的样本，以便进行预期的诊断试验（参见疫病章节第4条——诊断方法）。
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不论监测目的如何，必须完整记录所有抽样方法，并说明理由。
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在疫病暴发调查中，尽管会增加假阳性数量，但由于调查的首要目的是确定病例，因此试验的敏感性仍非常重要。如前所述，试验的敏感性和特异性对于计算样本量、分析结果和得出结论也非常重要。
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3 抽样方案
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3.1 选择流行病学单位和抽样方法
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监测数据可源自许多不同来源。
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死亡率记录通常来自水产动物养殖场。但在软体水产动物养殖场，这一数据很少或观察频率较低（如2周统计一次累计死亡率）。如以发现某种特定疫病或感染为目的，保留的记录可用于识别意外高死亡率或不明原因事件的发生时期，从而可指导对于高发种群或在某时间段的采样工作。
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许多水生动物疫病具有相关疫病传入或传播的共同风险因素，如发生于一个地区不同年龄动物之间的疫病。如在产地掌握了动物年龄分布格局，则有助于设计调查方案。
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鉴于水产养殖场内动物个体的价值，往往需要进行常规卫生监控检查。与养殖场常规兽医或水生动物卫生专家进行交流可提供有价值的信息，能够帮助鉴定疫病暴发和证实在种群中没有出现不明原因的临诊事件。
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应抽取活体水生动物样本，除非在各疫病章节中另有特殊说明。
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在疫病暴发调查中，如抽样种群中有濒死动物，则应首先选择这些濒死动物，其余样本应包括从所有正在接受检查的养殖动物中随机选择有代表性的活体水生动物。如果是野生无脊椎种群（如软体动物），种群中高度可疑样本可包括死亡个体附近的动物。
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3.2 采样后的操作程序
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在样本收集后，应尽快处理水生动物的器官、组织和液体样本。如需组织学检查，应避免将样本冷冻。如进行病毒生物学试验、PCR检测、毒理学试验、某些细菌学检验等特定试验，可选择冷冻样本。因此，应根据诊断试验方法的类型，采取最恰当的方式保存合适的样本。
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应将样本用密封无菌的冷藏容器或与冰块一起单独包装送交实验室，但如不适合冷冻（见上文），应避免样本直接接触冰或冷冻包裹。建议在水产养殖地选取水生动物后，立即收集样本，按照各章节中或每个物种前言部分的相关介绍，妥善保存和处理样本。应在样本上附上标签，标明采集地点、时间、日期、品种、样本数、采集时的死亡或濒死情况及样本收集人的姓名和联系方式。样本标签用纸应选用结实的防水材质或塑料纸，并用永久性记号笔（防水和抗酒精）或2号铅笔书写。
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参考文献
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WORLD ORGANISATION FOR ANIMAL HEALTH (OIE) (2012). Chapter 1. 4. Aquatic animal health surveillance. In: Aquatic Animal Health Code, fifteenth edition. OIE, Paris, France.
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WORLD ORGANISATION FOR ANIMAL HEALTH (OIE) (2009). OIE Guide for Aquatic Animal Health Surveillance. OIE, Paris, France.
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第2.1篇 两栖类动物疫病
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第2.1.0章 概述
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（正在起草中。）
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第2.1.1章 箭毒蛙壶菌感染
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1 范围
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本章所述壶菌病由具有游动孢子的真菌箭毒蛙壶菌感染所致。箭毒蛙壶菌的分类为真菌界（Fungi）壶菌门（Chytridiomycota）壶菌纲（Rhizophydiales）。本章建议适用于：无尾目（Anura）（青蛙和蟾蜍）、有尾目（Caudata）（蝾螈、水螈和鳗螈）、无足目（Gymnophiona）（真蚓科）的所有物种。
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本章所述所有方案和试剂均可从OIE参考实验室获得。所有抽样、组织学、组织化学和TaqMan PCR技术都已经验证（Hyatt等，2007）。
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2 疫病信息
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2.1 病原
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2.1.1 病原及病原株
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在1998年和1999年首次发现箭毒蛙壶菌（Batrachochytrium dendrobatidis，Bd）（Ber ger等，1998；Longcore等，1999）。该菌现被公认为潜在致死性壶菌病的病原（参见澳大利亚壶菌病威胁消减计划http://www.environment.gov.au/biodiversity/threatened/publications/tap/pubs/chytrid-background.pdf），已在全球范围内造成两栖动物大量死亡和衰退，两栖动物数量急剧下降，甚至引起两栖类物种灭绝，澳大利亚现已灭绝的物种高达八种（Fisher等，2009）。箭毒蛙壶菌传播速度快（Lips等，2006；Skerratt等，2007），在两栖动物内引起较高的死亡率（Lips等，2006；Scholegel等，2006）。在宿主种群密度很低的情况下，箭毒蛙壶菌仍能生存（Scholegel等，2006；Woodhams和Alford，2005）。迄今为止，已在野生两栖类生存的各大洲（36个国家）发现了箭毒蛙壶菌。箭毒蛙壶菌已感染350多种两栖类动物，其中200多种的数量已开始减少（Skerratt等，2007）。
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箭毒蛙壶菌引起皮肤病变。因为没有发现和内部器官一致的病理变化，所以至今未能确定其发病机制。关于该病致死原因，目前已发表了两种互不排斥的假设。第一种假设：箭毒蛙壶菌释放某些蛋白水解酶或活性化合物，透过皮肤被动物吸收；第二种假设：两栖类皮肤功能损坏干扰了水及水电解质平衡（渗透调节），体液电解质紊乱导致两栖类动物死亡（Berger等，1998）。最近发布的一份报告支持第二种假设（Voyles等，2009）。
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2.1.2 病原在宿主体外的存活能力
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据推测，箭毒蛙壶菌能在宿主体外生存，但尚未证实。目前，已从岩石中提取了其DNA（Lips等，2006），而且在实验室条件下也可在鸟的羽毛和潮湿土壤中培养该菌（Johnson和Speare，2003，2005；Lips等，2006）。从实验室感染的南方豹蛙上已分离到箭毒蛙壶菌。
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2.1.3 病原稳定性（有效灭活方法）
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箭毒蛙壶菌对很多化学和物理处理方法敏感（Phillott等，2010）。有效的处理方法有：季铵化合物、二癸基二甲基氯化铵（如PathX，1：500稀释，30s）、苯扎氯铵（如F10，1：1500稀释，1min），次氯酸钠的有效浓度在1%或以上。另外一种有效方法是将其浸泡在70%酒精和1mg/mL卫康（Virkon）消毒剂中20s。这些化学试剂可用于实验室、两栖类饲养及野外消毒工作，如用酒精棉消毒剪刀、游标卡尺、其他操作使用工具等。箭毒蛙壶菌无法在完全干燥的环境下生存。但在实践中，长时间处于水滴中的病原即便在水滴干涸后仍能存3h（Johnson等，2003）。37℃加热4h可杀死孢囊。常规杀灭细菌、真菌及病毒的紫外照射方法对箭毒蛙壶菌无效。
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箭毒蛙壶菌虽可在多种氮源（Piotrowski等，2004）及无菌湖水中（Johnson和Speare，2003，2005；Piotrowski等，2004）生长，但速度比较缓慢。另外发现，在没有青蛙作为宿主的情况下，箭毒蛙壶菌可以腐生生长。游动孢子的活动时间长达24h以上，在18h和24h后仍能保持运动力的孢子比例分别为50%和5%。
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2.1.4 生活史
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箭毒蛙壶菌主要有两个基本生活阶段：一是水生性、短暂散布的游动孢子阶段；二是固着单中心的叶状体、最终发展成具有无性繁殖能力的游动孢子囊阶段。箭毒蛙壶菌生长在皮肤的复层表皮，菌体在表皮细胞内生长，最初寄生在皮肤较深层，其生长与细胞成熟同步，菌体在角质化过程中向外移动。箭毒蛙壶菌最初生长在活细胞中，但当孢子囊处于缺乏细胞器的表层角质死细胞时，菌体就会停止生长。排放管（discharge tubes）能吞噬并溶解表皮细胞膜，并开口于表层细胞表面，经常突出于体表。孢子囊在成体及蝌蚪体内的分布表明，复层角质化表皮是箭毒蛙壶菌寄生的必要条件（Berger等，1998：Marantelli等，2004）。不成熟的孢子囊也能生长在含有前角质蛋白的较深层细胞里。尚未发现稳定的静息孢子。
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2.2 宿主
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2.2.1 易感宿主种类
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如上所述，在全球六大洲均已发现箭毒蛙壶菌，包括两栖类2个目14个科的350多个物种。总体而言，大多数有尾目和无尾目动物均可感染箭毒蛙壶菌，不同物种的发病率和死亡率不同。基本上没有蝌蚪死亡的报告（仅有一篇报告，Blaustein等，2005）。到目前为止，尚未在卵上检测到活的箭毒蛙壶菌。
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2.2.2 宿主易感阶段
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宿主易感阶段包括各生长阶段：幼体期、变态期和成体期（不含卵）。
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2.2.3 易感品种或亚群（检测概率）
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不同物种的先天免疫力有很大差异。物种栖息的微生境和环境也是物种感染和患病的重要影响因素。例如，在较高温度下（>26℃），箭毒蛙壶菌的毒力会下降。
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除卵外，可用多种方法检测到箭毒蛙壶菌幼体、（变态期）成体前期和成体各阶段，检测方法包括肉眼观察蝌蚪、光学显微镜、免疫组织化学、电子显微镜、免疫电镜、定量PCR法等。
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2.2.4 靶器官和感染组织
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箭毒蛙壶菌主要感染两栖动物的表皮（Hyatt等，2007）。表皮严重腐烂是壶菌病的一个明显病症。皮肤腐烂多发生于腹部、四肢、足部等处（Berger等，2005a，2005b；Pessier等，1999）。可通过观察到皮肤角质化及发现游动孢子囊来确定皮肤病变。收集病变部位的皮肤显然是检测箭毒蛙壶菌的最佳方法。
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2.2.5 终身携带病原的持续性感染
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一些野生两栖动物持续带菌，却很少或没有发现其发病或死亡。尚不清楚这些种类是否为终身病原携带者。
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2.2.6 媒介
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两栖类能够成为箭毒蛙壶菌的储存宿主，但不发病。箭毒蛙壶菌在环境中及共栖种中的生存能力可导致一些物种灭绝。对约97%极度濒危的两栖类而言，箭毒蛙壶菌的危险性很大（Smith等，2006）。如上所述，箭毒蛙壶菌会导致一些两栖类灭绝（Fisher等，2009）。
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2.2.7 已知或可疑的野生水生动物携带者
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两栖类动物是箭毒蛙壶菌唯一的传染源和携带者。
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2.3 疫病模式
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2.3.1 传播机制
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可通过与患病动物接触或接触水生游动孢子而感染箭毒蛙壶菌。远距离传播不仅可通过水源，还可通过国际间的动物贸易（Rowley等，2007）。转移受污染的水或潮湿土壤也可能造成传播。
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2.3.2 流行
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流行情况会随季节、地区和物种的不同而有很大差异。感染种群的发病率至少为5%，有时可达90%在热带地区，冬季及高海拔地区的发病率往往较高。可从以下网址查询根据全球化强化监控（通过实时定量PCR法）得到的发病率数据：http://www.spatialepidemiology.net/bd-maps/。
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2.3.3 地理分布
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在世界各大洲均有箭毒蛙壶菌感染的报道（见上文）。有关箭毒蛙壶菌的最新资讯（国家、地区、物种及样本检测数目、阳性／阴性、鉴定方法、报告年份、国际自然保护联盟IUCN的状况和所在地等），参见网址：http://www.spatialepidemiology.net/bd-maps/。本章内容发表时，全球已有72个国家报道发现箭毒蛙壶菌，详细内容参见上述网址。
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2.3.4 死亡率和发病率
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一些两栖类会与箭毒蛙壶菌共生，而其他两栖类会被感染（Davidson等，2003；Hanselmann等，2004；Retallick等，2004）。即使在同一物种内，一些种群可与箭毒蛙壶菌共生，而一些种群数量会减少甚至灭绝（Briggs等，2005）。箭毒蛙壶菌具有高度传染性，是导致两栖动物灭绝的潜在致死性病原。
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2.3.5 环境因素
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壶菌病的暴发与季节（较冷月份）、海拔高度（大多数灭绝的种群均生活在高海拔地区）、繁殖栖息地等因素密不可分（最近宣布灭绝的一个物种生活在溪流中）。该疫病对种群数量影响的严重程度与少量种群繁殖力低下相关（Williams和Hero，1998）。注：这些已确定的因素之间关系复杂，似乎存在内在易感性差异。
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2.4 控制和预防
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2.4.1 疫苗
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尚无疫苗。
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2.4.2 化学疗法
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体外试验结果表明，箭毒蛙壶菌对抗真菌药物敏感，不耐高温（>30℃），但清除两栖类身上箭毒蛙壶菌的有效方法不多（Berger等，2010）。有报告表明，加热（32℃加热5d，37℃加热两次，每次8h，前后间隔24h）能够杀死2种两栖类身上的箭毒蛙壶菌（Phillott等，2010；Woodhams等，2003）。但目前还需进一步试验，并优化加热杀菌方法。很多两栖类无法承受37℃温度。虽然用伊曲康唑溶液（0.01%每天浸泡5min，连用11d）或用福尔马林／孔雀石绿浸泡变态后期的青蛙对箭毒蛙壶菌病都有效（Forzan等，2008；Hohreiter和Rigg，2001；Nichols和Lamirande，2009；Parker等，2002），但这些试验还不够严谨，且存在药物毒性问题，特别是福尔马林和孔雀石绿。然而，伊曲康唑浸泡法已被广泛应用于两栖类的拯救和保护工作中，对成熟个体和未成熟个体都有效。据报道，在一个对照实验中，用低浓度（1.5mg/L）伊曲康唑成功治愈了一种被感染的蝌蚪，但可能出现色素脱失问题（Garner等，2009）。注：伊曲康唑水溶性制剂尚未普及。已有报道，伏立康唑治疗两栖类（成熟个体和蝌蚪）安全有效，方法是每天喷洒1次浓度为1.25mg/L的伏立康唑，连用7d（Martel等，2010）。
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2.4.3 免疫刺激
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尚未试验。
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2.4.4 抗病育种
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尚无抗病育种计划，但一些国家正在制定箭毒蛙壶菌病国家控制计划，包括对野生两栖类个体实施卫生消毒措施，并认识到需要保护原始、孤立地区的易感物种免受箭毒蛙壶菌感染。另一个项目（Genwin，2008）涉及建立圈养种群，避免易感物种受到流行病原扩散的威胁，且避免已感染物种数量逐渐减少（两栖动物方舟项目：http://www.amphibianark.org/）。
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2.4.5 引入抗性品种
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存在抗病物种被视为增加了疫病向濒危物种传播的风险。圈养育种计划的实施增补了野生濒危青蛙种群的数量。
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2.4.6 阻断剂
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尚未试验。
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2.4.7 消毒
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最近发表的一篇文章综述了消毒操作规程（Phillot等，2010）。文中详细描述了野生两栖类的捕获、处理、保存、感染前后皮肤消毒措施、青蛙标记、皮肤消毒、伤口愈合、治疗辅助设备等，详见表2.1。这些操作规程旨在提供现场卫生措施，减少个体间箭毒蛙壶菌的传播风险。这篇文章也详细描述了进出口及地区间卫生措施，以防止箭毒蛙壶菌感染风险蔓延。
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表2.1 杀灭箭毒蛙壶菌的消毒措施
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表2.1 杀灭箭毒蛙壶菌的消毒措施（续）-1
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2.4.8 常规管理措施
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在圈养设施对野生种群造成威胁时，需考虑采取以下措施：
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i）必须对水、垃圾及其他材料加以处理，以杀死箭毒蛙壶菌，或妥善储存、处置及转移到其不构成威胁的地方。例如，被污染的水可被排放到封闭的下水道，再直接排放到海水环境。
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ii）必须对两栖类动物（包括食用动物）采用封闭式养殖，以防其进入外部环境。
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iii）出入相关养殖设施的人员、设备及材料均需加以消毒，以防箭毒蛙壶菌传播。
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iv）必须对准备释放到自然环境中的两栖类进行严格隔离，并进行箭毒蛙壶菌检测，以确定是否可以释放。如任何样本检测为阳性，则需对所有动物重新进行检测，直到其不再具有感染性为止。
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v）当计划建立养殖设施时，需考虑场地位置及当地箭毒蛙壶菌状况、安全用水供应情况、消费情况、废弃物安全排放等。例如，最好在热带低凹处选址养殖，因为这样会减少箭毒蛙壶菌对当地物种的威胁，也易于安全排放废弃物。
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vi）若当地存在箭毒蛙壶菌，需注意防止扩大菌群或引入新菌株。养殖过程中，需保证污水和其他材料含菌量在排放前达到环境水平。引进新物种时，需事先妥善处理和清洗潜在携带新壶菌菌株的两栖动物。
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在外来资源对圈养设施造成威胁的情况下，需考虑采取以下措施：
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i）外来水、人员或材料进入设施时，需进行箭毒蛙壶菌消毒，已知其来源安全的情况除外。
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ii）需对引进的两栖类进行隔离与检测。如出现任何样本检测阳性，则需对引入的所有群体重新进行检测，直到消除感染。
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3 采样
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3.1 样本选择
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3.1.1 脚趾（成体）、口盘（蝌蚪／幼体）、皮肤（成体和幼体）
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可在野外切取用来进行TaqMan PCR法检测的脚趾，采样后，应干燥保存或储存于70%酒精中，或在提取DNA之前，放在1.5mL离心管里，－80℃保存。用于脚趾组织学分析的切片应保存在10%中性福尔马林缓冲液中。
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在野外采集蝌蚪口器样本（口盘，照片见图3.1）可用棉拭子[4]涂抹采样（图3.1A），也可将口盘剖割后放在滤纸上自然干燥，感染动物可见下颌色素减少（图3.1B）、牙齿变短或缺失（由塔斯马尼亚大学病理学系D. Obbendorf博士提供图片）。
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进行青蛙皮肤涂抹采样时，充分擦拭（3～5次）腿、脚内侧和朝水面皮肤，然后把棉拭子折断装入1.5mL离心管。进行蝌蚪口器擦拭时，需把棉拭子伸入其内部并快速转动多次。
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图3.1 蝌蚪口器样本
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3.1.2 水浴和过滤料
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因为感染青蛙的皮肤会脱落在周围环境里，所以需把感染的两栖类放到盛有杀灭箭毒蛙壶菌溶液的容器里（如DS溶液，详细配方见下）。浸泡15min后，可直接将浸泡水用于试验。另外，也可将水浴液过滤（0.45μm滤膜[5]），滤膜干燥储存（室温或4℃），供试验分析使用。
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试剂：
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（1）弱盐溶液（DS）的配制：
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KH2PO4 0.001M
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MgCl2 0.0001M
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CaCl2 0.00002M
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（2）储备液#1（磷酸盐储备液）：
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KH2PO4 136.0g
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K2HPO4 174.18g
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（NH4）2HPO4 132.07g
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蒸馏水定容至1000mL。
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（3）储备液#2（钙镁储备液）：
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CaCl2·2H2O 36.76g
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MgCl2·6H2O 50.83mg
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用蒸馏水定容至500mL，用KOH稀溶液调到pH7。
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（4）DS溶液：0.1mL钙镁储备液，0.5mL磷酸盐储备液，蒸馏水定容至1000mL。
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3.2 样本保存
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可干燥保存皮肤样本或切下来的口器（最高温度23℃）。注：长时间暴露在高温环境下（如无人看管的汽车内）将降低核酸修复能力。
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在光学显微镜和电子显微镜下观察时，需将组织分别固定在10%中性福尔马林缓冲液和2.5%戊二醛缓冲液中。应按上述方法处理流行性造血器官坏死和蛙病毒感染样本。
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3.3 样本合并
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最多可合并5个样本（弱阳性样本可能会被遗漏）。注：样本合并仅用于寻找是否存在感染的种群研究（Hyatt等，2007）。
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3.4 最适宜使用的器官或组织
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腹部皮肤（成体）、脚趾（成体）及嘴部（蝌蚪）。
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3.5 不宜使用的样本和组织
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内脏和卵。
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4 诊断方法
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4.1 现场诊断方法
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4.1.1 临诊症状
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绝大多数感染动物没有相应的临诊症状，典型症状出现期通常较短，仅限于濒死的患病两栖类。
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4.1.2 行为变化
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中枢神经系统症状最为明显。行为变化表现为运动缓慢且不协调，坐姿不正常，肌肉强直性痉挛，正常反射消失和瘫痪。
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4.2 临诊诊断方法
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4.2.1 肉眼可见病变
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严重感染时可见皮肤变化，包括皮肤异常脱落（脱皮频繁且碎片较小）和出现红疹。但这些不是壶菌病的特异性病症。
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4.2.2 临诊化学变化
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患病绿树蛙（Litoria caerulea）体内钠离子和钾离子的浓度分别降低20%和50%（Voyles等，2009）。
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4.2.3 显微镜下病变
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显微镜检查包括湿皮检查（脱落的碎片、涂片标本或整个皮肤）、组织学和免疫组织化学法，皮肤组织需要用苏木精-伊红进行染色。这些常规检测方法有很高的阳性预测价值。这些技术的详细方法及结果判读参见下文介绍。
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4.2.4 湿片法
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可检测从蹼或其他部位取下的皮肤样本。这项技术能够保持皮肤解剖学特征，并可检测大面积皮肤。该技术的优点在于可定向检查样本，确定可疑病原的位置，从而有助于鉴定。例如，该方法可确定疑似病原真菌是否在表皮细胞，并由此证明是否为箭毒蛙壶菌，或确定其是否位于更深层，由此体现出两栖类的正常外部形态。此项技术成本低且快速，由经验丰富的检测人员操作时，其敏感性与苏木精-伊红染色法相同（Longcore等，2007），对于研究无皮肤脱落的健康青蛙非常有用。
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通常在现场观察感染蝌蚪口器颜色缺失就可进行判断，可用10倍放大镜辅助观察。检测蝌蚪嘴部可将唇齿（tooth-rows）或口器切成碎片，并用盖片将其压碎，能够看到成群的孢子囊。
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在使用湿片法和涂片法（见下文）时，可看到细胞内圆形和椭圆形孢子囊群。尽管常见含孢子的孢子囊，但在脱落的皮肤里，最常见的是衰老的空壳孢子囊。排放管与孢子囊相连，孢子从此处排出，直接到达皮肤表面，呈圆圈状，难以鉴别。观察孢子囊的内部隔膜可增加诊断的准确性。表皮细胞胞核与孢子囊大小相似，但不同之处在于其膜的形状不规则且模糊不清，且外观呈灰色的扁平颗粒状。
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4.2.5 涂片法
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用光学显微镜检查皮肤碎屑或皮肤涂片可简单快速地鉴定箭毒蛙壶菌。新鲜、冷冻或固定标本均适用（Berger等，2009a）。可用解剖刀或无菌塑料勺刮下青蛙身上的脱落皮肤，涂抹在载玻片上，滴加1滴水，涂匀，盖上盖玻片，用复合光显微镜进行检测。最好能获得单层上皮细胞。先用100倍光镜找到所需区域，再换成400倍光镜对孢子囊进行形态观察。细胞内，椭圆形的孢子囊（5～13μm）成群存在，虽常见含孢子的孢子囊，但在脱落的皮肤内，衰老的空孢子囊更为常见。
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可采用以下方法对上述样本进行染色：
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（1）乳酚棉蓝：
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i）滴加1滴70%的酒精于载玻片上。
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ii）将样本在酒精中涂抹均匀。
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iii）在酒精完全挥发之前滴1～2滴乳酚棉兰。
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iv）用食指和拇指夹住盖玻片，一端先接触液体，然后缓慢放下，以防止出现气泡，随后进行检测。
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试剂（配制1L）：
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石炭酸 200.0g
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棉兰 0.5g
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丙三醇 400mL
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乳酸 200mL
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去离子水 200mL
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（2）刚果红：用新配制的刚果红溶液对皮肤碎屑或涂片染色45～60min，空孢子囊的几丁质外壳和排放管会被染成砖红色。大多数成熟、不成熟和空孢子囊都能被染色。注：用此方法不会使孢子染色，受损表皮细胞核被刚果红染成浅橘色。
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试剂：
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①储备液（饱和溶液）：
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刚果红染料 1.0g
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NaCl储备液 500mL
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（NaCl储备液：30.0g NaCl + 200mL蒸馏水）
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②工作液（刚果红）：
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刚果红储备液 50.0mL
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1% NaOH 0.5mL
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注：需采用玻璃纤维过滤，溶液要澄清，不能混浊，现用现配。
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DipQuick[6]可用于一般细胞学诊断。用染色方法诊断箭毒蛙壶菌时，除孢子和孢子囊壁被染色外，细胞质和宿主细胞核也会被染色。
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注：这些染色方法可提高鉴定的准确度，便于诊断，但尚未与其他方法进行比较。
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4.3 病原检测和鉴定方法
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4.3.1 直接检测法
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