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前言
第九章　罗非鱼加工副产物高值化利用技术
第一节　罗非鱼加工副产物中低值蛋白的高值化利用技术
一、罗非鱼鱼头蛋白质的提取及性质
1．罗非鱼鱼头蛋白质的制备及基本成分分析
分别采用上述4种方法提取，冷冻干燥制备鱼蛋白粉，对其营养成分和回收率进行分析，结果见表9-1。由表9-1可得，采用酸溶解-等电点沉淀法、碱溶解-等电点沉淀法回收鱼蛋白粉的蛋白质回收率分别为57.45%和55.59%，远高于热水提取（31.51%）和酶法水解（29.81%），由此表明，酸（碱）溶解-等电点沉淀法可以有效回收罗非鱼鱼头蛋白。加热浸提和酶法水解回收的大部分是水溶性的肌浆蛋白，且热处理过程中蛋白变性，使溶解度下降，沉淀后离心被除去，导致了鱼蛋白的回收率低；酸（碱）溶解-等电点沉淀法在极端酸（碱）条件下溶解并回收了大部分的肌原纤维蛋白和肌浆蛋白，只有一小部分结缔组织蛋白和膜结构蛋白没有被利用，故蛋白质回收率显著提高。
表9-1　罗非鱼鱼头及其蛋白粉的一般营养成分（%）
4种方法提取所得的蛋白粉样品的粗蛋白质含量为76.02%～89. 97%，其中，热提鱼蛋白和酶解鱼蛋白的蛋白质含量低于80%，脂肪和灰分含量均较高，而酸提蛋白和碱提蛋白的蛋白质含量均高于85%，且蛋白质含量差异显著（P<0.05）。酸（碱）溶解-等电点沉淀法也可以有效去除脂肪和灰分，主要原因是提取全过程在低温下进行，脂肪在低温下易凝固，高速冷冻离心并过滤可以除去绝大部分的中性脂质、膜脂和灰分，因而AFP和ALFP的纯度较高。总体分析，酸（碱）溶解-沉淀法具有较高的回收率，蛋白质含量高，能有效去除脂肪和不溶性杂质，降低蛋白的氧化。
2．罗非鱼鱼头蛋白粉的氨基酸组成分析
表9-2列出了罗非鱼鱼头及其蛋白粉的氨基酸组成，共17种氨基酸，其中9种必需氨基酸（组氨酸为婴儿必需氨基酸）。与罗非鱼鱼头原料相比，热水浸提后降低了大部分氨基酸的含量，因为加热浸提法浸出物成分复杂，其中主要是一些含氮浸出物、游离的氨基酸、小肽、肽的衍生物、嘌呤碱等。同时氨基酸在加热过程中与糖类化合物发生美拉德反应生成挥发性的风味物质，以气体的形式损失。而Pro、Gly、Ala的含量增加；酶法水解是一种温和的水解蛋白质的方法，与原料蛋白质的氨基酸组成相比，氨基酸含量有轻微下降，但较好地保持了氨基酸的完整性；原料中的氨基酸是以大分子蛋白质形式存在，而酶解物的氨基酸是以游离氨基酸分子形式和肽分子形式存在的。酸（碱）溶解-等电点沉淀法降低了Gly、Ala和Pro的含量，特别是Gly的含量大幅下降，因为提取过程中去掉了大部分胶原蛋白，而胶原蛋白中含有丰富的Gly和Pro；另外，可能因为部分甘氨酸是游离氨基酸，在蛋白质沉淀回收过程中部分被除去，酸溶蛋白和碱溶蛋白的Ile、Leu、Lys含量得到提高，其余氨基酸含量与原料基本保持一致。总体分析，4种提取方法中，加热浸提法氨基酸含量降低幅度最大，酶法水解下降程度较小，但加热浸提和酶法水解提取的必需氨基酸占总氨基酸的比例均低于40%，必需氨基酸与非必需氨基酸的比例未达到60%，未达到优质蛋白的范畴，故酸（碱）溶解-等电点沉淀法能较好地保持氨基酸的完整性，氨基酸平衡效果较好。
表9-2　罗非鱼鱼头及其蛋白粉的氨基酸组成及含量（mg/g）
表9-2　罗非鱼鱼头及其蛋白粉的氨基酸组成及含量（mg/g）（续）-1
3．罗非鱼鱼头蛋白粉的必需氨基酸评价
根据FAO/WHO/UNU 1985年提出的蛋白质模式，对罗非鱼鱼头蛋白质必需氨基酸进行评价，氨基酸评分（AAS）和化学评分（CS）见表9-3，从表中可以看出，除HFP外，TH、EFP、AFP和ALFP的AAS均大于1，符合成人对氨基酸的需求。按照婴儿模式，原料及其4种蛋白粉的第一限制性氨基酸都为色氨酸，第二限制性氨基酸组氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸+半胱氨酸。按照化学评分，除HFP两种限制性氨基酸是色氨酸和亮氨酸以外，TH、EFP、AFP和ALFP都为色氨酸和蛋氨酸+半胱氨酸。相似的是，评分最高的都是赖氨酸。比较4种蛋白的评分，TH评分高于HFP和EFP，而低于AFP和ALFP，故可认为酸（碱）溶解-等电点沉淀法提取的蛋白优于加热浸提、酶法水解提取的蛋白。
表9-3　罗非鱼头及其蛋白粉的必需氨基酸评价
表9-3　罗非鱼头及其蛋白粉的必需氨基酸评价（续）-1
4．罗非鱼鱼头蛋白粉的色差分析
罗非鱼鱼头蛋白颜色分析如表9-4所示。总体来看，4种蛋白粉的白度值都较低，主要原因是鱼头中含有较多的色素物质：肌红蛋白、血红蛋白和鱼皮黑色素等。与AFP和ALFP相比，EFP和HFP具有较高的L*值和较低的a*值和b*值，因此，酶解法和加热浸提法制得的蛋白质白度值显著高于酸（碱）溶-等电点沉淀法的（P<0. 05）。主要原因是热提蛋白和酶解蛋白时肌红蛋白和血红蛋白的变性引起，蛋白质在加热过程中肌红蛋白变性生成变性珠蛋白高铁血色原，从而变为灰白色，白度值增加。酸（碱）溶解-等电点沉淀法回收了绝大部分蛋白，色素物质也可能随着蛋白质的提取而被提取出来，AFP和ALFP的a*值较高是由残留的未变性的血红蛋白引起，另一方面，血红蛋白在极端pH环境中发生氧化，故b*值较高是由变性和氧化的血红蛋白和肌红蛋白引起，同时脂肪氧化也会使蛋白质颜色偏黄。故4种提取方法中，加热浸提和酶法水解得到的蛋白质色泽较好，而酸（碱）溶解-等电点沉淀法提取的蛋白质色泽相对较差。
表9-4　罗非鱼鱼头蛋白粉的色差
5．罗非鱼鱼头蛋白粉的溶解性分析
pH对罗非鱼鱼头蛋白粉溶解性的影响如图9-1所示。由图9-1可知，4种蛋白溶解度随pH的变化曲线呈两种不同的趋势。在试验pH范围内，热提蛋白和酶解蛋白的溶解性较好，其溶解度均高于93%，由此也进一步表明，这两种方法回收的蛋白质以水溶性成分为主，因此蛋白质回收率较低，溶解性较好。经过酸（碱）溶解-等电点沉淀法提取的蛋白质溶解度呈U形曲线，在pH 4.0～6.0内，蛋白质的溶解性最差，偏离此pH范围溶解度大大增强。由此进一步表明酸（碱）溶解-等电点沉淀提取的蛋白质包括盐溶性、水溶性和部分不溶性蛋白质组分，蛋白质回收率也较高。比较而言，ALFP的溶解性较AFP好，可能与酸性条件下蛋白质的变性和聚集程度更大有关。总体分析，热水浸提和酶法水解提取的蛋白质在pH 2.0～10.0内溶解性均较好，而酸（碱）溶解-等电点沉淀法提取的蛋白质在接近等电点pH时溶解性较差，偏离等电点范围蛋白质溶解度增强，由此推断，ALFP和AFP的等电点很可能在pH 4.0～6.0内。
图9-1　pH对罗非鱼鱼头蛋白粉溶解性的影响
6．罗非鱼鱼头蛋白粉的乳化性分析
pH对罗非鱼蛋白质乳化活性和乳化稳定性的影响如图9-2所示。
图9-2　pH对罗非鱼鱼头蛋白粉乳化性的影响
①在试验范围内，EAI和ESI值随pH的变化趋势相同，呈现先下降后上升，在pH 4.0～6.0内，蛋白质的乳化活性和乳化稳定性最差。而当pH偏离等电点范围时，蛋白质溶解度提高，蛋白质迅速扩散并在表面吸收。乳化性能随之增加。在等电点pH附近，溶解性最差，蛋白质在油-水界面上的吸附也最少，导致乳化活性和乳化稳定性最差。
②4种方法提取的蛋白质比较，AFP和ALFP的蛋白质乳化性显著高于HFP和EFP，原因是酸（碱）溶解-等电点沉淀法提取的组分主要有肌浆蛋白和肌原纤维蛋白，肌原纤维蛋白的两亲性可以有效降低油-水界面的张力，且在提取过程中降解的蛋白质暴露了疏水基团，大分子蛋白和疏水基团越多，体系的乳化性越好。加热浸提和酶法水解蛋白质的大分子降解为小分子，故体系的乳化性能相对较差。
③碱溶蛋白质的乳化性较酸溶蛋白质好，也进一步表明碱溶蛋白质提取过程中的变性程度相对酸溶蛋白质要较。总体分析，酸（碱）溶解-等电点沉淀法制备的蛋白质乳化性显著高于加热浸提法和酶解法提取的蛋白质，但酸（碱）溶蛋白质在接近等电点pH时乳化性较差，偏离等电点范围蛋白质乳化性较好。
二、罗非鱼鱼排蛋白质的制备及其性质
1．提取条件对罗非鱼鱼排分离蛋白质得率的影响
图9-3所示为4种偏离等电点的pH条件下低温提取罗非鱼鱼排蛋白质的得率。由图9-3可知，在4种偏离鱼蛋白等电点的pH条件下，提取所得上清液蛋白得率均超过60%，由此表明，鱼蛋白在极端酸性（pH<2）和碱性（pH>10.5）条件下的溶解性较好。比较而言，pH 2.0条件下罗非鱼鱼排蛋白的溶解性最好，提取蛋白的得率最高，达68%左右。蛋白质的溶解性主要与蛋白质分子大小和表面电荷有关，在偏离等电点的极端酸性（pH<2）和碱性（pH>10.5）条件下，蛋白质分子表面分别带正电荷和负电荷，分子趋于解离，因此，在极端酸性和碱性pH条件下，蛋白质的溶解性较大，且蛋白质分子表面电荷数会随着pH进一步偏离而增大，因此，pH 2.0条件下蛋白质的提取率比pH 3.0时的提取率高。
图9-3　不同pH条件下提取鱼排蛋白质的得率
在不同pH条件下提取可溶性蛋白质，分别在pH5.5条件下沉淀，图9-4所示为沉淀过程的蛋白质得率。由图9-4可知，在pH 2.0、pH 3.0和pH 12.0条件下提取的蛋白液在相同的沉淀条件下，沉淀蛋白质的得率差别不大，均为85%左右，而当提取pH条件为13.0时，沉淀蛋白质的得率最高，超过95%，这种差别很可能与酸（碱）提取过程中蛋白质分子结构的变化有关，推测很可能在pH 13.0条件下，蛋白质分子变性比较明显，更易沉淀。
图9-4　不同pH条件下提取可溶性蛋白质的得率
整个酸碱法回收蛋白质的得率如图9-5所示。由图9-5可知，酸碱转换法提取罗非鱼下脚料蛋白质得率在52%以上。总的趋势是，在极端酸性条件下，提取蛋白得率较碱性提取条件下蛋白质得率高。与酸碱法提取罗非鱼白肉蛋白质的得率（56%～68%）要低，很可能与罗非鱼鱼排中脂肪及杂质含量高有关。
图9-5　酸碱转换法提取罗非鱼鱼排蛋白质的得率
2．罗非鱼鱼排蛋白质的成分分析
分别在4种pH条件下提取罗非鱼鱼排蛋白质，然后在pH 5.5条件下沉淀，经冷冻干燥得到淡黄色的罗非鱼鱼排蛋白粉，具有淡淡的鱼香味，首先对其一般营养成分进行分析，结果见表9-5。由表9-5可知，在分离蛋白粉中粗蛋白质的含量均高于85%（干基），碱性条件下蛋白质含量要比酸性条件下高，pH 13.0条件下提取的蛋白质含量最高，接近90%。低温提取制备分离蛋白的过程中，经过酸（碱）溶解-等电点沉淀可以有效除去油脂；各组蛋白样品的灰分含量均低于4.5%，由此表明酸（碱）提取和等电点沉淀过程可以有效除去罗非鱼下脚料中含有Ca、K等的盐类及其他不溶性杂质，碱性提取条件下灰分含量明显比酸性条件下提取的灰分含量低。比较而言，不同pH条件下提取所得的分离蛋白质中粗蛋白质的含量也有差别，在pH 2.0和pH 13.0条件下提取所制备的样品蛋白质含量较高，由此进一步表明，在极端酸性和碱性pH条件下，蛋白质分子表面经电荷增加，蛋白质的溶解性增强，提取率增加，提取所得蛋白质的纯度也因此提高。
表9-5　罗非鱼鱼排蛋白粉的一般营养成分
3．鱼排分离蛋白质的溶解性
罗非鱼鱼排分离蛋白质的溶解性随pH的变化见图9-6。pH对蛋白溶解性的影响比较明显，且各样品的溶解度随pH的变化趋势基本相同，在pH 6.0左右，蛋白粉的溶解性最低，在pH 2.0和10.0时，溶解性较高。
图9-6　pH对罗非鱼鱼排蛋白质溶解性的影响
不同pH条件下提取的分离蛋白的溶解性各不相同，比较而言，pH 12.0条件下提取制得的分离蛋白粉溶解性最好，而pH 2.0条件下提取制得的分离蛋白粉溶解性较差，分析可能在酸性提取条件下蛋白质的变性和聚集比较明显，蛋白质的溶解性随之下降。
蛋白质的溶解性受pH的影响较大。当pH高于或低于等电点时，蛋白质带负电荷或正电荷，水分子能同这些电荷相互作用并起稳定作用，从而增加了蛋白质的溶解性；当pH接近等电点时，蛋白质分子同水的作用比较弱，使得肽键能相互靠拢，有时能形成聚集体而导致蛋白质沉淀，所以，鱼排分离蛋白质的等电点可能在pH 4.0～6.0。
4．分离蛋白质的乳化性
pH对罗非鱼鱼排分离蛋白质乳化活性的影响见图9-7。pH对分离蛋白质乳化活性的影响比较明显，且乳化活性随pH的变化趋势基本相同，在pH 4.0～6.0范围内，蛋白粉的乳化活性最低，而在偏酸和偏碱的条件下，样品的乳化性较好。不同pH条件下提取的分离蛋白质的乳化活性各不相同，比较而言，pH 12.0条件下提取制得的分离蛋白质乳化活性最好，而pH 2.0条件下提取制得的分离蛋白质乳化活较差。这是由于蛋白质分子表面的结构和带电荷性决定的。
图9-7　pH对罗非鱼鱼排分离蛋白质乳化活性的影响
蛋白质的乳化性与溶解性密切相关。在pH偏离蛋白质等电点的酸性和碱性条件下，蛋白的溶解性较好，其乳化活性也随之增大，由此也可进一步推测罗非鱼鱼排分离蛋白质的等电点很可能在pH 4.0～6.0范围内。
5．分离蛋白质的SDS-PAGE分析
图9-8所示为罗非鱼鱼排分离蛋白质的SDS-PAGE电泳图谱。在不同条件下提取制备的罗非鱼鱼排分离蛋白质的相对分子质量分布基本类似，都是连续分布，表明体系组分复杂，其相对分子质量范围在14300～200000，且在相对分子质量200000、44300和14300均出现比较明显的蛋白条带。肌原纤维蛋白由肌球蛋白重链（MHC）、轻链、肌动蛋白和α-辅肌动蛋白等构成，在图9-8中200000处为肌球蛋白重链，而在44300附近处则为肌动蛋白，符合典型的鱼蛋白电泳图谱，且小分子分布在14300处，属于水溶性肌浆蛋白。此外，碱性条件下提取的蛋白质与酸性条件下提取的蛋白质相比，其电泳图谱在44300～66400处明显不同。因此，推测在44300～66400处酸提蛋白质比碱提蛋白质少一条带是由于在酸提法过程中这一小部分蛋白质被水解。
图9-8　罗非鱼鱼排分离蛋白质的SDS-PAGE电泳图谱
三、罗非鱼加工副产物制备类蛋白的工艺技术
1．底物水解度对合成类蛋白产率的影响
在底物浓度40%、加酶量3%、pH 5.0的条件下反应24h，试验底物水解度对合成类蛋白产率的影响，结果见图9-9。随着底物水解度的增加，合成类蛋白产率增大，类蛋白反应明显增强；当水解度低于10%时，类蛋白产率为负值，表明没有发生合成反应，甚至出现了微弱的水解；当水解度在20%～40%时，合成类蛋白产率随水解度的增加而增得比较明显，当水解度为40%时，类蛋白产率达6.97%。另外，在试验条件下，Alcalase蛋白酶酶解罗非鱼加工副产物的过程中，水解度达到40%左右后随水解时间的延长，水解进程非常缓慢，综合考虑水解进程和类蛋白产率，选定水解度为40%的罗非鱼加工副产物水解蛋白作为制备类蛋白的底物。
图9-9　底物水解度对类蛋白产率的影响
2．加酶量对制备类蛋白产率的影响
在底物水解度40%、底物浓度40%、pH 5.0的条件下反应24h，试验加酶量对类蛋白产率的影响，结果见图9-10。由图9-10可知，加酶量对类蛋白反应的影响非常明显。当加酶量在1%～4%，随着加酶量的增加，类蛋白产率增大；但当加酶量超过4%时，类蛋白产率有所下降。由此进一步表明，反应过程中水解和合成同步进行，因此，确定进一步试验的加酶量范围为3%～5%。
图9-10　加酶量对类蛋白产率的影响
3．底物浓度对类蛋白产率的影响
在底物水解度40%、加酶量4%、pH 5.0条件下反应时间24h，试验底物浓度对类蛋白产率的影响。由图9-11可知，在试验范围内，当底物浓度从10%上升到40%时，类蛋白产率也迅速增加。当底物浓度为40%时，制备类蛋白产率最高，达10.03%，此后，随着底物浓度的升高，类蛋白的产率反而下降，由此确定进一步试验的底物浓度范围为30%～50%。
图9-11　底物浓度对类蛋白产率的影响
4. pH对类蛋白产率的影响
在水解度40%、底物浓度40%、加酶量4%条件下反应24h，试验pH对制备类蛋白产率的影响，其结果见图9-12。在pH 2.0左右，类蛋白产率为负值，由此表明，在胃蛋白酶水解反应的最适pH附近，出现了轻微的水解；而在pH 5.0左右，即偏离胃蛋白酶最适水解条件的pH范围内，类蛋白产率较高，由此确定进一步试验的pH范围为4.0～6.0。
图9-12　pH对类蛋白产率的影响
5．反应时间对类蛋白产率的影响
在水解度40%、底物浓度40%、加酶量4%、pH 5.0时试验反应时间对类蛋白产率的影响。由图9-13可知，随着反应时间的延长，类蛋白产率增加，在试验范围内，反应24h后类蛋白的产率达到最大值10.11%，此后随着时间的延长，类蛋白产率增加不明显，进一步保温到36h，类蛋白产率开始降低。因此，选定进一步试验的反应时间为24h。
图9-13　反应时间对类蛋白产率的影响
6．响应面试验设计、分析及工艺优化
综合水解度、底物浓度、加酶量、pH和反应时间对类蛋白产率的影响，确定水解度为40%、反应温度37℃、反应时间24h，选取底物浓度（20%～40%）、加酶量（3%～5%）、pH（4.0～6.0）3个因素进行响应面试验，以合成类蛋白产率为指标，采用统计分析软件Export design 7.0中关于响应面分析的部分对试验进行设计、分析和工艺优化。
以类蛋白产率为响应值，通过RSM软件对其进行方差分析可知，模型F值为13.69，F>F0.01（9，10）=4.95，模型显著水平远小于0.05，表明二次回归模型高度显著；并且回归模型的F-检验显示，实测值与预测值的相关系数R2为0.9596，说明模型的预测值和试验值拟合较好，自变量与响应值之间线性关系显著。综合各参数，说明该试验方法可靠，各因素水平区间设计较合理，因此可用该回归模型预测类蛋白反应的产率。
回归模型各项的方差分析结果还表明，模型的一次项、二次项和交互项均具有显著性，各试验因子对响应值的影响不是简单的线形关系，且底物浓度对类蛋白合成的影响最明显；其次是加酶量和pH。各因素经回归拟合后得到二次多项回归方程如下：类蛋白产率Y=8.96+0.56A+0.39B+0.37C-0.32AB-0.40AC-0.53BC-0.59A2-0.89B2-0.86C2，分别表达了类蛋白产率与底物浓度、加酶量和pH之间的变化规律。
根据回归分析结果，在3个因素中固定一个变量（取0水平，即加酶量3%，底物浓度40%，pH 5.0）进行降维分析，做出相应的三维响应曲面图和二维等高线图（图9-14～图9-16）。由图中可知，三维响应曲面图均呈抛物面开口向下的圆顶丘状，随着响应值的增加而形成一个顶点，表明回归方程在所选水平范围内存在极大值。而二维等高线图都呈椭圆型，表明底物浓度、加酶量和pH两两之间的交互作用显著，这与方差分析的结果一致。且当加酶量、底物浓度和pH趋近0水平时，类蛋白产率越高。
图9-14　加酶量、底物浓度及其交互作用对合成类蛋白产率影响的响应面
图9-15　pH、底物浓度及其交互作用对类蛋白产率影响的响应面
图9-16　pH、加酶量及其交互作用对类蛋白产率影响的响应面
为了确定最佳反应条件，对响应面试验结果利用RSM软件进一步进行优化，在试验因素水平范围内，以类蛋白产率最高为指标，得出底物浓度、加酶量和pH 3个因素的最佳组合为：底物浓度31.76%、酶添加量2.92%、pH 4.95，相应的响应面二次模型预测类蛋白产率极大值为8.99%。进一步对优化组合条件下的类蛋白合成反应进行5次重复试验，类蛋白产率为（8.96±0.11）%。最后，通过Origin 7.0软件进行单样本t-检验分析，实际值与预测值的标准误差为1.32%，低于5%；自由度为4，P值为0.10104，与模型预测值无显著差异，表明试验优化的工艺参数可行。
综上研究，得到罗非鱼加工副产物制备类蛋白的工艺技术为：先用Alcalase蛋白酶酶解罗非鱼加工副产物，当水解度达到40%左右，以其作为底物，加入胃蛋白酶，酶添加量2.92%，底物浓度31.76%，pH 4.95，反应温度37℃，反应时间24h，获得类蛋白的产率为8.96%。通过SDS尿素PAGE和HPLC分析表明，合成类蛋白的蛋白相对分子质量增大，小分子多肽和氨基酸发生了缩合反应生成了分子量较大的类蛋白，是一种无风味的特殊蛋白质，拓展了其进一步开发利用。
四、罗非鱼鱼肉蛋白质酶解物的制备及其抗氧化活性
1．罗非鱼蛋白酶解物抗氧化活性的常用评价方法
目前评定水产蛋白酶解物的抗氧化活性一般是通过评定其自由基清除能力、还原力、抑制脂质过氧化能力、金属离子螯合能力等指标来进行综合考察的。
①自由基的清除能力。人体的衰老都是因为机体不能够及时完全清除自由基，例如，超氧阴离子（O-2·）、过氧化氢（H2O2）、羟基自由基（·OH）等，这些自由基具有极不稳定性和较高的反应性。因此，一种高抗氧化能力的生物活性肽需要具备高效清除上述自由基的能力。
②还原力也是评价一种物质抗氧化能力的一个重要指标，当加入抗氧化物质时，铁氰化钾的Fe3+被还原为Fe2+，Fe2+带有浅绿在700nm处有强的吸收值，吸光度值的大小反映了Fe2+的浓度，因此，吸光值越高表明其抗氧化活性越好。
③抑制脂质过氧化能力。食品中的不饱和脂肪酸由于很容易氧化生成过氧化脂质，再通过一系列的分解、聚合反应会产生腐败甚至毒性物质。脂肪的氧化也会导致癌症的发生以及衰老。目前检测抗氧化剂的材料一般采用亚油酸。亚油酸通过吸收空气中的氧进行自动氧化反应，产生脂肪酸氢过氧化物。加入抗氧化剂后，水油混合体系中的氢过氧化物的含量与空白中的过氧化物质做比较，进而评估抑制脂类自氧化的效果。
④金属离子螯合能力也用来评定其抗氧化指标，由于过渡态金属离子如Fe2+、Cu2+和Zn2+能催化不饱和脂质氧化过程中自由基的形成。当抗氧化活性肽存在时，其能够为过渡金属离子提供孤对电子并通过形成配位键与之共价结合，因此，也可作为评价抗氧化能力的一个指标。
2．罗非鱼鱼肉蛋白水解酶的筛选
（1）水解罗非鱼鱼肉制备抗氧化肽的蛋白酶
胰蛋白酶、复合蛋白酶、风味蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶是酶解鱼肉蛋白质的常用商业蛋白酶制剂，罗非鱼胃蛋白酶和肠蛋白酶为从罗非鱼胃、肠中提取得到的内源性蛋白酶。各种酶活力均按照国标SB/T 10317－1999测定出来，加酶量是按照各自实际酶活力进行添加。由表9-6可知，提取获得的罗非鱼胃蛋白酶、肠蛋白酶具有较好的活性，与一些商业蛋白酶活性相比相差不大。
表9-6　蛋白酶的酶活力及试验条件
（2）水解度和蛋白利用率的比较
由图9-17可知，对外源酶而言，木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、风味蛋白酶水解罗非鱼鱼肉蛋白后的蛋白质回收率相对较高，其值分别为79.65%、77.2%、76.8%，而复合蛋白酶与菠萝蛋白酶相对较低。对内源酶而言，罗非鱼胃蛋白酶水解罗非鱼鱼肉蛋白后的蛋白质回收率比肠蛋白酶要好，其值分别为65.11%、59.76%。
图9-17　罗非鱼鱼肉蛋白质经不同酶水解后的蛋白质回收率比较
水解度可反映酶水解底物蛋白的效果。由图9-18可知，与其他酶相比，木瓜蛋白酶和风味蛋白酶水解罗非鱼鱼肉蛋白质的效果较好，其中罗非鱼木瓜蛋白酶酶解物的水解度为20.85%，略高于风味蛋白酶（20.6%）；对内源酶而言，罗非鱼胃蛋白酶的水解效果比肠蛋白酶的水解效果好，其水解度分别为17.03%、15.52%。从底物蛋白质的水解程度来讲，木瓜蛋白酶是较为适合的酶类。
图9-18　不同蛋白酶的水解度比较
（3）酶解物清除DPPH自由基的活性比较
抗氧化物质与自由基反应不仅能够终止自由基的氧化反应，而且还能产生稳定的化学物质。DPPH是一种很稳定的以氮为中心的自由基，如一种物质能够清除DPPH自由基则可以推断该物质具有降低羟基自由基、烷基自由基或过氧自由基的能力。DPPH自由基在可见光区的最大吸收峰波长为517nm，其遇到能够提供质子的物质就会被清除，吸光值也随着下降。不同蛋白酶酶解产物清除DPPH自由基能力见图9-19。
图9-19　不同蛋白酶酶解产物清除DPPH自由基能力的比较
由图9-19可知，木瓜蛋白酶酶解物的DPPH自由基清除率最好，其清除率为75.74%；其次是胃蛋白酶酶解物与胰蛋白酶酶解物，其值分别为73.61%、71.53%。罗非鱼鱼肉蛋白质虽经风味蛋白酶水解后具有较高的蛋白质回收率与水解度，但其产物的DPPH自由基清除率较低，其值为59.87%，这可能是风味蛋白酶易将罗非鱼鱼肉蛋白质水解成游离的氨基酸，从而影响了产物的抗氧化活性。
内源酶方面，罗非鱼胃蛋白酶和肠蛋白酶酶解产物对DPPH自由基的清除率分别为73.61%、52.45%，其中罗非鱼胃蛋白酶的酶解产物的DPPH自由基清除率略低于木瓜蛋白酶。
（4）酶解物清除羟基自由基（·OH）活性的比较
机体一旦出现应激或疾病时，氧自由基就会过量产生，从而对人体造成危害。羟基自由基是目前所知活性氧中对生物体毒性与危害最大的一种自由基，它容易与体内的氨基酸、蛋白质以及DNA等生物分子发生反应，易导致疾病的发生。提供氢质子的物质能够与羟基自由基发生反应，生成稳定的化合物，并终止自身的氧化性。如图9-20所示，胰蛋白酶的酶解产物清除羟基自由基的能力较好，清除率为59.56%；木瓜蛋白酶酶解物对羟基自由基的清除率略微低于胰蛋白酶酶解物，其清除率为57.03%；风味蛋白酶酶解物对羟基的清除率在外源酶酶解物中最低，为43.86%；内源酶酶解物中，罗非鱼胃蛋白酶的酶解物清除羟基自由基的能力比外源酶的酶解物高，其清除率为60.51%，且明显高于罗非鱼肠蛋白酶的酶解物（40.27%）。因此，罗非鱼胃蛋白酶是酶解罗非鱼鱼肉蛋白质获得具有强清除羟基自由基能力酶解物的较适酶源。
图9-20　不同蛋白酶酶解产物清除羟基自由基能力的比较
（5）酶解物清除超氧阴离子（O-2·）效果的比较
超氧阴离子是其他氧自由基的起源，因此，清除体内超氧阴离子是防止机体快速衰老的重要途径。由图9-21可知，木瓜蛋白酶酶解物清除超氧阴离子能力最好，其清除率为34.35%；胰蛋白酶和风味蛋白酶酶解物的超氧阴离子清除率略微低于木瓜蛋白酶酶解物的清除率，分别为32.06%、31.73% 。外源酶中，菠萝蛋白酶酶解产物的清除能力最差，清除率为26.58%；内源酶中，罗非鱼肠蛋白酶酶解物的超氧阴离子自由基清除率最低，为26.23%。
图9-21　不同蛋白酶酶解产物清除超氧阴离子自由基能力的比较
（6）酶解物还原力效果的比较
还原力大小能够反映出抗氧化剂供电子能力的强弱。酶解产物中的抗氧化物质能够提供电子将铁氰化钾中Fe3+还原成Fe2+，Fe2+在700nm下有最大的吸光值。因此，吸光值较大的样品，还原能力较好，具有较高的抗氧化性。由图9-22可知，木瓜蛋白酶酶解物与罗非鱼胃蛋白酶酶解物的还原力最好，其吸光值分别为0.628、0.653；菠萝蛋白酶酶解物与罗非鱼肠蛋白酶酶解物的还原力较差，其吸光值分别为0.489、0.524，抗氧化性能较低。同时也发现，酶解物清除DPPH自由基能力与还原力的结果相一致。
图9-22　不同蛋白酶酶解产物还原力的比较
通过对比罗非鱼鱼肉蛋白质经不同酶水解后其蛋白质回收率与水解度指标发现，木瓜蛋白酶酶解物的蛋白质回收率为79.65%、水解度为20.85%，均高于其他蛋白酶酶解物，是水解罗非鱼鱼肉蛋白质效果最好的酶，这可能与木瓜蛋白酶作用位点具有广泛特异性有关。
对不同酶解物的自由基清除率及还原力进行对比发现，7种酶的酶解产物皆显示了一定的抗氧化性。其中木瓜蛋白酶酶解产物清除DPPH自由基、超氧阴离子能力均高于其他蛋白酶酶解物；罗非鱼胃蛋白酶酶解物对羟基自由基的清除率及其还原力较好。因此，木瓜蛋白酶酶解物与罗非鱼胃蛋白酶酶解物相对具有较好的抗氧化活性。从酶的水解效果、罗非鱼鱼肉蛋白质回收率以及酶解物的抗氧化活性方面予以综合考虑，选用木瓜蛋白酶水解罗非鱼鱼肉蛋白质较为适宜。
3．水解度对罗非鱼酶解物抗氧化活性的影响
（1）罗非鱼鱼肉蛋白质水解度的变化
由图9-23可知，随着酶解时间的增加，罗非鱼鱼肉蛋白质的水解度逐渐升高，其水解度由14.2%（1h）快速升至27.1%（6h），而当继续延长酶解时间至8h时，水解度缓慢增至29.3%。这一先快后缓的变化趋势与蛋白酶在水解豆类蛋白与乳蛋白时的水解度的变化趋势相一致。
图9-23　罗非鱼鱼肉蛋白质水解度的变化
（2）水解度对酶解物清除DPPH自由基能力的影响
从图9-24中可以看出，当水解度从14.2%（1h）增加到22.3%（4h）时，酶解物的DPPH自由基半清除率IC50由7.1mg/mL降至4.8mg/mL，表明其清除DPPH自由基能力提高。而当水解度继续增大时，其清除DPPH自由基能力反而有所下降。这可能是由于水解程度低不利于从罗非鱼鱼肉蛋白质将抗氧化活性肽段释放出来，而水解程度过高会使抗氧化活性肽段继续降解成游离氨基酸而导致活性下降。
图9-24　水解度对酶解物清除DPPH自由基能力的影响
（3）水解度对酶解物在亚油酸体系中抑制脂质氧化能力的影响
罗非鱼鱼肉蛋白质经木瓜蛋白酶酶解后的产物在亚油酸体系中抑制脂质氧化的能力如图9-25所示。
图9-25　水解度对酶解物在亚油酸体系中抑制脂质氧化能力的影响
从图9-25中可知，添加罗非鱼酶解物的亚油酸体系在7d内均发生了不同程度的氧化（吸光值逐渐升高），但4h酶解物对抑制亚油酸氧化的效果比其他酶解物要好，6h酶解物与8h酶解物的抑制效果次之，1h酶解物与2h酶解物抑制效果较差，这可能与不同水解度的酶解产物在分子量及氨基酸组成上存在差异性有关。结果表明，水解度与酶解物在油脂中的抗氧化效果存在相关性。
综上所述，罗非鱼鱼肉蛋白质水解产物的抗氧化活性与水解度密切相关。当水解度增加至22.3%时，酶解物具有较好的清除DPPH自由基与抑制脂质过氧化的能力，过低或过高的水解度均会导致酶解物抗氧化活性的下降。
4．罗非鱼鱼肉组分蛋白酶解物的抗氧化特性
（1）不同组分蛋白酶解物的蛋白质回收率和水解度
提取罗非鱼鱼肉3种组分蛋白（基质蛋白、肌浆蛋白、肌原纤维蛋白），经酶解后得到酶解物的蛋白质回收率。其中基质蛋白酶解物的蛋白质回收率最高，为89.8%，肌原纤维蛋白次之，为68.2%，肌浆蛋白最低，为40.1%。从蛋白质的角度来看，基质蛋白组分在酶解中对蛋白质回收率的影响最大。
图9-26　不同组分蛋白质回收率比较
从图9-27可以看出，3种分离的组分蛋白中，肌原纤维蛋白酶解物的水解度最高，为10.1%，基质蛋白酶解物的水解度为8.3%，肌浆蛋白水解度最低，为4.7%。组分蛋白的水解度偏低可能与蛋白分离提取时使用的盐提取、酸沉淀导致蛋白结构改变、部分变性有关；从水解度的角度来看，肌原纤维蛋白组分在酶解中对水解度的影响最大。
图9-27　不同组分蛋白的水解度比较
（2）不同组分蛋白酶解物羟基自由基的IC50
由图9-28可知，3种组分蛋白中，肌浆蛋白酶解物清除羟基自由基的能力最强，IC50为12.352mg/mL，其次为基质蛋白酶解物，IC50为14.986mg/mL，肌原纤维蛋白酶解物清除羟自由基的效果最差，IC50为16.626mg/mL；这可能是由于肌原纤维蛋白分子比肌浆蛋白分子大，所以较肌浆蛋白组分来说比较难以深度酶解，基质蛋白中的胶原蛋白分子有3条相互缠绕的多肽链，结构十分稳定也较难被酶解；由图9-28中可以判断出，酶解罗非鱼鱼肉蛋白质时，肌浆蛋白组分是完整鱼肉蛋白质中清除羟基自由基最好的组分。
图9-28　不同组分蛋白酶解物清除羟基自由基能力的比较
（3）不同蛋白组分酶解物DPPH自由基的IC50
对比各种不同蛋白组分酶解物DPPH自由基的IC50可以看出，肌浆蛋白组分清除DPPH自由基的能力最强，IC50为3.554mg/mL，远低于基质蛋白、肌原纤维蛋白酶解物的IC50；可以得知，罗非鱼肉蛋白在中性蛋白酶酶解4h时，完整鱼肉蛋白中清除DPPH自由基最好的组分是肌浆蛋白组分。
由以上可知，在罗非鱼3种组分蛋白中，基质蛋白的蛋白质回收率最高，为89.8%，肌原纤维蛋白的水解度最高，为10.1%，肌浆蛋白清除羟基自由基和DPPH自由基的能力最好，IC50分别为12.352mg/mL、3.554mg/mL；可以得出在酶解罗非鱼鱼肉蛋白质过程中，对蛋白质回收率、水解度、清除羟基自由基和DPPH自由基能力影响最大的组分依次为基质蛋白、肌原纤维蛋白、肌浆蛋白。
图9-29　不同组分蛋白酶解物清除DPPH自由基能力的比较
五、罗非鱼肽-矿物离子螯合物的制备技术、抗氧化活性及结构特征
1．罗非鱼肽-矿物离子螯合物的制备技术
肽-矿物离子螯合物一种具有环状结构的有机化合物，它是由矿物离子按一定的摩尔比以共价键同肽类结合而成的。影响矿物离子与肽进行螯合反应的因素有物料的质量比、pH、温度和反应时间等，不同的螯合工艺所得的螯合产物的螯合率和理化性质有所差异。矿物离子螯合肽的制备工艺目前已相对成熟，一般制备流程是以一些天然动植物蛋白为原料，用酶解法获取蛋白肽，然后选取人体必需的微量元素等以一定的质量比与蛋白肽在一定的温度和pH条件下水浴进行螯合反应制备螯合物。
在罗非鱼肽-矿物离子螯合物的制备方面，将罗非鱼酶解物溶解后配成溶液（pH 7.2），然后按照酶解物与矿物盐（CaCl2、FeCl2、CuCl2）的质量比为5∶1、10∶1、20∶1的条件下进行螯合（温度为37 ℃，时间为40min），反应结束后，将混合物置于透析袋中（截留相对分子质量为100）进行透析，去除掉游离态的矿物离子，然后将透析液冻干后分别制备得到矿物离子螯合物I、螯合物II和螯合物III。
2．罗非鱼酶解物对矿物离子（Ca2+、Fe2+、Cu2+）的螯合能力
矿物离子螯合率见图9-30。由图9-30可知，随着酶解物与矿物盐质量比的升高（5∶1至20∶1），Ca2+、Fe2+、Cu2+的螯合率均有不同程度的提高，从而表明增加配体数量有利于其与受体及中心离子的结合。从图9-30还可看出，在酶解物与矿物盐质量比为5∶1的条件下，酶解物螯合铜离子的螯合率最高，为59.7%，亚铁离子螯合率最低，为44.8%，同时结合酶解物与矿物盐质量比提高时螯合率的变化趋势可知，罗非鱼酶解物对不同矿物离子的螯合能力存在一定的差异性，其大小依次为：铜离子>钙离子>亚铁离子。蛋白酶解物具有较好的螯合矿物离子的活性也被其他相关文献所报道。
图9-30　罗非鱼酶解物螯合矿物离子的能力
3．矿物离子螯合物的抗氧化活性
（1）螯合物清除DPPH自由基能力分析
从图9-31可知，相比亚铁离子螯合物与铜离子螯合物，钙离子螯合物Ⅰ（5∶1）、螯合物Ⅱ（10∶1）、螯合物Ⅲ（20∶1）清除DPPH自由基的能力相对较好，其次为亚铁离子螯合物与铜离子螯合物。与罗非鱼酶解物清除DPPH自由基的能力相比，钙离子螯合物Ⅱ（10∶1）、螯合物Ⅲ（20∶1）以及铜离子螯合物Ⅲ（20∶1）在DPPH自由基清除率上不存在显著性差异（P> 0.05）。而铜离子螯合物在DPPH自由基清除能力上均低于罗非鱼酶解物。相关研究发现，含有某种特定氨基酸的多肽具有显著的抗氧化能力，如甘氨酸、脯氨酸、赖氨酸、谷氨酰胺、组氨酸、亮氨酸、酪氨酸等。当多肽中的这些氨基酸的键与矿物离子发生反应后，就减少了氨基酸接受自由基的能力，即减小了抗氧化肽的抗氧化能力，因此，需控制矿物离子的添加量。研究结果表明，不同离子螯合物在DPPH自由基清除能力上存在较大的差异性，同时通过采用合适的螯合条件可使螯合物获得较好的DPPH自由基清除能力。
图9-31　矿物离子螯合物清除DPPH自由基的能力
（2）还原力分析
矿物离子螯合物的还原力见图9-32。从图9-32中可以看出，钙离子螯合物的还原力明显高于亚铁离子螯合物与铜离子螯合物，且增加配体含量后获得的钙离子螯合物（Ⅱ、Ⅲ）其还原力高于酶解物，而亚铁离子螯合物与铜离子螯合物的还原力则明显低于罗非鱼酶解物。这可能是螯合钙离子后使得肽空间结构发生了有利的改变，更易将Fe3+转变为Fe2+。
图9-32　矿物离子螯合物的还原力
（3）脂质过氧化抑制率分析
为了进一步评价矿物离子螯合物的抗氧化性，对产物在亚油酸体系中的抑制脂质氧化能力进行了研究。不同螯合物的脂质过氧化抑制率见图9-33。由图9-33可知，钙离子螯合物与铜离子螯合物的脂质过氧化抑制能力明显高于亚铁离子螯合物。酶解物螯合钙离子、铜离子后其脂质过氧化抑制能力较大幅度提高。螯合物抑制脂质过氧化的能力高于酶解物的现象，国内学者在研究其他鱼类蛋白酶解物-矿物离子螯合物的活性时也有类似报道，这可能是抗氧化肽中的疏水性肽能够通过增加抗氧化肽在油脂里面的溶解能力提高其对脂质的抑制率，矿物离子螯合物抑制脂质氧化的能力高于未螯合的酶解物可能是增加了酶解物中疏水性多肽的暴露程度。
图9-33　矿物离子螯合物抑制脂质过氧化的能力
4．螯合物的微观结构
罗非鱼酶解物螯合矿物离子前后其微观结构的变化见图9-34。由图9-34可知，罗非鱼酶解物［图9-34（A）］呈形状不规则的小块状，小碎块结构较多，这可能是罗非鱼鱼肉蛋白质经酶解作用后形成小分子肽所致。当罗非鱼酶解物分别与钙离子、亚铁离子、铜离子螯合后，其螯合物［图9-34（B～D）］的微观结构发生了明显的变化，
图9-34　罗非鱼酶解物与矿物离子螯合物的电镜扫描图
原先存在于酶解物中的小碎块结构消失了，呈现的是大块状结构，同时在大块状结构中可明显看到有白色的小斑点镶入其中，由此可以推知，罗非鱼酶解物与矿物离子通过配位键进行了结合，螯合后其相对分子质量有所增大，形成了图9-34中所示的大块状结构。
5．罗非鱼酶解物与矿物离子螯合物的红外光谱分析
罗非鱼酶解物及其矿物离子螯合物的红外光谱见图9-35。对罗非鱼酶解物而言，位于1650cm-1与1554cm-1的吸收峰可归结为酰胺Ⅰ带（C=O）和酰胺Ⅱ带（N-H与C-N）的振动。当酶解物螯合钙离子、亚铁离子、铜离子后，酰胺Ⅰ带的吸收峰从1650cm-1分别移至1653cm-1、1652cm-1、1653cm-1，这可能是由肽链上的羰基（C=O）伸缩振动所引起。同时从图9-35中可知，当酶解物螯合钙离子、亚铁离子、铜离子后，位于3290cm-1的吸收峰分别移动至3279cm-1、3288cm-1、3295cm-1，这是由N-H的伸缩所引起，引起伸缩的原因可能是N-H被Ca-N、Fe-N、Cu-N所取代。此外，螯合后，位于1395cm-1吸收峰（与COO-相关）分别移动至1403cm-1、1390cm-1、1398cm-1。以上变化可表明，罗非鱼酶解物是通过羧基氧原子和氨基氮原子与钙离子、亚铁离子、铜离子进行结合，从而生成矿物离子螯合物。红外光谱的类似变化也在乳蛋白酶解物螯合铁离子时被报道。
图9-35　罗非鱼酶解物与矿物离子螯合物的红外光谱扫描
综上所述，罗非鱼肉蛋白酶解产物具有较好的螯合矿物离子钙离子、亚铁离子、铜离子的能力，但在其螯合能力上存在较大的差异性，按螯合能力的大小依次为：铜离子>钙离子>亚铁离子。
罗非鱼酶解物螯合钙离子、亚铁离子、铜离子后其产物的抗氧化活性存在较大的差异性，综合DPPH自由基清除率、还原力、脂质过氧化抑制率来予以评价，罗非鱼酶解物-钙离子螯合物具有较好的抗氧化活性。
通过电镜扫描与红外光谱分析，罗非鱼酶解物螯合钙离子、亚铁离子、铜离子后其微观结构均发生明显的变化，有大块状结构形成；罗非鱼酶解物螯合钙离子、亚铁离子、铜离子的活性位点可能是氨基氮原子与羧基氧原子。
六、罗非鱼加工副产物制备调味基料的技术
1．不同蛋白酶对罗非鱼加工副产物的水解效果
分别选用木瓜蛋白酶碱性蛋白酶（Alcalase）、中性蛋白酶（Neutrase）、复合蛋白酶（Protamex）、风味酶（Flavourzyme）、菠萝蛋白酶对罗非鱼加工副产物进行水解，以游离氨基酸态氮含量和风味为评价指标，固液比（下脚料与去离子水质量比）为1∶1，酶的加量为2000U/g，在各种酶相应的最适作用条件下水解4h，其最适作用条件根据文献和初步试验确定，加热灭酶5min，4200r/min离心15min，取上清液分别进行氨基酸态氮含量测定和风味评价，结果见表9-7。
表9-7　几种蛋白酶对罗非鱼加工副产物的水解效果
由表9-7可知，在同样的水解时间下，菠萝蛋白酶的水解液中游离氨基酸的含量最高，效果较好；从风味来说，木瓜蛋白酶的口感最差，有难闻的木瓜与鱼腥相混合的异味，菠萝蛋白酶的口感有菠萝的清香味，伴有淡的鱼腥味，风味酶水解后风味最好。由于菠萝蛋白酶易获得，价格适中，综合以上结果认为，采用单酶水解，以菠萝蛋白酶较适宜，但水解风味需改善。
2．几种双酶复合水解效果分析
由于风味酶包含内切肽酶和外切肽酶两种活性，可以脱除低水解度底物苦味蛋白水解液的苦味。根据文献报道，该酶能改善鸡肉水解物的风味，水解液无苦味，这在单酶水解条件下也得以证实，故从改变酶解液风味和增加水解度考虑，将风味酶与其他酶混合水解，水解结果见表9-8。由菠萝蛋白酶与风味酶混合水解的效果比其他酶与风味酶混合水解的效果好，而菠萝蛋白酶先加入水解一段时间再加入风味酶继续水解，结果比这两种酶同时加入水解效果更好，所以采用先加入菠萝蛋白酶，后加入风味酶的混合酶水解效果好。
表9-8　几种双酶水解效果比较
3．双酶复合水解最适条件的确定
在确定的双酶水解条件下，在其他水解条件相同时，改变底物浓度，固液比分别以2∶1，1∶1，1∶2进行试验，测得水解液中的游离氨基酸含量分别为699mg/mL2、756mg/mL2、578mg/mL2，结果表明底物浓度以固液比1∶1效果最好。在此底物浓度下，采用正交试验L9（3）4，安排了菠萝蛋白酶与风味酶复合酶的处理方案，考察了加酶量（菠萝蛋白酶+风味酶）（A）、温度（B）、水解时间（C）和pH（D）4个因素对下脚料水解的影响，试验中，先加入菠萝蛋白酶进行水解，后加入风味酶进行水解，以水解过程产生的游离氨基氮为指标，正交试验的结果见表9-9、表9-10。
表9-9　双酶复合水解的因素水平表
表9-10　双酶复合水解正交试验结果
由表9-9和表9-10可见，加酶量是影响酶水解效果的主要因素，其次是温度、水解时间，而pH的影响最小，L9（3）4正交试验结果显示复合酶水解的最佳工艺条件是A2B2C3D3，即在水解底物的自然pH，50 ℃下，菠萝蛋白酶加入量为2250U/g，水解4h，再加入风味酶750U/g，在同样条件下继续水解2h。由于水解时间不是主要影响因素，而水解时间太短，酶解不充分，水解时间太长，影响水解液风味，综合考虑之后，总的水解时间确定为5h。我们以确定的优化条件进行重复试验，其中水解时间以菠萝蛋白酶水解3h，风味酶水解2h，结果水解液游离氨基酸态氮达到1.42%，水解度为80%，水解效果好。
4．调味液的调配试验
将浓缩酶解液与辅料（食盐、老抽酱油、白砂糖、料酒、乳化制、姜和甘草汁等）进行调配，试验显示酶解液添加量、乳化制和酱油（老抽）对产品的风味、色泽、形态影响较大，其中黄原胶与淀粉比例合适时能显著改变制品的黏稠度。对酶解液添加量（A）、淀粉（B）、酱油（老抽）（C）和黄原胶（D）4因素各先取3水平进行L9（3）4正交试验，以色泽、风味、稳定性、形态进行感官评价，得出综合评分，试验结果见表9-11。结果表明，以淀粉和黄原胶为主要因素，最佳组合水平为A2B2C3D2，即酶解液30%、淀粉6.5%、黄原胶0.2%、酱油（老抽）8%。按此比例添加产品具有鱼香味，稠度适中，不易分层，酱油（老抽）的加入可不用添加焦糖色素，产品红亮褐色。我们知道，抽提型调味料如鸡精的成本就要8元/kg，相比之下，采用罗非鱼加工废弃物为原料，价格低廉，酶水解浓缩之后，制成酶解型调味料，浓缩酶解液添加量为30%时，产品具有多层次、圆润的味道，后味甘香，而传统的味精等的化学调味料虽然味道强烈，但味道单调，不圆滑，后味较差，有的会引起口干等不适症。
表9-11　调味液主要成分L9（3）4正交试验结果
5．调味料的氨基酸分析
水产调味料的营养价值和呈风味的含氮营养物质密不可分的，例如氨基酸、肽和核苷酸等营养物质。罗非鱼加工废弃物经过酶解后，蛋白质水解为小肽和游离氨基酸，对调味料进行氨基酸分析，结果见表9-12。
表9-12　调味料氨基酸成分含量
由表9-12可知，调味料营养丰富均衡，含有18种氨基酸，种类齐全。氨基酸总量为2.73%，必需氨基酸占39.6%，氨基酸组成与FAO/WHO推荐的氨基酸组成较接近，这些氨基酸对人体有重要的营养价值。各种氨基酸中，谷氨酸含量最高，是主要的呈鲜味氨基酸，与核苷酸相辅相成，使产品鲜味更佳。另外，脯氨酸、天冬氨酸、丙氨酸、精氨酸和甘氨酸这些呈味氨基酸的含量也较高，并且含有少量牛磺酸，它们的存在使调味料呈现圆润柔和的甜味及鲜味，水产调味料的独特风味正源于此。
6．产品质量检验
感官指标检验：对成品进行感官指标检验的标准包括外观、色泽、风味等指标。组织形态均一，无沉淀及分层现象，半透明、黏稠的可流动体；亮的红褐色或棕褐色；具有浓郁海鲜风味，鲜美适口，细腻无颗粒感，无异味。
理化指标检验：按照国家酱油标准进行理化指标检验。结果表明，该海鲜酱调味料各项指标均达到国家标准（GB2717－2003） ，其中总酸及氨基酸态氮含量比国家标准更优越，结果见表9-13。
表9-13　海鲜酱理化指标
七、罗非鱼碎肉制备肉味香精工艺技术
1．组合酶解对游离氨基酸的影响
通过液相色谱对水解液的游离氨基酸进行检测分析，结果见表9-14。从表9-14可知，木瓜蛋白酶与风味蛋白酶组合的水解液氨基酸总量、含硫氨基酸、鲜味氨基酸、亲水性氨基酸以及疏水性氨基酸都明显高于其余两组。
表9-14　组合酶解蛋白水解液的游离氨基酸含量
氨基酸与还原糖的美拉德反应在香精中起到了重要的作用，它们对挥发性物质的生成有很大贡献。各单个的氨基酸与还原糖的反应产生不同的气味。目前检测到的挥发性物质包括吡嗪（煮熟的，烧烤的，烘焙谷物的气味）、烷基吡嗪（坚果的，烤的）、烷基吡啶（青草味的，涩的，苦味的）、吡咯（谷物味）、酰基吡啶（饼干味）、呋喃和呋喃酮（芳香味，烧焦味，辛辣味，焦糖味）、苯酚类（青草味，坚果味，芳香味）、噻吩（肉味）。
含硫氨基酸在美拉德反应中生成含硫化合物产生肉味，含硫氨基酸包括蛋氨酸和半胱氨酸，在美拉德反应过程中半胱氨酸非常活跃。半胱氨酸在美拉德反应过程中通过施特雷克法降解会形成硫化氢、氨和乙醛，它们又和美拉德反应过程中产生的羰基中间产物进一步反应，从而形成多种重要的风味化合物，如呋喃、吡嗪、吡咯、噻唑以及其他杂环化合物，对肉味风味具有重要贡献。风味蛋白酶与木瓜蛋白酶组合酶解得到的罗非鱼蛋白水解液的含硫氨基酸高达13.06%，是一种很好的制备肉味香精的前体物；鲜味氨基酸在调味品中起到增强鲜味的作用，它们与核苷酸共同作用构成香精的鲜味，它们在美拉德反应前后的变化很小，可能因为它们是亲水性氨基酸的缘故。
综上所述，利用风味蛋白酶与木瓜蛋白酶组合水解得到的蛋白水解液得到更多的含硫氨基酸、鲜味氨基酸以及疏水性氨基酸，所以它是一种更好的肉味香精前体。
2．组合酶解对相对分子质量分布的影响
通过液相色谱对水解液的相对分子质量分布进行检测分析，结果见表9-15。由表9-15可知，3组水解液的肽相对分子质量分布大体相似，差别不明显。它们的相对分子质量范围97%以上的肽段相对分子质量小于1000，相对分子质量在77%左右的肽段小于500，相对分子质量小于2000的占到总体的99.5%左右。通过组合酶解制备的鱼肉水解液区别于很多的畜禽水解液和植物蛋白水解液，可能是跟鱼肉本身的蛋白种类和氨基酸组成有关系。
表9-15　组合酶解水解液的相对分子质量分布情况
八、鱼露的制备工艺技术
1．罗非鱼鱼露的酶法制备技术
（1）酶解加酶量对罗非鱼蛋白酶解液多肽含量的影响
研究结果表明，酶解液中的多肽含量随着加酶量的增加而增加，但加酶量在0.5 L/g以上时，多肽含量增加的程度不明显（图9-36），这是由于酶量继续增加，导致多肽进一步水解成氨基酸，从而降低多肽含量。
图9-36　加酶量对酶解液多肽含量的影响
当风味酶添加量保持不变，改变碱性蛋白酶（E1）的添加量，且其他条件不变时，酶解液中多肽含量差异比较大。由图9-37、图9-38可知，在风味酶（E2）添加量为0.5mL/g时，酶解后所得多肽含量，随着E1添加量的增加而增加，这是由于碱性蛋白酶酶解生成的短肽含量较高且较稳定，并且碱性蛋白酶能将罗非鱼鱼肉深度水解，而风味酶对罗非鱼鱼肉的水解程度较浅。在研究中，考虑到酶解效果与生产成本之间的关系，E1、E2添加量分别为：5mL/kg、0.5g/kg（E1与E2按原酶计算）。
图9-37　碱性蛋白酶添加量对酶解液多肽含量的影响
图9-38　风味蛋白酶添加量对酶解液多肽含量的影响
（2）酶解液与鱼糜含氮成分的比较
表9-16可知，酶解液的多肽含量为18.42mg/mL，比酶解前多肽含量（2.94mg/mL）增加了6倍多，提高了酶解液的营养价值。
表9-16　酶解液与鱼糜含氮成分的比较
（3）鱼露对自由基的清除作用
分别对自制鱼露、商品鱼露对羟基自由基、超氧阴离子进行清除试验。图9-39表明，自制鱼露对自由基的清除率明显高于商品鱼露，说明自制鱼露有更好的抗氧化功能。
图9-39　2种鱼露对羟基自由基的清除效果
（4）自制鱼露与商品鱼露的感官评价及成分分析
由表9-17可见，自制鱼露跟商品鱼露比较，其风味、色泽、口感等感官基本相同。比较两者的营养价值，自制鱼露多肽含量略高，氨基酸态氮接近商品鱼露，总氮含量为商品鱼露的2.5倍，且自制鱼露食盐含量较低，咸度适中，适合消费者的口感。传统的鱼露生产工艺采用自然发酵法生产，生产周期很长，难以进行自动化连续生产，生产规模小。采用酶技术制成鱼露，生产周期大大缩短。
表9-17　2种鱼露的成分比较
2．鱼露发酵工艺技术
（1）复合酶解结果
将解冻好的下脚料浆加水、调pH、加酶进行摇床酶解。首先进行单酶水解试验，选用水解罗非鱼常用的3种酶，即胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、风味蛋白酶，以料液比、pH、酶用量、温度及时间作为因素分别进行五因素四水平的正交试验，之后在单酶水解的基础上进行复合酶解，确定最佳水解条件。
试验组合A3B2C4D3E1氨基氮含量最高达到3.220mg/mL，明显高于单酶水解的结果，而且从K值也可看出，复合酶的整体水平明显高于单酶。由于酶配比对于酶解效果影响很弱，考虑到经济因素，选取了分析最佳组合，即酶配比为1.5%胰蛋白酶+2.0%风味酶，固液比1∶2，pH 8.5，水解时间4h+4h，温度50℃。
（2）发酵过程
水解度对发酵结果的影响见图9-40。水解度3（胰蛋白酶∶风味蛋白酶为1∶2，即80min∶160min）的氨基酸态氮含量整体高于水解度1及水解度2，这可能是由于水解度1的水解度过高不利于发酵，而水解度3在水解过程中产生大量小肽段更有利于发酵造成的。总酸含量反映了其他微生物感染程度，同时总酸对于鱼露的风味形成具有一定贡献，所以总酸含量不应过高或过低。由图9-41可知，水解度3的总酸含量整体水平较稳定且含量居中，可作为选择对象。
图9-40　水解度对氨基态氮含量的影响
图9-41　水解度对总酸含量的影响
加盐量对发酵的影响：传统鱼露在加工过程中会加入大量的盐（20%～30%）进行发酵（抑菌作用），但含盐量高影响鱼露的口感，而且随着人们健康意识的提高，低盐成为新的发展趋势。该试验中选择5%、10%、15%、20% 4个梯度水平。在水解度3的基础上接入驯化好的种曲在28℃下进行加盐量对发酵的影响试验，结果见图9-42、图9-43。
图9-42　加盐量对氨基态氮的影响
图9-43　加盐量对总酸的影响
由图9-42可知，加盐量对氨基态氮的影响总体不大。由图9-43可知，随着发酵的进行总酸总体呈下降趋势，这可能是由于固态发酵物料利用不完全，导致后期微生物分解代谢大于合成代谢，从而引起总酸下降。酱油的国家标准GB 2717－2003中要求总酸（以乳酸计）含量应≤2.5g/dL，由此可见，所有加盐量水平均处于正常范围之内。综合考虑，10%的加盐量对于改善鱼露的口感更有利且对氨基态氮无显著性影响。
温度对发酵的影响：在低盐的条件下适当升高温度进行低盐保温发酵，不仅有利于发酵的快速进行，同时也能在一定程度上抑制杂菌的污染。该试验选用4个温度梯度，即28℃、32℃、36℃、40℃。试验结果见图9-44、图9-45。
图9-44　温度对氨基态氮的影响
图9-45　温度对总酸的影响
由图9-44和图9-45可知，在不同温度下氨基态氮的增长趋势基本相同，发酵初期快速增长，达到一定峰值后又急速下降，设想原因可能为固态发酵物料利用率较低，导致后期微生物分解代谢大于合成代谢，氨基态氮含量及总酸含量都急剧下降。综合考虑32℃温度下的氨基态氮含量要略高于其他组，总酸含量居中，因此，设想温度为32℃。
种曲添加量对发酵的影响：种曲添加量的大小会直接对发酵造成影响，若种曲添加量过小，菌种繁殖缓慢造成总发酵周期延长；若种曲添加量过大造成能源浪费，经济上不合算。因此，选择4个种曲添加量梯度进行优化选择，即0.05%、0.1%、0.2%、0.4%。试验结果见图9-46、图9-47。
图9-46　种曲添加量对氨基态氮的影响
图9-47　种曲添加量对总酸的影响
由图9-46和图9-47可知，种曲添加量对于氨基态氮含量影响较小，氨基态氮含量的增长趋势也基本相同，总的来说种曲添加量为0.2%组氨基态氮含量较高，选择其为最佳种曲添加量。
（3）发酵各因素间的交互作用
通过多因素方差分析，得出发酵各因素间的交互作用从而确定响应面优化因子，由组内差异可看出，水解度为20%时与水解度为28%、25%具有显著性差异；加盐量10%与其他3个水平均无显著性差异；温度32℃与40℃无显著性差异，28℃与36℃具有显著性差异；种曲添加量0.2%与其余3个水平均有显著性差异。只有水解度与温度具有交互作用，其余各组间无交互作用。发酵过程在氨基态氮最高的时候即为发酵终点，即物料利用率最高点，在响应面优化过程中需要确定这一因素，即发酵时间。因此，响应面优化因子选择水解度、温度及发酵时间。
（4）响应面优化试验结果
以氨基态氮为指标进行二次正交旋转响应面进行优化试验，对试验数据进行多元回归拟合，可得温度（X1）、水解度（X2）及发酵时间（X3）与氨基态氮（Y）间的二次多项回归方程：
Y=-9.5277+0.27018125X1+0.27665X2+1.198675X3-0.004029688X21-0.061725X22-0.066975X23-0.004125X1X2+0.0115X2X3-0.0004375X1X3
由回归方程所做的响应曲面图及其等高线图见图9-48、图9-49。通过图9-48和图9-49即可对任何两因素交互影响氨基态氮的效应进行分析与评价，并从中得出最佳因素水平范围。
对回归方程求一阶偏导数，当响应值Y最大时可求的各因素的水平：X1=32.0048，X2=2.0115（20.115%），X3=9.0168，在此条件下发酵初液的氨基态氮含量达到0.4782g/dL。
图9-48　交互项响应曲面图
图9-49　交互项等高线图
九、罗非鱼骨肉酱制备工艺技术
（1）工艺流程

（2）工艺操作要点
①鱼排的储运：在鱼排工厂加工产生的新鲜鱼排立即进行冰鲜，于2d内运输至加工地点进行低温冻藏（-18℃）待用。
②鱼排解冻、清洗和剁碎：将鱼排置于清水中解冻。清洗时注意洗去腹腔内中椎骨处的血膜和黑物。将鱼排剁成1～2cm小块。
③醋酸高压蒸煮：称取鱼排于容器中，按料液比2∶1加入质量浓度3%的醋酸溶液，并确保物料完全浸入醋酸溶液当中，放入杀菌锅中进行蒸煮。热处理程序为，前30min为升温时间，温度升至126℃（0.15 MPa），然后进行90min蒸煮处理，最后10min为降温时间。
④胶体磨粉碎处理：蒸煮软化处理后，将物料固液分离，固体骨肉块先经绞肉机进行粉碎，然后与前分离汁液搅拌均匀，并加入一定的清水调节浆液稠度，再进行胶体磨处理。经过多次试验，确定按软化后固液物料总质量的50%左右加水稀释，使浆料固形物含量达到13%～17%，能得到适合胶体磨处理要求的浆料稠度。胶体磨循环时间为5min。测得浆料在胶体磨中质量流通量为150g/s。
⑤高压微射流处理：将物料进行脱气处理后用M-110EH高压微射流纳米均质机，以均质压力为120 MPa进行处理，处理3次，得到鱼骨肉浆。
⑥蒸发浓缩：将物料进行常压或减压蒸发浓缩，使物料变稠，并控制浆料最终水分含量为60.3%。
⑦调味、包装、杀菌：将浓缩后浆料置于搅拌器中，加入糖和盐并搅拌均匀。经过试验，确定添加5%砂糖和0.5%的食盐得到的感官品质较好。将调味后酱体进行蒸煮袋真空包装，置于100℃沸水下杀菌30min。杀菌后冷却。因罗非鱼骨肉酱含有2%～3%的总酸度，故杀菌后可室温保存。
（3）醋酸高压蒸煮处理对胶体磨处理后浆体粒度分布和口感的影响
（4）高压微射流均质处理对浆体粒度分布和口感的影响
对胶体磨粉碎后的浆体再进行高压微射流均质处理可有效进一步降低浆体的粒度。高压均质处理能增加使扫描弦长在0～10μm范围内颗粒数百分比增加10%～22%，并使在10～40μm范围内的颗粒数百分比减少9%～17%（图9-51）。另外，醋酸高压蒸煮软化处理条件对均质处理后的骨浆粒度也有影响。对60MPa均质后骨浆，3%、90min蒸煮处理的平均粒度小于0%、90min蒸煮处理组，前者的0～10μm范围内颗粒数百分比比后者增加5.3%，10～40μm范围内颗粒数百分比比后者少8.4%。对120MPa均质后浆体，3%、90min蒸煮处理的平均粒度也小于0%、90min蒸煮处理组，前者的0～10μm范围内颗粒数百分比比后者增加7.8%，10～40μm范围内颗粒数百分比比后者少10.9%。在10～40μm范围内，高压均质处理的粒度分布曲线显得更加平滑。经过高压均质处理的样品口感明显有了改善，3%、90min蒸煮处理、120 MPa均质压力均质处理可使骨浆口感显著变得细化，颗粒感已不明显，并接近无骨鱼肉浆的细化口感。高压微射流处理后样品在10～40μm范围的颗粒数减少使其在口腔的颗粒感减弱。
图9-51　不同蒸煮条件和均质压力对骨肉浆粒度分布的影响
（5）涂抹性的表征及罗非鱼骨肉酱流变特性测定
涂抹性是涂抹酱体类食品一个重要的指标。它是指酱体被涂抹的过程中由于受剪切作用而黏度变小，以使涂抹过程顺畅进行，涂抹结束后酱体黏度回升并能稳定附着在被涂抹食品物料上不流动的一种特性。在食品流变学中可采用触变性的概念反映涂抹酱体的涂抹性。为客观反映罗非鱼骨肉酱的触变性，使用哈克流变仪RS600进行测定测定：探头为C35/1°Ti。将少量样品置于锥板之间。在（25±1）℃下进行测定。剪切率范围为0～637s-1，剪切率从0增大到637s-1，剪切时间为1min，然后以相同的剪切时间使剪切率慢慢减少到0，即完成一个循环共需2min。一般循环4次，样品的触变性完全消失。即向上流动曲线和向下流动曲线完全重合。每个样品重复测定3次。如图9-52所示，剪切应力达到最大值的A点为静态屈服值（SYV）。向下流动曲线和向下流动曲线构成了一个滞后环，滞后环的总面积表示了触变性的大小，触变性越大，则酱体的涂抹性越好。通过测定滞后环面积和A点对应的表观黏度，可客观反映酱体的涂抹性。
图9-52　罗非鱼骨肉酱的流变特性图
（6）浓缩程度对骨肉酱涂抹性的影响
涂抹性是骨肉酱重要的性能指标。它是指酱体能在涂抹过程中黏度降低，便于涂抹，涂抹结束后，酱体黏度又能回升以保持形态的一种性能。流变学中研究的流体触变性能较好的反应酱体的这种涂抹性能。通过测定罗非鱼骨肉酱的流动曲线，发现其在低浓缩程度下（水分质量分数≥68.3%）趋于牛顿流体，而当浓缩程度不断增大（水分质量分数≤68.3%），骨肉酱逐渐形成触变性流体（图9-53）。通过计算滞后环面积发现，随着浓缩程度的提高，鱼骨肉酱的静态屈服值下的表观黏度和触变性逐渐接近色拉酱。当浓缩至水分质量分数为60.3%时，鱼骨肉酱的表观黏度17.25Pa·s，是色拉酱的97%，鱼骨肉酱滞后环总面积为5.370×104Pa/s，以接近色拉酱水平（5.360×104Pa/s）。面包倾侧试验结果（图9-54）反映了当浓缩后的水分质量分数为60.3%时，骨肉酱能完全黏附在食品上，并且涂抹后不流动，已表现出与色拉酱相似的涂抹特性。
图9-53　不同浓缩程度下调味罗非鱼骨肉酱的流动曲线
图9-54　不同浓缩水分含量下调味罗非鱼骨肉酱面包倾侧试验结果（酱体厚度3mm）
（7）产品质量指标
以软化处理蒸煮时间90min，醋酸处理浓度3%，胶体磨循环时间5min，高压微射流均质压力为120MPa，浆体浓缩至水分质量浓度60.3%后进行调味、包装、杀菌处理制备的罗非鱼骨肉酱具有相对较好的口感和涂抹性。产品外观如图9-54所示。骨肉酱的水分含量为56.9%，总氮肥为3.8%，脂肪为4.4%，灰分为8.1%，酸为4.7%，糖0.55，盐为0.2%，氨基酸态氮肥为2.7%，钙含量为1.4%。罗非鱼骨肉酱蛋白质和矿物质比较丰富，分别占22%（以蛋白质换算系数5.9计算）和8.1%，钙磷比为1.9。《中国居民膳食营养素参考摄入量》（2013版）指年成人、少年儿童钙推荐摄入量（recommended nutrient intake, RNIs）为800～1000mg，孕妇为1000～1200mg，老年人为1000mg。按骨肉酱的成分计算，每日摄入骨肉酱30～40g，即可达到人的钙营养需求。
从骨肉酱的感官评价看，醋酸不仅能增强热软化处理效果，还能掩盖鱼土腥味。产品为淡黄色，无土腥味，酸甜可口，咸度适中，具有鱼肉特有的滋味，酱体细腻柔滑，无明显颗粒感，入口即化，酱体具有较好的涂抹性，能完全黏附在食品上，涂抹后不流动。
第二节　罗非鱼鱼油的制备及其微胶化技术
一、罗非鱼内脏鱼油的制备技术
1．鱼油提取和精制
取罗非鱼内脏捣碎，放于容器内，加入水，通入氮气，于水浴锅中水浴升温至45～50℃，用40g/dL的KOH水溶液调节pH为8；在最佳的水解工艺条件下水解：水解温70～80℃，水解时间40min, KNO3用量为6g/dL，盐析时间10min，水解过程中需搅拌；冷却至室温时分离上层油层，离心（3000～4000r/min）除去杂质得粗鱼油。粗鱼油经磷酸脱胶后，根据鱼油的酸价，升温至40～60℃，加入体积分数为2 %的70g/dL的NaOH溶液，搅拌15min ，静置分层，吸取上清层 ，然后水洗至中性；加入混合脱色剂（高岭土∶活性炭为1∶1），在60℃下脱色30min，经抽滤得精制罗非鱼内脏油。
所得鱼油的各项指标均达到鱼油质量标准，且质量较好，工艺稳定（表9-18）。工艺中所用的盐为钾盐，它是传统农业肥料，而提取鱼油后的废水、废渣含有大量的氨基酸、蛋白质，所以内脏制取鱼油后的废弃物，经处理就可以作为优质绿色肥料的原料，进一步利用，达到了废弃物综合利用的目的。
表9-18　罗非鱼内脏鱼油指标分析
2．多不饱和脂肪酸的纯化
罗非鱼油多不饱和脂肪酸的纯化可采用低温-钾盐乙醇法和尿素包埋法两种方法进行，选用-20℃作为低温处理温度，这与工厂低温冷库温度相适。从鱼油多不饱和脂肪酸的纯化收率上来讲，低温-钾盐乙醇法不如尿素包埋法；采用低温-钾盐乙醇法纯化后的鱼油多不饱和脂肪酸总和为58.9%，EPA和DHA之和从粗鱼油16.0%提高为31.6%，而采用尿素包埋法纯化后的鱼油多不饱和脂肪酸总和为60.6%， EPA和DHA之和从粗鱼油的16.0%提高为32.3%，故从试验结果来看，是以尿素包埋法对鱼油多不饱和脂肪酸的纯化略为佳。但是，尿素包埋法的抽滤、除石油醚、干燥等操作十分麻烦、费时；而低温-钾盐乙醇法具有工艺简单易行，成本低，易于分离等优点。在生产应用当中要综合考虑产品得率、人力、物力、回收等方面的因素，所以采用低温-钾盐乙醇法进行纯化多不饱和脂肪酸。
鱼油混合脂肪酸制备：取一份罗非鱼粗鱼油，加入1.5倍体积的乙醇和体积分数5%的水，加2.5g/dL KOH，在沸水浴中充氮气回流皂化30min ，冷却至室温后，加入适量水和石油醚，除去胆固醇和非皂化物，分除去石油醚层，用体积分数为30%的硫酸溶液酸化，pH为2～3，搅拌，静置分层，取上层油液，水洗几次，即得鱼油混合脂肪酸。
低温-钾盐乙醇法：将氢氧化钾溶于体积分数为95%的乙醇中，加入鱼油混合脂肪酸，充分搅拌20min，静置；溶液中析出饱和脂肪酸钾盐结晶，过滤，滤液放在-20℃中24h，过滤；滤液在旋转式薄膜蒸发器上减压回收部分乙醇，浓缩液加入其体积1倍的水，然后用硫酸溶液进行酸化，分离上层油液，即为纯化了的多不饱和脂肪酸。
低温-钾盐乙醇法得到的浓缩多不饱和脂肪酸总和得率为58.9% ，而EPA和DHA之和从粗鱼油的得率16.0%提高到31.6%。
此法所得鱼油容易分离，条件温和，质量较好，操作简便，不易产生新的废弃物，达到了综合利用的目的，而且该法优于传统的淡碱水解提油法。
鱼油产品技术指标为符合国家食品卫生标准SC/T 3502－2000，粗鱼油黄色，稍有混浊，具有鱼油的腥味；精制鱼油浅黄色，具有鱼油特有的微腥味，无酸败味。
二、罗非鱼鱼油氧化防止技术
精制鱼油在贮藏时由于不饱和脂肪酸含量较高，极易受光照、温度、空气等的影响而发生氧化，从而产生致癌物质，所以防止鱼油氧化十分重要。
当罗非鱼油在65℃贮藏时，若不添加抗氧化剂，鱼油的过氧化值（POV）和硫代巴比妥酸反应物值（TBARS）随贮藏时间的延长而增加，而放置60h后就达不到鱼油的食用标准。因此，通过在鱼油中分别添加3种不同类型的抗氧化剂（TBHQ、VE、茶多酚），对其抗氧化效果进行了研究（表9-19），添加量都是0.02%。添加VE的鱼油，在65℃贮藏60h时， POV值的增加相对对照组较慢，但贮藏120h时，不加抗氧化剂的鱼油POV值为123.34meq/kg, TBARS值为18.9μmol/g，添加了VE的鱼油POV值为95.56meq/kg, TBARS值为13.86μmol/g，抗氧化效果不理想。TBHQ和茶多酚在鱼油中的抗氧化效果较好，在60h，添加TBHQ的鱼油POV值为8.84meq/kg, TBARS值为5.55μmol/g，而添加茶多酚的鱼油POV值为8.97meq/kg, TBARS值为6.04μmol/g，鱼油仍是新鲜的，而此时不加抗氧化剂的鱼油已氧化了，远远超过食用油标准。TBHQ和茶多酚在鱼油中的抗氧化效果相近，TBHQ略好一些，但TBHQ为合成抗氧化剂，茶多酚为天然抗氧化剂，TBHQ仍未被欧洲、日本、加拿大等国批准在食品上应用，而且价格也较贵，所以综合考虑，采用茶多酚作为鱼油的抗氧化剂比较合适。
表9-19　在65℃条件下不同抗氧化剂对鱼油POV和TBARS的影响
三、罗非鱼油微胶囊化技术
1．微胶囊鱼油的壁材
鱼油中的不饱和脂肪酸易在贮藏过程中氧化变质，而采用微胶囊技术可以有效防止鱼油制品的氧化。使鱼油从液体变成固体粉末，提高制品流动性、混合性，便于食品加工与保存。目前，微胶囊技术在油类制品中已有应用，大多是采用阿拉伯胶、糊精、变性淀粉等作为壁材，近年来黄原胶等本身具有抗氧化性的壁材也用于微胶囊中，对提高微胶囊鱼油的氧化稳定性十分重要。
用于制取微胶囊的壁材应具有高水溶性、乳化性、成膜性，且不易吸潮，还要求高浓度壁材溶液具有较低黏度。食品工业中喷雾干燥微胶囊化所使用壁材主要有以阿拉伯胶为代表的植物胶、碳水化合物（主要指糊精、水解多糖、变性淀粉）和蛋白质。
阿拉伯胶是一种天然的植物胶，作为壁材具有良好的附着力和成膜性，常用于微胶囊壁材中。但喷雾干燥过程中高温受热会使得胶体分子降解，乳化性能下降，导致包埋率降低，阿拉伯胶价格也相对较贵，成本较高。在阿拉伯胶的基础上加入明胶后，可使微胶囊产品包埋率明显上升，说明一定量的明胶可以明显提高鱼油乳化液的稳定性及鱼油的包埋率。采用明胶、黄原胶与蔗糖复配，形成的鱼油乳化液不分层，乳化稳定性好，不易发生液滴的聚集和破乳，使微胶囊鱼油达到较高的包埋率，且氧化稳定性较好，是最适宜的壁材组成。
明胶来源于广泛存在于动物皮、筋、骨髓中的胶原蛋白质，易溶于温水，具有良好的成膜性。蛋白质乳化能力和易成膜性对脂类物质保留率有很大作用，碳水化合物有利于壁材中多功能基质形成，将蛋白质和碳水化合物按一定比例混合则可满足对壁材多功能性的要求。因此，将蛋白质和碳水化合物复配用于鱼油微胶囊制备可得到较好的效果。
黄原胶是一种高分子高糖物质，易溶于冷水和热水，它在很低的浓度下仍具有较高的黏度，如1%浓度的黏度相当于明胶的100倍左右，增稠效果显著。通常添加于微胶囊化过程中以增强乳化液的稳定性。由于黄原胶与蛋白质有协同作用，将它们复配后可以提高乳液的稳定性，从而可以提高微胶囊化的包埋率和质量。将黄原胶添加到壁材中，壁材溶液的乳化稳定性明显得到提高。黄原胶稳定的双螺旋结构还使其具有极强的抗氧化能力，用于鱼油微胶囊中可有效防止鱼油的酸败。
碳水化合物类壁材（糖类壁材），在食品工业中最常见的有淀粉、麦芽糊精、玉米糖浆、蔗糖和海藻糖等。它们具有黏度低、固液浓度高、溶解性能好等特点，是一类应用广泛的微胶囊壁材。但同时，由于糖类壁材的界面特性不稳定，易造成微胶囊化效率低，玻璃化转变温度低，通常需要通过对其做一定的化学改性修饰，或者与一些蛋白类或植物水溶性胶类壁材联合使用。
在罗非鱼鱼油微胶囊的制备中，壁材对微胶囊化罗非鱼油包埋率的影响效果为：明胶与蔗糖比例对微胶囊包埋率的影响最大，其次是鱼油与壁材比例，黄原胶含量的影响最小。采用响应面优化得到的微胶囊化罗非鱼油的最佳壁材组合为：蔗糖13.5%，明胶5.1%，黄原胶含量为0.31%，鱼油6.5%。所得产品的包埋率为89.16%。
2．微胶囊鱼油的喷雾干燥
喷雾干燥过程中，进风温度对产品质量的影响最为显著。产品结构致密程度、芯材是否被破坏和产品水分含量等都与进风温度有关。进风温度过高，会导致产品粒子表面开裂，引起效率、产率显著下降。降低进风温度，可防止心材的挥发损失，保持粒子结构完整。然而，进风温度过低，由于产品水分含量高，喷雾干燥时粘壁现象严重；同时，过高的水分也不利于产品的保存。适当提高进风温度，可较快的在粒子表面形成一层硬壳（玻璃态的壁），有利于阻止鱼油的损失和防止鱼油的氧化。
微胶囊产品的包埋率和产品产率在进风温度为115℃时达到最大，进风温度对产品的水分含量影响不大，在115℃以上时水分含量保持较低水平。综合3个指标选择115℃作为罗非鱼微胶囊鱼油的喷雾干燥的进风温度（图9-55～图9-57）。出风温度为75℃，喷雾压力100kPa。在以上条件下得到的鱼油微胶囊产品色泽洁白，外观较好，可有效包埋芯材，还具有抗氧化的作用，可提高产品的保质期。
图9-55　进风温度对包埋率的影响
图9-56　进风温度对水分含量的影响
图9-57　进风温度对产品产率的影响
3．微胶囊鱼油产品
鱼油微胶囊化能明显降低鱼油的氧化速度，加速氧化15d后，未微胶囊化鱼油的POV值从初始的3.13meq/kg上升到45.49meq/kg，而微胶囊鱼油的POV值为19.26meq/kg，仅为未微胶囊化鱼油的1/2，抗氧化效果显著（图9-58）。微胶囊化鱼油产品指标见表9-20。
图9-58　微胶囊产品的氧化稳定性分析
表9-20　微胶囊化鱼油产品指标
微胶囊化罗非鱼油产品具有较低的水分含量，色泽和溶解性较好，呈现较好的产品状态。产品具有明显的抗氧化性，水分含量低，色泽洁白，溶解性好，溶解后呈牛奶状，有较好的鱼油味。鱼油酸价≤8mg/kg，过氧化值≤6mmol/kg。
第三节　罗非鱼鱼皮和鱼鳞的利用
一、罗非鱼鱼皮和鱼鳞的化学组成
1．常规营养成分
罗非鱼鱼皮和鱼鳞是罗非鱼生产过程中产生废弃物中主要的成分之一，鱼皮和鱼鳞分别占废弃物总量的约5%和4%。罗非鱼鱼皮、鱼鳞含有大量有价值的有机和无机成分，是一种大量的优良胶原蛋白资源。罗非鱼皮、鱼鳞的水分、灰分、粗蛋白质、总糖等常规成分的含量见表9-21。表9-21的数据表明，鱼皮中含有丰富的蛋白质，粗蛋白质含量占干物质的94.7%。鱼鳞中含有丰富的粗蛋白质和灰分，分别占干物质的53.5%和44.1%，脂肪含量最少。
表9-21　罗非鱼皮和鱼鳞的常规营养成分分析（%）
2．氨基酸含量
氨基酸是组成蛋白质的基本单位，蛋白质中不同种类、不同比例的氨基酸组成，均对蛋白质的结构、物理性能、生理活性等方面产生影响。鱼皮和鱼鳞的主要成分为蛋白质。表9-22的数据表明，在罗非鱼鱼皮和鱼鳞蛋白质的氨基酸组成中，必需氨基酸分别占氨基酸总量的22.81%和22.42%，显然鱼皮和鱼鳞不是优质蛋白质。但两者均含有丰富的甘氨酸、脯氨酸和丙氨酸，是胶原蛋白的特征氨基酸。
表9-22　罗非鱼皮和鱼鳞蛋白质中氨基酸含量分析（%）
3．胶原蛋白
胶原蛋白是罗非鱼鱼皮和鱼鳞蛋白质的主要组成，其中，罗非鱼鱼皮胶原蛋白的含量为20%～28%，鱼鳞胶原蛋白的含量在50%左右。罗非鱼鱼皮和鱼鳞的胶原蛋白为Ⅰ型胶原蛋白，且较完整保存着的Ⅰ型胶原蛋白的3股螺旋构型，并且两者的胶原蛋白的溶解性好，吸水率低，可作为很好的保水剂，是提取胶原蛋白的良好来源。
二、罗非鱼鱼皮提取胶原蛋白的工艺技术
1．提取工艺
鱼皮、鱼鳞清洗→前处理→提取→过滤→精制→干燥→胶原蛋白。
2．操作要点
（1）鱼皮胶原蛋白的提取
①清洗：新鲜鱼皮用清水清洗干净，去除脂肪等杂物，晾干水分后备用；冻结鱼皮解冻后漂洗干净，晾干水分后备用。
②前处理：在前处理过的鱼皮加入NaCl溶液，使NaCl的最终质量浓度为6%，浸泡12h，不停搅拌（重复1次），然后沥干，并用水洗至中性。然后加入2倍体积的盐酸于4℃条件下浸泡30min，沥干并水洗至中性。
③提取和干燥：在酸处理后的鱼皮中加入一定量的去离子水，65℃水浴提胶4h，真空抽滤后4000r/min离心5min，取上清液浓缩，干燥粗胶原蛋白。
④精制：在粗提液加入NaCl，使其终浓度达到0.9mol/L，盐析过夜，5000r/min离心20min，弃去上清液，沉淀用10倍体积0.5mol/L的乙酸溶解，5000r/min离心20min去除杂质，上清液再次重复盐析、离心、溶解操作，最后用蒸馏水透析3d，每天更换透析液，冻干即得胶原精制品。
（2）鱼鳞胶原蛋白的提取
①清洗：将鱼鳞清洗干净，自然晾干表面水分，备用。
②前处理：在清洗干净的鱼鳞中加入一定量的脱钙液浸泡一段时间，用清水清洗干净，再以物料比为1∶20（W/V）的NaOH或NaCl溶液浸泡12h后用蒸馏水冲洗至中性。
③提取和干燥：在脱钙后的鱼鳞中加入一定体积的酸提取液（提取液中含有1%胃蛋白酶）提取一段时间，5000r/min离心20min，收集上清液，即得到胶原蛋白粗提液。
④精制：在粗提液加入NaCl，使其终浓度达到0.9mol/L，盐析过夜，5000r/min离心20min，弃去上清液，沉淀用10倍体积0.5mol/L的乙酸溶解，5000r/min离心20min去除杂质，上清液再次重复盐析、离心、溶解操作，最后用蒸馏水透析3d，每天更换透析液，冻干即得胶原蛋白精制品。
3．响应面优化试验结果
Box-Benhnken的四因素五水平试验中共有27个试验点，其中试验1～24是分析因子试验、试验25～27是零点试验，胶原蛋白含量（Y）为响应值。采用SAS 9.0软件对胶原蛋白含量试验数据进行多元回归分析，可知方程的一次项、二次项的影响都是极显著的，交互项不显著，方程的决定系数为97.98%，说明响应值有97.98%来源于所选变量，回归方程可以较好地描述各因素与响应值之间的真实关系。根据分析结果，去掉非显著项得到胶原蛋白含量对盐酸浓度（X1）、盐酸浸泡时间（X2）、提取温度（X3）和提取时间（X4）的二次回归模型，该方程表达了提取所得胶原蛋白含量（Y）与各因素之间的变化规律。
响应曲面和等值线可以直观地看到各因素间的交互情况，其中等值线的形状可以反映出因素间交互效应的强弱，圆形表示两因素间的交互作用不显著，而椭圆形则表示显著，结果见图9-59。
图9-59　盐酸浓度和盐酸浸泡时间交互作用的响应面和等值线图
由图9-59可知，盐酸浓度和酸浸泡时间两因素间的相互影响不大。在编码值中间区域，胶原蛋白含量最高，当酸浓度过低或过高、酸浸泡时间过短或过长时胶原蛋白含量下降。该试验选用盐酸来除去原料中的杂蛋白，可以破坏分子间盐键和希夫碱引起胶原纤维膨胀，为下一步热水提取胶原蛋白起了促进作用。
由图9-60可知，提取时间和提取温度两因素间的相互影响显著。随着提取温度升高，提取时间延长，胶原蛋白含量升高，而且响应曲面显示坡度较陡。在编码值中间偏上区域，胶原蛋白含量最高，当温度过高提取时间较长时胶原蛋白含量略有下降。
图9-60　提取温度和提取时间交互作的响应面和等值线图
利用SAS软件分析得到X1、X2、X3、X4的代码值分别为0.172646、0.082245、0.26964、0.309204，经换算得出相应的实际值为盐酸0.212948mol/L、盐酸浸泡时间为20.61684min、提取温度为42.6964℃、提取时间为12.6184h，此条件下胶原蛋白含量（Y）的理论值为296.069263mg/g。为检验响应曲面法所得结果的可靠性，采用上述优化的提取条件，考虑到实际操作的情况和温度越高胶原蛋白越易变性，将工艺参数修正为酸浓度0.213mol/L、酸浸泡时间21min、提取温度42℃、提取时间12.6h，实际测得的胶原蛋白含量（Y）为293.018mg/g。试验值与理论值的相对误差为1.03%，证明该模型得出的胶原蛋白的参数是可行的。
4．胶原蛋白性质研究
（1）胶原蛋白的紫外光谱分析
由图9-61可知，胶原蛋白溶液的最大吸收峰在232nm。该法所得胶原蛋白在这3个区域吸收强度较弱，说明在胶原蛋白的一级结构中色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸含量很低，符合Ⅰ型胶原蛋白特征。
图9-61　胶原蛋白溶液的紫外光谱图
（2）氨基酸组成
经检测，胶原蛋白特征氨基酸羟脯氨酸、脯氨酸含量为17.64%，酪氨酸和苯丙氨酸的含量均很低，符合胶原蛋白特征。
（3）胶原蛋白的SDS-PAGE分析
由图9-62可知，罗非鱼鱼皮胶原蛋白含两条α链（α1和α2）和它们的聚合链β，说明罗非鱼鱼皮中的胶原蛋白是Ⅰ型胶原蛋白。α1链的相对分子质量约为125000，α2链相对分子质量约为111000，β链相对分子质量约为202000。由于胶原蛋白变性温度为40～41℃，该试验采用40℃提取鱼皮胶原蛋白，可能导致小部分蛋白变性，相对分子质量降低，因此，可见部分相对分子质量低于116000的蛋白带出现在图谱中。
图9-62　罗非鱼鱼皮胶原蛋白的SDS-PAGE图谱
（4）凝胶强度
6.67%胶原蛋白溶液的凝胶强度为682.00g，胶原的凝胶强度与其所含的亚氨基酸量有关，主要是羟脯氨酸，可见羟脯氨酸在胶原蛋白溶液中的含量很高。
（5）特性黏度
由图9-63可知，胶原蛋白浓度越大，黏度越高。热水提取的胶原蛋白特性黏度为1.461dL/g，比用酸法（0.5mol/L醋酸，4℃，浸提48h）提取的罗非鱼皮胶原蛋白特性黏度13.129dL/g低，这是由于酸法提取过程中，胶原蛋白疏水性氨基酸组成发生了改变。当含有较多的疏水性氨基酸时，黏度较低，当胶原蛋白中含有较多的羟脯氨酸时，黏度增高。
图9-63　胶原蛋白的特性黏度
三、罗非鱼鱼皮胶原蛋白降血压酶解液的制备与活性
1．罗非鱼鱼皮胶原蛋白降血压酶解液的水解工艺条件
（1）单酶水解正交试验
根据单酶水解的预备试验结果，选定Alcalase 2.4L碱性蛋白酶和菠萝蛋白酶作为目标酶，选择温度（A）、pH（B）、酶/底物（C）、时间（D）、底物浓度（E）为因素，每个因素确定4个水平，按L16（45）正交表进行正交试验。两种酶正交试验的因素及其水平分别见表9-23、表9-24。
表9-23　Alcalase 2.4L碱性蛋白酶的正交试验因素与水平
表9-24　菠萝蛋白酶的正交试验因素与水平
（2）复合酶水解试验
由Alcalase 2.4L碱性蛋白酶和菠萝蛋白酶组成复合酶，对罗非鱼皮胶原蛋白进行复合水解。试验方法和条件见表9-25。
表9-25　复合酶水解试验
（3）Alcalase 2.4L碱性蛋白酶最适水解工艺条件
Alcalase 2.4L碱性蛋白酶正交试验结果见表9-26。对表9-26的正交试验结果进行分析，结果见表9-27。由表9-27可知，5个影响因素对水解反应的影响由大到小依次为：反应温度>pH>底物浓度>加酶量>反应时间，最适水解条件为：55℃，pH 7.5，6000U/g，2h，底物浓度4%。
表9-26　Alcalase 2.4L碱性蛋白酶正交试验结果
表9-27　Alcalase 2.4L碱性蛋白酶正交试验结果分析
（4）菠萝蛋白酶最适水解工艺条件
对表9-28的正交试验结果进行分析，结果见表9-29。从表9-29可以看出，5个影响因素对菠萝蛋白酶水解反应的影响顺序依次为：pH>反应温度>加酶量>反应时间>底物浓度，最适水解条件为：45℃，pH 4.5，4000U/g，4h，6%。
表9-28　菠萝蛋白酶正交试验结果
表9-29　菠萝蛋白酶正交试验结果分析
（5）复合酶解试验工艺的确定
4种不同复合酶和2种单酶水解产物的水解度及ACE抑制率的测定结果见表9-30。从表9-30中可知，所有复合酶的酶解产物的ACE抑制率均超过了50%，与单酶水解产物的ACE抑制率之间存在显著差异（P<0.05）。
表9-30　复合酶酶解产物的水解度及其ACE抑制活性
2．酶解物的分离纯化
采用上海沪西BSZ-100自动部分收集器在波长为220nm处进行检测收集，在原液Sephadex G-25的分离中，出现3个峰，如图9-64所示。分别收集高活力峰管，浓缩作活性测定。水解原液，柱层析3个峰的半抑制浓度IC50分别为2.82mg/mL、3.50mg/mL、2.12mg/mL。取活力最高的第3峰（乙酸洗脱液凝胶制备峰）作进一步分析，简称为ACF。根据出峰时间及标准蛋白质相对分子质量，求出相对分子质量标准曲线方程为：logMW=-0.2256T+5.7179（R2=0.9935）。由HPLC图计算超滤水解液相对分子质量约为350。
图9-64　水解液凝胶色谱图
四、罗非鱼鱼皮制备抗氧化肽的工艺技术
1.8种蛋白酶的水解罗非鱼皮的效果比较
由图9-65和图9-66可知，罗非鱼皮在经8种不同酶酶解后的蛋白质提取率相差不大但均低于30%，提取率较低。水解度差异较大，其中酸性蛋白酶水解罗非鱼皮的效果较差，水解度仅有6.64%，Alcalase水解罗非鱼鱼皮的效果较其他酶稍好，水解度为13.04%，这可能是由于Alcalase能够专一性水解蛋白质终端的疏水性氨基酸且其作用位点相对广泛。
图9-65　罗非鱼鱼皮酶解液的蛋白质提取率
图9-66　8种酶水解罗非鱼鱼皮的水解度
2．罗非鱼鱼皮酶解液的抗氧化活性比较
以还原性谷胱甘肽作参比，将8种酶水解罗非鱼皮得到的酶解液作梯度稀释，测定各酶解液对DPPH自由基的半抑制浓度（IC50）以表征其清除DPPH自由基的能力，试验结果见图9-67。各蛋白酶水解罗非鱼皮得到的酶解液对DPPH均表现出一定的清除活性，其中酸性蛋白酶、中性蛋白酶和胰蛋白酶的酶解产物的IC50较高，意味着这3种酶解产物清除DPPH自由基的活性较其他酶解产物要差。而碱性蛋白酶和Alcalase的酶解产物的IC50分别为6.34mg/mL和6.11mg/mL，低于其他酶解产物，说明其相对于其他酶解产物对DPPH自由基清除活性要好，但远高于谷胱甘肽的IC50（0.04mg/mL），说明其活性较谷胱甘肽差。罗非鱼皮酶解液对DPPH自由基的清除能力与其浓度呈明显的量效关系，随着浓度增大，酶解液清除DPPH自由基的活性显著增强。
图9-67　8种酶水解罗非鱼鱼皮酶解液的DPPH自由基半抑制浓度（IC50）
如图9-68所示，碱性蛋白酶及Alcalase的酶解液对·OH的IC50相对较低，分别为11.13mg/mL和12.42mg/mL，其余各酶解液的IC50均大于15mg/mL，而谷胱甘肽的IC50为0.6mg/mL，可见碱性蛋白酶和Alcalase虽较其他各酶的酶解液对·OH的清除活性要高，但相比谷胱甘肽对·OH的清除活性较差。罗非鱼鱼皮酶解液对·OH的清除能力与其浓度也呈较明显的量效关系，随着浓度增大，酶解液清除·OH的活性增强。
图9-68　8种酶水解罗非鱼鱼皮酶解液的·OH半抑制浓度（IC50）
由图9-69可见，各酶解液中，酸性蛋白酶和胃蛋白酶酶解液的还原力较差，碱性蛋白酶和Alcalase的酶解物的还原力较其他酶解液强，其中碱性蛋白酶酶解物的吸光度值为0.892，高于Alcalase酶解物的0.657。王强等采用木瓜蛋白酶酶解罗非鱼鱼肉蛋白质，得到酶解液的浓度为5mg/mL时还原力为0.9706，稍高于罗非鱼鱼皮碱性蛋白酶水解物。
图9-69　8种酶水解罗非鱼鱼皮酶解液的还原力
在8种酶解液中，碱性蛋白酶酶解液对·OH的清除能力和还原力均最强，Alcalase酶解液清除DPPH自由基的能力强于碱性蛋白酶酶解液，但其对·OH的清除能力及还原力不及碱性蛋白酶酶解液。由于Alcalase也是碱性蛋白酶的一种，由此可见，在各酶的最适条件下，碱性蛋白酶水解罗非鱼鱼皮制备抗氧化活性肽的效果最佳。这很可能是因为碱性蛋白酶在水解天然蛋白质时较其他酶有更广泛的酶切位点，其水解出来的短肽序列以及终端氨基酸与许多生物活性相关，其中包括抗氧化活性。目前已经见诸报道的大多数抗氧化活性肽的相对分子质量都低于10000，但这并不意味着酶解产物的水解度越高、分子量越小，其抗氧化活性就越强，如杨萍等研究大眼金枪鱼蛋白质酶解物，李雪等研究草鱼鱼肉蛋白质酶解物时，均发现随着水解度增加，产物的还原力反而下降。这是因为肽类的氨基酸组成种类、数量及其排列顺序都对其抗氧化活性有重要影响。因此，根据以上试验结果，选定碱性蛋白酶作为试验用酶并对酶解工艺进行优化设计。
3．碱性蛋白酶酶解罗非鱼鱼皮条件的响应面优化设计及结果
响应面中心组合设计试验因素编码值见表9-31，试验安排及结果见表9-32。
表9-31　BBD响应面分析各因素编码值和实际值
表9-32　BBD响应面试验安排及结果
表9-32　BBD响应面试验安排及结果（续）-1
根据表9-32的试验结果计算二次回归方程中的各级回归系数，得到二次回归方程（1）：
其中X1、XX2、X3、X4分别代表pH、时间、温度、料液比的各编码值。通过回归方程（1）反映出各因子与响应值之间的关系，具体方差分析结果见表9-33。
表9-33　BBD响应面试验结果方差分析
表9-33　BBD响应面试验结果方差分析（续）-1
由表9-33方差分析结果得知，模型显著性检验P<0.0001表示该模型具有统计学意义，模型失拟项P值为0.2072>0.05表示模型无失拟因素存在。其中X1、X2、X3、X4、X1X2、X1X3、X2X3、X2X4、X12、X22、X32、X42对响应值均有显著影响（P<0.05），其余项不显著。此外，模型决定系数R2=0.9713说明响应值有97.13%取决于所选取的变量，模型校正决定系数AdjR2=0.9379，变异系数CV=7.93%，说明该模型只有6.21%的变异，其回归方程的拟合程度较好，预测值和实测值之间的相关性较高，可以用来对碱性蛋白酶酶解罗非鱼鱼皮制备具有抗氧化活性肽的工艺进行初步分析和预测。
根据回归方程（2），绘制出三维响应面分析图和二维等高线，详见图9-70至图9-75。
图9-70显示，当pH一定时，响应值随酶解时间的延长而下降。反应体系的pH在酶解过程中不断变化，反应时间过长可能使体系pH超出蛋白酶的最适范围而影响其活性，同时已被水解出来的目标产物可能被微生物降解，反而造成目标产物得率降低，使酶解液的还原力下降。反应时间一定时，反应体系pH的改变对响应值影响不大，这可能是因为一定时间内，在蛋白酶的最适pH范围改变反应体系的pH对酶的活性影响不大。
图9-70　pH和酶解时间对响应值的影响
由图9-71可见pH和温度的交互作用良好，pH和温度的变化对响应值影响较大，过高或过低的pH及温度都对酶解产物的还原力不利。这是可能是由于较为剧烈的水解条件影响了蛋白酶的活力，从而使目标物的产量降低。
图9-71　pH和温度对响应值的影响
由图9-72可见，当pH一定时，响应值随料液比的增大先增大再减小，这是由于当料液比低即加水量大，这意味着溶液中酶的浓度下降，作用于底物的有效酶活降低，从而影响到产物的生成；而浓度高时即加水量小，此时溶液较为黏稠，对反应体系中pH的调节和酶的溶解及均匀混合产生不利影响，因而也造成目标产物的得率下降，从而使响应值降低。
图9-72　pH和料液比对响应值的影响
图9-73显示了酶解时间和温度的交互作用。由图9-73可知，时间一定时，响应值随温度升高先增大后减小，表明了过高或过低的温度均影响到酶的活性而不利于其水解底物产生目标物；一定的温度下，响应值与酶解时间呈相同趋势。
图9-73　酶解时间和温度对响应值的影响
图9-74的曲面弧度较平缓，从图中可见，当料液比一定时，改变酶解时间对响应值的影响较小，而当酶解时间一定时，改变料液比对响应值的影响较大，说明在这两个交互因素中料液比比酶解时间对响应值的影响更显著。
图9-74　酶解时间和料液比对响应值的影响
从图9-75中可以看出，当温度一定时，料液比的改变对响应值的影响较大。对温度和料液比交互的方差分析结果为不显著，但由图中可知，其等高线呈椭圆形，表明料液比和温度间仍存在一定的交互作用。
图9-75　温度和料液比对响应值的影响
根据Design Expert Software（version 8.0.5）软件分析得到碱性蛋白酶水解罗非鱼鱼皮制备抗氧化活性肽的最佳酶解反应条件为：pH 10.0、反应时间4h、温度40 ℃、料液比0.38，所得酶解液的还原力最高，为1.000。在最优水解条件下，进行了3组重复性试验，测得优化后的罗非鱼鱼皮蛋白质抗氧化活性肽的还原力为（1.054±0.057），与模型预测值并无显著性差异（P>0.05），表明试验确定的模型条件可以用于预测实际值。
4．超滤分离及其产物抗氧化活性分析
将TSH依次通过截留相对分子质量为100000、50000、10000、5000的超滤膜后得到5个组分：大于100000、50000～100000、10000～50000、5000 ～10000、小于5000，测定各组分DPPH自由基和·OH IC50以及还原力，并与未经超滤的TSH对比，结果见图9-76、图9-77。
由图9-76可知，在各超滤分离的组分中，相对分子质量小于5000的组分对DPPH自由基的清除活性最好，其IC50为2.77mg/mL，相对分子质量大于50000的2个组分IC50较高，TSH的IC50为5.52mg/mL，介于大分子多肽（大于5000）和小分子多肽（小于5000）之间。辛建美在酶解金枪鱼碎肉后对水解液进行超滤分离，得到相对分子质量大于10000、5000～10000、小于5000的组分对DPPH自由基的IC50分别为0.7662mg/mL、0.6470mg/mL、0.6541mg/mL，可见其抗氧化效果强于该研究中TSH的超滤组分。总体来看，在TSH的超滤组分中，其清除DPPH自由基的活性随相对分子质量的增大而下降，小分子多肽较大分子的多肽抗氧化活性好。
图9-76　TSH及其超滤组分的DPPH自由基的半抑制浓度（IC50）
图9-77显示，各超滤组分对·OH的清除活性随相对分子质量的增大也呈下降趋势，相对分子质量小于5000的组分活性最强，其IC50为5.48mg/mL，大分子多肽（大于5000）的活性相对较差，2个组分的IC50均大于10mg/mL，而TSH的IC50则介于小分子多肽和大分子多肽之间，为8.28mg/mL。
图9-77　TSH及其超滤组分的·OH的半抑制浓度（IC50）
将超滤所得各组分稀释到浓度为5mg/mL的溶液以测试其还原力。图9-78显示了各超滤组分的还原力，由图9-78可知，大于100000的组分还原力最差，仅为0.444，而小于5000的组分在各超滤组分中还原力最好，其吸光度值为1.301，较TSH的还原力1.054高，其余组分的还原力随分子量增大呈下降趋势，均低于TSH的还原力。当样品浓度介于2.5～10mg/mL之间时，超滤液还原力强于酶解液，而当样品浓度介于1.25～2.5mg/mL之间时，超滤液的还原力弱于酶解液。这可能是由于酶解产物的还原力与水解后暴露出来的氨基酸残基相关，它们可能含有侧链-OH或能提供电子。
图9-78　TSH及其超滤组分的还原能力
TSH在经超滤分离后得到相对分子质量范围不同的组分，各组分间的抗氧化活性存在较大差异且随相对分子质量的增大而下降，其中小于5000的组分抗氧化活性最强。TSH的抗氧化活性低于相对分子质量小于5000的组分但高于相对分子质量大于50000的组分，说明在TSH中，小于5000的组分是其表现抗氧化活性主要成分。因此，选择小于5000的组分进行下一步分离纯化，并记为TSH-1。
5. Sephadex G-25凝胶柱层析分离
TSH-1经Sephadex G-25凝胶柱分离得到6个分离峰，见图9-79。由于Sephadex G-25的分离范围为1000～5000，相对分子质量大于5000的组分一般在洗脱体积小于一个柱床体积时出峰，相对分子质量小于1000的组分由于在凝胶介质中停留时间长，通常洗脱液体积要至少大于1倍柱体积时才能被洗脱下来。从图9-79凝胶分离结果可以初步判定色谱峰1的相对分子质量应大于5000，峰5、峰6的相对分子质量在1000附近或小于1000，峰2～4的相对分子质量介于1000～5000之间。从峰型来看，分离得到的6个峰中，峰1～4的峰宽相对窄，峰5和峰6的峰型较宽，说明是一类分子量较为接近的混合物。各峰的DPPH自由基清除率、还原力及ORAC值见图9-80～图9-82。
图9-79　TSH-1经Sephadex G-25凝胶分离结果
图9-80显示了各峰对DPPH自由基的半抑制浓度，其中峰3、峰4和峰6的IC50相对其他峰较低，分别为0.66mg/mL、0.72mg/mL和0.57mg/mL。峰1、峰2的IC50相对较高，分别为1.18mg/mL和1.20mg/mL。测得TSH-1的DPPH自由基半抑制浓度2.77mg/mL，分析各峰的抗氧化活性较TSH-1均有所提高，其中峰6的活性最强，较TSH-1的活性提高了5倍。相关研究中，Fan等用Sephadex G-25纯化罗非鱼骨架蛋白酶解物中相对分子质量小于1000的组分得到4个分离峰，其中峰4的分子量最小但抗氧化活性最差，峰3的活性最强，其较纯化前粗分的活性提高了1.7倍，纯化效率较高。
图9-80　TSH-1 Sephadex G-25凝胶层析各峰的DPPH自由基的半抑制浓度（IC50）
将凝胶层析所得各峰冷冻干燥，取适量干粉重新溶解并配置成浓度为1mg/mL的溶液以测试其还原力。由图9-81可见，峰6的还原能力为各峰中最强，其吸光度值为（0.407±0.017）。峰1、峰2峰还原力较差，其吸光度值分别为（0.223±0.020）和（0.220±0.008）。
图9-81　TSH-1 Sephadex G-25凝胶层析各峰的还原力
从图9-82可见各峰的抗氧化活性，峰6的抗氧化活性最高，其ORAC值为（1219.65±147.63）μmol t/g （以Trolox当量表示）或（650.07±78.69） mg t/g（以谷胱甘肽当量表示），均高于其他各峰。综上所述，经Sephadex G-25分离纯化后所得组分较TSH-1的抗氧化性均有所提高。
图9-82　TSH-1 Sephadex G-25凝胶层析各峰以谷胱甘肽当量表示的ORAC值
6．反相高效液相色谱（RP-HPLC）分离纯化
TSH-2经分析型反相高效液相色谱分离，分离结果及各分离峰的抗氧化活性（ORAC）分别见图9-83和图9-84。各峰出峰时间、峰面积及峰高见表9-34。
图9-83　TSH-2经RP-HPLC分离色谱图
图9-84　TSH-2 RP-HPLC各峰以Trolox当量表示的ORAC值
表9-34　TSH-2经RP-HPLC分离的出峰时间、峰面积及峰高
TSH-2经RP-HPLC分离纯化后得到8个主要的峰，峰1和峰3的峰型尖窄，信号较强但保留时间较短，峰6和峰7则未完全分开，各峰的ORAC测试结果见图9-84及图9-85。对收集到的8个峰进行ORAC测试，从结果来看，峰7抗氧化性极差，除峰5和峰7的ORAC值低于TSH-2外，峰1的ORAC值与TSH-2接近，其余各峰的ORAC值均高于TSH-2，说明在纯化的过程中得到了抗氧化活性高于原料的组分，但同时也有活性较差的组分被分离出来。峰6的ORAC值最高，水溶性维生素E（2276.05±102.96）μmol/g，谷胱甘肽（1213.84±54.91）mg，峰8的抗氧化性也较强，其ORAC值为，水溶性维生素E（2179.68±31.79）μmol/g，谷胱甘肽（1162.50±16.95）mg/g。
图9-85　TSH-2 RP-HPLC各峰以谷胱甘肽当量表示的ORAC值
五、罗非鱼鱼皮和鱼鳞制备明胶的工艺技术
1．罗非鱼鱼皮明胶的提取工艺
（1）工艺流程
冻罗非鱼皮→解冻→漂洗→NaOH溶液浸泡→漂洗至中性→稀盐酸浸泡→漂洗至中性→熬胶→过滤→干燥→成品。
（2）鱼皮预处理
解冻鱼皮，晾干剪碎按一定比例浸泡于NaOH溶液中，期间不时搅拌，然后浸泡于稀HCl溶液中，不断加快搅拌，使黑膜基本脱净，然后漂洗至中性，沥干。
以明胶得率及凝胶强度为指标，选择浸碱的浓度（A）、浸碱时间（B）及熬胶温度（C） 3个因素，每个因素3个水平，按L9（33）正交表进行试验。正交试验因素水平见表9-35。由正交试验结果（表9-36）及方差分析（表9-37、表9-38）可以得出罗非鱼皮提取明胶的最佳条件：在2.5% NaOH浸泡3.5h，然后用0.02% HCl处理3h，去尽黑膜，再在55 ℃下熬胶提取明胶。
表9-35　正交试验因素水平表
表9-36　正交设计及结果
表9-36　正交设计及结果（续）-1
表9-37　得率的方差分析
表9-38　凝胶强度的方差分析
（3）成品制作
将经前处理过的鱼皮，按鱼皮质量的113倍加入水，恒温条件下熬胶，然后用200目筛过滤得澄清胶液，置于鼓风干燥箱内干燥，得到成品。该方法的明胶提取率为26.5%，所得明胶的粗蛋白质含量为82.46%，凝胶强度高达468g。
2．罗非鱼鱼鳞制备明胶的工艺技术
（1）工艺流程
冷冻罗非鱼鱼鳞→洗涤→切碎→前处理→漂洗→浸酸→漂洗至pH 5～6→熬胶→合并胶液→真空浓缩→60 ℃干燥→粉碎→成品。
（2）操作要点
①原材料的预处理。将购买的带鳞鱼皮解冻，人工刮鳞，将鱼鳞进行清洗、称重、分装、冷冻，备用。
②前处理方法。分别进行碱法（石灰）、酸法（盐酸）、酸盐法（盐酸与硫酸钠）、盐碱法（氢氧化钠与硫酸钠）、酶法（酸性蛋白酶）处理的L9（33）正交试验（表9-39至表9-43），以得率、黏度及凝胶强度为指标，通过直观分析和综合平衡法得出各方法的优化工艺。
表9-39　碱法处理正交试验结果及直观分析
表9-39　碱法处理正交试验结果及直观分析（续）-1
表9-40　酸法处理正交试验结果及直观分析
表9-40　酸法处理正交试验结果及直观分析（续）-1
表9-41　酸盐法处理正交试验结果及直观分析
表9-41　酸盐法处理正交试验结果及直观分析（续）-1
表9-42　盐碱法处理正交试验结果及直观分析
表9-42　盐碱法处理正交试验结果及直观分析（续）-1
表9-43　酸性蛋白酶法处理正交试验结果及直观分析
所用水量为鱼鳞的3倍。为了对前处理方法进行比较，前处理后的提胶工艺pH均为6，并按上述pH单因素试验规定的提胶温度、时间和次数进行提胶。
由正交试验得出各种前处理方法的最佳提取条件：
碱法：用3倍1%的石灰溶液，在温度10 ℃下浸渍鱼鳞4 d，其间在第2 d时更换1次同含量的石灰溶液。
酸法：用3倍浓度为3.5%的HCl溶液，在温度20 ℃下浸渍鱼鳞8h。
酸盐法：用3倍2.5% HCl与5g/L Na2SO4的混合溶液在常温下（23 ℃左右）浸渍鱼鳞12h。
盐碱法：用3倍40g/L NaOH与100g/L Na2SO4的混合溶液，在温度20 ℃下，浸渍鱼鳞8h。
酶法：用3倍0.2%的酸性蛋白酶溶液，调pH至3.5，于35 ℃水浴中酶解鱼鳞1h。
（3）鱼鳞最佳的前处理工艺条件
分别采用以上5种前处理的最优工艺参数对鱼鳞进行前处理，最后以明胶得率、黏度和凝胶强度为指标进行相对比较（表9-44），但从环保方面考虑，以酶法为最佳，条件为：0.2%的酶溶液，调pH至3.5，于35 ℃水浴中酶解1h。
表9-44　鱼鳞提胶5种前处理方法比较
（4）熬胶
1）单因素试验
以较优的前处理方法处理后，经浸酸漂洗后的鱼鳞分别放置在pH为4、5、6、7的热蒸馏水（水量以浸没原料为准）中提胶3次，并分别测定其胶的得率、黏度和凝胶强度。其提取温度、时间如下：第1次提胶温度为60℃，时间为2h，过滤分离胶液；第2次提胶温度为65℃，时间为2h，过滤分离胶液；第3次提胶温度为70℃，时间为3h，过滤，合并3次提取所得胶液。根据表9-45及图9-86的结果，最终确定熬胶pH控制在pH 5～6。
表9-45　鱼鳞熬胶pH单因素试验
图9-86　明胶得率、黏度、凝胶强度随提胶pH变化的趋势
2）温度和时间组合优化试验
在pH 5～6热蒸馏水中提胶，其温度和时间组合分别如下：提胶时间共10h，水量2.5倍，分为5组。
1组：65 ℃加热10h，一次提胶；2组：75℃加热10h，一次提胶；3组：65℃、75℃各加热5h，共分2次提胶；4组：65℃加热3h，70℃、75℃各加热3.5h，共分3次提胶；5组：60℃、65℃、70℃、75℃各加热2.5h，共分4次提胶。根据表9-46和图9-87的结果，最优的温度和时间条件为65℃加热3h，70℃、75℃各加热3.5h，共分3次提胶。
表9-46　鱼鳞熬胶温度、时间的组合优化试验
图9-87　明胶得率、黏度、凝胶强度随提胶温度、时间变化的趋势
（5）真空浓缩、干燥、粉碎
采用旋转蒸发器，在真空度不低于500mm汞柱，温度不超过60 ℃的情况下浓缩，将合并胶液浓缩至20%左右，然后在60 ℃的鼓风干燥箱干燥至明胶含水量14%以下，经粉碎机粉碎，即可得成品明胶。
六、即食型罗非鱼皮休闲食品加工技术
1．水发鱼皮加工工艺技术
（1）工艺流程
罗非鱼鱼皮→刮去鱼鳞和残留鱼肉→清洗→沥水→碱液浸泡→烫漂→冰水浸泡→冷藏（调味或备用）。
（2）操作要点
①前处理：对罗非鱼鱼皮原料进行整理，将鱼皮上的鱼鳞刮掉、残留鱼肉切掉，然后将鱼皮表面的黏液、血渍等清洗干净，置阴凉处沥水。
②碱液浸泡：将沥干水的鱼皮放进已配好的不同浓度的碱液中浸泡4～6h，取出，用清水冲洗多次。
③烫漂：将清水煮沸后，降至90 ℃恒温，鱼皮浸入水中30s后捞出。
④冰水浸泡：将烫漂好的鱼皮迅速放入无菌冰水中浸泡30min，浸泡过程中多次替换无菌冰水至溶液pH为7。
⑤冷藏：把沥干水的鱼皮冷藏于-20 ℃备用。
（3）碱处理条件的筛选
水发后的鱼皮产品应充分膨胀，并能保持鱼皮特有的本色。传统的加工工艺多采用甲醛和高浓度碱液达到这一目的，但该种处理方法多会危及消费者的身体健康，因此，该试验尝试在不使用甲醛的情况下尽可能降低碱液浓度，通过工艺改进使鱼皮达到较好的水发效果。经正交试验，碱处理的最佳组合为A1B3C3，即最优碱处理条件为浸泡温度25 ℃，浸泡时间6h，碱液浓度0.0225g/L。以最佳工艺重复试验结果表明，其水发率为232%。
（4）烫煮温度及时间对产品的影响
在保证质量安全的前提下，产品组织形态、气味、弹性和爽脆度是水发罗非鱼皮品质评定的主要指标，影响产品上述指标的主要因素包括烫煮方式和冷却工艺。因此，该研究分别对烫煮条件和冷却方式进行了研究，结果见图9-88、图9-89。
图9-88　烫煮温度及时间对产品综合评分的影响
图9-89　冷却方式对产品综合评分的影响
由图9-88可见，随烫煮温度的提高，产品的综合评分呈上升趋势，在90 ℃时评分达到最大值，而后评分逐渐下降；在相同温度下烫煮不同时间，产品的评分也不尽相同，当温度低于85 ℃时，烫煮60 s后产品的综合评分略高，当温度达到并超过90 ℃，烫煮60 s后产品的综合评分反而低于30 s的结果。这是因为温度低时，加热时间过短无法将产品熟化，鱼皮卷曲效果差，鱼皮口感较硬，温度升高到90 ℃时，可以在较短的时间（30 s）将产品熟化，鱼皮脆爽有弹性，鱼皮充分卷曲，但温度继续升高，鱼皮在很短时间里会熟化过度，软烂。因此，确定最合理的烫煮温度为90 ℃，烫煮时间为30 s。
罗非鱼皮具爽脆有弹性的特点，采用低浓度的碱液浸泡及烫煮后，在冰水中浸泡的时间要控制好，若浸泡时间不够，则弹性不够好。由图9-89可见，4种冷却方式中以冰水冷却效果最好，可以较好的保证产品的卷曲状态，在一定程度上增加产品的脆爽度；常温水和常温盐水的冷却效果最差，冷却后的产品变软，无法保持鱼皮烫煮后的卷曲状态。这是由于鱼皮的主要成分是胶原蛋白，其特点是冷却会形成凝胶，从而利于烫煮后鱼皮形状的保持，浸泡时间过短产品未能完全冷却，致使产品弹性差。从图9-86可知，冰水浸泡20min的效果最好。经上述工艺处理后的产品基本保持其原有的形态；鱼味正常、无异味、有弹性、不糜烂、不僵硬。
（5）储存时间对产品保质期的影响
为了保证水产食品的卫生安全，将水发罗非鱼皮成品于4 ℃储存在1 d、5 d、15 d、30 d分别测定其菌落总数、大肠杆菌群、致病菌。结果表明，成品在4 ℃的环境下保存30 d，其微生物细菌总数仍低于国家食品卫生标准规定指标，大肠菌群和致病菌未检出，因此，产品质量符合食品卫生标准。
（6）最佳水发鱼皮工艺条件
经过试验筛选出最佳工艺条件为：鱼皮在25 ℃下，浓度为0.0225g/L的碱液中浸泡6h，达到最佳水发效果，然后在90 ℃恒温烫漂30s，最后用无菌冰水浸泡至pH7，于4 ℃下贮藏在30 d。在此工艺条件下生产的水发罗非鱼皮，口感爽脆，质量最佳。
2．油炸鱼皮
（1）工艺流程
原料处理→清洗→沥水→切块→添加调味料→浸泡→油炸→沥油、冷却→称重、包装→成品→贮藏。
（2）操作要点
①原料处理。对罗非鱼鱼皮原料进行整理，将鱼皮边上残留的鱼鳞、残留鱼肉刮掉，然后将鱼皮表面的黏液、血渍等清洗干净。取出后置阴凉处沥水。②把沥干水的鱼皮切块，每块大小规格约为5cm×8cm的小段。③把鱼皮分成3组，每组约重0.25kg，分别添加3种糊状混合调味料，然后浸泡。④把浸泡后的鱼皮放进沸油中，炸至鱼皮呈金黄色，出锅沥油，在常温下自然冷却。⑤将冷却后的鱼皮称重，每袋为50g，装入复合薄膜袋，用0.08～0.10 MPa真空封口机封口，即为成品，放在常温下保藏。
第四节　罗非鱼鱼骨制备活性钙的加工技术
一、罗非鱼鱼骨制备鱼骨粉的方法
1．脱肉方法比较
原料鱼骨含有大量鱼肉，直接干燥制成的骨粉产品腥味重，蛋白质及脂肪含量高，不符合食品级骨粉的质量要求。因此，石红等比较了沸水浴蒸煮20min、1%（W/W）枯草蛋白酶50 ℃水解6h、120 ℃高压蒸煮处理30min以及1%（W/W）枯草蛋白酶50 ℃水解6h后120 ℃高压蒸煮处理30min对鱼骨原料中肉质的去除效果，结果显示（表9-47）：鱼骨下脚料经煮沸或高压蒸煮处理后可以去除大部分鱼肉，但鱼骨表面及鱼骨之间仍残留有部分鱼肉，不利于鱼骨的净化，经此工艺处理制得的鱼骨粉颜色呈黄色或黄褐色，两种处理方法均存在较重的鱼腥味；下脚料经酶解处理后，鱼肉去除效果较好，但鱼脊骨部分仍存在胶质样物质，这些物质在一定程度上仍会影响鱼骨粉产品的颜色和腥味；进一步采用高压处理可使这些胶质样物质与骨分离，使骨变得洁白，腥味明显降低。高压处理可以将鱼骨中的蛋白质和脂肪含量由酶解后的32.2%和3.24%降低到15.0%和1.76%，蛋白质和脂肪的去除率接近一半。
表9-47　几种脱肉方法的效果比较
2．水解度对鱼骨粉质量影响
研究表明，水解对鱼骨中肉的去除状况影响较大，为确定合理的水解时间，石红等以鱼骨为原料，加入1%（W/W）枯草蛋白酶50 ℃水解不同时间，将水解后的鱼骨干燥、制粉，并测定骨粉蛋白质含量及产品色泽，以分析水解度对这些指标的影响，结果见表9-48。由表9-48可知，水解前6h，随水解时间的延长，原料水解度增加，制得的骨粉蛋白质含量降低；6h时原料水解度约为15%，此时大部分鱼骨彼此分开，有少量鱼排仍粘连在一起，骨粉蛋白质含量约为29.20%；水解时间大于6h，原料水解度及蛋白质含量变化差异不明显（P<0.05）。水解时间对产品干燥后的色差L*影响不大，但对其a*值、b*影响则比较明显，总体趋势为初期随水解时间延长，骨粉的a*值、b*值降低，水解6h以后a*值、b*降低程度差异不明显（P<0.05）。分析结果表明，骨粉的颜色变化与其蛋白质含量呈正相关，蛋白质含量越高，骨粉颜色越深，反之亦然。
表9-48　水解对鱼骨粉质量的影响
3．高压处理的作用
（1）高压处理对产品质量的影响
高压蒸煮不但可以进一步去除水解后残留的蛋白质和脂肪，改善产品的颜色，还可以使骨酥化，有利于骨的粉碎。为确定合理的高压蒸煮条件，石红等将1%（W/W）枯草蛋白酶50 ℃水解6h后的鱼骨样品于120 ℃进行高压蒸煮、干燥、粉碎后制粉。结果表明（表9-49）：随高压蒸煮时间的延长，脂肪和蛋白质含量呈下降趋势，其中高压蒸煮10min产品脂肪和蛋白质含量约减少一半，20min后蛋白质和脂肪降低的趋势减弱，至30min产品脂肪和蛋白质含量降低程度差异不明显（P<0.05）。高压可以赋予产品良好的色泽，但高压处理时间对颜色的影响不明显，由表可知产品经高压处理后L*值明显增加，产品b*值及a*值均下降，产品由淡黄色转为白色。高压处理时间过短时（<10min），干燥后的鱼骨骨质较硬，不易折断，而处理20min以后的骨质脆易折断。
表9-49　高压处理时间对产品品质的影响
（2）高压处理对粉碎效果的影响
高压可以改变骨质的脆性，势必对产品的粉碎效果产生一定的影响。为探讨高压处理对鱼骨粉碎效果的影响，将80目、100目、140目、180目、200目的筛网由上到下依次叠放，取上述不同高压处理时间制得的鱼骨100g，于相同条件下粉碎相同时间后过筛，收集通过各筛网的骨粉样品，称重后计算其所占比例。结果表明（图9-90）：所有鱼骨样品粉碎粒度分配趋势相同，即80目、100目及200目收集的样品较多，而140目及180目收集的样品较少。但随高压蒸煮时间的延长，鱼骨粉碎细度增加，80目及100目收集的样品比例随高压处理时间的延长而降低，200目收集的样品比例则随高压处理时间的延长而升高，说明高压处理有利于鱼骨的细化过程。但高压处理时间超过30min，不会再明显增加产品的粉碎细度，因此，选择将酶解后的样品于120 ℃下进行高压处理30min。
图9-90　高压处理对的影响产品粉碎效果
（3）高压处理对骨粉Ca含量及Ca溶解度的影响
由图9-91可知，鱼骨经高压处理后制得的骨粉Ca含量略有升高，这是因为高压可以去除部分残留蛋白质及脂肪，而且随着高压处理时间的延长，鱼骨粉产品在HCl溶液（pH 4）中的钙溶解度增加（图9-92）。其中，高压20min样品中钙的溶解度为40.3mg/L，高压30min后样品的溶解度增加至46.6mg/L，继续增加高压处理时间，钙溶解度的增加趋势变缓，40min后样品的溶解度增加至48.4mg/L。钙溶解度增加的原因可能是高压处理使骨粉的细度增加，从而促进其中钙的溶解，这一现象进一步说明高压有利于骨的粉碎过程。因40min高压对钙的溶解度、骨的粉碎情况等指标的影响差异不明显，结合经济原因，选择30min高压作为合理的处理时间。
图9-91　高压对鱼骨粉钙含量的影响
图9-92　高压对鱼骨粉HCl溶解度的影响
4．鱼骨粉产品质量指标
根据上述研究确定鱼骨粉制备的最佳试验条件为：将鱼骨经1%（W/W）枯草蛋白酶50 ℃水解6h，120 ℃高压蒸煮30min，微细粉碎后过200目筛网。测定所得产品的质量指标，结果见表9-50。可见，该法制得的鱼骨粉钙含量为31.5%，磷含量为15.8%，二者的比例约为2∶1，粗蛋白质和脂肪含量相对较低，分别为11.88%和0.89%，产品细度小于200目。
表9-50　鱼骨粉产品质量指标
二、罗非鱼骨制备有机活性钙技术
1．罗非鱼骨中提取钙的正交试验
通过正交试验，由表9-51可以看出温度的因素极差最大，在121 ℃高温下提取率最高，而柠檬酸和苹果酸的比例是第二大影响因素，以两者之比为3∶2最好，时间的影响较小，其中在1h的提取效果较好。综合上述分析最佳的提取条件是A3B2C3，即将罗非鱼骨粉放在柠檬酸和苹果酸（3∶2）混合溶液中，在121 ℃的高温下提取1h，经重复试验表明，在最佳条件下钙的提取率达到92.1%。
表9-51　罗非鱼骨中钙提取的正交试验
表9-51　罗非鱼骨中钙提取的正交试验（续）-1
采用该法从鱼骨中提取钙比薛长湖教授等采用的乳酸和盐酸混合提取鳕骨钙的钙提取率高，而且风味好，有柠檬酸和苹果酸的清香风味，鱼腥味较淡，而采用乳酸和盐酸提取的产品有不愉快气味。
2．两种钙剂在不同条件下的溶解度比较
从表9-52可见，当pH为中性时，碳酸钙的溶解度均远远小于CMC活性钙，而当pH为4时，CMC活性钙迅速全部溶解，而碳酸钙只是部分溶解。CMC活性钙在煮沸的水中基本溶解，其溶解度为88%。由于钙盐的溶解性同钙的吸收率有关，钙以离子状态吸收，在机体内也以离子状态参与生命活动，因此，以有机酸制取的活性钙比用无机酸制取的钙溶解度大，人体对钙的吸收相应高了一些。CMC活性钙的溶解性明显优于碳酸钙，可见其吸收率亦较好。
表9-52　钙剂的溶解度比较
3. CMC活性钙粉的生物利用
（1）CMC活性钙剂对大鼠增重的影响
采用相同成分和含量、仅钙剂来源不同的人工合成饲料饲喂大鼠，喂养28 d，对大鼠增重的影响和饲料利用率的测定结果见表9-53。低钙对照A组的大鼠体重增长和饲料利用率均显著低于各补钙组，而且表现出脱毛、易受惊、四肢无力等特征，提示缺钙是影响机体正常生长的重要因素。喂养CMC活性钙的B组体重增长和饲料利用率与喂养碳酸钙的C组无显著性差异（P>0.05），这两组大白鼠的体重呈稳定增长趋势，皮毛光滑柔顺，精力旺盛。测定结果表明CMC活性钙的生物效价略高于碳酸钙。
表9-53　试验大鼠体重增加与饲料利用率的关系
（2）CMC活性钙剂对大鼠钙代谢的影响
不同来源钙剂对大鼠钙代谢的结果列于表9-54。由此可看出，低钙对照A组与其他两组相比，有显著的差异。喂养CMC活性钙的B组无论在吸收率、存留率或股骨钙含量上均高于喂养碳酸钙的C组，表明补钙可有效改善大鼠骨质的钙化状况，维持血钙在正常的范围之内。说明CMC活性钙在体内可被良好的吸收，这与Miller等报道健康青春期受试者对柠檬酸苹果酸钙的平均吸收率高于碳酸钙相吻合。
表9-54　大白鼠钙代谢测定结果
三、罗非鱼鱼骨制备氨基酸螯合钙技术
1．酶解条件研究
（1）酶解效果及骨粉钙含量的测定
罗非鱼鱼头鱼排的成分含量：水分含量60.66%，蛋白质含量10.31%，总氮含量1.65%。由试验得出罗非鱼下脚料酶解后的出骨率为9.30%，蛋白质水解度（DH）为25.45%。用电导滴定法测出的骨粉中钙含量为27.48%。
（2）菌种配比及底物形式的筛选
从表9-55和图9-93可以看出，骨粉加酶解液的形式（第1组）下发酵的效果（RCa=13.5128，转化率45.74%）远比单用骨泥发酵（第2组）的效果（RCa=10.1596，转化率36.97%）要好；而在菌种配比上，两种菌种复配的效果要比单一菌种发酵好，复配比为嗜热乳酸链球菌∶嗜酸乳杆菌 = 2∶1（第6组）的效果（RCa=14.1116，转化率47.77%）最优。
表9-55　菌种配比及底物形式的筛选
图9-93　发酵底物和菌种配比的筛选
因为鱼骨经磨成粉状后，与发酵液及菌种的接触面积大大增加，使其转化率有了显著的提高。另外，鱼排酶解液含有丰富全面的营养物质，蛋白质经酶解后降解成氨基酸或小分子蛋白质，对乳酸菌的生长更有利；以酶解液为原料发酵所得的钙制剂，钙磷比接近2∶1，更有利于人体的吸收。
（3）正交试验选择最优发酵条件
乳酸菌接种量 （A） 、鱼骨粉浓度（B）、蔗糖添加量（C）、骨粉粒度（D）4因素及其相互作用的正交试验结果与极差分析见表9-56。由此可见，第13组A2B1C3D2所得发酵液中活性钙的转化率最高，达到83.09%。根据极差分析，A2B1C3D3是最优的发酵条件组合。4个因素对钙转化的影响大小如下：B>D>A>C，而它们之前的相互作用对钙转化的影响相对较小，B及D为主要影响因素。由于蔗糖添加量对试验结果影响不大，考虑到生产成本问题，建议采用5%添加量较佳。
表9-56　L18（37）正交试验表
接种量的大小直接影响骨粉钙的转化率，接种量越大，菌种对骨钙的游离作用也越彻底，从而提高游离钙的溶出量。骨粉浓度高，所得发酵液中游离钙的浓度高，但相对的转化率偏低，所以，如果单从转化率上看，骨粉浓度越小，骨钙转化率越高。蔗糖可以为乳酸菌提供足够的碳源，保证乳酸菌的生长，从而达到提高骨钙转化率的效果。
（4）发酵时间对钙转化的影响
不同的发酵条件，随着菌种的活性和发酵液中营养成分及生长环境的改变，乳酸菌对活性钙的转化速率也会发生改变。由表9-57和图9-94可以看出，随着发酵天数的增加，钙转化率也在增长。第5天时钙转化率已高达85.71%，但当发酵到第6天时，钙转化率的增长曲线出现了一个拐点，增长放缓。因此，综合生产实际，考虑生产成本，发酵天数为5d最佳。
表9-57　发酵时间对钙转化的影响
图9-94　不同发酵时间对钙转化率的影响
2．螯合条件的优化
（1）不同pH对螯合反应的影响
由图9-95可知，在酸性比较强的条件下螯合率很低，在pH6～8范围内时螯合率较高，为31.26%～36.24%，在碱性比较强的情况下螯合率也比较低。其原因可能是当反应液中存在大量的H+，H+需要大量的供电基团以形成稳定的物质，与Ca2+争夺供电基团，从而会减少Ca2+的供电集团，减少螯合物的形成。在碱性比较强的情况下，OH+与钙离子形成的氢氧化钙沉淀，其稳定系数大于螯合钙，从而大大减少了螯合钙的形成。
图9-95　pH对螯合率的影响
（2）不同螯合温度对螯合反应的影响
由图9-96可知，温度对螯合率的影响非常显著，在温度比较低的情况下，螯合率比较低，在温度到达60 ℃时螯合率最高，为54.74%。而高于60 ℃时，螯合率开始下降。由此可见，在温度比较低的情况下，反应体系提供的能量不够，不能使反应充分进行，从而导致螯合率相应减少。在温度较高时，反应体系产生的螯合物在高温下会发生一定程度的分解，减少了螯合物的形成，导致螯合率的下降。
图9-96　温度对螯合率的影响
（3）不同反应时间对螯合反应的影响
由图9-97可知，随着时间的延长，螯合率在不断上升，当反应时间为90min，螯合率达到最大55.62%。之后，随着时间的延长，螯合率开始下降，当反应时间为120min，反应基本上达到平衡。当反应时间延长至150min，螯合率没有太大的变化。在反应时间相对比较短的情况下，螯合反应没有充分完成，因而螯合率相对较小。在反应时间相对较长的情况下，螯合产物会有一定程度的分解，从而导致螯合率的下降。
图9-97　时间对螯合率的影响
（4）氨基态氮浓度对螯合反应的影响
由图9-98可知，当氨基态氮浓度较低时，螯合率也较低，但随着氨基态氮浓度的上升，螯合率在不断上升，当氨基态氮的浓度为1.6g/L时，螯合率达到最大，为56.62%。当氨基态氮的浓度大于1.6g/L时，螯合率反而下降，其原因可能是氨基酸与钙的螯合反应存在一个最适比例，大于或小于这个最适比例都会影响螯合率的大小。
图9-98　氨基态氮浓度对螯合率的影响
（5）多元线性回归试验结果及分析
采用多元线性回归试验设计，试验结果见表9-58。应用SPSS软件分析，得到螯合率与因素编码值之间的回归方程：Y=53.09 + 1.22X1+1.38X2-0.29X3+1.60X4。从表9-59可以看出，回归模型的F值为4.9，F<0.05，说明所得的回归方程拟合的较好，回归效果显著，因此用此回归方程模型来模拟pH、温度、时间、氨基态氮浓度这4个因素与指标值之间的关系是可行的。通过单因素试验和多元线性回归正交组合设计试验的综合对比，优化得到螯合率较高的最佳工艺为多元线性回归正交组合设计中的第9组，即pH为7.0，温度为60 ℃，时间为90min，氨基态氮浓度为1.6g/L。
表9-58　螯合试验结果
表9-58　螯合试验结果（续）-1
表9-59　回归方程方差分析
3．氨基酸钙粉的生物利用研究
（1）氨基酸螯合钙浓缩液还原能力的测定结果
由图9-99可以看出，在0.1～0.7mL的体积范围内，氨基酸螯合钙浓缩液的还原能力随着体积的增大呈缓慢上升趋势。当体积大于0.7mL时，氨基酸螯合钙浓缩液的还原能力随着体积的增大呈快速上升趋势。这可能是反应存在累积效应，当积累到一定量程度时，反应会突破阈值，速度会加快。
图9-99　氨基酸螯合钙浓缩液还原能力测定
（2）氨基酸螯合钙浓缩液对羟自由基的清除率
当加入0.5mg/mL的抗坏血酸0.5mL时，对羟基自由基的清除率为6.62%，而氨基酸螯合钙浓缩液对羟基自由基的清除率为6.60%，说明浓缩液清除自由基的效果和0.5mg/mL的抗坏血酸效果相当（图9-100）。
图9-100　氨基酸螯合钙浓缩液对羟基自由基的清除率
（3）氨基酸螯合钙浓缩液对超氧阴离子的抑制作用
用动态方法测得反应的对照品的速率回归方程为：V对照 =0.060X+0.057（R2=0.998），样品的速率回归方程：V样品=0.029X+0.081（R2=0.999）。所以，当氨基酸螯合钙浓缩液的加入量为0.1mL时，对超氧阴离子的抑制率为51.67%。因此，氨基酸螯合钙浓缩液对超氧阴离子的抑制率效果比较好。
第五节　罗非鱼内源酶提取技术
一、罗非鱼内脏中酶的筛选体系
1．罗非鱼内脏中各酶提取及测定结果分析
（1）蛋白酶
国内外对蛋白酶的研究比较多，主要是因为它的水解作用对工业、农业生产有着重要的应用价值，现在对蛋白酶的应用领域还应用到了医药生产。可见，今后对蛋白酶的应用领域将会越来越广泛。研究表明，每克罗非鱼肠可以提取的蛋白酶活性为790 U，而从每克无花果果实和蛇鲻鱼肠提取到的蛋白酶活性分别为130 U和490 U。从提取蛋白酶活的量上来看，罗非鱼肠道中含有的蛋白酶比较丰富。因此，罗非鱼肠具有比较大的提取蛋白酶的前景。
（2）脲酶
鱼类可以对尿素进行利用，因此，在鱼类的肠道中可能存在有脲酶。将其提取后添加入动物的饲料中可以提高动物对尿素的利用，从而达到节约氮源节约能源的目的。将从罗非鱼肠道提取出的脲酶与鲤肠和团头鲂肠中的提取得到的脲酶比较。从每克罗非鱼肠中可以提取0.019 U脲酶酶活，而从鲤肠和团头鲂肠中可能得到0.121 U和0.144 U。罗非鱼肠中脲酶的含量较少，与鲤肠和团头鲂肠中的酶活几乎相差一个数量级。
（3）超氧化物歧化酶
超氧化物歧化酶（SOD）是生物体内一类重要的自由基清除剂，使自由基的形成和清除处于动态平衡，从而可抵御O-2·的毒害作用。近年来，国内外不断报道SOD可作为药用酶治疗人体的多种疾病，如炎症、肺水肿、自身免疫性疾病等，而且还具有抗肿瘤、防衰老等作用，因此，SOD的研究和应用已受到广泛的重视。
将从罗非鱼肝脏中提到的SOD酶活性与鳗鱼肝和蜂王浆提到的SOD酶活性进行比较。每克罗非鱼肝可以提取1958 U酶活性，在鳗鲡肝和蜂王浆提取的酶活性分别为1520 U和44 U。从试验结果看到在罗非鱼肝中SOD的含量比较丰富，因此可提取利用的价值比较高。
（4）胆碱酯酶
胆碱酯酶是神经系统中一种重要的水解酶。对有机磷化合物作用特异性强，灵敏度高，在军事分析化学、食品卫生、农业化学工业、环境检测等领域有着较为广泛的用途，日益受到人们的关注。
将从罗非鱼肝脏中提到的胆碱酯酶的酶活性与鳗鲡肝和鳗鲡头提到的胆碱酯酶的酶活性进行比较。每克罗非鱼肝可以提取的酶活性为231 U，在鳗鲡肝和鳗鲡头提取的酶活性分别为157 U和64 U。罗非鱼肝脏中胆碱酯酶的含量要高于鳗鲡肝和鳗鲡头，且胆碱酯酶又是一种非常稀缺的酶。所以从罗非鱼肝脏中有较高的提取胆碱酯酶的价值。
（5）乙酰胆碱酯酶
在农药被大量用于农作物时，需要一种快速而准确的检验药残的试剂满足人们的需要。乙酰胆碱酯酶可以与有机磷和氨基甲酸酯类农药的活性部位快速不可逆地结合，使酶失活。利用这一特点，人们常用乙酰胆碱酯酶来检测有机磷和氨基甲酸酯类农药污染的情况。
将从罗非鱼头中提到的乙酰胆碱酯酶酶活性与黃鱼脑和猪血块提到的酶活量进行比较。每克罗非鱼头可以提取13.2 U酶活性，黃鱼脑和猪血块提到的酶活分别为252 U和9.1U。罗非鱼头中乙酰胆碱酯酶的酶活性不多。
（6）碱性磷酸酶
碱性磷酸酶是一种底物专一性较低的磷酸单酯酶，广泛存在于人体、动物、植物与微生物中，在生物体内直接参与了磷酸基团的转移和代谢过程。碱性磷酸酶可用于核酸研究、毒物学研究及医学研究。由于有益于皮肤细胞的再生和新陈代谢，该酶还可添加到药用化妆品中。为了满足生产实践上的需要，罗非鱼肝脏被用来提取碱性磷酸酶。
将从罗非鱼肝脏中提到的碱性磷酸酶的酶活性与鳗鲡肝提到的碱性磷酸酶的酶活性进行比较。每克罗非鱼肝可以提取1800 U酶活性，在鳗鲡肝提取的酶活性为2050 U。碱性磷酸酶在罗非鱼肝脏中的含量虽然不如鳗鲡肝中的酶活性，但是仍表现出了比较高的活性故仍具的较高的提取价值。
（7）凝乳蛋白酶
凝乳酪在干酪加工和酸凝乳加工中作为凝乳剂被广泛使用。传统方法提取凝乳酶是从犊牛皱胃作为原料进行提取和加工的。近年来，犊牛价格上涨很快，犊牛皱胃来源受到影响。因此，从经济上考虑，我们在实验室中希望可以从罗非鱼的内脏中提取出凝乳蛋白酶作为犊牛皱胃的替代品。
将从罗非鱼内脏中提到的凝乳蛋白酶活量与小牛皱胃中提取到的酶活量进行比较。每克罗非鱼肝脏仅提取75 U的酶活性，而在小牛皱胃中酶活性为5359 U，与它相差了近2个数量级。因此，罗非鱼肝脏不具有提取凝乳酶的价值。
（8）酸性磷酸酶
2．罗非鱼内脏中酶的筛选结果
罗非鱼内脏中酶的筛选结果：蛋白酶、超氧化物歧化酶、胆碱酯酶和碱性磷酸酶具有较高的活性，对其进行开发研究具有较大的意义。
3．罗非鱼肠道中蛋白酶的分析
蛋白酶在罗非鱼肠道中的含量较为丰富，具有较高的提取利用价值，因此需要对肠道各部分蛋白酶的分布进行探讨。分别称取等量的罗非鱼胃、前肠、中肠和后肠，加入等体积的提取缓冲液，分别测定出肠道各部分蛋白酶的含量，酶活性用以OD275nm的值表示，结果见表9-61。蛋白酶主要存在于罗非鱼肠中的胃和前肠部分。食物中的蛋白质主要在罗非鱼的胃、前肠部分被消化分解，而中肠和后肠主要是起吸收营养的作用，故所含的酶量较少。
表9-61　罗非鱼肠道各部分蛋白酶的测定
4．罗非鱼肝脏中超氧化物歧化酶与碱性磷酸酶的分析
超氧化物歧化酶与碱性磷酸酶在罗非鱼肝脏中的含量较为丰富，具有较高的提取利用价值。以罗非鱼肝脏为原料，分别提取超氧化物歧化酶与碱性磷酸酶进行分析，结果见表9-62。
表9-62　罗非鱼肝脏中超氧化物歧化酶与碱性磷酸酶的测定
二、罗非鱼内脏蛋白酶超声波提取工艺技术
1．提取方式对蛋白酶活性的影响
在相同pH缓冲液匀浆破碎条件下，分别采用低温浸提法（4℃）和超声波法，提取罗非鱼胃蛋白酶和肠蛋白酶，在相同处理时间下，测定酶活性，结果如图9-101、图9-102所示。不管是胃蛋白酶还是肠蛋白酶，采用超声波法进行得取效果明显优于低温浸提法。随着提取时间的延长，超声波法提取的蛋白酶活性有所下降，而低温浸提法是处理90min比60min时酶活性有所提高，但到120min之后酶活性趋于稳定。
图9-101　不同提取方式对胃蛋白酶的影响
图9-102　不同提取方式对肠蛋白酶活性的影响
2．超声波法提取罗非鱼内脏蛋白酶工艺条件研究
（1）缓冲液pH的影响
从罗非鱼胃中提取的胃蛋白酶缓冲液pH要求是酸性的，由图9-103可以看出，在pH 1～3提取的胃蛋白酶的活性最高，随着pH的升高，提取的胃蛋白酶活性明显降低。而从罗非鱼肠中提取的蛋白酶所需缓冲液pH是弱碱性的，在pH 7～8，蛋白酶活性最高，当pH<6时，酶活性较低，当pH>9时，酶活性下降明显。
图9-103　缓冲液pH对蛋白酶活性的影响
（2）提取温度的影响
由图9-104可以看出，提出温度对蛋白酶活性有影响，其中从胃中提取的胃蛋白酶活性随着提取温度的升高呈缓慢下降趋势，在20℃左右提取的蛋白酶活性较高；从肠中提取的蛋白酶活性随温度的变化明显，在25～35 ℃提取的蛋白酶活性较高。
图9-104　提取温度对蛋白酶活性的影响
（3）提取时间的影响
从图9-105可以看出，提取时间对蛋白酶活性有明显的影响，胃蛋白酶的活性开始时随提取时间的增加不断上升，到了55～70min酶活性最高，其后随时间的延长而下降。而从肠中提取的蛋白酶活性在80～90min时最高。
图9-105　提取时间对蛋白酶活性的影响
（4）超声波强度的影响
超声波强度对从肠中提取的蛋白酶活性有明显的影响（图9-106），在超声波强度为70 W时，活性最高，随着超声波强度的增强，曲折下降。而从胃中提取的蛋白酶活性在超声波强度为60～90 W时，相对较高，当超声波强度高于90 W时，蛋白酶活性明显降低（图9-106）。
图9-106　超声波强度对蛋白酶活性的影响
（5）超声波法提取罗非鱼胃蛋白酶的工艺条件优化
通过单因素试验比较提取过程不同因素对蛋白酶活性的影响，由于各因素之间相互交叉影响，因此，为全面考察工艺的最佳参数条件，根据单因素试验的结果，确定以提取的温度（A）、超声波强度（B）、缓冲液pH（C）、提取时间（D）4个因素为试验因素，以提取的蛋白酶活性为试验指标，进行正交试验。
超声波法提取罗非鱼胃蛋白酶的因素水平见表9-63，试验结果及极差分析见表9-64、表9-65。由分析可知，影响超声波提取罗非鱼胃蛋白酶的主要因素是B、A，次要因素是D、C。按最优组合是A2B1C1D2，即缓冲液pH为1，提取温度为25 ℃，提取时间为60min，超声波强度为70 W。
表9-63　影响罗非鱼胃蛋白酶提取的因素水平表
表9-64　罗非鱼胃蛋白酶超声波提取条件正交试验结果
表9-65　方差分析
（6）超声波法提取罗非鱼肠蛋白酶的工艺条件优化
超声波法提取罗非鱼肠蛋白酶的因素水平表见表9-66，试验结果及极差分析见表9-67、 表9-68。由分析可知，影响超声波提取罗非鱼肠蛋白酶的主要因素是A、B，次要因素是C、D。按最优组合是A3B2C1D3，即缓冲液pH为7.5，提取温度为35℃，提取时间为85min，超声波强度为70 W。
表9-66　影响罗非鱼肠蛋白酶提取的因素水平表
表9-67　罗非鱼肠蛋白酶超声波提取条件正交试验结果
表9-68　方差分析
三、罗非鱼肠蛋白酶的分离纯化与性质
1．罗非鱼肠蛋白酶的硫酸铵分级盐析条件
采用硫酸铵分级盐析法初步纯化蛋白酶的结果见图9-107，当（NH4）2SO4饱和度为30%时，离心上清液中蛋白酶活性，用OD275nm表示为0.710。酶活性与初值相比，几乎保持不变。而蛋白质浓度，用OD595nm表示为0.119，即只有初始值的14%。当（NH4）2SO4饱和度为70%时，上清液中蛋白酶活性，用OD275nm表示只有0.011，说明上清液中酶活力基本失去。所以确定肠蛋白酶硫酸铵分级沉淀的硫酸铵饱和度为30%～70%。
图9-107　硫酸铵分级盐析分离蛋白酶
2．离子交换层析纯化罗非鱼肠蛋白酶的条件
第一章　概述
第一节　罗非鱼养殖生产情况
罗非鱼（Tilapia）隶属硬骨鱼纲、鲈形目、鲈形亚目、鲡鱼科，有100多种。罗非鱼原产非洲，是一种热带中小型鱼类，其生命力强，适宜于淡水、海水的网箱和流水高密度集约化等养殖方式。
我国的罗非鱼养殖业发展迅速，产量从2003年的89.2万t增加到2013年的165.8万t，年均增长率为8.6%，稳居世界首位，是我国最具国际竞争力的品种，也是最具产业化发展条件的品种（农业部渔业局，2004－2013；农业部渔业渔政管理局，2014）。目前，广东、广西、海南、福建、云南等地罗非鱼养殖业发展势头迅猛，并带动了种苗、饲料、加工、贸易等相关产业的发展。除了鲜食外，我国罗非鱼的加工业近年来也得到了较快的发展，罗非鱼产品出口量迅速增长。但罗非鱼产品主要是冻鱼片和冻全鱼，这些产品的加工水平较低，品种单一，附加值不高；而且罗非鱼在加工过程中产生50%～60%的下脚料没有得到充分利用，其中，鱼鳞、鱼皮占5%～6%，鱼排占10%～13%，鱼头占16%～18%，鱼下巴占12%～14%，内脏占7%～9%。因此，有必要提高罗非鱼的精深加工水平和综合利用能力，开发品种多样的罗非鱼系列产品，开拓国内外罗非鱼消费市场，提高罗非鱼产业的经济效益。
1997年，罗非鱼成为继我国内地传统养殖种类鲢（Hypophthalmichthys molitrix）、草鱼（Ctenopharyngodon idellus）、鳙（Aristichthys nobilis）、鲤（Cyprinus carpio）、鲫（Carassius auratu）之后、排第六位的主要淡水养殖鱼类。自20世纪90年代中期以来，我国罗非鱼产量逐年增长，尤其是进入21世纪以来，我国罗非鱼养殖迅猛发展。2003－2013年我国罗非鱼产量见图1-1（农业部渔业局，2004－2013；农业部渔业渔政管理局，2014）。
图1-1　2003－2013年我国内地罗非鱼产量增长趋势
罗非鱼在我国内地的养殖主要分布在广东、广西、海南、福建、云南等省（自治区），2013年我国各地区罗非鱼养殖产量见表1-1。2013年罗非鱼主要产区的产量占全国罗非鱼总产量的百分比分别为：广东42.2%，广西17.3%，海南21.4%，福建7.7%，云南7.4%，5个主要产区的罗非鱼产量占全国总产量的96.0%。
表1-1　2013年全国各地区罗非鱼养殖产量（t）
第二节　罗非鱼的加工现状
罗非鱼肉呈白色，具有易于切片、刺少、无腥味、味道纯美、适合不同方式烹调等许多优点，越来越为欧美等高值鱼类消费群体所青睐。目前，罗非鱼加工产品主要为冻罗非鱼片，其贮藏期长，食用方便，非常适合欧美市场的需求，利润也比条冻罗非鱼高。2005年起，我国冻罗非鱼片出口量超过了条冻罗非鱼出口量，标志着我国罗非鱼出口产品结构和价位的提升。冻罗非鱼片的加工工艺为：原料鱼→暂养→宰杀→放血→剖片→去皮→磨皮→修整→杀菌→冻结→冻罗非鱼片成品。鲜、冷罗非鱼片的价值远高于冻品，而且减少了冷藏保管费和速冻加工费，具有显著的经济效益，因此，近年来在保证鲜、冷罗非鱼片品质方面也做了较多研究。李来好等通过研究罗非鱼片贮藏过程中气味、肌肉弹性、色差、菌落总数及嗜冷菌、pH、总挥发性盐基氮（TVB-N）、液汁流失率等指标的变化情况，分析比较了冰温气调技术与其他保鲜方法对罗非鱼片质量影响的差异。研究结果表明，冰温与气调包装在贮藏过程中起到了协同保鲜的作用，比单独采用冰温或气调保鲜方法分别延长了3d和6d的货架期，比传统空气冷藏保鲜方法延长了约4倍时间的货架期。李杉等研究了在冰温条件下，不同充气比率的气调包装对贮藏期和品质的影响，气体组成均为70%二氧化碳（CO2）和30%氮气（N2），充气体积（V）与鱼片质量（m）比率为（3～4）∶1能明显抑制微生物的生长繁殖，保持鱼片的新鲜度，且对样品的感官色泽影响程度最小，并有效延长了鲜罗非鱼片的货架期。
我国罗非鱼出口产品按海关编码划分，有活罗非鱼（03019991），鲜、冷罗非鱼（03026940），冻罗非鱼（03037940），冻罗非鱼片（03042910），盐腌及盐渍的罗非鱼（03056940）和制作或保藏的罗非鱼，整条或切块（16041920）等出口产品品种，我国出口罗非鱼产品及其海关编码见表1-2。
表1-2　我国罗非鱼产品的海关编码
我国罗非鱼工厂化加工始于20世纪90年代末，在20世纪中期以后快速发展，近十年来我国罗非鱼加工出口进入快速发展期，罗非鱼加工产业得到了长足的发展。罗非鱼加工是一个拉动性很强的产业，不仅能促进罗非鱼生产从原料的初级生产向工业制成品转化，还可促进罗非鱼产业化发展，让渔民增产增收。近年来，随着我国罗非鱼产业的快速发展，产量逐年增长，加之国际市场对罗非鱼需求量的不断扩大，一批中小型专门加工罗非鱼的企业也迅速发展起来，激发了我国罗非鱼加工业迅速发展，罗非鱼加工企业数量、产量和产值不断增加，推动了我国罗非鱼加工业的快速发展，推进了我国的渔业经济结构战略调整，增强了罗非鱼在国际市场的竞争力。
第三节　罗非鱼加工产业发展趋势
一、罗非鱼加工产品趋向于高质化、多样化
为满足21世纪人们对健康关注程度加大、生活节奏加快、消费层次多样化和个性化发展的要求，根据罗非鱼加工副产物的资源现状，可开展多层次、多系列的水产食品，提高产品的档次和质量，来满足不同层次、品味消费者的需求。
近年来，随着加工规模的扩大，罗非鱼加工业产能超过实际需求，大规格商品鱼比例低，产品收购价格与品质脱节。因此，要明确质量分级方法，推进罗非鱼分级制，充分体现质高价优。未来罗非鱼加工业的发展方向应以优化产品结构，使罗非鱼产品实现高质化、多元化、系列化，以提高罗非鱼的加工附加值。
随着人们生活水平的提高和生活节奏的加快，国内市场对于冷冻调理食品、鱼糜制品以及方便即食食品的需求逐渐增加。罗非鱼的精深加工应以市场为导向，不断开发出适合人们需要的产品，使罗非鱼产品在色泽、口味、风味方面更加丰富。目前，我国的罗非鱼出口产品仍以冻罗非鱼片和冻全鱼为主，国内以鲜活或冰鲜销售为主。虽然开发了种类繁多的罗非鱼加工制品的加工技术，如液熏罗非鱼片、罗非鱼罐头、腊罗非鱼制品、冰温气调保鲜罗非鱼、罗非鱼鱼丸、烤罗非鱼、罗非鱼松、罗非鱼排、罗非鱼糕、罗非鱼饼、熏制罗非鱼、调理冷冻食品、休闲即食食品等系列产品的加工技术，但在实际应用上还比较少。随着技术的发展和市场需求的增加，高质、多样化罗非鱼加工产品将逐步走向市场。
二、罗非鱼内销产品逐渐扩大
国内罗非鱼市场潜力非常大，罗非鱼未来的市场将在国内。部分罗非鱼加工企业已经认识到了这一点，开始研究国内市场对罗非鱼的需求，并研发生产罗非鱼在国内市场的销售产品。罗非鱼产业的发展必须以市场需求为导向，罗非鱼的内销市场将进一步向家庭速食、快餐店、西餐店等方向发展。内销市场开发的关键是推出更多的产品形式，注重加工生产出适合国内消费的罗非鱼产品。
我国每年养殖生产的罗非鱼一半都在国内消费，国内市场的罗非鱼消费潜力巨大。随着罗非鱼加工产品的多样化，我国国内的罗非鱼市场将进一步拓展。同时，由于西部地区劳动力大量进入沿海地区，适应了东部的饮食习惯，也将使罗非鱼消费量逐步增加。
三、罗非鱼加工副产物的综合利用
罗非鱼在加工的过程产生的副产物（包括头、尾、骨、皮、鳞、内脏及残留鱼肉），大多未进行有效利用，不仅污染环境，而且会浪费资源。通过以现代生物工程技术、酶工程技术等为主的高值化加工处理技术，对罗非鱼下脚料进行高效综合利用，包括从鱼皮、鱼鳞中提取胶原蛋白和制备胶原多肽，从内脏中提取精炼鱼油以及鱼肝膏，以鱼骨钙为原料开发新型活性钙制品，进行水发鱼皮加工和鱼鳞休闲食品开发等，可提高罗非鱼资源的利用率，减少对环境的污染，开拓了罗非鱼加工“零废弃”的途径。
近年来，随着罗非鱼产业的快速发展，罗非鱼加工副产物精深加工技术越来越受到行业的关注，国内已有部分罗非鱼加工企业认识到，单纯依靠粗加工罗非鱼片的传统模式已不能满足竞争愈发激烈的国际市场的需求，许多科研院所、高校和企业纷纷开始探索罗非鱼加工副产物的精深加工技术和开发高值化产品。除了利用罗非鱼加工副产物加工鱼油、鱼粉外，还充分利用罗非鱼鱼皮、鱼骨、内脏等副产物进一步精深加工，开发高附加值的明胶、胶原蛋白、胶原肽、功能活性肽、调味料、生物酶类、活性钙等产品。
四、高新技术在罗非鱼加工中的应用
随着科学的发展，在罗非鱼加工中逐步运用液熏技术、冰温气调技术、生物酶工程技术、膜分离技术、微胶囊技术、超高压技术、冷杀菌技术、无菌包装技术、微波能及辐照技术、超微粉碎和真空技术等高新技术对罗非鱼进行深度加工开发，充分利用罗非鱼资源，将加工原料进行二次利用，坚持开发节约并重、注重资源综合利用，完善再生资源回收利用体系，才能全面推行清洁生产，形成低投入、低消耗、低排放和高效率的节约型增长方式，为罗非鱼功能性食品的开发提供更多、更有效的资源。使罗非鱼精深加工的水平和技术不断提高，同时对罗非鱼加工副产物进行综合利用的速度也大大加快，使从罗非鱼加工副产物提取制备功能性活性成分成为提高企业市场竞争力、推动罗非鱼产业健康持续发展的有力保证。
在罗非鱼加工和副产物高值化开发过程中，要特别注重控制生产过程中产生的能源和资源排放，将其减少到零；将那些不得已排放出的能源、资源充分再利用，包括废水的处理，加工残渣的无害化处理及二次利用等，最终做到全鱼无废弃的加工方式。
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第二章　罗非鱼原料特性
第一节　罗非鱼的肌肉组成和营养成分
一、罗非鱼的肌肉结构
1．鱼体结构
罗非鱼鱼体通常由头、躯干、尾和鳍四部分组成。精细分割则可将鱼体分成鱼鳞、鱼皮、鱼肉、鱼骨、鱼鳍和内脏等部分（图2-1）。
图2-1　罗非鱼鱼体结构示意图
鱼皮有数层上皮细胞组成，最外层覆盖有薄的胶原层；鱼鳞则从表皮下面的真皮层长出，鱼鳞主要由胶原蛋白和磷酸钙构成，起着保护鱼体的作用；鱼骨骼主要成分有胶原蛋白、骨黏蛋白、骨硬蛋白以及磷酸钙等。鱼鳍按照所处部位，则分为背鳍、腹鳍、胸鳍、尾鳍和臀鳍。罗非鱼内脏包括胃、肝、胆、肾、胰脏和鱼鳔，鱼鳔含有大量的胶原蛋白，可作为生产鱼肚或鱼胶的原料。罗非鱼组织中，鱼肉一般占鱼体质量的40%～50%；鱼头、鱼骨、鱼皮和鱼鳞占鱼体质量的30%～40%；鱼内脏和鳃占鱼体质量的18%～20%。肌肉部分是罗非鱼最重要的可食用和被加工部分；鱼骨、鱼鳞、内脏、鳃等部分一般不被食用，但可以被利用。
2．肌肉组织
脊椎动物的肌肉一般分为横纹肌和平滑肌，横纹肌又分为骨骼肌和心肌。罗非鱼肌肉属于横纹肌中的骨骼肌，附着在脊椎骨的两侧，其横断面呈同心圆排列（图2-2），根据肌肉色泽的差异，罗非鱼肌肉可分为普通肉和暗色肉。罗非鱼肌肉是由许多被肌隔膜分开的肌节重叠而成，而肌节是由肌纤维构成。暗色肉是鱼类特有的肌肉组织，存在于体侧线的表面及背侧部和腹侧部之间。
图2-2　罗非鱼鱼体的中部横断面
暗色肉含有丰富的肌红蛋白和少量血红蛋白而呈暗红色，因此又称为红色肉或血合肉。暗色肉除含有较多的色素蛋白之外，还含有较多的脂质、糖原、维生素和活力很强的酶等，其pH为5.8～6.0，比普通肉的pH低，肌纤维较细；而普通肉则含有较多的盐溶性蛋白和水分。在保鲜过程中，暗色肉比普通的白色肉变质快，在食用价值和加工贮藏性能方面，暗色肉低于白色肉。
二、肌肉的化学组成
1．水分
罗非鱼肌肉的含水量较高，一般占鱼体质量的75%～80%。鱼肉中水分为自由水和结合水。自由水占总水含量的75%～85%，能溶解水溶性物质，并以游离状态存在于肌原纤维和结缔组织的网络结构中，参与维持电解质平衡和调节渗透压；自由水能被微生物所利用，在干燥时易蒸发脱除；在冷冻时易冻结而形成冰晶，导致肌肉细胞破损，造成汁液流失和组织变软。结合水占总水分含量的15%～25%，因与蛋白质及碳水化合物中的羧基、羟基、氨基等形成氢键，而难以被蒸发和冻结，也不能被微生物所利用。肌肉中水分含量及存在状态，不仅影响蛋白质等高分子的结构、行为功能，而且影响肌肉中的生化变化和微生物的生长。
2．蛋白质
（1）肌浆蛋白
存在于肌肉细胞肌浆中的水溶性（或稀盐类溶液中可溶解的）各种蛋白的总称，种类复杂，其中很多是与代谢有关的酶蛋白。各种肌浆蛋白的相对分子质量一般在1.0×104～3.0×104。在低温贮藏和加热处理中，较肌原纤维蛋白稳定，热凝温度较高。此外，色素蛋白的肌红蛋白亦存在于肌浆中，用于区分暗色肌和白色肌。
（2）肌原纤维蛋白
由肌球蛋白、肌动蛋白以及称为调节蛋白的原肌球蛋白与肌钙蛋白所组成。肌球蛋白和肌动蛋白是构成肌原纤维粗丝与细丝的主要成分。两者在ATP的存在下形成肌动球蛋白，与肌肉的收缩和死后僵硬有关。肌球蛋白的相对分子质量约为5.0×105，肌动蛋白约为4.5×105，是肌原纤维蛋白的主要成分。肌球蛋白分子由重链与轻链两个部分所组成，每一肌球蛋白分子上有3根或2根（白色肉为3根，暗色肉为2根）分子量不同的轻链。当两种蛋白在冻藏、加热过程中产生变性时，会导致ATP酶活性的降低或消失。同时，肌球蛋白在盐类溶液中的溶解度降低。这两种性质是用于判断肌肉蛋白变性的重要指标。在鱼糜制品加工过程中加2.5%～3.0%的食盐进行擂溃的作用，主要是利用氯化钠溶液从被擂溃破坏的肌原纤维细胞溶解出肌动球蛋白使之形成弹性凝胶。
（3）肌基质蛋白
包括胶原蛋白和弹性蛋白，是构成结缔组织的主要成分。两者均不溶于水和盐类溶液。胶原是由多条原胶原分子组成的纤维状物质，当胶原纤维在水中加热至70℃以上温度时，构成原胶原分子的3条多肽链之间的交链结构被破坏而成为溶解于水的明胶。在肉类的加热或鳞皮等熬胶的过程中，胶原被溶出的同时，肌肉结缔组织也被破坏，使肌肉组织变软烂和易于咀嚼。
3．脂质
脂质是动物肌肉组织中含量较高的另一类化合物。脂质含量也会因组织、营养状态、年龄、季节和水域环境等不同而发生显著变化。脂类包括的范围很广，在化学组成和化学结构上也有很大差异，但它们的共同特性是不溶于水，而溶于乙醚、石油醚和氯仿等有机溶剂。鱼类脂质大致可分为非极性脂质和极性脂质，其中，甘油三酸酯、固醇、固醇酯、蜡酯、二酰基甘油醚和烃类等为非极性脂质；卵磷脂、磷脂酰乙醇胺、磷酸酰丝氨酸和鞘磷脂等为极性脂质。
4．糖类
罗非鱼肌肉中糖类含量较少，含量一般在1%以下，但对煮熟后鱼肉的滋味有明显影响。鱼体中最常见的糖类是糖原和黏多糖。鱼类的糖原贮存在肌肉和肝脏中，是鱼体贮藏的一种重要来源，其含量因鱼生长阶段、营养状态、饵料组成等不同而异。鱼类致死方式影响其肌肉中的糖原含量，活杀时其含量为0.3%～1.0%；但如挣扎疲劳致死的鱼类，因体内糖原的大量消耗而使其含量降低。黏多糖是鱼类中含量较多的另一种多糖，广泛分布于鱼类的软骨、皮中。它在生物体内一般与蛋白质结合形成糖蛋白质，具有许多生物活性，如抗微生物活性、抗肿瘤活性、免疫增强作用、抗凝血活性、促进组织修复及止血作用等。
5．矿物质
罗非鱼鱼体中的矿物质是以化合物和盐溶液的形式存在，其种类很多，主要有钾、钠、钙、磷、铁、锌、铜、硒、碘、氟等人体需要的大量元素和微量元素，含量一般较畜肉高。罗非鱼中的钙含量为120mg/kg，铁含量为9mg/kg，锌含量为8.7mg/kg。因此，罗非鱼是人类重要的矿物质来源。
6．维生素
（1）脂溶性维生素
维生素A一般在肝脏中含量多，可作为鱼肝油制剂。维生素D是水产品中另一类重要的维生素，也主要存在于鱼类肝脏中，在肌肉中含量少。维生素E是一种天然强抗氧化剂，能有效防止脂肪氧化，保护细胞免受不饱和脂肪酸氧化产生毒性物质的危害。
（2）水溶性维生素
维生素B1又称硫胺素，有嘧啶环和噻唑环结合而成的一种B族维生素，罗非鱼中维生素B1含量在0.001～0.004mg/g。维生素B2又称核黄素，是机体中许多重要辅酶的组成部分，广泛参与体内各种氧化还原反应，一般肝脏、暗色肉高出普通肉5～20倍。维生素B5又称烟酸，罗非鱼普通肉中的含量要高于暗色肉和肝脏。吡哆醇、吡哆醛、吡哆胺及其磷酸酯统称为维生素B6，罗非鱼肝脏中维生素B6含量高于肌肉。维生素C又称抗坏血酸，在罗非鱼肌肉和肝脏中含量低，在卵巢和脑中维生素C含量较高。
三、罗非鱼肌肉的营养价值
1．罗非鱼肌肉中营养成分的含量
5种罗非鱼肌肉蛋白质的含量基本接近（表2-1），平均为16.85%，高于鸡蛋（12.80%）；粗脂肪平均含量2.25%，低于黄鳝（3.5%）而高于对虾（0.80%）。其中，奥里亚罗非鱼含量最高，为2.65%，尼罗罗非鱼最低，为1.75%，其他3种基本相当，为2.26%～2.34%。5种罗非鱼中灰分约为1%。
表2-1　不同罗非鱼中营养成分（%，n=5）
2．罗非鱼肌肉中氨基酸组成及含量
（1）氨基酸组成
从表2-2可以看出，5种罗非鱼肌肉蛋白质中的氨基酸组成基本一致，总量为14.41%～17.07%，含量最高的均为谷氨酸，最低的为色氨酸，这一结果与虹鳟等淡水鱼肌肉氨基酸组成类似。其中氨基酸总量及必需氨基酸含量最高的为红罗非鱼，含量最低的为奥尼罗非鱼。必需氨基酸与总氨基酸的比值是50.45%～51.57%，风味氨基酸与总氨基酸的比值是36.03%～37.06%，彼此差异不大，与其他报道的淡水鱼的相关氨基酸组分非常接近。
表2-2　不同罗非鱼肌肉中氨基酸组成及含量（%）
（2）罗非鱼必需氨基酸组成
从表2-3可以看出，5种罗非鱼第一限制性氨基酸均为色氨酸，其氨基酸分值为0.55～0.88，低于AAS标准值，除奥利亚罗非鱼的苏氨酸（0.97）及奥尼罗非鱼的亮氨酸（0.99），异亮氨酸（0.99）以及苏氨酸（0.95）的含量略低于AAS的标准值外，其他3种必需氨基酸AAS（除色氨酸）均大于1，说明罗非鱼肌肉必需氨基酸组成相对平衡且含量丰富，属于优质蛋白。
表2-3　不同罗非鱼必需氨基酸组成（%）
（3）罗非鱼肌肉中牛磺酸含量
经测定尼罗罗非鱼和奥尼罗非鱼中牛磺酸含量最高，分别为2200mg/kg和2100mg/kg；奥利亚罗非鱼和红罗非鱼含量次之，分别为1900mg/kg和1800mg/kg；吉富罗非鱼含量最低，仅为1100mg/kg；罗非鱼鱼肉中牛磺酸含量与竹鱼（2060mg/kg）、多线鱼（2160mg/kg）等鱼类基本相当，但高于鲱（1060mg/kg）。
3．罗非鱼肌肉中脂肪酸种类及含量分析
从表2-4可以看出，5种罗非鱼肌肉中脂肪酸种类不大，不饱和脂肪酸含量为53.6%～57.9%，明显高于饱和脂肪酸含量。饱和脂肪酸（SFA）与多不饱和脂肪酸（PUFA）的总量接近，均大于单不饱和脂肪酸（MUFA）的总量。在SFA中含量较高的为16∶0，其次为18∶0；MUFA中18∶1的含量明显高于其他脂肪酸，PUFA中以18∶2含量最高，它是合成花生四烯酸的前体，直接影响动物的生长和繁殖能力，在5种罗非鱼以尼罗罗非鱼中含量最高，为脂肪总量的17.5%；红罗非鱼、吉富罗非鱼及奥尼罗非鱼中含量基本相当，为14.8%～15.4%；奥利亚罗非鱼鱼肉中含量最低11.5%。此外，几种罗非鱼肌肉中还含有大量DHA等。
表2-4　不同罗非鱼肌肉中脂肪酸种类及含量分析
表2-4　不同罗非鱼肌肉中脂肪酸种类及含量分析（续）-1
第二节　罗非鱼鲜度与品质
一、罗非鱼鲜度
1．感官检测法
利用人的视觉、味觉、嗅觉、触觉来鉴别水产品品质优劣的一种检验方法。通常从鱼类眼球、鳃部、肌肉、体表、腹部以及水煮试验等方面进行评价，一般认为，新鲜的鱼具有以下特征：眼球饱满、明亮，角膜透明清晰，无血液浸润；鳃部色泽鲜红，黏液透明无异味，鳃丝清晰，鳃盖紧闭；肌肉坚实有弹性，以手指压后凹陷立即消失，肌肉的横断面有光泽，无异味；体表有透明黏液，鳞片鲜明有光泽，牢固地固着在鱼体表面，不易剥落；腹部无膨胀现象，肛门凹陷无污染，无内容物外泄；水煮试验鱼汤透明，有油亮光泽和良好气味。
2．物理检验法
主要是根据鱼体僵硬情况及体表的物理化学、光学的变化来评价水产品鲜度的一类方法。目前，常用的有僵硬指数法和激光照眼法。僵硬指数法适用于鱼体僵硬初期到僵硬期再到解僵期过程的鱼体鲜度评价，在解僵后则不适用。激光照眼法是日本长崎水产公司研制出的一种评价鱼类鲜度的方法，其原理是根据鱼眼对激光反射光线的强度和频率来测定鱼的新鲜程度，鱼的鲜度越高，鱼眼反射光的强度越高、频率越高。
3．化学检验法
根据水产品在保鲜过程中所发生的生物化学变化来评价其鲜度的一类方法，也是一类相对可靠、应用最多的水产品鲜度评价方法，可通过测定水产品K值、挥发性盐基氮（TVB-N）和三甲胺（TMA-N）等的含量来评价水产品的鲜度。K值是评价僵硬以前及僵硬及解僵过程的鱼类、贝类鲜度的良好指标，K值越小鲜度越高，一般新鲜鱼的K值小于10%。挥发性盐基氮不能反映出鱼类死亡后的早期鲜度，但用于评价从解僵自溶至腐败过程的水产品的鲜度变化，挥发性盐基氮含量越低，产品新鲜度越高。三甲胺含量则可用于水产品的风味及可接受评价。
4．微生物学法
通过贮藏保鲜过程中细菌总数来评价水产品鲜度的一种方法。鱼体在死后僵直阶段细菌繁殖缓慢，而到自溶阶段后期因含氮物质分解增多，细菌繁殖很快，因此测出的细菌数多少，大致反映了鱼体的新鲜度。一般细菌总数小于104cfu/g的可判为新鲜鱼，大于106cfu/g则表明腐败开始，介于两者之间的为次新鲜鱼。
5．其他测定法
除上述方法外，目前已经开发出一些通过仪器设备快速测定水产品鲜度的方法，如气味浓度测量仪法、传感器测量法（K值传感器、微生物传感器、胺类传感器），这类方法具有用样量少、简便、快捷、灵敏度高等优点。
二、鲜度对加工品质的影响
1．鲜度对鱼糜凝胶形成能力的影响
原料鱼的鲜度，对鱼糜制品的凝胶形成能力及凝胶强度有明显影响。如果将处于僵直前、僵直中和僵直后的鱼肉冻结后贮藏，每隔一段时间取其一部分制成鱼糜并测定其Ca2+-ATP酶活性和凝胶形成能力，结果发现，随着冷藏时间延长，鱼糜凝胶形成能力下降；用僵直前的鱼肉加工成的鱼糜，其Ca2+-ATP酶活性和凝胶形成能力下降幅度小，而用僵直后鱼肉加工成鱼糜的Ca2+-ATP酶活性和凝胶形成能力下降幅度大。将鲢糜冷藏0～9d，并每隔24h取样采用85℃一段加热或30℃与85℃两段加热法测定鱼糜的凝胶形成能力，结果也表明，随着贮藏时间延长，鱼糜鲜度下降，其凝胶形成能力和凝胶强度也随之降低。
2．鲜度对罗非鱼冷冻解冻和加热失重率的影响
持水性是鱼类肌肉品质的重要评价指标之一。冷冻贮藏是罗非鱼最常用的保藏方法，冻藏鱼在解冻后其肌肉中的汁液会渗出，一般鱼体鲜度越低，解冻后汁液渗出越多，解冻后的失重率越高。加热处理是罗非鱼最常用的烹饪或者加工方法，当加热使肌肉温度升高到65℃左右时，其开始收缩、硬度增大，所含可溶性成分随水分一起析出，从而导致肌肉重量损失。鱼肉在加热过程中的失重率，受鱼体大小和新鲜度的影响。水产品鲜度高时，鱼体大小，对加热失重率的影响不大，但随着鱼体鲜度下降，鱼体越小，其加热失重率越高。就同一大小的鱼体而言，鱼体新鲜度越低，其加热失重率越高。
3．鲜度对鱼产品质地和口感的影响
鱼产品的鲜度对其加工制品的质地和口感有非常明显的影响。鱼体越新鲜，其组织结构越完整，采用新鲜度高的鱼加工成的风干制品的质地和口感越硬实；反之，鱼加工品质地和口感会变松软。将鱼肉加热至50℃时其硬度增加，而持续加热一定时间后，因肌肉中胶原蛋白和弹性蛋白在60℃以上水中逐渐溶解，其肌肉组织又会变软。僵直前和僵直期的鱼肉加热后组织收缩、硬度增大较明显，而解僵的鱼肉加热后尽管发生收缩，但其质地变得软烂。
三、罗非鱼肉土腥味物质
1．罗非鱼肉挥发性物质
（1）感官评价
经过10名特殊培训的感官评定员对新鲜罗非鱼进行感官评定，得出其风味轮廓如图2-3所示。可以看出，罗非鱼具有较重的鱼腥味、泥土味和青草味；相对而言，金属味、油脂味和蘑菇味相对较轻。
图2-3　新鲜罗非鱼风味轮廓
（2）气相色谱-质谱分析
采用固相微萃取-气相色谱-质谱方法对罗非鱼挥发性成分进行分析，优化的分析条件为：转子搅拌1050r/min，45℃萃取30min，气相色谱自动进样口解析10min。用DB-5MS毛细管色谱柱分析，NIST05数据库确认定性，通过面积归一化法定量得到各化学成分的相对百分含量。罗非鱼背部肉中挥发性物质化合物组成如图2-4和表2-5所示。
图2-4　DB-5MS检测的罗非鱼挥发性物质总离子流色谱图
表2-5　DB-5MS检测罗非鱼挥发性物质
表2-5　DB-5MS检测罗非鱼挥发性物质（续）-1
（3）罗非鱼不同部位挥发性物质色谱图
罗非鱼皮、罗非鱼鳃部、罗非鱼内脏等不同部位的挥发性物质离子流色谱图如图2-5至图2-7所示。
图2-5　罗非鱼皮挥发性物质色谱图
图2-6　罗非鱼鳃挥发性物质色谱图
图2-7　罗非鱼内脏挥发性物质色谱图
在罗非鱼鱼皮、鱼鳃、鱼内脏和鱼肉四者之间，罗非鱼内脏的挥发性物质含量高，且种类多，其次是罗非鱼鱼皮和鱼鳃，鱼肉的挥发性物质相对少一些。因此，一般情况下，罗非鱼内脏的腥味值高于罗非鱼鱼皮和鱼鳃，腥味值最低的是罗非鱼鱼肉。
罗非鱼内脏挥发性物质共检测到63种、罗非鱼鳃部和鱼皮分别检测到54种和50种、罗非鱼鱼肉中挥发性物质为40种。罗非鱼内脏作为腥味较重的部位，其中，1-辛烯-3醇、壬醛、2-辛烯-1-醇、辛醛等典型性腥味物质的含量都较另外3个部位高。
2．罗非鱼鱼肉中典型性土腥味物质含量的测定
（1）微波蒸馏功率
随着微波功率的不断增加，蒸馏萃取物的峰面积也随之升高，GSM和MIB的萃取物峰面积分别在额定微波功率的60%和40%时达到最大值（图2-8），当采取60%加热方式时，会有黄色的油状物产生，这时的萃取产物中杂质很多，会对GSM和MIB的分析产生影响；所以最终采取额定功率的40%（360W）作为微波蒸馏功率条件。
图2-8　微波功率对土腥味物质萃取量的影响
（2）微波蒸馏时间
目标物峰面积在2～6min之间会随着微波时间的延长而增加，而在6～8min时间段则会下降，目标物的回收率降低（图2-9）。其原因有可能是随着微波时间的延长，微波萃取瓶中样品的水分已实现完全蒸馏，继续加热造成样品变黑变黄，进而影响最终收集的蒸馏产物，干扰了SPME的萃取，所以最终采取微波时间6min。
图2-9　微波时间对土腥味物质萃取量的影响
根据优化的条件，对所购罗非鱼肉中的土臭素和2-甲基异莰醇进行检测，其色谱图如图2-10所示，最后测得样品中土臭素和2-甲基异莰醇的平均含量分别为4.97μg/kg、1.21μg/kg。微波蒸馏-固相微萃取-气相色谱质谱法对土臭素和2-甲基异莰醇的加标回收率RSD≤5%。
图2-10　罗非鱼样品中GSM和MIB的离子色谱图
3．脂肪氧化酶对罗非鱼腥味物质形成的影响
（1）罗非鱼肌肉不饱和脂肪酸的含量
罗非鱼摄食的食物原料中含有亚麻酸、DHA和EPA等物质，经过代谢转成罗非鱼体内的亚油酸、DHA和EPA等。不同种的罗非鱼所含有的不饱和脂肪酸的种类和含量区别都较大（表2-6）。
表2-6　奥尼和吉富罗非鱼肌肉脂肪酸对比
奥尼和吉富罗非鱼不饱和脂肪酸的含量分别达到了65.40%和70.50%，亚油酸含量分别达到13.38%和16.81%，DHA和EPA的含量之和也分别达到了5.22%和13.2%，与一些海水鱼的含量接近。而草鱼、鲤等肌肉中基本是不含有DHA和EPA的，所以罗非鱼在这方面的营养价值比草鱼、鲤高。不过，不饱和脂肪酸在冷冻贮藏过程中极易氧化，造成不饱和脂肪酸的损失。
（2）羟基磷灰石柱提取罗非鱼肉中LOX
罗非鱼肉中LOX粗提液经羟基磷灰石柱层析分离后，其洗脱曲线见图2-11所示，在NaCl浓度接近于0.25mol/L时，得到了一个单一的活性峰，酶的比活力大大提高。
图2-11　羟基磷灰石柱层析分离罗非鱼肉中LOX
（3）罗非鱼肌肉中LOX底物特异性
催化肉中脂肪酸氧化的催化剂有LOX、金属离子和血红蛋白等，在冷冻贮藏过程中，脂肪氧化酶对鱼肉的氧化更为严重。在对经过羟基磷灰石柱纯化的LOX进行底物特异性测试时发现，亚油酸、亚麻酸和DHA均能被LOX氧化，其结果如表2-7所示。
表2-7　罗非鱼LOX底物特异性
罗非鱼肉中LOX的最适底物是亚麻酸。不同来源的LOX的底物特异性是不同的，哺乳动物LOX的最适底物多数情况下是花生四烯酸，植物LOX的最适底物一般认为是亚油酸；鱼类LOX的最适底物变化范围比较大，鲢的最适底物为亚麻酸，而鲑LOX的最适底物为DHA。
（4）LOX、血红蛋白、Fe3+对罗非鱼模型鱼肉的氧化产生的挥发性物质
采用SPME-GC-MS方法检测LOX、血红蛋白、Fe3+氧化罗非鱼模型鱼肉所产生的挥发性物质。3种物质氧化后所得挥发性物质如图2-12至图2-14所示。
图2-12　脂肪氧化酶氧化模拟鱼肉后所得挥发性物质
图2-13　血红蛋白氧化模型鱼肉所得挥发性物质
图2-14　Fe3+氧化模型鱼肉所得挥发性物质
由表2-8、表2-9和表2-10的结果对比来看，脂肪氧化酶能催化模型鱼肉产生21种化合物，而血红蛋白和Fe3+则分别能催化产生13种和9种化合物，脂肪氧化酶催化模型鱼肉能产生更多的挥发性物质，这可能与罗非鱼肉中含有大量不饱和脂肪酸有较大关系。而血红蛋白催化模型鱼肉后产生物质多为烷烃类，Fe3+催化产生的物质主要为醇醛类，但其数量较少。而脂肪氧化酶能催化模型鱼肉产生较多醇、醛、酮类等一些典型的腥味物质，表明脂肪氧化酶很可能在罗非鱼腥味物质的形成过程中发挥着重要的作用。
表2-8　LOX氧化模型鱼肉产生的挥发性物质
表2-8　LOX氧化模型鱼肉产生的挥发性物质（续） -1
表2-9　血红蛋白氧化模型鱼肉产生的挥发性物质
表2-10　FeCl3氧化模型鱼肉产生的挥发性物质
4．臭氧水脱除罗非鱼腥味物质
（1）0℃臭氧水脱除罗非鱼腥味的方法
人们把含有一定浓度臭氧的水称为臭氧水。臭氧在水中不稳定，其原理是发生氧化还原反应后生成性质活泼的羟基和单原子氧等，从而可以破坏水中的有机物和微生物等。影响臭氧溶解性质的因素很多，如水质、温度、光照、pH、臭氧气体的流量、水容积等。臭氧水作为安全的食品加工辅助方法，0℃臭氧水是可以与食品直接接触的。目前，食品加工中臭氧的利用状态主要是臭氧冰、臭氧水和臭氧气体等，接触方式多为直接接触，利用目的主要为消除异味和杀菌消毒等。
臭氧溶解在不同温度的水中时，在刚开始的10min，10℃与20℃水的溶解能力较强，且两者相差不大；不过之后在10～60min的过程中，10℃水的臭氧溶解能力要大于20℃水。0℃水的溶解能力在10min之前较为滞后，但在20min之后，其溶解能力要大于前两者（图2-15）。在三者的降解速度中，0℃臭氧水的降解速度最慢（图2-16）。臭氧在水中的分解近似服从一级反应规律，即臭氧水浓度lnCt与分解时间T呈直线关系，函数关系为：
图2-15　温度对臭氧在水中溶解性质的影响
图2-16　温度对臭氧在水中分解性质的影响
lnCt=K·T·lnC0
式中　K——分解速率常数；
Ct——放置T时间的浓度；
C0——起始的浓度。
因此，0℃臭氧水处理法脱除罗非鱼土腥味物质的操作方式为：
罗非鱼→采肉→8mg/L的0℃臭氧水漂洗20min→清水漂洗→测定腥味物质
（2）臭氧水处理对罗非鱼肉土腥味物质的脱除效果
根据优化的0℃臭氧水处理方法，检测处理前后的罗非鱼肉中土臭素和2-甲基异莰醇的含量，考察0 ℃臭氧水对罗非鱼肉土腥味物质的脱除效果。检测方法仍采用微波蒸馏-固相微萃取-气相色谱质谱方法，气相色谱质谱扫描方式为SIM模式。处理前后，罗非鱼肉中土臭素和2-甲基异莰醇的含量如图2-17至图2-20所示。
图2-17　罗非鱼肉臭氧水处理前GSM含量色谱图
图2-18　罗非鱼肉臭氧水处理后GSM含量色谱图
图2-19　罗非鱼肉臭氧水处理前MIB含量色谱图
图2-20　罗非鱼肉臭氧水处理后MIB含量色谱图
臭氧水处理罗非鱼肉前后土臭素和2-甲基异莰醇的脱除率如表2-11所示：0 ℃臭氧水漂洗的方式，可以脱除罗非鱼肉中30.5%～39.7%的土臭素和25.1%～30.6%的2-甲基异莰醇。经过试验对比证明，在臭氧水的漂洗时间由10min升至30min时，其对两种土腥味物质的脱除率却只分别提高了9.2%和5.5%，推测产生此效果的原因是臭氧不能与鱼肉内部的两种土腥味物质相互作用。
表2-11　臭氧水处理法对罗非鱼腥味物质脱除效果
0 ℃臭氧水漂洗罗非鱼肉20min后能够有效脱除罗非鱼肉中的土臭素和2-甲基异莰醇，两者的含量分别降低39.1%和30.4%，漂洗后两者的浓度分别降至2.98 μg/kg和0.84 μg/kg，极大程度了降低了其腥味值。
0 ℃臭氧水处理罗非鱼肉挥发性物质的总离子流色谱图如图2-21所示，挥发性物质如表2-12所示。
图2-21　罗非鱼挥发性物质离子流色谱图
表2-12　挥发性化合物质
表2-12　挥发性化合物质（续）-1
臭氧水漂洗处理后的罗非鱼挥发性物质色谱图如图2-22所示。对比漂洗前后，罗非鱼挥发性物质种类的含量及种类，发现一些典型的腥味物质含量减少（表2-13）。
图2-22　臭氧水漂洗处理后罗非鱼挥发性物质色谱图
表2-13　漂洗前后变化明显的挥发性物质
同时，对漂洗前后罗非鱼肉的营养成分及质构进行检测，其结果如表2-14、表2-15所示。经过臭氧水处理后，罗非鱼肉的各营养成分如蛋白质、脂肪、灰分、水分等含量变化不大，说明臭氧水处理脱腥方法对罗非鱼营养成分损失较小。罗非鱼肉的质构TPA参数硬度、弹性、凝聚力稍微有所降低，而黏附性则稍微有所增加，但整体变化不大（图2-23）。说明臭氧水处理方法具有可行性。
表2-14　脱腥处理后罗非鱼肉各成分含量指标
表2-15　脱腥处理后鱼肉质构测定结果
图2-23　罗非鱼TPA模式质构测试典型图谱
四、不同养殖模式的罗非鱼品质差异
罗非鱼的养殖领域由原来在淡水池塘和小水库养殖拓宽到山塘和海水等水域养殖。养殖方式由原来的粗养、套养为主，转向以精养为主，混养、立体养殖等多种养殖模式并存。目前，罗非鱼养殖有单养、混养与立体养殖。单养，即纯粹罗非鱼的养殖，全程投喂饲料，分级标苗，每年可以养殖2～3造；混养，即将其他鱼和虾等同罗非鱼混养在一起，也是全程投喂饲料，在年底干塘；立体养殖则是在前两种模式的基础上，加上鱼塘上养殖鸡、鸭、猪，在养殖前期不投料，当鱼体规格达到0.15～0.30kg后开始投料，1年可以养殖1造。
目前南方主要有鱼猪混养、鱼鸭混养、鱼菜共生、纯投料四种模式。不同养殖模式由于水质、饲料等差异导致罗非鱼产品在营养成分、肌肉物理特性等方面会有差异（表2-16）。
表2-16　不同养殖模式罗非鱼肉常规营养成分占鲜重百分比比较（%）
各种养殖模式的罗非鱼肉水分含量有差异，鱼菜共生模式的罗非鱼肉水分含量最高，纯投料模式的罗非鱼肉水分含量最低，相差2.63%；纯投料模式的罗非鱼肉粗蛋白质含量最高，鱼菜共生模式的罗非鱼肉最低，两者相差1.23%，差别不大；鱼猪混养模式的罗非鱼肉粗脂肪含量最高，鱼鸭混养模式的罗非鱼肉最低，两者相差1.16%，差别不大；纯投料模式的罗非鱼肉粗灰分含量最高，鱼猪混养模式的罗非鱼肉最低，两者相差1.01%，差别较大；鱼猪混养模式的罗非鱼肉总糖含量最低为0.39%，而其他三者没有太大区别。
4种养殖模式中，鱼猪混养模式的罗非鱼肉鲜味、口感、嫩度评价值最高，而其他3组中都有某个指标值是所有试验组中最低的。因此，鱼猪混养模式的罗非鱼肉可接受度值也是最高的（表2-17）。
表2-17　不同养殖模式罗非鱼肉质主观评定
硬度相对其他组较高的是纯投料模式的罗非鱼肉，较低的是鱼猪混养模式的罗非鱼肉；弹性和黏附性虽有差别，但差别不大。但是由于各平行组所测得的硬度的变化范围较大，因此也可以认为各组间的硬度波动范围差别不明显（表2-18）。
表2-18　不同养殖模式罗非鱼肉质分析
各组中pH1、pHu最大的是鱼猪混养模式的罗非鱼肉，最小的是纯投料模式的罗非鱼肉，两者相差仅0.3%，差异不大，并且各组的pH1、pHu之间的差值微小。熟肉率最高的是鱼鸭混养模式的罗非鱼肉，最低的是鱼菜共生模式的罗非鱼肉，两者相差6.98%，差异较大，同时也可以得出蒸煮损失的差异也较大。失水率和贮存损失最高的是鱼菜共生模式的罗非鱼肉，最低的是纯投料模式的罗非鱼肉，差异较大。肌原纤维断裂指数最高的为鱼猪混养模式的罗非鱼肉，最低的为纯投料模式的罗非鱼肉，两者之间相差50，差异较大（表2-19）。
表2-19　不同养殖模式罗非鱼肉理化特性比较
肌红蛋白含量最高的是鱼鸭混养模式的罗非鱼肉，最低的是鱼菜共生模式的罗非鱼肉，两者相差12.03mg/kg，差异较大。各个组中3种相关色素的比例虽有变化，但差别不大（表2-20）。
表2-20　不同养殖模式罗非鱼肉肌红蛋白及相关色素比较
醛类、酯类和烃类是这4种养殖模式的罗非鱼肌肉的主要风味物质，其总的相对含量分别占鱼猪混养、鱼鸭混养、鱼菜共生以及纯投料养殖模式罗非鱼挥发性风味成分的80.47%、82.12%、89.04%以及92.90%，并且在这几种养殖模式的罗非鱼的风味成分中己醛所占的百分含量是最高的。这4种养殖模式的罗非鱼肉中的共有风味成分有30种，共有成分总得相对含量分别占这4种模式风味成分的83.07%、80.68%、83.05%和62.57%（表2-21）。另外，从对这4种养殖模式的罗非鱼的挥发性成分的分析来看，他们之间存在显著差异，分别用“脂肪味-青草味”“杏仁香”“柑橘香”“酒香-醚香”“鱼腥味”“黄瓜香”“花果香”“鸡肉香”“蜡香”“桃子香”“紫罗兰香”来表征，这些物质的量的差异是造成不同养殖模式罗非鱼不同风味的重要原因。
表2-21　不同养殖模式罗非鱼肉挥发性成分及其百分含量
表2-21　不同养殖模式罗非鱼肉挥发性成分及其百分含量（续）-1
表2-21　不同养殖模式罗非鱼肉挥发性成分及其百分含量（续）-2
表2-21　不同养殖模式罗非鱼肉挥发性成分及其百分含量（续）-3
罗非鱼中游离氨基酸的组成丰富，其中甜味氨基酸和苦味氨基酸占的比重较大。非呈味氨基酸中牛磺酸的含量最高，它具有促进婴幼儿脑组织和智力发育，提高神经传导和视觉技能，防止心血管病等生理功能，是人体健康必不可少的一种营养素。从表中也可以看出，不同养殖模式的罗非鱼氨基酸的组成并不相同，鱼猪混养模式的罗非鱼肉缺乏谷氨酸和肌氨酸，鱼鸭混养模式的罗非鱼肉缺乏谷氨酸，鱼菜共生模式的罗非鱼肉和纯投料模式的罗非鱼肉缺少亮氨酸，且某些氨基酸在不同养殖模式的罗非鱼中的含量有明显差异（表2-22）。
表2-22　不同养殖模式罗非鱼肉中主要游离氨基酸组成及含量（μg/g，湿基）
表2-22　不同养殖模式罗非鱼肉中主要游离氨基酸组成及含量（μg/g，湿基）（续）-1
各种养殖模式罗非鱼肉脂肪酸种类并不完全相同，相对含量较高的脂肪酸为：C16∶0、C18∶2、C18∶1、C18∶0、C20∶4、C22∶6。鱼猪混养模式的罗非鱼肉和鱼鸭混养模式的罗非鱼肉的饱和脂肪酸总量明显高于鱼菜共生和纯投料模式的罗非鱼肉。纯投料模式的罗非鱼肉单不饱和脂肪酸总量较低，而其他3种养殖模式较高且差别不大。纯投料模式的罗非鱼肉多不饱和脂肪酸总量最高，而鱼猪混养和鱼鸭混养模式的罗非鱼肉的较低，且后面二者的差别不大（表2-23）。
表2-23　不同养殖模式罗非鱼肉中游离脂肪酸组成及相对百分含量（%）
表2-23　不同养殖模式罗非鱼肉中游离脂肪酸组成及相对百分含量（%）（续）-1
罗非鱼中的饱和脂肪酸以C16∶0、C18∶0为主，单不饱和脂肪酸以C18∶1、C16∶1为主，多不饱和脂肪酸以C18∶2、C20∶4、C22∶6为主。
五、不同致死方式对罗非鱼片品质的影响
动物在处于一种有意识的状态进行致死时，会产生激烈的应激反应和剧烈的运动，这不仅不利于动物福利，并且会对产品品质产生影响，还会给致死操作过程带来困难。鱼肉含有较高的水分、丰富的蛋白质、不饱和脂肪酸等特点导致鱼肉易腐，不易长时间保存。影响鱼肉质量的因素很多：养殖、捕捞、致死、加工和贮藏等。致死方式处理是鱼类福利的一个重要部分，鱼肉产品的品质与鱼屠宰应激状态密切相关。众所周知，鱼死后鱼肉会发生僵硬、解僵和自溶等一系列的变化，而鱼在致死前的状态，会对这一过程造成影响。研究表明，鱼类致死时的应激反应会导致肌肉的鱼片组织软化，多孔，会使死后僵直开始的更早，并且导致鱼肉更低的pH。鱼肉中孔隙的增加是由剧烈的肌肉收缩导致的，鱼的致死前应激还会促使僵硬程度的加强。为了获得更高质量的鱼肉，越来越多的人致力于改善养殖鱼类的质量，这其中就包括收获前以及宰杀的最佳处理条件，尽量减小或消除应激反应带来不良影响。根据研究的结果及实践证明，很多措施可以减缓鱼类的应激，比如避免高温，尽量缩短操作的时间，对鱼进行麻醉处理等。致死方法研究的目的就是减小鱼类的宰前应激以及屠宰过程中的痛苦，使鱼在真正死亡之前，减少对外界刺激的敏感程度。许多研究已经证实，不同的致死方式所造成的应激反应有所差异。
致死方法大致分为两类：化学麻醉法和物理击晕或致死法。化学麻醉法就是使用化学的药物，使鱼失去意识，处于昏迷状态，因此，减少鱼在运输以及屠宰过程中的应激反应，减少了死亡时的痛苦，保证了动物福利，同时有利于最终的鱼肉产品质量。使用的化学药品有丁香油（clove oil）、2-苯氧乙醇（2-phenoxyethanol）、异丁香酚（iso-eugenol）等近30种。化学药物对于进行麻醉，即可以满足道德要求，又不会对最终的鱼肉质量造成坏的影响，但是使用化学药品会对消费者产生潜在的危险。因此，此类麻醉通常是用于试验需要对鱼进行麻醉。物理击晕法就是利用物理的手段，使鱼达到昏迷或死亡的目的。物理致死方式很多都是传统的宰杀方式，主要有：窒息法、冰激法、机械击晕、CO2麻醉法、去鳃放血法、电击晕法、N2致死、盐浴等。
不同的致死方法对保鲜起着重要的作用，因此对比不同致死方式对品质的影响，选择较好的致死方式对罗非鱼的保鲜具有重要的意义。
罗非鱼常用的4种致死方式包括：Ⅰ．鳃部放血，去鳃后放入冰水混合物中20min；Ⅱ．冰水致死，将活鱼放入冰水中20min；Ⅲ．敲击头部致死；Ⅳ．敲击头部，鳃部放血，置于水中（室温）20min。
致死方式对罗非鱼片挥发性盐基氮（TVB-N）的影响（图2-24）：TVB-N是细菌繁殖和蛋白质分解产生的氨和胺类等碱性含氮的挥发性物质，通常作为鱼类的一项鲜度指标。在致死后4 ℃冰藏的0～6d中，Ⅱ组和Ⅲ组的TVB-N值显著低于Ⅰ组和Ⅳ组（P<0.05），整个贮藏期中，Ⅳ组的TVB-N值的水平显著高于其他各组（P<0.05）。通过4个组的TVB-N值的变化可以看出，冰水致死和敲击头部致死两种宰杀方法优于鳃部放血和敲击头部后放血。
图2-24　不同致死方式罗非鱼片挥发性盐基氮的差异
致死方式对罗非鱼片Ca2+-ATP酶活性的影响（图2-25）：肌动球蛋白具有ATP酶活性，肌动球蛋白的变性，不仅会导致其盐溶性的下降，还会使ATP酶活性显著下降。Ca2+-ATP酶的活性中心位于肌球蛋白的球状头部，Ca2+-ATP酶活性是评价肌球蛋白分子完整性的良好指标。4组致死方式得到的新鲜鱼片的Ca2+-ATP酶活性具有差异，Ⅲ组的Ca2+-ATP酶活性最高，Ⅰ组的Ca2+-ATP酶活性最低，Ⅲ组的Ca2+-ATP酶活性显著高于Ⅰ组和Ⅱ组（P<0.05）。在2～10d内，Ⅰ组的Ca2+-ATP酶活性显著低于其他3组，在致死后4 ℃冰藏的2～6d，Ⅱ组的ATP酶活性显著低于Ⅲ组和Ⅳ组2个组。通过4个组的Ca2+-ATP酶活性的变化可以看出，敲击头部致死宰杀方法优于鳃部放血和敲击头部后放血。
图2-25　不同致死方式罗非鱼片Ca2+-ATP酶活性差异
致死方式对罗非鱼片色泽的影响（图2-26）：因为Ⅰ组和Ⅳ组2组的宰杀方式包含了放血处理，所以促使这两组的鱼片更加苍白。Ⅰ组和Ⅳ组的亮度值（L*值）显著高于Ⅱ组和Ⅲ组的L*值（P<0.05）。Ⅱ组和Ⅲ组之间的差异不显著（P>0.05）。Ⅰ组的红绿色值（a*值）最低，显著低于其他各组，其次为Ⅳ组；Ⅱ组和Ⅲ组的a*值较高，Ⅱ组a*值显著高于Ⅰ组，Ⅲ组的a*值也显著高于Ⅳ组。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ4个组之间的黄度值差异很小，达不到显著水平（P>0.05）。通过4个组的色泽变化可以看出，冰水致死和敲击头部致死两种致死方法优于鳃部放血和敲击头部后放血。
图2-26　不同致死方式罗非鱼片色泽的差异
致死方式对罗非鱼片质构的影响（图2-27）：4个组的弹性和凝聚性都没有明显的变化趋势（P>0.05），相互之间的弹性和凝聚性的差异不显著。新鲜鱼片的硬度值Ⅰ组和Ⅲ组显著高于Ⅱ组和Ⅳ组（P<0.05）。在致死后冰藏的2～6d，Ⅲ组的硬度值显著高于Ⅱ组和Ⅳ组（P<0.05）。6d后，各组之间的差异不显著。咀嚼性和胶着性都是与硬度密切相关，其变化趋势，基本与硬度值的变化一致。通过4个组的质构指标变化可以看出，敲击头部致死组宰杀方法优于其余组。
图2-27　冰藏过程中罗非鱼片质构指标的变化
通过研究4种致死方式对罗非鱼片品质的影响，可以认为敲击头部致死法最有利于罗非鱼片的保鲜，其次为冰水致死法。
六、罗非鱼片贮藏过程中品质变化及货架期预测模型
1．罗非鱼片贮藏过程中品质变化
目前罗非鱼贸易除部分在国内以鲜活产品形式销售外，大部分以冷藏、冷冻鱼片的形式出口。低温冷藏能有效地抑制鱼体自身酶的活力，同时抑制多种微生物的生长和繁殖，延长罗非鱼片的保存时间，但冷藏期间罗非鱼片仍然会发生一系列的变化，包括糖原分解、蛋白质变性分解、脂肪氧化酸败等，可通过pH、K值、TVB-N值、Ca2+-ATP酶活性及TBA值等指标的变化指示，感官值可从总体上反映产品的品质变化。
罗非鱼片感官评价评分标准（表2-24）：罗非鱼片的感官评定分为色泽、气味、组织形态和肌肉弹性4个部分，鱼片的综合分值在17～20分为新鲜，9～16分为品质良好，8分以下为品质发生明显劣变。
表2-24　罗非鱼片的感官评价标准
罗非鱼片感官分值在贮藏期间的变化（图2-28）：随着贮藏时间的延长，鱼片的感官值有明显的变化，呈下降趋势。鱼片在贮藏的前4d处在良好的品质状态；在贮藏的5～11d，鱼片品质随着贮藏时间的延长有明显的下降，表现为色泽逐渐变为暗淡，肌肉弹性变差，有异味产生，总体评价处于次级的品质状态；在贮藏的12～15d，罗非鱼片色泽暗沉，肉质松软，稍有发甜的异味。
图2-28　贮藏过程中罗非鱼片感官值的变化
罗非鱼片pH在贮藏期间的变化（图2-29）：随着贮藏时间的延长，鱼片的pH呈先下降后上升的变化趋势。贮藏的前3d pH下降较快，由初始的6.98下降至6.58，之后缓慢下降，到8d时达到最低值6.30，随后缓慢上升，15d上升到6.76。
图2-29　贮藏过程中罗非鱼片pH的变化
罗非鱼片TVB-N值在贮藏期间的变化（图2-30）：随着贮藏时间的延长，鱼片的TVB-N值呈持续上升趋势。在贮藏期1～6d, TVB-N值增长缓慢，平均每天增长幅度为1.0130mg/（100g·d）。在贮藏期6～12d, TVB-N值增长加快，平均每天增长幅度为2.40mg/（100g·d）。
图2-30　贮藏过程中罗非鱼片TVB-N值的变化
罗非鱼片K值在贮藏期间的变化（图2-31）：鱼片在贮藏过程中K值的变化呈上升趋势，新鲜鱼片K值为6.5%，贮藏2d后K值到达为17.5%，均处在一级鲜度的状态；在贮藏的3～9d后，K值达到升至40.5%，鱼片处在二级鲜度阶段状态；贮藏13d后K值到达65%，鱼片进入初期腐败阶段。
图2-31　贮藏过程中罗非鱼片K值的变化
罗非鱼片Ca2+-ATP酶活性在贮藏期间的变化（图2-32）：随着贮藏时间的延长，罗非鱼片肌原纤维中Ca2+-ATP酶活性呈下降趋势。在贮藏期1～2d内，Ca2+-ATP酶活性降低幅度较大，贮藏期第2天，Ca2+-ATP酶活性降低了22.61%，达到1.847μmol/（mg·h），平均每天降低11.30%；在贮藏后期13～23d内，Ca2+-ATP酶活性降低幅度减缓，贮藏期第13d, Ca2+-ATP酶活性降低了55.74%，达到1.056 μmol/（mg·h），平均每天降低5.06%。
图2-32　贮藏过程中罗非鱼片Ca2+-ATP酶活性值的变化
罗非鱼片TBA值在贮藏期间的变化（图2-33）：随着冷藏时间的延长，鱼肉中的TBA值逐渐上升，冷藏15d后TBA值为0.267mg/100g。罗非鱼的脂肪含量低，因此，在贮藏过程中TBA值的变化幅度小，脂肪氧化速率较慢。
图2-33　贮藏过程中罗非鱼片TBA值的变化
罗非鱼片在冷藏条件下其感官值、pH、TVB-N值、K值、Ca2+-ATP酶活性、TBA值均随贮藏时间的延长呈规律性变化。其中，TVB-N值、K值和TBA值均随着贮藏时间的延长呈缓慢上升趋势，感官指标、Ca2+-ATP酶活性值随着贮藏时间的延长而降低，pH则是在贮藏过程中先降低后上升。TVB-N值、K值、Ca2+-ATP酶活性都与感官值有较好的相关性，可以较好地反应罗非鱼片在冷藏期间肉质的变化情况；pH、TBA值需要与以上指标结合才能反映指示罗非鱼片的品质变化。
在冷藏过程中，罗非鱼片的TVB-N值在呈上升趋势，可较好地指示罗非鱼片的品质随贮藏时间的变化。TVB-N值与蛋白质分解和细菌的繁殖密切相关，一直被公认为鲜度评价的重要指标。低温贮藏可以有效地抑制TVB-N值的增长，表现为贮藏前期该值增长缓慢，但随着贮藏时间的加长，TVB-N值快速增加。K值较TVB-N值能更好地反映鱼肉早期的鲜度变化。多数研究表明，刚宰杀的鱼K值在5%左右，满足生食的鱼体K值应小于20%，K值在20%～40%范围内为二级鲜度，60%～80%为初期腐败鱼，即丧失商品价值。对鱼肉品质要求较高的国家，如日本等国现在多用K值来作为判定鱼品鲜度的指标。Ca2+-ATP酶活性是用来衡量肌球蛋白分子完整性的参数，通过其可反映鱼肉蛋白变性的情况，间接反映贮藏时间的长短。肌原纤维蛋白质中的肌球蛋白具有ATP酶活性，在鱼肉的贮藏过程中，Ca2+-ATP酶活性发生改变的原因有很多观点，有的研究者认为肌动球蛋白的变性会引起Ca2+-ATP酶活性发生改变，尤其是肌动球蛋白球状头部区域的变性；有的研究者认为巯基氧化形成二硫键导致分子聚合是ATP酶活性下降的主要原因；有的认为是由于冰晶的机械作用引起的。
罗非鱼片的pH在贮藏过程中呈现先下降后上升的趋势。一般认为，贮藏前期pH的下降是糖原在缺氧环境下酵解产生乳酸引起的，后期pH的上升是由于大量的微生物繁殖，导致鱼肉中蛋白质分解产生游离氨基酸、肽、蛋白胨等物质。多数研究认为，pH的变化受到较多因素的影响，pH的变化不稳定，难以找到具体的临界值来区分鱼片的鲜度，故单独用其判定品质变化不妥，需要结合其他品质判定方法做出判断。TBA在整个冷藏过程中，含量很低，变化很小，同样需要结合其他品质判定方法做出判断。
罗非鱼片在冷藏条件下的品质变化受一系列因素影响，单一指标不能准确的反映其品质的变化，可采用感官及理化指标来综合判定罗非鱼片在冷藏条件下的品质的变化。
2．罗非鱼片贮藏货架期预测模型
目前，在食品贮藏过程中，食品动力学特性的研究是预测食品在贮藏过程中品质变化的基础。鱼肉在加工、贮存和运输过程中，由于外界环境、微生物和酶等因素的作用，鱼肉腐败变质，品质下降。为了预测、控制鱼肉品质变化的程度，人们就需要了解鱼肉品质变化的动力学特性。在掌握了鱼肉品质变化的动力学规律，人们就可用该规律对加工生产过程进行监控，对鱼肉品质的变化进行预测，也可提前采取措施对猪肉的品质变化进行控制。鱼肉保存过程中在细菌和酶等因素的作用下，蛋白质分解产生胺类等碱性含氮物质，此类物质具有挥发性，称为挥发性盐基氮。通过测定鱼肉中挥发性盐基氮的含量、细菌总数就可反映鱼肉鲜度的变化，从而建立其随贮藏温度和时间变化的动力学模型，总结出罗非鱼片的品质变化趋势。
罗非鱼片在贮藏过程中，TVB-N和菌落总数不断增加，TVB-N和菌落总数的变化规律分别符合零级反应和一级反应动力学模型，贮藏温度越高，反应速率越大（图2-34，图2-35）。罗非鱼片贮藏过程中TVB-N和菌落总数的反应速率常数可用阿仑尼乌斯方程描述，有很高的拟合精度。
图2-34　TVB-N与贮藏时间的关系
图2-35　菌落总数与贮藏时间的关系
根据罗非鱼片在贮藏过程中TVB-N的变化可得罗非鱼片贮藏过程中TVB-N变化的动力学模型：
t=（lnAt-lnA0）/（ 2.05×1011×e-64960/RT）
式中A0为罗非鱼片的初始TVB-N值，At为罗非鱼片贮藏t时间后的TVB-N值。
根据罗非鱼片在贮藏过程中菌落总数的变化，同理可得罗非鱼片贮藏过程中菌落总数变化的动力学模型：
t=（lnAt-lnA0）/（6.88×1012×e-71580/RT）
式中A0为罗非鱼片的初始细菌总数，At为罗非鱼片贮藏t时间后的细菌总数。
两个模型皆可根据需要用于预测不同贮藏温度下罗非鱼片的贮藏期。
参考文献
第三章　冻罗非鱼片加工技术
第一节　罗非鱼保活贮运技术
一、捕捞环节的控制
活鱼长距离运输，鱼的体质至关重要。应尽量减少捕捞时对鱼体的机械损伤和起网密集时鱼体相互刺伤，采用尼龙网具，全程带水，严格按捕捞规范操作，以减少鱼体损伤，并且从捕捞的鱼中挑选健康活泼、规格一致的罗非鱼。
二、暂养期间关键因子的控制
1．短途转运环节的控制
（1）饥饿处理
罗非鱼要经过一段时间的饥饿处理，在保证较低的肠道充塞度的情况下（0～Ⅰ级）才可运输。田标等的研究表明，黑鲷活运前暂养2 d的存活率大大高于不暂养的。饥饿处理结果发现暂养40h左右，其肠道充塞度可降至Ⅰ级以下。
（2）控温处理
温度不同，罗非鱼耗氧率、排氨率、游离CO2排放率、水体pH和鱼体呼吸频率等都存在差异。适宜的水温能降低鱼体基础代谢水平，减少水体中有毒物质的积累，保证长距离运输中水质各项理化因子稳定。夏季要求水温控制在20℃左右，冬季则维持自然水温即可。
三、长距离运输过程中的水质调控
1．温度（T）
水温过低，鱼体肌肉僵硬，活动减弱，免疫能力减弱，不耐存活；水温过高，鱼体活跃，黏液及代谢物排泄增多，影响水质，同样不适宜长距离运输。何琳等自行研制的冷藏集装箱通过设定制冷出口温度即可控制长距离运输温度在20 ℃左右，既实现了缓慢降温，又使温度更具恒定性。
2．溶解氧（DO）
溶解氧是活体水产品赖以生存和活动的必要条件。溶氧量不足，鱼体烦躁不安，出现浮头症状，严重时甚至窒息死亡；溶氧量过高又会导致气泡病的发生，同样不利于存活。罗非鱼能够耐低氧环境，其窒息点为0.07～0.23mg/L，但长距离运输建议控制溶氧量在3～7mg/L。
3．氨氮（NH3-N）
氨和尿素是鱼类的主要排泄物，其过量积累会使鱼体受到损伤，严重时甚至导致中毒死亡。一般认为，氨氮中毒主要是非离子氨（UIA-N）的毒性作用。试验中，虽然测定的氨氮含量高至94.20mg/L，但由于运输水体pH近中性，且水温较低，其非离子氮最高为1.51mg/L，所以罗非鱼存活率依然能得到保证。因此，在温度、pH得到有效控制的条件下，罗非鱼长距离运输中氨氮含量控制在100mg/L以内是相对安全的。
4．亚硝酸盐氮（NO-2-N）
亚硝酸盐氮是三态氮中不稳定的中间形式，溶解氧充足时，在硝化菌的作用下可转化为无毒的硝态氮；缺氧时，在反硝化菌的作用下，又可能转化为毒性更强的氨氮。其本身毒性是通过氧的运输，重要化合物的氧化及损坏器官来表现的。试验中溶氧量一直控制在3～7mg/L，亚硝酸盐氮则在0.5mg/L以下，未对罗非鱼显示毒性作用。
5. pH
pH的大小直接影响到鱼体的生命状态。其偏高会腐蚀鳃部组织，最终因失去呼吸能力而死亡；同时也会增加分子态氨的毒性，加大对鱼体的危害。pH偏低会降低血液载氧能力，造成自身生理缺氧，新陈代谢、免疫功能下降，进而导致疾病，死亡率增加。罗非鱼在pH5.0～10.0能够存活，长距离运输装备可稳定控制pH在6.9左右，处于罗非鱼的最适pH范围内。
6．游离CO2
游离CO2偏高对活体水产品有麻痹和毒害作用，可降低血液pH，减弱血液对氧的亲和力，机体表现出呼吸困难、昏迷或侧卧现象，严重时致死。张扬宗对鲢、鳙、青鱼幼鱼试验的结果表明，即使水中溶氧量充足，当游离CO2超过80mg/L时，试验鱼表现呼吸困难；超过100mg/L时发生昏迷或仰卧现象；超过200mg/L时引起死亡。试验中，长距离运输装备可控制游离CO2含量低于70mg/L。
7．浊度
水体浊度主要由于鱼体分泌及排泄物引起。随着运输时间的延长，水体中黏液、剥离组织碎片、有机物等悬浊物上升，悬浊物附着于鱼体鳃部，影响气体交换，最终致使鱼体呼吸困难。因此，浊度的控制与长距离运输的成败密切相关，试验中浊度控制低于400度。
四、暂养水温调控
罗非鱼长距离运输结束，到站卸车后暂养，鱼箱内经长距离运输的水环境采用逐步换水的方式进行改善；同时适量地加水进行梯度调温。夏季水温维持25℃左右为宜，冬季水温应调整到不低于18℃。从试验数据分析，长距离运输结束升温过程中，换水比不换水效果好。试验组不论是NH3-N、NO-2-N还是游离CO2等各项水化指标，还是鱼体活动能力、体色等情况，均明显好于对照组。因此，为保证较高存活率，罗非鱼长距离运输结束后，升温待售过程须逐步换水，减少新的应激，并将其视为运输管理的重要操作技术手段之一。
第二节　冻罗非鱼片加工工艺技术
一、冻罗非鱼片生产工艺流程
鲜活原料鱼暂养→去鳞→去鳃放血→清洗消毒→剖片→剥皮→磨皮→整形→挑刺修补→冻前检查→CO发色→浸液漂洗→臭氧（O3）杀菌→分级→称重→装盘→速冻→脱盘→镀冰衣→包装→金属探测→成品冷藏。
二、冻罗非鱼片生产工艺操作条件
1．暂养时间、暂养池温度和暂养时鱼水比例的确定
暂养池在进鱼前，应先对暂养池进行清洁消毒，然后放进所需的水量，水温应控制在25 ℃以下，进鱼时，应将来自不同产区（或养殖场）的鱼货分池暂养，不应互混；在标志牌上注明该批原料的产地（或养殖场）、规格、数量。暂养的鱼量按鱼水质量比1∶3以上投放，投鱼后应及时调节水位。暂养的进鱼量按鱼水比1∶3以上投放，暂养时间应在3h以上，以确保去除鱼体的附着物和泥腥味。在暂养过程必须不断充氧和用循环水泵喷淋曝气，以防止鱼缺氧死亡，确保鱼的活力。温度过高时容易造成鱼的死亡，所以暂养池的水温应控制在25 ℃以下，并及时清除喷淋曝气时产生泡沫，确保水质良好。
2．原料分选
将暂养后的鱼捞起，分拣出不宜加工鱼片的小规格鱼和已经死亡的鱼另行处理，将符合规格的鱼送到放血台。
3．鱼体放血
进行放血时，在操作台上用左手按紧鱼头，右手握尖刀在两边鱼鳃和鱼身之间的底腹部斜插切一刀至心脏位置，然后将鱼投入在有长流水的放血槽中，并不时搅动，让鱼血尽量流滴干净。放血时间应控制在20～40min，时间太短则放不干净，时间太长则发生鱼死后进入僵硬现象，造成剖片困难。
4．鱼体清洗和消毒
根据实际生产中的消毒效果，用50～100mg/L次氯酸钠消毒水或用臭氧浓度高于5mg/L的臭氧水消毒5min，能取得较好的消毒效果。
5．剖片工序操作要点
手工剖片时，双手应戴经消毒的手套，左手捉紧鱼头，将鱼体压紧在操作台上，右手握刀，下刀准确，刀口从鱼尾部贴着中骨向鳃部剖切，将背腹肌肉沿鳃边割下，然后反转再剖切另一边。剖鱼片时，要把刀磨好，避免切豁、切碎而降低出成率。剖切下的鱼片应及时放在底部盛有碎冰的容器中，用于在在加工时存放鱼片的容器，大小应满足在15min之内就能被装满。装满鱼片后在上面并覆盖少量的碎冰，然后送进去皮工序。
6．去皮工序操作要点
用去皮机去皮时，用手拿住鱼片的尾部，将鱼片有皮的一面小心轻放在去皮机的刃口上，并注意鱼片的去皮方向。用手工去皮操作时，应戴好手套，掌握好刀片刃口的锋利程度，刀片太快易割断鱼皮，刀片太钝则剥皮困难。
7．磨皮工序操作要点
将去皮鱼片的一面放在磨板上，一边流放少量的长流水，用手轻压鱼片在磨板上回旋磨光，磨去去皮时留下白色或黑色的鱼皮残痕，将磨皮后的鱼片置于塑料网筐中，用低于15 ℃流水将鱼片上血污冲洗干净。然后应及时放在盛有碎冰的容器中，上面并覆盖少量的碎冰，送进下一整形工序。
8．整形工序操作要点
整形目的是切去鱼片上残存的鱼皮、鱼鳍、内膜、血斑、残脏等影响外观的多余部分，用流动水冲洗干净鱼片，去除鱼鳞、血斑等残迹。鱼皮、内膜残痕超过0.5cm2以上属不合格。整形时应注意产品的出成率。
9．去骨刺、挑刺、灯检、修补工序操作要点
鱼片前端中线处常有较多的骨刺，应用刀切去带有骨刺的肉块。
挑刺时用手指轻摸鱼片切口处，挑出鱼片上残存的鱼刺，并对整形工序的遗漏部分进行修整。对于包装注明无鱼刺的鱼片每千克鱼片不超过一根鱼刺，且长度小于10mm或直径小于1mm；若一根鱼刺的长度不超过5mm，且直径不超过2mm，则可认为不存在瑕疵。
在灯检台上进行逐片灯光检查，光照度应为1500 lx以上。灯检时，对光检查挑检出寄生虫。虫囊的直径大于3mm或寄生虫的长度大于10mm的应挑除。
10．鱼片浸液漂洗工序操作要点
可根据客户的要求，用添加食品添加剂的溶液进行浸液漂洗，以防止鱼肉蛋白质的冷冻变性，对提高鱼片的持水性和改善产品的风味和口感是较为有效的。所用食品添加剂的品种和用量应符合GB 2760的规定。浸液漂洗的温度掌握在5 ℃左右，超过5 ℃时需加冰降温。漂洗时间一般控制在5～10min比较好。
11．分级工序操作要点
按鱼片重量的大小进行规格分级，此工序须由熟练的工人操作，在分级过程中，同时去除掉不合格的鱼片。
12．臭氧消毒杀菌工序操作要点
根据实际生产中的消毒效果，用臭氧浓度高于5mg/L的臭氧水对鱼片进行消毒杀菌处理5min以上能取得较好的消毒效果。臭氧水的制备是用臭氧发生器制出的臭氧用水气混合泵与低温水混合溶解，因水中臭氧浓度衰减速率较快，所以应随制随用，臭氧水必须随制随用，水温须控制在5℃以下，才能保证取得相应的臭氧浓度。
13．速冻、镀冰衣工序操作要点
采用IQF冻结时鱼片须均匀、整齐摆放在冻结输送带上，不能过密或搭叠，以免影响冻结。进冻前应先将冻结隧道的温度降至-35 ℃以下，冻结过程的冻结室内温度应低于-35 ℃，冻结时间控制在50min以内，鱼片中心的冻结终温应低于-18 ℃。
镀冰衣时将冻块放入冰水中或用冰水喷淋3～5s，使其表面包有适量而均匀透明的冰衣。用于镀冰衣的水的应经预冷或加冰冷却至不超过4 ℃。
14．金属探测工序操作要点
装箱后的冻品，必须经过金属探测器进行金属成分探测，若探测到金属，则须挑出有问题的冻块另行处理。
15．生产记录操作要点
每批进厂的原料应有产地（或养殖场）、规格、数量和检验验收的记录。加工过程中的质量、卫生关键控制点的监控记录、纠正活动记录和验证记录、监控仪器校正记录、成品及半成品的检验记录应保持有原始记录。按批量出具合格证明，不合格产品不得出厂。产品出厂应有销售记录。应建立完整的质量管理档案，设有档案柜和档案管理人员，各种记录分类按月装订、归档，保留时间应在2年以上。
第三节　罗非鱼发色技术
一、罗非鱼发色工艺
1.CO发色的历史
应用CO对肉制品进行发色的渊源可以追溯到远古时期，当时的人们偶然将鲜肉置于火炉边发现炉火的烟可以使肉制品保持良好的色泽，尽管当时还不了解其中的原理，但这个习惯却因此延续下来，最终发展成为用冷烟工艺赋予肉制品良好的色泽。至20世纪60年代气调包装的引入，研究人员才发现包装气体中混入少量的CO可使肉类产生鲜亮的颜色，且色泽相对比较稳定。1985年，美国申请世界首例运用CO发色技术处理鲜肉、禽类、鱼类等制品的专利；1996年，Yawalski等发明了烟过滤技术以浓缩烟中的风味成分及CO气体；1999年，Kowalski将一种无味烟用于冷冻水产品发色处理，其中的主要成分也是CO。自此，CO在肉制品及水产品中的应用开始受到人们的重视。最初CO发色技术多用于畜肉等暗色肉类颜色的保持，现在该项技术已扩展到水产品加工领域，应用范围从传统的捕捞品种扩展到养殖品种。
2．发色工艺条件选择
（1）活体发色工艺
预冷暂养：将水槽内注水，调节水温至13～15 ℃，将鲜活罗非鱼按鱼水比（W∶W）约为1∶2的比例放入水槽中，暂养3～5min，控制水温使之保持在13～15 ℃。发色：将CO通入到冷却水槽中，使气水充分混合，通气时间约为5～20min，停止通入CO气体，转通空气3～5min后，整个过程尽可能保持鱼的鲜活状态，结束发色过程。将鲜活罗非鱼取出，刺喉放血，剖片制成罗非鱼片。
（2）不同通气量及通气时间对鱼片色泽的影响
取鲜活罗非鱼置于水槽中，水槽容量为57 L，水温控制在16～18 ℃，分别以50mL/min、80mL/min、120mL/min、160mL/min的气流量将CO气体通入到水槽中，每隔5min取样一次，每次取鱼6～8条，测定不同通气量及通气时间对鱼片发色效果的影响，结果见图3-1至图3-4。
图3-1　通气量对亮度（L*值）的影响
图3-2　通气量对黄蓝色值（b*值）的影响
图3-3　通气量对红绿色值（a*值）的影响
图3-4　通气量对色差角的影响
由图3-1、图3-2可见，通入CO气体后鱼片的L*值和b*值均较通气前略有下降，此后随通气量的增加，鱼片L*值和b*值变化不明显。由图3-3、图3-4可见，通入CO气体后鱼片的a*值及色差角变化则比较显著，当通气量为80mL/min时，a*值最大，色差角最小，当通气量大于80mL/min时，a*值下降，色差角则有所增加。在通气量一定的情况下，鱼片L*值和b*值在通气5min内略有下降，此后变化幅度不大；a*值则随通气时间的延长呈明显的上升趋势，通气15min以后呈现下降现象；色差角则随通气时间延长呈下降趋势。通过色差分析可知，通气量为80mL/min，通气时间为10min时，鱼片的a*值最高，平均值为23.59。通气量小于80mL/min，通气时间15min时，鱼片的a*值比较接近，但均略低于通气量80mL/min，通气时间10min所得a*值，由此可见通气量80mL/min，通气时间10min为最佳的活体发色条件，此条件下制得的鱼片中线红色肉部分色泽呈亮红色或红色，白色肉部分为亮白色，产品合格率高达83.3%，不合格产品不会出现肉色发暗的现象，可以通过袋装发色进一步提高产品外观。通气量小于50mL/min时，发色时间要相对延长，且发色结果不稳定，这是因为通气量过低，气水混合不均匀，从而导致鱼体吸入CO量的差异。通气量为120mL/min时，鱼片中线红色肉部分颜色多呈暗红色，白色肉部分色泽发暗，产品发色效果可修复性差，这是因为通气量过高，短期内使鱼体吸入大量的CO气体，造成鱼的休克及部分死亡，导致鱼体放血不充分，从而影响肉质的颜色。
（3）发色温度及通气方式对发色效果的影响
取鲜活罗非鱼置于水槽中，以80mL/min的气流量将CO气体通入到水槽中，通CO气体10min后，取样后改充空气5min，取样，测定鱼片的色差值，并对产品色泽进行感官评定，同时比较水温对发色效果的影响，结果见表3-1。
表3-1　通气方式及水温对鱼片色差及感官影响
由表3-1可知，发色温度（15～18 ℃，28～29 ℃）可以使鱼片的a*值略有提高，但对其他指标的影响不显著。通气方式对鱼片的a*值、色差角及感官评定结果存在显著性影响（P<0.05），对鱼片的L*值及b*值的影响均不显著。
表3-2为通气方式及发色温度对鱼片色差值的影响，通气方式A制得的鱼片a*值均低于通气方式B制得的鱼片a*值。通气方式B制得的鱼片具有较高的a*值（18.69～19.44），低色差角值（15.85～16.84），色泽处于红色到亮红色之间，感官评定值为（4.5～5.0）。同种发色方式，不同发色温度比较表明温度15～18 ℃之间发色鱼片的a*值略好于28～29 ℃的结果，但其他指标的差异不明显。
表3-2　通气方式及温度对发色效果分析（P< 0.05）
（4）鱼水比例对发色效果的影响
取鲜活罗非鱼置于水槽中，以80mL/min的气流量将CO气体通入到水槽中，鱼水比例分别为1∶3、1∶1.5，通CO气10min后，取样测定鱼片的色差值，并对产品色泽进行感官评定，结果见表3-3。
表3-3　鱼水比例对发色效果的影响
由表3-3可知，鱼水比例对鱼片的a*值及感官评定结果存在显著性影响（P<0.05），对发色鱼片的L*值、b*值及色差角的影响均不显著。当鱼水比例为1∶3时，其a*值和感官评定值较高（19.44，5.0），鱼片红色肉部分颜色为亮红色，白色肉部分色泽白亮，鱼片卖相明显好于鱼水比例为1∶1.5发色所得鱼片。鱼水比例为1∶1.5时，水的流动不畅，使气水混合泵附近CO气体浓度增大，加之鱼的密度较高，鱼与鱼之间的游动性差，近泵处的鱼吸收CO量较高，致使部分鱼休克，放血不完全，导致鱼肉色泽暗淡，而远处的鱼吸收CO量较低，发色不透彻，尤其是鱼中线红色肉部分色呈暗红色。
3．与传统发色技术的比较
由表3-4可知，通过发色技术处理的鱼片a*值显著提高（P<0.05），色差角显著降低；活体发色与袋装发色制得的鱼片之间a*值差异也极为显著（P<0.05），但其色差角相差不明显。两种发色方式对产品的L*值及b*值不存在显著影响，其值分别为44.55～46.78和4.21～8.85。由表3-5可知活体发色技术使整个工序生产时间降低30～45min，杀菌次数减为1次，细菌总数减少35.6%，CO耗费量大大降低，细菌总数及挥发性盐基氮明显低于传统袋装发色结果。
表3-4　活体发色与传统发色方法对产品色差值比较
表3-5　活体发色与传统发色方法对产品质量影响比较
二、罗非鱼片CO发色机理
动物体内红色素主要有肌红蛋白和血红蛋白两种，其中肌肉中以肌红蛋白为主，主要负责接收毛细血管中的氧并将之扩散到细胞组织。肌红蛋白由1个球蛋白分子和含铁血红素分子组成，其存在形式有脱氧肌红蛋白（Mb, deoxymyoglobin）、氧合肌红蛋白（MbO2，oxymyoglobin）和高铁肌红蛋白（MetMb, metmyoglobin），其中肌肉色泽的变化主要由肌红蛋白含量和肌红蛋白存在形式决定。动物体内肌红蛋白的变化形式如图3-5所示。
图3-5　肌红蛋白的Mb、MbO2和MetMb三种形式的相互变化
在动物生存时，肌肉中的肌红蛋白以两种形式存在：与氧结合形成鲜红色的氧合型肌红蛋白，不与氧结合时成暗红色脱氧合肌红蛋白。动物死后，肌红蛋白自动氧化生成暗褐色的高铁肌红蛋白。动物死后如何保持肉中肌红蛋白的存在形式，避免肌红蛋白氧化生成褐色的高铁肌红蛋白是控制鱼片色泽的关键。因CO与肉中肌红蛋白具有极强的亲和能力，通常其亲和力高出氧近200倍，且与肌红蛋白结合的稳定性极高，防止肌红蛋白中Fe2+向Fe3+转化，从而达到较长时间保持肉质良好色泽的目的。肌红蛋白的变化形式与肉质颜色变化的关系如图3-6所示。从发色机理分析，CO与鱼肉肌红蛋白的结合并不会改变肌红蛋白的结构，并且反应是一个可逆过程，同肌红蛋白与氧的结合类似，CO只是作为一种气体被肌红蛋白运送到肌肉组织。
图3-6　肌红蛋白变化形式与肉质色泽的关系
三、发色过程中鱼肉色泽的变化
1．暗色肉色泽的变化
颜色是衡量发色罗非鱼片产品质量的重要指标之一，试验采用CIE L*a*b*系统测定发色鱼片的色泽，辅以色差角和饱和度（C值）及感官评价共同衡量发色效果。结果分别见表3-6、表3-7。
由表3-6可知，活体发色可以使罗非鱼片暗色肉的a*值显著增加（12.09→22.46），但L*值、b*值变化不明显。同样反映产品颜色的色差角随发色时间的延长而降低（32.69→20.33），变化趋势与a*值相反，但其显著变化的时间范围与a*值一致，均是在15min前变化显著（P<0.05），15min后变化不明显（P>0.05）。饱和度随发色时间的延长呈增加趋势（14.47→ 23.86），在0～15min内差异显著（P<0.05），在发色15min后渐趋稳定（23.84→23.86）（P>0.05）。上述结果表明通气量为80mL/min时，发色15min效果较好，这一结果与感官评定结果相一致，感官评定结果最高为4.8，此时，罗非鱼片暗色肉呈红色或亮红色，腹内普通肉部分呈亮白色。
表3-6　活体发色过程中暗色肉色泽的变化
传统发色（表3-7）同样可以明显增大罗非鱼片暗色肉的a*值，减小其色差角，增加其饱和度，对暗色肉的L*值、b*值影响不明显。与活体发色相比，传统发色时间相对较长，a*值、色差角及色饱和度变化显著区域集中在40min以前，40min后上述指标的变化差异不明显（P>0.05）。除发色时间长于活体发色外，传统发色的各项评价指标也略逊于活体发色，其中活体发色15min后a*值为22.14，而传统发色需40min才达到19.19。色差角大于活体发色，饱和度小于活体发色。传统发色时间大于40min后，罗非鱼片暗色肉呈红色或亮红色，腹内普通肉部分呈亮白色，感官评定结果最高为4.6。
表3-7　传统发色过程中暗色肉色泽变化
2．普通肉色泽的变化
罗非鱼背部暗色肉呈条纹状间隔分布，腹部肉则为普通肉，研究进一步探讨了发色对罗非鱼普通肉的影响，结果见表3-8、表3-9。结果表明无论是活体发色还是传统发色对罗非鱼普通肉部分均无明显影响（P>0.05）。这是因为发色过程CO作用的主要对象是鱼肉中的肌红蛋白，而该成分多分布在暗色肉中，普通肉中含量比较少。部分个体可能会存在普通肉变暗的现象，其原因是由于放血不充分，导致部分血液残留在鱼肉中，从而造成其色泽变暗。
表3-8　活体发色过程中普通肉的色泽变化
表3-9　传统发色过程中普通肉的色泽变化
3．可提取总肌红蛋白含量的变化
分析表明罗非鱼暗色肉中可提取总Mb含量明显高于普通肉（P<0.05）（图3-7、图3-8）。发色过程可使暗色肉可提取总Mb含量升高，如活体发色由3.77mg/g增加到5.29mg/g，传统发色由3.77mg/g增加到7.66mg/g，但发色方式对普通肉中可提取总Mb含量影响不明显。活体发色过程中暗色肉可提取总Mb含量呈逐渐增加的趋势，在发色15min时可提取总Mb含量达到最大值；而后随时间延长，可提取总Mb含量变化不明显。当发色完成后，暗色肉中可提取总Mb含量与沙丁鱼可提取总Mb含量接近，高于鲭的可提取总Mb含量；但普通肉中可提取总Mb含量远低于沙丁鱼和鲭可提取总Mb含量。
图3-7　活体发色过程中总Mb含量变化
图3-8　传统发色过程中总Mb含量变化
暗色肉和普通肉中MetMb含量的变化分别见图3-9和图3-10。结果表明，活体发色和传统发色均可不同程度降低暗色肉中的MetMb含量。对活体发色来讲，发色处理5min后，暗色肉的MetMb含量开始下降，10min后下降趋势不明显（P>0.05），而传统发色10min内MetMb含量变化比较明显（P<0.05），而后变化不显著（P>0.05）。
图3-9　暗色肉中MetMb含量变化
图3-10　普通肉MetMb含量变化
4. CO含量的变化
罗非鱼片在活体发色和传统发色过程中CO含量的变化情况见图3-11。结果表明，两种发色方式随着发色时间的延长，暗色肉中CO含量逐渐增多，活体发色15min后增加渐缓并趋于稳定，传统发色40min后趋于稳定。
图3-11　暗色肉中CO含量的变化
5．波谱扫描
图3-12结果显示鱼片经CO发色后暗色肉和普通肉的吸收峰在400～500nm波段都有不同程度的红移，其中未发色暗色肉Mb粗提液的吸收峰为410nm，经CO发色后红移至415nm，未发色罗非鱼片普通肉Mb粗提液的吸收峰位于405nm处，经CO发色后，吸收峰红移至408nm。以上结果表明通过CO发色处理确实使鱼肉的肌红蛋白存在形式发生了变化。在480～700nm波段，暗色肉与普通肉Mb粗提液的吸收峰形式存在明显不同，其中暗色肉在530～580nm存在两个明显的吸收峰，而普通肉的峰形不明显，暗色肉和普通肉经CO发色处理后其吸收峰值都略有提高。
图3-12　罗非鱼片Mb粗提液吸收光谱变化情况
6．色泽与各指标的相关性分析
鱼片发色过程中产品色泽变化与a*值紧密相关，因此，研究进一步对总Mb、MetMb及CO含量与产品颜色a*值的相关性进行分析。结果表明（表3-10），活体发色和传统发色的鱼片暗色肉可提取总Mb、MetMb及CO含量与a*值呈显著相关。其中活体发色的可提取总肌红蛋白和CO含量与a*值呈极显著正相关（P<0.01），MetMb含量与a*值呈显著负相关（P<0.05）。传统发色鱼片可提取总肌红蛋白和CO含量与a*值呈极显著正相关（P<0.01），MetMb含量与a*值呈极显著负相关（P<0.01）。
表3-10　暗色肉各影响因素与a*值的相关系数
四、发色方式对罗非鱼片的质量影响
1．贮藏过程中L*值的变化趋势
图3-13（a）为罗非鱼片冷藏过程中L*值的变化情况。由结果可知，三种方式所得鱼片的初始L*值不同，其中未发色鱼片和传统发色鱼片的L*值略高于活体发色鱼片；冷藏过程中，随着冷藏时间的延长，三种处理方式所得鱼片暗色肉的L*值均缓慢升高，但L*值的增长幅度不尽相同，其中未发色和传统发色鱼片冷藏期间L*值上升幅度明显高于及活体发色鱼片。
图3-13　贮藏过程中暗色肉L*值的变化
图3-13（b）为罗非鱼片冻藏过程中L*值的变化情况。由结果可知，冻藏期间三种罗非鱼片L*值变化趋势基本一致，均呈先升高后降低的趋势，冻藏3个月时，L*值最高。贮藏过程中L*值的变化在一定程度上可能与肌球蛋白变性和肌肉失水情况有关。
2．贮藏过程中a*值的变化趋势
三种处理方式所得鱼片的初始a*值差异显著（P<0.05），其中活体发色鱼片a*值最高，以下顺次为传统发色和未发色鱼片。未经发色处理的鱼片a*值在冷藏过程中略有降低，经发色处理的鱼片冷藏第3天a*值明显升高（P<0.05），此后呈下降趋势［图3-14（a）］。与冷藏方式略有不同，冻藏期间未经发色处理的鱼片a*值在4个月贮藏期内基本不变，而后略有下降；经发色处理的鱼片在冻藏1个月内略有下降，而后下降趋势不明显［图3-14（b）］。
图3-14　贮藏过程中暗色肉a*值的变化
3．贮藏过程中b*值的变化趋势
由图3-15（a）可知，未经发色处理的鱼片b*值在冷藏5d内基本保持不变，7d后略有升高；经发色处理的鱼片在冷藏过程中b*值基本保持不变（P>0.05）。由图3-15（b）可知，三种处理方式所得鱼片在1个月的冻藏期内b*值略有升高，而后随冻藏时间延长，b*值下降；其中三种处理方式所得鱼片的初始b*值基本相当，但随冻藏时间的延长，未发色鱼片的b*值略高于传统发色和活体发色样品，从统计学意义来讲，发色与否对样品b*值变化影响不显著（P>0.05）。
图3-15　贮藏过程中暗色肉b*值的变化
4．贮藏过程中罗非鱼片暗色肉CO含量变化
经CO发色处理后的罗非鱼片贮藏过程中暗色肉CO含量变化情况如图3-16所示。由结果可知，发色处理鱼片经冷藏3～5d暗色肉中CO含量均高于冷藏初期，冷藏5d后CO含量基本稳定。冻藏期间，传统发色和活体发色处理的鱼片CO含量略有下降，但是下降幅度不显著（P>0.05）。
图3-16　贮藏过程中暗色肉结合CO含量的变化
5．贮藏过程中罗非鱼片暗色肉可提取Mb含量的变化
图3-17（a）表明，三种发色处理所得鱼片在冷藏过程中暗色肉可提取Mb含量呈先上升再下降的趋势，未发色鱼片和传统发色鱼片在冷藏7d内呈上升趋势，活体发色鱼片在冷藏9d内呈上升趋势。冻藏过程中三种处理方式所得鱼片可提取Mb含量变化趋势基本相同，均在冻藏1个月内可提取Mb含量升高，之后随冻藏时间延长，可提取Mb含量下降［图3-17（b）］。经发色处理的鱼片贮藏过程中可提取Mb含量要高于未发色鱼片。
图3-17　贮藏过程中暗色肉可提取Mb的变化
6．贮藏过程中罗非鱼片暗色肉MetMb含量的变化
贮藏过程中鱼片暗色肉MetMb含量变化情况见图3-18。由结果可知，不同处理方式所得鱼片初始MetMb含量略有不同，其中未发色鱼片暗色肉MetMb含量最高，传统发色鱼片次之，活体发色鱼片最低。冷藏期间三种鱼片暗色肉MetMb含量呈上升趋势，其中活体发色鱼片暗色肉MetMb含量上升速度略逊于其他两种鱼片，且冷藏13d后，活体发色处理所得鱼片的MetMb含量保持平稳，但另外两种方式所得鱼片的MetMb含量则有所下降［图3-18（a）］。冻藏期间，未发色鱼片和传统发色鱼片暗色肉在冻藏前2个月MetMb含量有所升高，而后呈下降趋势，活体发色鱼片MetMb含量上升幅度相对比较缓慢，4个月后MetMb含量才缓慢下降［图3-18（b）］。
图3-18　贮藏过程中暗色肉MetMb含量的变化
7．鱼片TVB-N的变化
图3-19为三种处理方式所得罗非鱼片贮藏过程中TVB-N含量变化情况。由结果可知，冷藏期间发色罗非鱼片5d内TVB-N值基本保持不变（P>0.05），但未发色罗非鱼片TVB-N值在3d后即明显增加，在5～7d内三种鱼片的TVB-N值均呈快速增长的趋势（P<0.05），而后上升趋缓［图3-19（a）］。冻藏期间三种罗非鱼片TVB-N值均呈缓慢上升的趋势，4个月后活体发色鱼片TVB-N值增长速度加快，未发色和传统发色鱼片在3个月后即呈快速增加趋势［图3-19（b）］。
图3-19　鱼肉贮藏过程中的变化情况
8．罗非鱼片质构的变化
质构与食品的外观、风味、营养一起构成食品的四大品质要素，是决定食品总体品质的一个重要因素。试验从硬度、黏性、咀嚼性和弹性四个方面来描述，不同处理方式所得鱼片在不同贮藏条件下的质构的变化情况，结果见表3-11。由结果可知，在0～4 ℃条件下贮藏时，三种处理方式所得鱼片弹性值变化不明显，但硬度、黏性、咀嚼性三项指标随贮藏时间的延长呈逐渐下降的趋势。不同处理方式所得鱼片的变化趋势有差异。其中未发色和活体发色样品在贮藏5d后，硬度、黏性、咀嚼性才出现明显下降的趋势（P<0.05），但传统发色样品在1d以后检测值就明显下降（P<0.05）。在贮藏试验结束后期传统发色产品的硬度、黏性和咀嚼性等指标明显低于未发色和活体发色样品。冻藏对鱼片弹性指标变化影响不显著（P>0.05）；但会使鱼片硬度逐渐下降，黏度和咀嚼性呈先上升再下降的趋势；不同处理方式对产品质构状况的影响差异不显著（P>0.05）。
9．冻藏过程中鱼片K值的变化
图3-20为三种处理方式所得罗非鱼片冻藏过程中K值的变化情况。由结果可知，冻藏期间三种处理方式所得罗非鱼片中以传统发色鱼片K值最高，但在6个月冻藏期内三种鱼片K值均不高于20%，符合生鱼片的鲜度指标。传统发色鱼片K值冻藏1个月后开始上升；未发色鱼片K值冻藏1个月后开始上升，3个月后下降；活体发色鱼片冻藏3个月后K值开始上升。K值越小表示鲜度越好。一般认为即杀鱼K值在10%以下，作为生鱼片的新鲜鱼K值大约在20%以下，20%～40%为二级鲜度，60%～80%为初期腐败鱼，而该研究所用鱼片在冻藏6个月后，K值最高是传统发色鱼片，约为12%，仍符合生鱼片的新鲜鱼要求。
图3-20　冻藏过程中鱼片K值的变化
表3-11　冷藏过程中鱼片质构变化
10．贮藏过程中鱼片微生物的变化
（1）贮藏过程中鱼片菌落总数的变化
图3-21为三种处理方式所得罗非鱼片贮藏过程中菌落总数的变化情况。由结果可知，冷藏初期三种处理方式所得罗非鱼片菌落总数快速增长，9d后基本稳定［图3-21（a）］。冻藏期间三种罗非鱼片菌落总数略有升高，总体变化差异不显著（P>0.05）［图3-21（b）］。三种处理方式所得鱼片的初始菌落总数存在明显差异，其中以传统袋装发色样品菌落总数最高，未发色鱼片与活体发色鱼片初始菌落总数基本相当。但在冷藏过程中，经发色处理的鱼片菌落总数增长略慢于未发色鱼片，冻藏过程中这种趋势表现不显著。
图3-21　贮藏过程中鱼片菌落总数的变化
（2）贮藏过程中鱼片大肠菌群数的变化
图3-22为三种处理方式所得罗非鱼片贮藏过程中大肠菌群数的变化情况。由结果可知，冷藏初期三种处理方式所得罗非鱼片大肠菌群数略有增加，后期变化不显著（P>0.05）［图3-22（a）］。冻藏期间三种罗非鱼片大肠菌群数3个月内略有升高趋势，但变化差异不显著（P>0.05）［图3-22（b）］。
图3-22　贮藏过程中鱼片大肠菌群数的变化
五、罗非鱼发色产品安全性评价
1．动物毒理试验
为了观察发色罗非鱼片的毒性，在预试验中，大致估计发色罗非鱼片的0%死亡率（Dn）和100%死亡率（Dm）的致死量范围，先用少量小鼠试验。结果表明，发色罗非鱼片灌胃剂量达小鼠最大耐受剂量15000mg/kg时，小鼠无一死亡或中毒症状。再用大量小鼠重复试验，观察结果与预试验相同，结果描述见表3-12。结果表明，在给药1h后，受试小鼠未见异常反应。连续观察14d，观察期内受试小鼠未出现死亡，动物的排泄物和尿液均未见异常，正常进食和饮水，体重正常增长，未见异常反应。
表3-12　发色罗非鱼片急性毒性试验结果（±s，g）
2．发色罗非鱼片的遗传毒性试验
（1）Ames试验
发色罗非鱼片的Ames试验结果见表3-13。结果显示：发色罗非鱼片的各种TA回变菌株数与阴性和阳性对照组作统计学检验，各剂量组均极显著小于阳性对照组（P<0.01），与阴性对照组比较，无显著性差异（P>0.05），并且各剂量组间也无剂量反应关系。
表3-13　鼠伤寒沙门氏菌的回变结果
（2）小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验
发色罗非鱼片对小鼠骨髓细胞微核率试验结果见表3-14。由结果可见，经泊松分布检验，各剂量组微核率均在正常范围内，微核率与阴性对照组比较均无显著性差异（P>0.05），但远小于阳性对照组微核率，与阳性对照组比较差异极显著（P<0.01）。
表3-14　发色罗非鱼片对NIH小鼠骨髓微核形成的影响（±s）
（3）小鼠睾丸染色体畸变试验
发色罗非鱼片的小鼠睾丸染色体畸变试验分析结果见表3-15。试验结果表明，丝裂霉素组小鼠的畸变细胞率、染色体结构畸变率与对照组比较，具有显著性差异（P<0.01）；发色罗非鱼片各剂量（低、中、髙）组小鼠的畸变细胞率、染色体结构畸变率与对照组比较，无显著性差异（P>0.05），组别之间未见剂量依赖关系。
表3-15　小鼠染色体畸变精子率和断裂均数（±s）
3．传统致畸试验
（1）发色罗非鱼片对孕鼠体重的影响
各组孕鼠20d内体重变化情况如表3-16。由结果可见，各组孕鼠培养期间，体重均呈增长趋势，但阴性对照组与剂量组在试验的第7天、第12天、第16天和第20天的体重增长量明显高于阳性对照组（P<0.05），但与阴性对照组相比无显著差异（P>0.05），各组间也无统计学差异（P>0.05）。
表3-16　发色罗非鱼片对孕鼠体重的影响
（2）发色罗非鱼片对胚胎形成的影响
发色罗非鱼片对胚胎形成的影响结果见表3-17。由结果可见，阴性对照组和各剂量组分别与阳性对照组比较，死胎数（率）和总致畸率均极显著低于阳性对照组（P<0.01），各剂量组与阴性对照组之间均无统计学差异（P>0.05）。
表3-17　发色罗非鱼片对胚胎形成的影响
（3）发色罗非鱼片对胎鼠发育的影响
试验末期对剖解取出的胎鼠做体重、体长和骨骼固定检查，结果如表3-18所示，各剂量组胎鼠体重和身长极显著地大于阳性对照组（P<0.01），各剂量组和阴性对照组胎鼠骨骼和内脏异常率极显著的低于阳性对照组（P<0.01）。各剂量组和阴性对照组动物骨骼异常仅出现在第V肋骨发育不良，但其缺失程度均在自然发生率范围内，因此可认为发色罗非鱼片对胎鼠发育无不良影响。
表3-18　发色罗非鱼片对胎鼠发育的影响
4. 30d喂养试验
（1）发色罗非鱼片30d喂养对SD大鼠一般状况的影响
在该试验条件下，发色罗非鱼片30d喂养试验动物无一死亡。SD大鼠外观体征未见异常改变，行为活动正常；发色罗非鱼片各剂量组和对照组动物毛色均有光泽且紧贴身体，口、眼、耳、鼻均未见异常分泌物；呼吸规则，粪便成形无黏液，无稀烂，尿液澄清透明。该试验结果表明，发色罗非鱼片连续灌胃30d未见SD大鼠出现异常反应。
（2）发色罗非鱼片30d喂养对SD大鼠体重、饮食量、食物利用率的影响
表3-19、表3-20为大鼠30d喂养期间体重变化情况。结果表明：发色罗非鱼片各剂量组雄性大鼠和雌性大鼠的体重在30d喂养期间均呈不断增长的趋势，但剂量组在各个测定时间点与对照组比较，体重均无显著性差异（P>0.05）。30d喂养过程中，对照组与剂量组的雄鼠体重均较雌鼠增长更快。大鼠体重增长情况不存在明显的剂量关系。
表3-19　发色罗非鱼片30d喂养对SD雄性大鼠体重的影响（±s，g）
表3-20　发色罗非鱼片30d喂养对雌性大鼠体重的影响（±s，g）
表3-21、3-22为30d喂养期间大鼠摄食量和饮水量的变化情况。结果表明：30d喂养期间，大鼠摄食量和饮水量呈无规律变化，发色罗非鱼各剂量组大鼠的摄食量和饮水量与对照组比较，无显著性差异（P>0.05）。
表3-21　30d喂养对SD大鼠摄食量的影响（±s，g）
表3-22　30d喂养对SD大鼠饮水量的影响（±s, mL）
表3-22　30d喂养对SD大鼠饮水量的影响（±s, mL）（续）-1
表3-23、表3-24为30d喂养期间大鼠食物利用率的变化情况。结果表明：发色罗非鱼片剂量组及对照组雄性大鼠头两周食物利用率显著高于后两周，雌性大鼠在第1周的食物利用率高于其他3个试验周。各剂量组雄性大鼠在各周的食物利用率与对照组比较无显著性差异（P>0.05），且各剂组大鼠食物利用率之间不存在剂量关系。发色罗非鱼片中剂量组雄性大鼠的总食物利用率与对照组比较无显著性差异（P>0.05）。
表3-23　30d喂养对雄性大鼠食物利用率的影响（±s，n=20）
表3-24　30d喂养对雌性大鼠食物利用率的影响（±s，n=10）
（3）发色罗非鱼片30d喂养对大鼠血常规的影响
表3-25和表3-26是30d喂养期间大鼠血常规指标的变化情况。结果表明：发色罗非鱼片高剂量组雄性大鼠血液中EO略高于对照组，中剂量组雌性大鼠血液中EO略高于对照组，但各剂量组对雄性大鼠血液中EO的影响无明显的剂量关系，也未见动物出现过敏反应和皮肤异常情况，因此该现象并无病理学意义。其余各剂量组大鼠的各血常规指标与对照组比较，无显著性差异（P>0.05）。
表3-25　发色罗非鱼片30d喂养对雄性SD大鼠血常规的影响（±s，n=10）
表3-26　30d喂养对雌性SD大鼠血常规的影响（±s，n=10）
（4）发色罗非鱼片30d喂养对大鼠血液生化的影响
表3-27和表3-28为30d喂养过程中大鼠血液生化指标的变化情况。结果表明，发色罗非鱼片各剂量组雌性大鼠血液中ALB略高于对照组，其中，高剂量组差异显著（P<0.01），其他两组P<0.05；雄性大鼠血液中剂量组的CR则略低于对照组（P<0.05），但这两个指标与喂食罗非鱼不存在明显的剂量依赖关系，亦未见肾脏的脏器指数、大体解剖和病理检查出现病变情况，且这两个指标均在正常范围值内，无病理学意义。其余发色罗非鱼片各剂量组雄性大鼠血液中的各个指标与对照组比较，无显著性差异（P>0.05）。
表3-27　30d喂养对雄性SD大鼠血液生化的影响（±s）
表3-28　发色罗非鱼片30d喂养对雌性SD大鼠血生化的影响（±s）
（5）发色罗非鱼片30d喂养对大鼠大体解剖和脏器系数的影响
①大体解剖：在该试验条件下，大体解剖观察SD大鼠脏器，受试物各剂量组主要脏器大小正常，表面光滑，未见肿胀、出血点、异常分泌物，弹性良好，未见包块、结节等；胃肠黏膜未见糜烂、缺损等改变；与对照组比较，未见明显差异。
②脏器系数：表3-29和3-30为30d喂养期间大鼠脏器系数的变化情况。结果表明，发色罗非鱼片各剂量组大鼠的各个脏器指数与对照组比较，无显著性差异（P>0.05）。
表3-29　发色罗非鱼片30d喂养对雄性SD大鼠脏器系数的影响（±s）
表3-30　发色罗非鱼片30d喂养对雌性SD大鼠脏器系数的影响（±s）
（6）发色罗非鱼片30d喂养对大鼠组织病理学检查结果的影响
①发色罗非鱼片30d喂养对大鼠心脏的影响。对照组、高剂量组心脏各20例，大体检查一致：心脏大小、形状均正常，外膜光滑，未见渗出物，表面及切面未见出血点及坏死灶。荧光成像系统显微镜下放大100倍检查两组心肌组织排列结构未见异常，细胞未见萎缩、肥大、变性及坏死，间质未见出血、纤维增生及炎细胞浸润（图3-23）。高剂量组心脏与对照组比较未见明显差异。
图3-23　心脏对照组（a）和高剂量组（b）
②发色罗非鱼片30d喂养对大鼠肝脏的影响。对照组、高剂量组肝脏各20例。大体检查一致：肝脏大小、形状正常，表面光滑，质软，色暗红或淡黄，未见渗出物，未见出血点、脓肿及坏死灶。荧光成像系统显微镜下放大100倍检查两组肝组织内肝小叶结构正常，中央静脉居中，管壁未见病变，周围肝细胞索呈放射状排列，未见出血、坏死、炎细胞浸润及纤维组织增生等现象（图3-24）。两组样本中均有个别肝组织可见肝细胞内小脂肪空泡（图3-25）。高剂量组肝脏与对照组比较未见明显差异。
图3-24　肝脏对照组（a）和高剂量组（b）
图3-25　脂肪空泡对照组（a）和高剂量组（b）
③发色罗非鱼片30d喂养对大鼠脾脏的影响。对照组、高剂量组脾脏各20例，大体检查一致：脾脏大小、形状均正常，色暗红，质软脆，表面光滑，切面红白髓相间。荧光成像系统显微镜下放大100倍检查两组脾组织内脾小体分布、结构正常，红、白髓结构清晰。中央动脉壁未见病变，未见充血水肿及变性坏死，未见含铁血黄素沉积（图3-26）。高剂量组脾脏与对照组比较未见明显差异。
图3-26　脾脏对照组（a）和高剂量组（b）
④发色罗非鱼片30d喂养对大鼠肺脏的影响。对照组、高剂量组肺脏各20例，大体见肺组织大小、形状均正常，未见充血、气肿或水肿。荧光成像系统显微镜下放大100倍检查两组肺组织结构相似，肺泡上皮细胞无肥大、无增生、无脱落，肺泡无气肿或肺不张。支气管黏膜上皮细胞无变性坏死，无鳞状上皮化生（图3-27）。两组样本各有少部分支气管周围见少量炎细胞浸润（图3-28）。高剂量组肺脏与对照组比较未见明显差异。
图3-27　肺对照组（a）和高剂量组（b）
图3-28　支气管炎细胞浸润对照组（a）和高剂量组（b）
⑤发色罗非鱼片30d喂养对大鼠肾脏的影响。对照组、高剂量组肾脏各20例，大体见各组肾脏大小、形状均正常，表面光滑，包膜菲薄易剥离，未见充血、出血，切面皮质与髓质纹理清楚，肾盂部位未见渗出物。荧光成像系统显微镜下放大100倍检查两组肾组织内肾小球正常，未见增大及萎缩，球囊壁层上皮细胞无增生及纤维化表现，肾小管上皮无变性坏死脱落（图3-29）。两组均有个别肾组织的部分肾小管管腔内见少量蛋白性物质（图3-30）。高剂量组肾脏与对照组比较未见明显差异。
图3-29　肾对照组（a）和高剂量组（b）
图3-30　肾小管内蛋白性物质对照组（a）和高剂量组（b）
⑥发色罗非鱼片30d喂养对大鼠胃的影响。对照组、高剂量组胃各20例，均沿大弯侧剪开，胃内可见正常黏膜皱襞，未见溃疡及糜烂，未见出血点，未见肿物。荧光成像系统显微镜下放大100倍检查两组胃黏膜上皮均完整，腺体排列整齐，极向好，黏膜下层可见少量单核细胞及嗜酸性粒细胞浸润，未见溃疡、坏死等病变（图3-31）。高剂量组胃与对照组比较未见明显差异。
图3-31　胃对照组（a）和高剂量组（b）
⑦发色罗非鱼片30d喂养对大鼠小肠的影响。对照组、高剂量组小肠组织各20例，荧光成像系统显微镜下放大100倍检查两组小肠肠黏膜上皮完整，腺体排列整齐，极向好，黏膜下层可见数量不等的浆细胞及嗜酸性粒细胞浸润，未见溃疡、坏死等病变（图3-32，图3-33）。高剂量组小肠与对照组比较未见明显差异。
图3-32　十二指肠对照组（a）和高剂量组（b）
图3-33　回肠对照组（a）和高剂量组（b）
⑧发色罗非鱼片30d喂养对大鼠结肠的影响。对照组、高剂量组结肠组织各20例，荧光成像系统显微镜下放大100倍检查可见两组结肠黏膜上皮完整，黏膜腺体未见异常，固有层未见出血、坏死，可见少量散状分布的单核、淋巴细胞（图3-34）。高剂量组结肠与对照组比较未见明显差异。
图3-34　结肠对照组（a）和高剂量组（b）
⑨发色罗非鱼片30d喂养对大鼠睾丸的影响。对照组、高剂量组睾丸组织各10例，乳白色，质软，切面呈海绵状。荧光成像系统显微镜下放大100倍检查可见曲细精管，可见各级造精细胞、精子及间质细胞，组织内未见出血、坏死及纤维化（图3-35）。高剂量组睾丸与对照组比较未见明显差异。
图3-35　睾丸对照组（a）和高剂量组（b）
⑩发色罗非鱼片30d喂养对大鼠卵巢的影响。对照组、高剂量组卵巢组织各10例，橘黄色黄豆大组织。荧光成像系统显微镜下放大100倍检查可见各级卵泡及黄体，未见囊肿及肿物（图3-36）。高剂量组卵巢与对照组比较未见明显差异。
图3-36　卵巢对照组（a）和高剂量组（b）
上述试验，包括器官显微组织观察是在广东省医学实验动物中心钟志勇副研究员的大力指导下完成的。
5．危险评估
（1）危害识别
CO是一种无色、无嗅、无味的气体，能与红细胞中的血红蛋白结合形成碳氧血红蛋白，从而使血红蛋白失去运输氧气的功能，血红蛋白对CO的亲和力约为对氧气亲和力的240倍。碳氧血红蛋白在血液中的浓度常被称为碳氧血红蛋白百分比，它与空气中CO的浓度、暴露时间等因素有关，CO中毒者血液呈樱红色，具有流动性，不易腐败。
目前，为保持肉制品暗色肉的鲜艳色泽，国内外越来越多地采用CO对肉制品进行发色处理，但尚未见有关发色肉制品CO残留对人体安全性影响的研究报道。该研究通过动物毒理学试验分析表明，发色罗非鱼片对小鼠半数致死剂量（LD50）远大于15000mg/kg，属于无毒级，在最大剂量范围内未产生明显的毒副作用，且无剂量反应关系，未观察到遗传毒性，也未显示致畸和致突变性。
（2）危害描述
危害描述是指CO残留对宿主健康的负面影响。血液中的COHb饱和度常作为判断CO中毒严重程度的一个主要指标，COHb饱和度越高，中毒越严重。一般来讲，健康的成年人COHb的浓度小于5%时，并不会造成身体不适。正常人因吸烟等原因血液中也可含有少量的COHb。当空气中CO浓度达到一定比例时，人因吸入CO而产生的中毒症状与其血液中COHb饱和度之间的关系见表3-31。
表3-31　CO在空气中的浓度、吸入时间与中毒症状
表3-31　CO在空气中的浓度、吸入时间与中毒症状（续）-1
（3）暴露评估
迄今为止，研究报道关于CO发色罗非鱼片暴露剂量的信息非常少。但却有详细报道对人体CO吸入量作了限定。由于血红蛋白的分解，机体自身可产生少量的CO，不吸烟人体内COHb的浓度1.2%～1.5%，吸烟者体内COHb的浓度可达3%～4%。只有那些对CO高度敏感的病人，在COHb浓度约为2.5%时才可能出现心脏功能异常、缺氧及胸痛等现象。考虑到社会上高敏感病人的特殊情况，有关专家根据不同人群推荐了其允许接触的CO时间及最大CO浓度（表3-32），以确保人体内的COHb含量低于1.5%，其中已包含了机体内源性CO的形成。
表3-32　空气中CO含量及接触时间推荐表
发色罗非鱼片CO残留量数据来源为两个方面，一是日本发色罗非鱼片CO残留状况的资料报道，二是我国多家罗非鱼片生产企业CO残留量。由表3-33可知，大部分发色罗非鱼片CO残留量在50～200 μg/kg之间，只有日本少数产品检出CO含量超过200 μg/kg，国内只有1家罗非鱼生产企业的产品略高于200 μg/kg。
表3-33　发色罗非鱼片CO残留状况（μg/kg）
根据表3-35的要求，结合水产品发色产品市场调查结果，分析比较人体摄入CO的量的安全性。一个成年人24h吸入空气10～20m3，相当于0.42～0.84m3/h。为防止血液中COHb最高浓度超过1.5%，中等体力劳动强度的人，30min内工作空间最大允许CO浓度为42mg/m3，期间吸入气体量为8.82～17.60mg。根据日本及我国部分罗非鱼片生产企业发色罗非鱼片的调查结果中显示罗非鱼体内的CO含量最高为957 μg/kg，根据这一结果进行计算，人体1d需食用9.22～18.39kg的发色鱼片才可能达到上述允许摄入量范围。而按实际人日均消费发色罗非鱼225g计算，每天摄入的CO含量仅为26.5～239.3 μg，远低于单位时间内人体允许吸入气体量。
（4）风险特征描述
因目前尚未有关于发色处理肉制中CO摄食量的有关规定，也未见有关摄食发色罗非鱼片发生中毒的案例发生，该研究分析采用人体工作环境允许的CO吸入量为衡量指标，经计算每天摄食经发色处理的罗非鱼片225g，体内理论吸收CO含量远低于允许吸入量，因此认为发色罗非鱼片CO残留量对人体健康不良效果的可能性理论上为零。但经发色处理的鱼片可以长时间保持其鲜亮色泽，特别是经真空包装后的产品，在一定程度上可以掩盖产品的腐败，常被一些不法商人利用，销售过期的产品，其中的微生物及新鲜度指标严重超标，对消费者的身体健康造成危害。
（5）预防措施
针对发色罗非鱼片可能产生的过期销售问题，各有关部门应严格加强对发色产品的监管，控制不合格产品在市场上的流通，确保肉制品市场的顺畅有序。
第四节　非热杀菌技术在罗非鱼加工中的应用
一、水产品非热杀菌技术研究进展
1．超高压杀菌技术
超高压杀菌技术（ultra-high pressure processing, UHP）是指将食品物料经软包装后放入液体介质（如水等）中，使用100～1000MPa压力在常温或低温条件下作用一段时间，从而达到杀菌的目的。超高压杀菌技术的杀菌机理是高压会影响细胞形态，导致菌体细胞壁和细胞膜的破裂，进而造成菌体内成分泄露。同时，超高压会使微生物内部蛋白质非共价键断裂，从而导致蛋白质变性，致使微生物内部组织被破坏。此外，超高压还会导致酶全部或部分失活。这些因素综合作用导致了微生物的死亡。超高压杀菌技术对几乎所有的细菌、霉菌和酵母菌均具有杀灭作用。
大量研究结果表明超高压杀菌技术可显著延长水产品货架期，保持并改善水产品品质，具有广阔的开发利用前景。超高压处理液体介质时是个瞬间过程且仅针对性破坏分子中的非共价键，在此过程中高压对肽段和蛋白质等高分子物质以及维生素、色素和风味物质等低分子物质的共价键无任何影响，可较好保持水产品原有的营养价值、色泽和风味。此外，超高压杀菌还具有高效、无污染和灭菌均匀等优点；而过高的压力使得能耗增加，且对设备要求过高，导致该技术成本提高，一定程度上影响了其推广。
2．臭氧杀菌技术
臭氧是一种广谱高效的抗菌剂，可以抑制细菌、真菌及其孢子、病毒和原生生物等绝大多数微生物的生长。臭氧本身就具有较强的氧化性，此外，臭氧在水中可发生氧化还原反应，生成具有较高反应活性的羟基自由基（·OH）、超氧阴离子自由基（·O-2）及氢化臭氧自由基（HO-3）等，臭氧的主要抗菌机理正是这些自由基氧化破坏微生物细胞的细胞壁、细胞膜、线粒体及细胞核等重要组成部分，从而导致微生物裂解死亡。此外，一些学者认为细胞内主要酶类的失活和DNA、RNA被破坏也是臭氧杀菌的主要机理。
臭氧可以在短时间内杀死绝大多数微生物，并且杀菌后多余的臭氧最终会被还原为氧气，不会造成残留及污染，相比于其他化学消毒剂（如次氯酸钠水等）优势显著。大量研究表明，臭氧处理可显著降低食品中微生物菌群的种类及数量，延长产品货架期。由于臭氧水处理通常采用喷雾和浸泡的方式进行，便于加工过程中的连续化操作，因此，臭氧作为一种安全和有效的抗菌剂已广泛应用于水产品工业中。此外，臭氧在水产品加工应用中除了具有杀菌作用外，还具有漂白和去异味等辅助功能。
3．酸性电解水杀菌技术
酸性电解离子水（acidic electrolyzed water）是一种新型机能水，它是通过电解水生成装置电解含HCl或HCl和NaCl混合液的电解质而生成的具有杀菌功效的功能水。目前，对于酸性电解水的杀菌机理方面的研究较多，有关酸性电解水的主导杀菌因素主要包括pH、氧化还原电位（oxidation reduction potential, ORP）、活性氧和有效氯杀菌等。近年来人们普遍认为其杀菌能力是以有效氯杀菌为主，其他各个杀菌因素（pH、ORP及活性氧）协同作用的结果。另外，一些学者认为微生物的细胞壁和细胞膜被破坏也是酸性电解水杀菌的主要机理之一，有关电解水杀菌的具体机理尚无定论，有待于进一步研究与探讨。
酸性电解水作为新型的安全环保消毒剂，适合用于生鲜水产品的杀菌保鲜。酸性电解水杀菌技术具有广谱高效、安全环保、电解水生成装置结构比较简单及生产成本相对较低的优点。酸性电解水作为一种新型杀菌剂，具有广阔的应用前景。目前，酸性电解水在国内正在得到推广和使用，但主要还是处于实验研究阶段，全面推广和使用尚需时日。
4．辐照杀菌技术
辐照杀菌通常是指利用一定剂量波长极短的电离射线对食品进行照射杀菌。在食品杀菌中常用的射线有χ-射线、γ-射线和电子射线。其中，γ-射线的穿透力很强，适合于完整食品及各种包装食品的内部杀菌处理，水产品的加工中通常采用γ-射线进行辐照处理。辐照杀菌机理主要有辐照产生的直接和间接效应两个方面。直接效应是指微生物细胞的细胞质受到高能射线照射后发生了电离和化学作用，使细胞内的物质形成了离子、激发态或分子碎片。间接效应是水分在受到高能射线辐射后，电离产生了各种游离基和过氧化氢，这些物质再与细胞内其他物质相互反应，生成了与细胞内原始物质不同的化合物。这两种效应共同作用阻碍了微生物细胞内的一切生命活动，导致细胞死亡，从而达到杀菌目的。
对水产品进行辐照杀菌的杀菌剂量要在安全剂量范围内，否则会对消费者的身体健康造成威胁。我国冷冻水产品辐照杀菌工艺的农业行业标准（NY T1256－2006）规定了冷冻水产品的辐照工艺剂量为4～7kGy。辐照杀菌技术具有穿透力强、杀菌效果好、无残留和易操控等特点，但放射线同样对人体有害，这就要求操作人员在杀菌处理过程中做好防护措施。
5．高密度CO2杀菌技术
高密度CO2技术（dense phase carbon dioxide， DPCD）是指在压力小于50 MPa的条件下，利用高密度CO2的分子效应达到杀菌和钝化酶的作用，该技术是一种新型的非热杀菌技术。目前DPCD杀菌技术的作用机理尚未明确，现有研究认为高密度CO2产生的分子效应会导致以下几个方面的影响：降低食物的pH；CO2分子和碳酸氢盐离子对微生物细胞具有抑制作用；对细胞膜的物理性破坏；改变细胞膜通透性；钝化酶和孢子活性等，这些因素的综合作用达到杀菌的效果。
基于DPCD技术的以上特点，目前其主要应用于牛奶、果蔬汁和全蛋液等液态食品的杀菌。DPCD技术应用于水产品的研究仍然相对较少，目前主要集中在对于贝类和虾的杀菌研究。DPCD技术具有可以保持食品原有品质、无污染和杀菌效果好等优点。但该技术在固态食品中的应用还存在较多问题，如持续化操作受限、CO2的扩散率较差和处理后的包装问题等。
6．生物杀菌技术
生物杀菌技术是指利用生物保鲜剂的抗菌作用来延长食品货架期的杀菌保鲜技术。生物保鲜剂是指从动植物、微生物中提取的天然的或利用生物工程技术改造而获得的对人体安全的保鲜剂。
不同特性的生物保鲜剂对水产品作用时的杀菌保鲜机理也并不是完全相同的。总结起来可以概括为以下几类：茶多酚和鱼精蛋白等生物保鲜剂含有抗菌活性物质，具有抗菌作用；有些生物保鲜剂如乳酸链球菌素和葡萄糖氧化酶等具有抗氧化作用；茶多酚和植酸等生物保鲜剂具有抑制酶活的功效；还有一类生物保鲜剂比如蜂胶和壳聚糖等可以在食品的表面形成一层保护膜，阻碍腐败微生物的侵入，达到保鲜目的。生物保鲜剂通常是多种杀菌机理同时作用达到保鲜目的。
目前，生物杀菌技术在水产品上的应用已经得到了广泛研究。在水产品杀菌中应用较多的生物保鲜剂有茶多酚、溶菌酶、乳酸链球菌素和壳聚糖等。为解决单一生物保鲜剂不能够达到预期保鲜效果的问题，可将不同功能特性生物保鲜剂按一定比例混合成复合型生物保鲜剂，通过相互之间的协同作用提高水产品的保鲜效果。生物杀菌具有低剂量、强杀菌、安全无毒和药效持久等优点，生物保鲜剂的使用，消除了使用化学防腐剂带来的安全隐患。随着人们对食品安全意识的不断增强，使用生物保鲜剂代替传统化学防腐剂将是发展的趋势。生物保鲜剂的开发成本较高，这在一定程度上影响了其推广应用。
除上述杀菌技术之外，还有一些其他的非热杀菌技术应用于水产品加工工业，如高压脉冲电场杀菌技术、微波杀菌技术、脉冲强光杀菌技术、紫外线杀菌技术和栅栏技术等。综合比较以上几种非热杀菌技术，臭氧杀菌技术凭借其便于连续化操作和广谱高效的特点在水产品加工中应用较为广泛；超高压杀菌技术可以瞬间杀菌且灭菌均匀，较为广谱高效；生物杀菌技术采用生物保鲜剂代替了传统的化学防腐剂，较为安全。
与传统的热杀菌方式相比较，上述非热杀菌技术优势明显。不仅克服了传统热杀菌无法保持水产品原有品质的不足，而且杀菌处理过后无化学物质残留，安全卫生，更好地满足了消费者对于水产品的需求。非热杀菌技术在水产品加工贮藏领域展现出了非常广阔的前景。虽然非热杀菌技术优势明显，但在应用推广过程中存在着诸多问题。首先，就我国当前的研究现状而言，多数研究尚处于试验研究阶段，大规模的推广应用极少，有些技术（如酸性电解水杀菌和高密度CO2技术等）杀菌机理尚不明确，这些都限制了它们的推广应用；其次，有些非热杀菌技术成本高、对设备要求高，限制了该技术的推广。因此，为解决非热杀菌技术在推广过程中遇到的困难，笔者认为今后研究应注重以下几点：要加强基础理论研究，特别是杀菌机理、适用条件和影响因素的研究；合理运用基础理论，研发新设备，尽可能地降低生产成本；进行多种技术复合杀菌研究，提高杀菌效果；探索研究更多的非热杀菌技术，开拓非热杀菌技术在水产品加工贮藏领域的应用。随着科学技术的不断发展，非热杀菌技术将在水产品加工过程中得到越来越多的应用。
二、罗非鱼加工过程减菌化处理技术
1．食品级过氧化氢对染菌罗非鱼片的杀菌效果
（1）过氧化氢的稳定性
①温度对过氧化氢溶液稳定性的影响。分别将试验用氧化氢稀释成样品浓度为6%和1%的待测样，于不同温度下放置5min后测定溶液中过氧化氢含量，结果见图3-37。
图3-37　温度对过氧化氢溶液稳定性影响
过氧化氢是一种具有强氧化作用的物质，其稳定性受浓度、温度等多种因素影响。由图3-37可知，随温度的升高，溶液中过氧化氢浓度均有下降，5℃放置5min，浓度6%和1%的待测样品中过氧化氢含量分别下降7.47%和4.23%，随放置温度的升高，过氧化氢浓度下降幅度加快，25℃放置5min，浓度6%和1%的待测样品中过氧化氢含量分别下降18.80%和17.45%，说明该过氧化氢溶液受温度影响较大。因此，加工过程中施用宜在低温条件下操作。
②时间对过氧化氢溶液稳定性的影响。将试验用氧化氢稀释成样品浓度为4%的待测样，于5 ℃温度下放置不同时间后测定溶液中过氧化氢含量，结果见图3-38。
图3-38　放置时间对过氧化氢溶液稳定性影响
由图3-38可见，过氧化氢溶液随放置时间的延长浓度略有下降，但影响幅度较小，5℃放置10min后下降幅度仅为5.32%。通常情况下H2O2在水溶液中稳定性较低，但该试验样品中由于加入特殊的载体物质，防止过氧化氢过速分解，保证产品中过氧化氢浓度的稳定性。
（2）过氧化氢溶液对染菌罗非鱼片杀灭效果的影响
①作用时间对染菌鱼片细菌杀灭效果的影响。将染菌后的鱼片置于有效过氧化氢浓度为2.54g/L的溶液中，料液比例为1∶2，分别于0min、2min、4min、6min、8min、10min取样，测定浸泡液中过氧化氢浓度及样品中细菌含量，计算杀菌率，结果见图3-39。
图3-39　作用时间对鱼片杀菌效果的影响
由试验结果可知，在整个浸泡过程中，过氧化氢浓度不断下降，在2min内，浸泡液中过氧化氢浓度下降幅度最小，仅下降10.32%，但对细菌的杀菌效率已达到比较高的水平，为82.9%，此后杀菌率上升幅度不大，6min时杀菌率达90%以上，细菌总数减为5.51×104个/g，符合食品卫生相关标准要求。
②浸泡液浓度对染菌鱼片细菌杀灭效果的影响。将染菌后的鱼片经不同浓度的过氧化氢溶液处理，料液比例为1∶2，浸渍时间为6min，鱼片取出后测定浸泡液中过氧化氢浓度及样品中细菌含量，计算杀菌率，结果见图3-40。
图3-40　浸泡液浓度对鱼片杀菌效果的影响
由图3-40可知，过氧化氢原始浓度越高，溶液的杀菌能力越强，过氧化氢耗费量越大，当过氧化氢浓度小于1.27g/L时，杀菌率为96.24%，浓度高于1.27g/L后，对鱼片的杀菌率影响不大，但过氧化氢消耗量却明显增加。这是因为过氧化氢在杀灭细菌、霉菌类微生物时，首先作用于细胞膜，使细胞膜的结构受到损伤，阻碍其正常的新陈代谢功能，继而破坏膜内组织，直至菌体死亡，也就是说过氧化氢通过作用菌体细胞的有机质达到杀菌的作用，但水产品本身也是由有机质构成，不可避免成为过氧化氢的作用对象，因此，过氧化氢溶液浓度越高其有效杀菌成分消耗越多。
③浸泡液比例对染菌鱼片细菌杀灭效果的影响。将染菌后的罗非鱼片经不同液料比的过氧化氢溶液处理，过氧化氢样品原始浓度为2.54g/L，浸渍时间为6min，样品取出后测定浸泡液中过氧化氢浓度及样品中细菌含量，计算杀菌率，结果见图3-41。
图3-41　液料比例对鱼片杀菌效果的影响
由图3-41可见，浸泡液与原料比为1∶1时，浸泡液的浓度下降最大，此时的杀菌效率不及85%，当浸泡液与原料比例超过2∶1时，杀菌率超过95%，随浸泡液比例的增加，浸泡液浓度下降趋缓，但并未明显提高染菌鱼片的杀菌率，且过氧化氢实际消耗量提高。这是因为浸泡液比例过低，无法浸没鱼片表面，从而影响溶液的杀菌效率，而浸泡液充足的情况下，其中的过氧化氢在杀菌的同时也作用于肌肉组织，从而造成过氧化氢的过度消耗。
（3）处理条件对过氧化氢残留量的影响
将染菌后的鱼片经不同浓度的过氧化氢溶液处理不同时间后，取出样品，用等量的无菌水冲洗，分别测定每次冲洗后过氧化氢的含量，近似看成鱼肉中过氧化氢的残留量，结果见表3-34。
表3-34　不同处理条件对过氧化氢残留量的影响
由表3-36可见，过氧化氢处理时间越长，处理液浓度越大，过氧化氢残留量越高；但样品经适度的水洗可以去除大量残留在表面的过氧化氢含量。由于过氧化氢本身并不稳定，在搅动、加热或光照后容易分解成水和氧气，我国和国际组织均未制定固体食品中过氧化氢的测定方法，因此，该法近似将冲洗液中过氧化氢的含量作为样品中过氧化氢的残留量存在一定的不足，还有待进一步研究。
2．鲜罗非鱼片减菌化预处理方法
（1）不同减菌方法对罗非鱼片菌落总数的影响
图3-42可以看出，3种不同浓度H2O2处理鱼片1min后，鱼片的菌落总数均大幅减少，随着时间的延长，菌落总数的减少趋缓。同时由图3-42可知，随着H2O2浓度的变大，菌落总数相应变小。对采用H2O2进行减菌处理的结果进行方差分析可知，处理时间对结果的影响极显著（F=21＞F0.01），浓度的对结果的影响也极显著（F=76>F0.01），首先考虑H2O2浓度对减菌效果的影响，从结果来看，0.1%和0.3%浓度的H2O2减菌效果相差不大，故从经济角度考虑0.1%比较合适，使用0.1% H2O2处理5min时，效果最好，较1min及3min分别高出7.89%及6.58%，故采用H2O2处理时宜采用浓度为0.1%的溶液处理5min。
图3-42　H2O2处理对菌落总数的影响
图3-43中显示，采用100mg/kg及150mg/kg浓度的NaClO溶液处理2min时，罗非鱼片的菌落总数迅速减少到1.6×104CFU/g以下，但随着处理时间的延长菌落总数的减少不明显。而50mg/kg NaClO溶液的减菌效果是随着时间的延长越好。对NaClO溶液处理后罗非鱼片的菌落总数结果进行方差分析的结果显示，其浓度的影响显著（F0.05<F=15.5<F0.01），处理时间的影响不显著（F=1.6<F0.05）。考虑减菌处理的试剂成本，减菌液浓度越小越好，故采用100mg/kg，从处理时间对结果的影响的差异来看，2min后，各浓度处理罗非鱼片的菌落总数曲线的斜率均变小，浓度为100mg/kg及150mg/kg时曲线的斜率为0，即菌落总数随处理时间的延长没有持续减少，这主要是由于NaClO的光敏性，它见光后会迅速分解，即处理时长达到一定时间，NaClO便失去了减菌的效用，故从效率角度，处理2min较为适宜。
图3-43　NaClO处理对菌落总数的影响
采用ClO2处理时，溶液的浓度及处时理时间的影响都极为显著（F浓度=21.5>F0.01，F时间=51.5>F0.01），从图3-44可看出，处理时间对减菌效果影响较大，3种浓度在0～10min时曲线斜率较大，说明ClO2在10min之内有比较稳定的减菌效果，10min以后，各浓度ClO2溶液处理后鱼片的菌落总数基本稳定，即ClO2溶液基本不再有灭菌效用，故减菌时间宜采用10min。从各浓度ClO2溶液的处理效果来看，当ClO2的浓度为50mg/kg时，随处理时间的不同，减菌率在51.3%～68.4%；当浓度为100mg/kg时，减菌率在65.7%～75%；而当浓度达到150mg/kg，处理时间达到10min以上时，减菌效果可以达到90.7%，减菌效果最好。
图3-44　ClO2处理对菌落总数的影响
如图3-45所示，采用壳聚糖具有良好的减菌效果，各浓度处理2min后，菌落总数均减至1.0×104CFU/g以下，之后随着时间的延长，由3条曲线的斜率可以看出菌落总数减少变缓，同时由方差分析可得，其浓度和处理时间对减菌效果的影响都不显著（F浓度=5.2<F0.05，F时间=3.8<F0.05）。从减菌率来看，均在88%以上，甚至高达97.4%。结果表明，当壳聚糖浓度为2g/L和3g/L，处理时长达5min以上时，对菌落总数的影响效果基本相当，所以，采用壳聚糖处理鱼片时，2g/L浓度处理5min比较合适。
图3-45　壳聚糖处理对菌落总数的影响
臭氧由于强氧化性，其减菌效果明显优于其他减菌剂，减菌率均超过90%，由图3-46看出，在0～2min时间段内减菌效果明显，5min之后趋平，由曲线看各浓度的减菌效果可知，5min后，浓度为5mg/kg和10mg/kg时鱼片的菌落总数约为1mg/kg处理时的一半，浓度继续增大时鱼片的菌落总数基本没有变化，表明O3浓度为5mg/kg时即可达到良好的减菌效果。通过方差分析结果可知O3浓度对鱼肉的菌落总数无显著影响（F=3.8<F0.05），而处理时间的影响极显著（F=18.25>F0.01），考虑工艺及最终处理效果，选取O3浓度5mg/kg，处理5min。
图3-46　O3溶液处理对菌落总数的影响
（2）不同减菌溶液处理对罗非鱼肉色差的影响
根据上文的试验结果，用5种减菌剂的最佳处理工艺对罗非鱼片进行处理，并对比其对罗非鱼肉色差的影响。处理的工艺及结果分别见表3-35、表3-36。
表3-35　减菌处理工艺参数
表3-36　不同灭菌处理后鱼肉色差测定结果
由表3-36结果可以看出，经过不同的减菌方法处理后，鱼肉的L*值都有所增加，同时a值都有不同程度的减小，b*值变化不明显对结果分析的意义不大。分析其原因，由于采用的减菌剂除壳聚糖外均有一定的漂白作用，色差的测定是根据肉的反光而分析得出的结果，经过一定的漂白后在结果上表现为亮度的增加。所测得a*值表明鱼肉的红色都有降低，从结果同时可以看出，经H2O2、ClO2、O3以及壳聚糖处理后的鱼肉较NaClO处理后的肉色要鲜亮，可能是因为前3种试剂具有氧化作用，在处理时分解释放出O2，一定程度上增加了鱼肉表面的氧分压，促进了氧合肌红蛋白的生成，使肉色显得鲜红；而壳聚糖可以在肉的表面形成一种保护膜对肉色起了一定的保护作用，但由于为酸溶液，降低了肌肉的pH，促进了氧合肌红蛋白的氧化而转变为高铁肌红蛋白，使肉色有所降低。
分析可知，用壳聚糖处理后鱼肉色度值（H*值）变小，肉色鲜亮，臭氧处理后变化不大，而其他方法处理后，H*值增幅较高，肉色偏黄。饱和度（C*值）结果表明，经过处理后肉色都有所变浅，臭氧处理的变化最小，这也与以上L*值及a*值的分析结果一致。
（3）不同减菌溶液处理对罗非鱼肉感官品质的影响
从表3-37的数据分析显示，除NaClO对感官色泽影响较为明显外，其他灭菌剂的影响不明显，但气味差别加大，H2O2、ClO2、NaClO处理后有明显的试剂的味道，而壳聚糖由于是醋酸溶液，鱼肉经过处理后有明显的酸味。放置1h后，各样品的色泽变化不一，H2O2、ClO2处理的样品颜色较刚处理后稍有变淡，可能是由于其继续对鱼肉漂白作用的结果，壳聚糖处理后的鱼肉红白间变得模糊，表面有一层薄薄的透明膜状物，可能是由于壳聚糖继续吸水膨胀后，其在鱼肉表面形成的保护膜增厚的原因。由于处理后随着时间的增长，各减菌剂分解、挥发，残留的气味渐淡，产品的气味略有改善。综合样品的色泽和气味结果，采用臭氧处理的样品前后都变化甚微，可能是由于其稳定性差，很快会自行分解，其持续作用的时间短，对鱼肉感官影响有限。
表3-37　不同灭菌处理后鱼肉的感官评定结果
研究结果表明，采用H2O2处理时宜采用浓度为0.1%的溶液处理5min；而NaClO溶液最适宜处理条件是100mg/kg处理2min；采用壳聚糖处理时，2g/L浓度处理5min比较合适；ClO2浓度达到150mg/kg处理时间达到10min时减菌效果可以达到90.7%，此时是其最好效果。和各减菌剂的减菌效果比较，O3水的效果最好，处理后菌落总数即降至0.6×104CFU/g以下，用浓度为5mg/kg的O3水处理鲜罗非鱼片5min，有较佳的保鲜效果，能明显地延长产品感官质量，具有显著的杀菌和抑菌作用，菌落总数比对照组减少90%以上。这是因为O3气体属强氧化剂，具有广谱杀微生物作用，其杀菌速度比氯快300～600倍，O3在水中的溶解度为氧的10倍，因此，其水溶液（O3水）亦有良好的杀菌作用。同时O3的浓度和处理时间对减菌效果影响不显著，说明处理后O3对产品没有持续影响作用，可以保证鱼肉品质，色差及感官分析结果可以印证此点，这是因为O3稳定性差，很快会自行分解为氧气，不存在有毒残留物，所以，O3是一种无污染的消毒剂，与其他灭菌剂（H2O2、ClO2、NaClO）相比，更能保证罗非鱼肉的食用安全性。从对鲜罗非鱼片实际灭菌效果及感官影响，经济实用，使用方便等方面考虑，采用5mg/kg的O3水，处理5min来对罗非鱼片进行减菌处理最佳。虽然壳聚糖的减菌效果与O3相比差异不显著，而且其作为一种高分子的糖类聚合物对人体无毒无副作用，还具有一定的生理活性，然而由于其中一种大分子的聚合物使用后容易在产品的表面形成一层薄膜，在一定程度上会影响产品的感官品质，一旦此问题解决，其作为一种新型的灭菌剂，具有十分广阔的利用前景。
三、罗非鱼片臭氧减菌化技术
1．臭氧冰在罗非鱼片保鲜中的应用
（1）感官质量评分
罗非鱼片的感官评分如图3-47所示。从该图中可以看出，用臭氧冰1、臭氧冰2和对照组的感官评分均随贮藏时间的延长而下降；3 d后，臭氧冰1和臭氧冰2保藏的感官评分分别为9.6分和9.4分，已明显高于对照组的8.6分，之后的变化也均高于对照组；如果以6分为鲜度良好的界限，臭氧冰1保藏在约12 d达到此界限，臭氧冰2的保藏在约10 d达到此界限，而对照组则约在8 d后就开始低于6分。因此，就感官评分而言，用臭氧冰1保藏明显地改善了罗非鱼片的感官质量，能使罗非鱼片的保鲜期延长了约4 d。
图3-47　鲜罗非鱼片冷藏过程的感官质量变化评分
从感官观察结果可以看出，用臭氧浓度为5mg/kg的臭氧冰1保藏效果最好，用臭氧浓度为15mg/kg的臭氧冰2保藏效果次之，而用对照组保藏的效果最差。臭氧冰2比臭氧冰1的保藏效果差，主要是因为臭氧冰2的臭氧浓度过高使其产品氧化较强，造成产品色泽和肌肉组织变差，因此，应避免使用过高的臭氧浓度。
（2）TVB-N值的变化
罗非鱼片在保藏过程中，TVB-N值是反映鲜度变化的重要指标，由图3-48可看出，经过8d，对照组保藏的鱼片，其TVB-N值达到20.65mg/100g，已超过国家标准规定的20mg/100g；到第11天，臭氧冰2保藏的鱼片其TVB-N值达才达到19.85mg/100g；到第13天，臭氧冰2保藏的鱼片其TVB-N值达才达到20.7mg/100g，这表明臭氧冰在一定程度上能够较好地控制罗非鱼片TVB-N值的产生，使保鲜期延长3～4d。
图3-48　鲜罗非鱼片冷藏过程的挥发性盐基氮（TVB-N）的变化
（3）pH的变化
由图3-49可看出用臭氧冰2保藏的鱼片，经过3d的保藏后pH急剧下降，而用臭氧冰1和对照组保藏的鱼片pH在整个试验中都只有较轻微的下降，其中用臭氧冰1保藏的鱼片的pH下降幅度略大于普通冰处理的鱼片。因为臭氧分解而生成的过氧化氢具有一定的酸性；臭氧冰2是在制冰时经调酸至pH4而制成的，酸性会更大，所以用臭氧冰2保藏的鱼片的pH在保藏时急剧下降。从鱼片的感官质量评价可知，鱼片的外观和风味、肌肉弹性等都受到影响，降低了鱼片的质量，所以臭氧冰的浓度不宜太高，采用臭氧浓度为5mg/kg的臭氧冰1保藏鱼片具有较佳的效果。
图3-49　鲜罗非鱼片冷藏过程pH的变化
（4）水分含量的变化
由图3-50可看出，鲜罗非鱼片在保藏期过程中，臭氧冰1、臭氧冰2和对照组水分含量均逐渐下降，趋势亦较相同，这说明用臭氧冰保藏罗非鱼片对水分含量的变化影响不大。
图3-50　鲜罗非鱼片冷藏过程水分的变化
（5）细菌菌落总数的变化
鲜罗非鱼片在冷藏过程中细菌菌落总数的变化见图3-51，从该图可看出，对照组保藏的鲜罗非鱼片，菌落总数随着贮藏时间的延长而逐渐增加，且在第9天之后现菌落总数出现快速增长的现象，用臭氧冰保藏的鲜罗非鱼片，其菌落总数明显比对照组要低得多。而且随着臭氧浓度的提高，对微生物的抑制作用也有所加强，臭氧冰1和臭氧冰2的菌落总数随着贮藏时间的延长略有增长，但变化不明显。
图3-51　鲜罗非鱼片冷藏过程菌落总数的变化
由此可见，臭氧冰具有显著的杀菌和抑制作用，鲜罗非鱼片保藏17d时，臭氧冰1和臭氧冰2的菌落总数分别为2.4×105CFU/g和1.0×105CFU/g，而对照组达到6.6×106CFU/g，比对照组分别减少了82%、97%，从而有效地保证了罗非鱼片安全质量，明显地延长了产品的货架保鲜期。
臭氧冰能明显地改善鲜罗非鱼片的产品感官质量，使鲜罗非鱼片感官质量的保鲜期延长了约4 d。但臭氧冰的臭氧浓度含量过高时会使产品造成色泽和肌肉组织变差，因此应避免使用过高臭氧浓度的臭氧冰；臭氧冰保藏鲜罗非鱼片，能有效降低水产品TVB-N的产生，使产品保鲜期延长3～4 d；臭氧冰对产品的pH会有较轻微的下降，高浓度的臭氧冰会影响鱼片的外观、风味和肌肉弹性，降低了鱼片的质量，所以臭氧冰的浓度不宜太高。试验表明采用臭氧浓度为5mg/kg的臭氧冰保藏鱼片具有较佳的效果；臭氧冰保藏鲜罗非鱼片对产品的水分含量变化影响不大；臭氧冰具有显著的杀菌和抑制作用，能显著地延长产品的货架保鲜期。当臭氧冰融化成水，臭氧就氧化分解为氧气，不会残留任何有害物质，并不会破坏食品原有的营养成分，是一种非常安全的食品消毒保鲜剂。可以预料，随着该领域研究的深入开展，臭氧冰保鲜将成为水产品保鲜的一条重要途径。
2．臭氧水对罗非鱼中微生物的杀菌效果
（1）臭氧水稳定性的测定
打开臭氧发生器一段时间后，关闭机器，测定臭氧浓度的降解情况，时间间隔为10min，试验重复3次，取平均值，结果见表3-38。
表3-38　臭氧浓度的降解规律
臭氧是一种具有强氧化作用的物质，但不稳定，在水中的浓度受多种因素影响，随着时间的推移，臭氧浓度下降。在纯水中臭氧水浓度越高，其降解除速度越快。由表3-38可知，于10 ℃放置，在测试范围内，臭氧浓度约为10mg/L时，经过20min，降解程度超过50%；而臭氧浓度为3.58mg/L时，降解50%所需的时间则超过40min；此外，有报道表明温度也会影响臭氧的溶解性，通常情况下温度越低，其溶解臭氧的能力越强。因此，加工操作时应尽可能保持低温，且臭氧应现配现用，才可以更好地发挥其杀菌作用。
（2）臭氧对罗非鱼中细菌的杀灭效果
将鱼片以1∶6的比例置于不同浓度的臭氧水中，作用时间为10min，测定其对鱼片的杀菌效果，试验重复3次，取平均值，结果见表3-39。
表3-39　水产品加工过程中臭氧杀菌效果
根据试验结果可知，随臭氧浓度增加，其杀菌能力增强，但与臭氧单独作用于菌体溶液的杀菌效果存在较大差异，分析其原因，与臭氧的灭菌机制有关。在杀灭细菌、霉菌类微生物时，臭氧首先作用于细胞膜，使细胞膜的构成受到损伤，导致新陈代谢障碍并抑制其生长，臭氧继续渗透破坏膜内组织，直至菌体死亡。也就是说臭氧必须和菌体细胞充分接触，使菌体细胞的有机质分解进而死亡。而在罗非鱼加工过程中，对于外来污染菌，且依附于产品表层的，臭氧可以充分发挥其杀菌优势。但罗非鱼本身也是由有机质构成，不可避免成为臭氧的分解对象，因此臭氧杀菌技术对于水产品本身或内部潜藏的菌体的杀菌效果未必同样有效。
（3）臭氧作用时间对细菌的杀灭效果
为确定臭氧作用时间对杀菌效果的影响，将鱼片于不同浓度下浸渍不同时间，试验重复3次，取平均值。
试验结果可知用一定浓度的臭氧浸泡鱼片，随浸泡时间的延长，并不能使臭氧的灭菌效果明显增加，经过进一步验证发现，如果采用静水浸泡，臭氧的消耗极快，浓度约为5mg/L的臭氧浸泡鱼片，数分钟后其臭氧就已基本耗尽。随着水溶液的浊度的增加，消耗在有机物分解方面的臭氧明显增加，这就出现两个值得注意的问题：其一，臭氧水浓度必须达到一定值，否则难以保证杀菌效果；其二，臭氧水必须是流动的，或采用喷淋方式，或使用机械化专用浸泡槽，能使产品从低浓度向高浓度移动，又有足够的处理时间，以保证产品的杀菌效果。
表3-40　臭氧作用时间对细菌杀灭效果的影响
（4）与传统的杀菌方式比较
比较浓度为18.8mg/L的臭氧水与100mg/L的次氯酸钠对水产品中细菌的杀灭效果，作用时间为15min，结果见表3-41。
表3-41　臭氧水与次氯酸钠杀菌效果比较
由表3-41可见，臭氧消毒方式在效果上明显好于传统的氯法消毒，周向阳等人也通过试验证实了这一点。此外，在传统氯消毒过程中，多采用浸泡的方式，有效氯作用消失快，只在短时间内维持杀菌作用力，要想维持一定的杀菌力，必须提高消毒剂的浓度，而这样会使产品产生浓重的氯臭味道。如果按照臭氧水一样以流动水的方式进行消毒，大量的排放水必然造成严重的环境污染。而用喷淋或流动的臭氧水消毒，排放的臭氧水一方面会以很快的速度降解，另一方面在一定程度上也能对周围的环境起到净化作用。
四、臭氧水处理对鱼肉品质的影响
1．罗非鱼肉pH的变化
按照上述方法测定臭氧减菌化处理前后罗非鱼片在冻藏过程中pH变化结果如图3-52所示。
图3-52　-20℃冻藏过程中罗非鱼片pH变化规律
由图3-52可知，臭氧处理组与对照组罗非鱼片pH的变化范围是：（6.3±0.1）～（7.1±0.0）。罗非鱼肉贮藏前10 d，臭氧处理组与对照组罗非鱼片pH分别由（6.7±0.3）、（6.6±0.1）下降到（6.3±0.2）、（6.3±0.1），贮藏初期，pH的下降主要与鱼肉中ATP降解、在无氧条件下肌肉中糖原酵解后产生乳酸及鱼肉中游离氨基酸组分与含量变化有关；其中臭氧水处理组的下降幅度稍大于未处理组，这可能是由于臭氧分解产生的过氧化氢具有一定的酸性引起的。有研究表明，鱼肉中腐败菌作用产生的氨及三甲胺等挥发性成分引起鱼肉在贮藏后期pH升高。该研究中两组罗非鱼片在贮藏10 d后pH升高，表明鱼肉机体已进入自溶阶段，鱼肉组织中的蛋白质分解为精氨酸、赖氨酸和组氨酸等碱性物质导致pH升高；另外，随着贮藏时间的延迟，鱼肉中的腐败菌促使鱼肉蛋白质、氨基酸及其他一些含氮物质分解为氨及胺类等挥发性腐败物，导致了pH的升高，在贮藏150 d时pH达到最大值，对照组为（7.1±0.0），臭氧水处理组为（7.0±0.0）；Olley与Lover早期研究了不同贮藏温度下鳕中磷脂质的酶促水解作用，结果表明，贮藏温度越高，由磷脂质水解产生游离脂肪酸的速度越快，当贮藏温度为-22 ℃时，鳕贮藏25周后，肌肉中游离脂肪酸含量由10%增加到20%，该研究在-20 ℃贮藏第180天时，两组鱼肉的pH较第150天有显著降低（P<0.05），这可能是由于罗非鱼肉肌肉中磷脂质因酶促水解作用产生游离脂肪酸引起的。因此，总体来看，臭氧水处理组与对照组鱼肉pH在冻藏过程中变化趋势无显著性差异（P>0.05）。
2．罗非鱼肉丙二醛（MDA）的变化
按照上述方法测定臭氧减菌化处理前后罗非鱼片在冻藏过程中MDA含量变化，结果如图3-53所示。
图3-53　-20℃冻藏过程中罗非鱼片MDA含量变化规律
由图3-53可以看出，在贮藏过程中，臭氧水处理组MDA含量由（0.83±0.06）nmol/mg升高到（26.16±0.53）nmol/mg，对照组MDA含量由（1.19±0.31）nmol/mg升高到（19.35±0.18）nmol/mg，臭氧处理组MDA含量与对照组具有显著性差异（P<0.05）。贮藏过程中，脂质氧化产物MDA含量总体呈上升趋势。在贮藏120 d时MDA含量增加速度变大，随后MDA含量随贮藏时间继续升高；经臭氧水处理后B组罗非鱼片中MDA的含量明显比对照组高（P<0.05），由于臭氧水减菌化处理过程中产生了具有较高氧化还原电势的羟基自由基和超氧阴离子自由基，O-2·在水溶液中可与H+结合生成HO2·，作为氧化剂或还原剂，HO2·的化学活性高于O-2·，HO2·的产生可以引起鱼肉脂质过氧化，HO2·与鱼肉脂质发生反应后，按照化学平衡原理，O-2·可以继续与H+反应生成HO2·，维持一定的反应；另外，早期研究表明，随着O-2·浓度的增加，可导致H2O2、OH、1O2及脂质过氧化产物生成量的增多。因此，臭氧处理组罗非鱼片中由于过量的O-2·的存在导致了脂质过氧化产物MDA含量高于对照组，因此可得出结论，臭氧处理过程中产生的羟自由基及超氧阴离子自由基衍生物，可出促进鱼肉中脂质氧化。
3．罗非鱼肉K值的变化
按照上述方法测定臭氧减菌化处理前后罗非鱼片在冻藏过程中pH变化，结果如图3-54所示。
图3-54　-20℃冻藏过程中罗非鱼片K值变化规律
由图3-54可知，对照组鱼肉K值由（7.80%±0.17）%降低至（4.28±0.06）%，当贮藏180 d时K值增加到（55.35±1.85）%；臭氧处理组鱼肉的K值由（14.22± 1.11）%降低至（11.19±0.09）%，当贮藏180 d时K值增加到（39.01±2.15）%，A、B两组鱼肉K值随贮藏时间的增加均呈上升趋势。这是由于水产动物死后初期，肌细胞中饥浆蛋白质网内Ca2+吸附能力下降，使Ca2+大量释放到细胞液中，促使肌原纤维内钙浓度增加，而Ca2+具有激活Mg2+-ATP酶活性的作用，使ATP含量因ATP酶催化水解迅速下降。在冻藏前60 d，对照组的K值变化幅度较小（<10%），这是由于贮藏条件的低温钝化了磷酸酶和核苷水解酶的活性，引起ATP降解中间产物IMP降解速度变缓，而经过臭氧水处理的罗非鱼片在冻藏期前90 d，K值却大于对照组，但仍维持在一级鲜度（K值≤20%），这可能是由于臭氧减菌化处理的罗非鱼片中因残留臭氧及自由基的强氧化作用导致鱼肉ATP发生降解反应，导致关联物中HxR与Hx含量升高，从而使K值在前90 d的时间内要高于对照组。随着贮藏时间的延长，贮藏90 d后，对照组组鱼肉K值超过二级鲜度（K值≥40%）这可能是由于对照组罗非鱼片K值不断增大，此过程中由于部分嗜冷腐败菌对鲜度的影响作用变大，而经臭氧水处理过的鱼片保持在二级鲜度范围内，这主要是由于臭氧处理后罗非鱼片表面微生物含量降低，由于初始微生物数量较低，因而臭氧减菌化处理后的罗非鱼片在贮藏90 d以后K值增加较对照组低，因此，对照组因微生物中嗜冷菌及特征腐败菌引起的鱼肉K值升高作用比臭氧处理组要大，通过臭氧减菌化处理可有效提高罗非鱼片在贮藏过程中的鲜度。
4．罗非鱼肉色差的变化
按照上述方法测定臭氧减菌化处理前后罗非鱼片在冻藏过程中鱼肉色差变化结果如表3-42及图3-55、图3-56所示。
图3-55　-20℃冻藏过程中罗非鱼片HW值变化规律
图3-56　-20℃冻藏过程中罗非鱼片C*ab值变化规律
由表3-42可知，臭氧水处理后罗非鱼肉的L值较对照组大（P<0.05），这是由于臭氧水具有的漂白作用使鱼肉亮度提升，并随冻藏时间的延长而发生显著性变化。在冻藏期前10 d，两组鱼肉的L值均呈上升趋势，可能是由于冻藏过程中罗非鱼肌肉内冰晶体的生成导致肉质持水性发生改变，鱼肉表面的游离水增多，在色差测定时增强了对光的反射，测得L值变大。李来好等研究了罗非鱼片CO活体发色技术，研究表明经发色后的罗非鱼片明显变红，且可显著降低罗非鱼片菌落总数，如前所述，鲜活罗非鱼分割切片之前未经过发色处理且进行了放血操作，选定测定色差的鱼肉位于罗非鱼肉的接近鱼尾的腹部，所测得a<0，因此，试验中罗非鱼片不显示红色。经臭氧减菌化处理后的罗非鱼片所测得的b*值较对照组稍低，因此，对照组较处理组发黄，这是臭氧对罗非鱼片的漂白作用造成的。
表3-42　-20℃冻藏过程中罗非鱼片L*值、a*值、b*值分析结果
由图3-55与图3-56可以看出，在贮藏初期，臭氧水处理组的鱼肉HW值较对照组大，而C*ab值较对照组小，说明在贮藏过程中鱼肉色泽变黄、变淡，原因是鱼肉中肌红蛋白为水溶性蛋白，在罗非鱼在臭氧水处理过程中，部分肌红蛋白溶于水，造成鱼肉中肌红蛋白数量减少，因而使鱼肉的色泽变淡；在贮藏后期，臭氧处理组与对照组鱼肉的颜色均变深，原因可能是高铁肌红蛋白在贮藏过程中的产生使鱼肉颜色变深，而臭氧水处理组鱼肉表现更为明显，这是由于臭氧的强氧化性将部分不饱和肌红蛋白氧化成高铁肌红蛋白从而使鱼肉颜色变深。
5．罗非鱼肉质构的分析
（1）罗非鱼肉硬度变化
质构仪所测硬度是指待测测样品达到一定变形程度时所必需的力，仪器记录的第一次穿冲样品时的压力峰值即为硬度值。臭氧减菌化处理前后罗非鱼片在冻藏过程中鱼肉硬度变化见图3-57。
图3-57　-20℃冻藏过程中罗非鱼片硬度变化规律
由图3-57可知臭氧处理组与对照组罗非鱼片的硬度值随贮藏时间的延长总体呈下降趋势，分别由（139.50±36.51）与（107.50±22.10）下降到（45.33±7.63）与（29.58±9.21）。由图3-57中A可知，在冻藏前10 d内肌肉硬度下降速度较快，这是由于试验在杀死鲜活罗非鱼后所得罗非鱼片在鱼体死后僵硬之前即直接进行冻结，使其僵直开始时间及持续时间延长。鱼体进入僵直期的迟早与僵直持续时间的长短主要是由鱼的种类、致死方式、致死前生理状态及贮藏温度等因素影响的。对照组鱼肉在10～20d时间段内，鱼肉硬度略有提升，这是由于进行质构测定时，罗非鱼肉在室温解冻后流出较多汁液，即解冻僵硬现象，此时肌肉中糖原在无氧条件下短时间内发生糖酵解作用，产生的能量促使ADP在肌酸激酶的催化下生产ATP，导致僵硬程度较高。对照组鱼肉在贮藏后期，由于鱼肉组织中酶类和微生物的作用蛋白分子结构改变，肌细胞蛋白和细胞外基质结构发生改变使得肌原纤维间隙增大、微观结构改变及肌原纤维间结构变得比较疏松，从而导致罗非鱼肌肉质地软化；另外，随着冻藏时间的延长鱼肉解冻失水率逐渐升高亦可导致鱼肉硬度下降。由图3-57中B可知，经过臭氧减菌化处理的罗非鱼片硬度比对照组的略高，且鱼肉硬度在20～30 d之间略有升高，此现象较对照组有所推迟。导致臭氧处理组罗非鱼片硬度较对照组高的原因，主要有两个方面：第一，臭氧处理后，罗非鱼片表面微生物含量较对照组明显降低，因而由微生物导致鱼肉软化的作用下降；第二，臭氧具有的强氧化性使处理后的罗非鱼肌肉蛋白发生变性失水作用，导致肌肉蛋白网络结构聚集从而使硬度上升，另外，由于臭氧处理过程中产生的超氧阴离子自由基与残留的臭氧，可以抑制鱼肉中糖原酵解作用，从而使鱼肉硬度降低速度变缓。
（2）罗非鱼肉胶着性变化
物料的胶着性可模拟表示将半固体的样品破裂成吞咽时的稳定状态所需的能量。臭氧减菌化处理前后罗非鱼片在冻藏过程中鱼肉胶着性变化见图3-58。
图3-58　-20℃冻藏过程中罗非鱼片胶着性变化规律
由图3-58可知，臭氧处理组与对照组罗非鱼片胶着性前60 d随贮藏时间的延长呈显著下降趋势，对照组罗非鱼片胶着性由（75.75±11.52）下降到（32.82±7.00），下降了56.67%，但第90天时胶着性较第60天升高了16.49%；臭氧处理组胶着性由（94.78±24.00）下降到（40.76±12.64），下降了57.00%，第90天时胶着性较第60天升高了31.60%，整体来说，臭氧处理组胶着性比对照组高（P<0.05）。第90天时鱼肉胶着性变大的原因有待探明。
（3）罗非鱼肉黏合性变化
物料的黏合性是指在质构测定特质曲线中，第一次压缩曲线达到零点与第二次压缩曲线开始间曲线的负面积。臭氧减菌化处理前后罗非鱼片在冻藏过程中鱼肉黏合性变化见图3-59。
图3-59　-20℃冻藏过程中罗非鱼片黏合性变化规律
由图3-59可知，臭氧处理组与对照组罗非鱼片的黏合性在贮藏前10 d呈上升趋势，分别由（-1.03±0.88）与（-0.74±1.41）升高到（-0.30±0.36）与（-0.20±0.26）；在第10～90天贮藏期内，两组罗非鱼片黏合性变化不显著（P>0.05）；随后罗非鱼片黏合性随贮藏时间的延长而显著下降（P<0.05）。罗非鱼肉在冻藏中，由于蛋白质分子的聚集、降解及疏水性基团的暴露，都会改变鱼肉中蛋白的黏度，另外，蛋白质的黏度还受到蛋白质浓度、pH及离子强度等因素影响，鱼肉蛋白质黏度的改变导致了鱼肉黏合性发生改变。
（4）罗非鱼肉黏聚性变化
物料的黏聚性值可模拟表示样品内部黏合力，其量度是第二次穿冲的做功面积除以第一次的做功面积的商（面积2/面积1）。臭氧减菌化处理前后罗非鱼片在冻藏过程中鱼肉黏聚性变化见图3-60。
图3-60　-20℃冻藏过程中罗非鱼片黏聚性变化规律
由图3-60可知，臭氧处理组与对照组罗非鱼片在贮藏过程第10～120天期间，其黏聚性随时间变化均不显著（P>0.05），且臭氧处理组罗非鱼片黏聚性与对照组间无显著性差异，因此臭氧减菌化处理罗非鱼片不会对罗非鱼肉黏聚性产生影响，且贮藏时间也不会对其黏聚性产生影响（20～120 d）。
（5）罗非鱼肉弹性变化
弹性是一种样品在应力作用下发生形变，待应力撤销后又恢复到原来的形状需要的高度、时间或体积的比率，形变的大小称为应变。质构仪中的弹性的量度是第二次穿冲的测量高度同第一次测量的高度比值（长度2/长度1）。臭氧减菌化处理前后罗非鱼片在冻藏过程中鱼肉弹性变化见图3-61。
图3-61　-20℃冻藏过程中罗非鱼片弹性变化规律
由图3-61可知，对照组罗非鱼片的弹性在贮藏过程中随时间变化不显著（P>0.05），臭氧处理组弹性在贮藏过程中随时间变化显著（P<0.05）；且臭氧处理组罗非鱼片弹性高于对照组，且样本间具有显著性差异（P<0.05）。由图3-61可知，对照组罗非鱼片在贮藏第20～120天期间，其弹性随时间无显著性变化（P>0.05）；而臭氧处理后罗非鱼片在第20～90天期间，弹性随时间无显著性变化（P>0.05）。因此-20℃冻藏过程中罗非鱼肉弹性变化不大。臭氧处理后使罗非鱼片弹性略高于对照组，可能是由臭氧氧化作用引起的鱼肉蛋白质变性导致的。
（6）罗非鱼肉咀嚼性变化
物料的咀嚼性只用于描述固态样品，其数值以胶着性与弹性的乘积表示。臭氧减菌化处理前后罗非鱼片在冻藏过程中鱼肉咀嚼性变化见图3-62。
图3-62　-20℃冻藏过程中罗非鱼片咀嚼性变化规律
由图3-62可知，臭氧处理组与对照组罗非鱼片咀嚼性在贮藏过程中随贮藏时间的延长而显著下降（P<0.05），分别由（183.07±52.90）与（136.14±26.98）下降到（69.33±12.27）与（57.44±23.83）；臭氧处理组与对照组间咀嚼性差异显著（P<0.05）。由于咀嚼性值是由胶着性与弹性的乘积表示，如前所述，臭氧处理组罗非鱼片胶着性与弹性均大于对照组，因此其咀嚼性亦比对照组大（P<0.05）。
（7）罗非鱼黏附力变化
黏附力是指在质构测试试验中，仪器探头与样品表面之间分离时所需要的力，即待测样品表面对仪器探头的黏附作用力，又称为黏着性。臭氧减菌化处理前后罗非鱼片在冻藏过程中鱼肉黏附力变化见图3-63。
图3-63　-20℃冻藏过程中罗非鱼片黏附力变化规律
由图3-63可知，臭氧处理组与对照组罗非鱼片肌肉黏附力在贮藏期间随贮藏时间变化较显著（P<0.05）。采用配对样本T检验分析对照组与臭氧组黏附力数据，结果表明，两组数据均值无显著性差异（P>0.05）。
6．罗非鱼肉菌落总数分析
按照上述方法测定臭氧减菌化处理前后罗非鱼片在冻藏过程中鱼肉菌落总数变化，结果如图3-64所示。
图3-64　-20℃冻藏过程中罗非鱼片菌落总数变化规律
由图3-64可以看出，臭氧处理组与对照组在-20℃贮藏10 d后，菌落总数均分别由（4.81±0.35）lgCFU与（5.14±0.21） lgCFU下降到（4.12±0.23）lgCFU与（4.25±0.80）lgCFU，其原因是鱼肉冻藏初期，由于鱼肉组织中及鱼片中微生物的自由水与结合水因低温冷冻形成冰晶，冰晶的形成抑制了微生物的生长与繁殖，导致部分非嗜冷或非耐冷微生物死亡。当贮藏时间超过10 d后，菌落总数开始增加，这是由于罗非鱼片中嗜冷微生物或耐冷微生物开始生长、繁殖；而臭氧处理的罗非鱼片菌落总数增加较对照组慢，且菌落数小于对照组，这是由于臭氧水处理罗非鱼片后，罗非鱼片表面微生物由于臭氧的强氧化作用破坏微生物细胞结构，达到减菌效果，处理组罗非鱼片微生物基数低于对照组，因此，在冻藏10 d后，菌落总数小于对照组且增长速度较对照组慢。罗非鱼肉冻藏20 d后，对照组的菌落总数超过二级鲜度指标（≥106 CFU/g），而经臭氧处理的罗非鱼片在贮藏了90 d的时候菌落总数才接近106 CFU/g。随着冻藏时间的延长，对照组细菌总数快速上升，菌落总数达到108 CFU/g，已超过三级鲜度（≥107 CFU/g），臭氧水的强氧化及抑菌能力很好地抑制了微生物的生长，延长了水产品的货架期。
7．臭氧减菌化处理后罗非鱼片品质变化的自由基作用机理分析
臭氧的氧化作用可导致不饱和有机分子的破裂，使臭氧分子结合在有机分子的双键上，生成臭氧化物。臭氧漂白作用的机理就是基于其氧化破坏双键反应作用的；此外，张涛等进行了水合氧化铁催化臭氧氧化去除水中痕量硝基苯的研究，结果表明，当加入自由基抑制剂叔丁醇后，抑制了臭氧在水溶溶液中·OH的生成，从而显著影响了硝基苯的氧化去除，因此，叔丁醇的存在有效抑制了臭氧水中·OH的生成和它对硝基苯的氧化反应，这也间接证明了臭氧催化氧化过程为·OH反应的机理。该研究中臭氧处理对罗非鱼肉的漂白作用，可认为是臭氧水中生成的强氧化性的·OH及O-2·对鱼肉中具有不饱和键的显色物质（如肌红蛋白）破坏作用引起的；另外，臭氧处理组MDA含量及K值与对照组间存在显著性差异，可以认为是臭氧减菌化处理过程中产生的自由基参与鱼肉生物大分子物质氧化作用，而生成各种不同性质的氧化产物导致的；臭氧处理后罗非鱼肉质构的变化，多数是由于鱼肉蛋白质结构变化引起的，臭氧具有的强氧化性使处理后的罗非鱼肌肉蛋白发生变性失水作用，导致肌肉蛋白网络结构聚集从而使硬度上升，臭氧处理过程中产生的·OH与O-2·与残留的臭氧，可以抑制鱼肉中糖原酵解作用，从而抑制鱼肉硬度降低速度。大量研究表明，臭氧具有显著的抑菌作用，其抑菌机理可认为是臭氧处理中产生的活性氧对腐败微生物中生物分子的损伤作用，活性氧作用于腐败微生物可破坏其DNA碱基与糖基，使DNA发生断链与交联作用；另外，活性氧作用于腐败微生物中生物膜的主要成分——磷脂，由于磷脂中富含多不饱和脂肪酸（PUFA），PUFA在自由基的存在下发生脂质过氧化反应及其链式反应，从而导致腐败微生物生物膜受到损伤；再次，臭氧水产生具有强氧化性的自由基可破坏某些腐败微生物的细胞壁及孢子，从而达到抑菌的作用。
五、臭氧水处理对鱼肉安全性评价
1.SD大鼠急性经口毒性试验
急性经口毒性试验是指一次或24h内多次染毒的试验，主要测定受试物的半数致死量或浓度，并观察试验动物的中毒表现。该试验中，罗非鱼片组、溶剂对照组各20只SD大鼠在给予受试物过程及14 d观察期内，大鼠表观行为、活动状况、呼吸、姿势等均未见异常，无大鼠死亡。动物解剖后，肉眼观察大鼠的心脏、肝脏、脾、胃、肠、肾及生殖腺等脏器外形、颜色、大小与比例，均未见任何异常，大鼠脏器未发生病变。大鼠体质量正常增长，罗非鱼片组大鼠体质量在各测定时间点与溶剂对照组比较均无显著性差异（P>0.05）（表3-44），因此，在该试验条件下，经4.5mg/L浓度的臭氧水处理30min后的罗非鱼片对SD大鼠经口最大耐受剂量（MTD）高于15g/kg，毒性分级为无毒。
表3-44　SD大鼠急性经口毒性试验体重结果（g，±s）
2.KM小鼠遗传毒性试验
（1）Ames试验
Ames试验是检测基因突变最常用方法之一，其原理是鼠伤寒沙门杆菌的突变菌株在有组氨酸的培基上可以正常生长，当培养基中无组氨酸时除少数自发回变菌落生长外不能正常生长，且当有能引起该菌因移码突变或碱基置换的致突变剂存在时，突变型会回复突变为组氨酸非缺陷型野生型，使细菌生长增多。当激活某些致突变剂后会引起沙门氏菌突变型发生回复突变，由S9混合液进行受试物的代谢激活作用并测定致突变物质引起的复归突然变异频度作为检出突变性，即可检查受试物是否为致突变物质。该试验中选用的组氨酸缺陷型鼠伤寒沙门氏菌株为TA97、TA98、TA100和TA1024种。一般观察：各组各皿均未见细菌毒性表现及沉淀；当无S9活化系统时，100 μg/皿剂量的诱变剂Dexon引起TA97、TA98及TA102菌株的回变菌落数分别为（1856±80）个、（1965±60）个及（1899±35）个，5 μg/皿剂量的诱变剂SA引起TA100菌株的回变菌落数为（1944±44）个，均显著高于溶剂对照组的2倍（P<0.01）；当有S9活化系统时，100 μg/皿剂量的诱变剂2-AF引起TA97、TA98、T100及TA102菌株的回变菌落数分别为（1931±73）个、（1843±60）个、（1809±105）个及（1913±49）个，显著高于溶剂对照组的2倍（P<0.01）（表3-45）。而罗非鱼片5个剂量组TA97、TA98、TA100和TA102的回变菌落数，无论有无S9活化系统，均未超过溶剂对照组回变菌落数的2倍，且与重复试验结果一致（表3-46）。表明受试罗非鱼片5个剂量组样品对TA97、TA98、TA100和TA1024种菌株未见明显的抑菌作用，也没有能引起菌株的基因移码突变或碱基置换的突变剂存在，上述4种菌株均未发生回复突变。因此，在该试验条件下，经4.5mg/L浓度的臭氧水处理30min后的罗非鱼片Ames试验结果为阴性。
表3-45　臭氧处理罗非鱼片对细菌回复突变菌落数的影响
表3-46　臭氧处理罗非鱼片对细菌回复突变菌落数的影响（重复试验）
（2）骨髓微核试验
骨髓微核试验（micronucleus test）是以诱发小鼠骨髓红细胞微核为指标来推断受试物染色体或有丝分裂器损伤的一种遗传毒性试验，常用于预测受试物的致癌潜力。根据细胞中纺锤体受损而丢失的染色体或胞内无着丝粒染色体片段在细胞分裂后期仍存留于子细胞细胞质中形成的微核，来判断受试物引起染色体异常作用的一种哺乳动物体内试验。
阳性对照组雌性动物的微核率显著高于溶剂对照组（P<0.01），罗非鱼片高、中、低剂量雌性动物的微核率分别为0.40、0.6、0.8，与溶剂对照组比较无显著性差异（P>0.05）；阳性对照组雄性动物的微核率显著高于溶剂对照组（P<0.01），罗非鱼片高、中、低剂量雄性动物的微核率分别为0.40、0.80、0.60，与溶剂对照组比较无显著性差异（P>0.05）（表3-47）。臭氧处理后罗非鱼片未对KM小鼠的骨髓细胞微核率产生具有统计学差异的影响，也无任何剂量反应关系，未影响细胞分裂时染色体的变化，对染色体也无明显断裂效应。在该试验条件下，经4.5mg/L浓度的臭氧水处理30min后的罗非鱼片骨髓细胞微核试验结果为阴性。
表3-47　臭氧处理罗非鱼片对KM小鼠骨髓细胞微核形成的影响（±s）
（3）睾丸染色体畸变试验
染色体畸变是反映生殖细胞DNA损伤的敏感指标，试验通过光镜直接观察染色体的数目和形态的变化（如断裂、易位、缺失及裂隙等），亦可称为细胞遗传学试验（cytogenetic assay）。小鼠睾丸染色体畸变试验属体内染色体畸变试验。
一般来说，由于不同周期的雄性生殖细胞对化学物质具有不同的敏感性，化学诱变剂诱发染色体畸变必须经过DNA复制期，因此，该研究在细线期（leptotene stage）前进行诱变处理，第14天采样，观察在诱变剂细线期前引起的精母细胞染色体效应。阅片观察后发现阳性对照组小鼠的睾丸染色体出现断裂、环状、微小体和多着丝点染色体的细胞数分别为26、68、5和4，畸变总数为103，总畸变率为10.3%，与溶剂对照（0.2%）相比显著升高（P<0.01）；罗非鱼片高、中、低剂量睾丸染色体畸变率分别为0.2%、0.2%，0.1%，与溶剂对照组相比均无显著差异（P>0.05）（表3-48）。有文献报道，通过体外细胞染毒试验发现O3对分裂中期人体口腔表皮癌细胞（human KB cell）染色体断裂率较对照组显著增加；Gooch PC等研究表明，高浓度O3通入含有外源凝集素（phytohaemagglutinin, PHA）刺激后S期人外周血白细胞的HBSS液（Hanks' balanced salt solution）90min以上，发现当剂量为14.46mg/（m3·h）与15.90mg/（m3·h）时有丝分裂时细胞染色单体缺失率显著增加，而在相同的条件下，G1期细胞染色体则未受明显影响。该研究中，臭氧处理后罗非鱼片残留O3浓度较上述研究O3暴露值低，在小鼠生殖细胞减数分裂细线期前以各剂量组罗非鱼片作为诱变剂引起的小鼠睾丸染色体畸变率显著低于阳性对照组。因此，在该试验条件下，经4.5mg/L浓度的臭氧水处理30min后的罗非鱼片睾丸染色体畸变试验结果为阴性。
表3-48　臭氧处理罗非鱼片小鼠睾丸染色体畸变试验结果
急性经口毒性试验是毒性研究的第一步，可初步估计受试物的毒害危险性；Ames试验是目前被世界各国广为采用的致突变性检测方法，可推测受试物的致癌性；小鼠骨髓细胞微核可反映体细胞接触致突变物和致癌物的遗传毒性的敏感指标；如前文所述，小鼠睾丸染色体畸变可反映生殖细胞DNA损伤的敏感度。该研究发现，经4.5mg/L浓度的臭氧水处理30min后的罗非鱼片对SD大鼠经口最大耐受剂量MTD＞15g/kg，毒性分级为无毒。Ames试验发现臭氧处理后的罗非鱼片各剂量组未引起4种受试菌株发生回复突变，可判定Ames试验结果为阴性，这与陈文品等采用同样的Ames试验条件研究普洱茶遗传毒性时的判断原则一致。有学者研究表明微核试验与染色体畸变试验具有良好的相关性，该研究中，经臭氧处理后罗非鱼片骨髓细胞微核试验与睾丸染色体畸变试验的结果均为阴性，未表现有遗传毒性。近年来，食品质量安全问题越来越受到政府部门、食品生产企业及消费者的重视，由于水产食品富含蛋白质且具有多种内源酶，较其他食品易腐败变质，因此，在开展水产品的减菌化处理方法及贮藏条件研究的同时应重视其产品安全性，尤其是抑菌剂的残留及相关反应产物可能引起的产品质量安全问题。经调研，目前罗非鱼片生产企业减菌化处理使用的O3浓度远低于4.5mg/L，因此，从急性毒性与遗传毒性的角度来看，经臭氧减菌化处理后的罗非鱼片具有较高的食用安全性。
第五节　罗非鱼片品质改良技术
一、加工条件对罗非鱼肌原纤维Ca2+-ATP酶稳定性的影响
1．加工温度对3种淡水鱼Ca2+-ATP酶活性的影响
将3种鲜活淡水鱼宰杀后取背部肌肉，分别置于不同温度下放置10min后，提取肌原纤维蛋白酶，并测定其Ca2+-ATP酶活性，结果见图3-65。
图3-65　温度对Ca2+-ATP酶活性的影响
鱼肌肉中肌球蛋白（myosin）的头部具有ATP酶的活性，并执行肌球蛋白与肌动蛋白相连接而产生收缩运动的功能，当蛋白质发生变性时，ATP酶的活性就下降。因此，肌原纤维蛋白质的变性程度可用ATP酶活性为指标来表示。不同温度处理后的鱼糜蛋白质Ca2+-ATP酶活性的变化直接反映了加工中鱼肉蛋白质的变性程度。由图3-65可见草鱼和罗非鱼的肌原纤维Ca2+-ATP酶活性在温度为10 ℃时，开始急剧下降，温度达到25 ℃时Ca2+-ATP酶活性下降趋于平缓；而鲮的Ca2+-ATP酶活性在温度达到20 ℃仍保持一定的稳定性，这与鱼类的栖息环境密切相关。通常情况下，鱼类栖息水域温度越高，蛋白质的热稳定性越好，淡水鱼的栖息水域温度高于海水鱼，从理论上其蛋白质的热稳定性也较好，故而其加工温度可以略高于海水鱼的加工温度。其中，草鱼Ca2+-ATP酶活性受温度影响不大，在20 ℃处理一段时间后酶的失活现象不明显，在实际生产中可以考虑适当提高加工温度，减少能源耗费。而罗非鱼和鲮在5～10 ℃时，活性才基本保持稳定，故应在生产中将温度控制在10℃以下，才可能很好地保持产品固有的质量。
2. pH对Ca2+-ATP酶活性的影响
将鱼背部肌肉于5℃条件下，分别用pH5.0、pH6.0、 pH7.0、 pH 8.0、pH9.0的高离子强度盐溶液提取肌原纤维蛋白酶，然后测定其Ca2+-ATP酶活性，结果见图3-66。
图3-66　pH对Ca2+-ATP酶活性的影响
图3-66可知，pH对3种鱼的Ca2+-ATP酶活性的变化影响很大，当pH为6～7时，3种鱼肉的Ca2+-ATP酶活性均处于较高水平，当pH小于6或大于7都会引起Ca2+-ATP酶活力迅速下降，这说明鱼肉的pH一旦远离中性条件，Ca2+-ATP酶变性明显加快。
3．原料鱼存放过程中鱼肉pH及Ca2+-ATP酶活性的变化
将鱼背部肌肉置于5 ℃、20 ℃环境下，定期取样，测定其Ca2+-ATP酶活性和pH的变化情况，结果见图3-67至图3-70。
图3-67　3种鱼在5 ℃下pH变化
图3-68　3种鱼在5 ℃下Ca2+-ATP酶活性变化
图3-69　3种鱼在20 ℃下pH变化
图3-70　3种鱼在20 ℃下Ca2+-ATP酶活性变化
由图3-67可见，现场宰杀的活鱼肌肉pH接近中性，在5 ℃保藏过程中，存放6h内，pH基本维持在原有水平；随后，其pH迅速下降，在12h后降至最低点6.7附近。经过一段时间的保藏，pH又开始上升。在此温度下Ca2+-ATP酶活性虽然略有变化，但始终处于较高的水平（图3-68）。
由图3-69和图3-70可见，鱼肌肉存放在20 ℃环境下，pH虽然也呈现先降后升的现象，但较5 ℃相比，pH降到最低点的时间明显缩短，仅为6h。其Ca2+-ATP酶活性在整个存放过程中，则呈现明显的下降趋势。肌原纤维Ca2+-ATP酶是鱼肉肌原纤维蛋变性的重要指标之一，对鱼肌肉的Ca2+-ATP酶活性的测定结果表明：几种鱼死后，在一段时间内仍可以保持较高的活性但随着贮藏温度的提高和贮藏时间的延长，其Ca2+-ATP酶活性均存在缓慢下降的趋势。鱼肉pH下降初期，其Ca2+-ATP酶活性变化不大，但在pH回升期间，Ca2+-ATP酶活性并不随之增加反而呈现加速下降的趋势，说明在鱼肉pH变化的同时，其肉质已经开始改变，部分蛋白质变性。相比较之下，5 ℃时鱼肉在相当长一段时间内具有较高的Ca2+-ATP酶活性，20 ℃时鱼肉在6h内即发生明显改变。这是因为随着温度的提高，鱼肉组织进入解僵、自溶的时间相对缩短。保藏初期，由于糖酵解反应生成乳酸和ATP，产生H+，导致pH降低。保藏后期由于氨基酸等含氮物质分解，产生挥发性碱性含氮物使pH又上升，致使鱼肉蛋白质变性，从而影响鱼肉质量。此外，在鱼肉存放过程中也发现随存放时间的延长，部分的水分会从鱼肉中析出，这说明pH低，使肌蛋白质保水能力降低。从以上分析看出，对捕获后的鱼类抑制其pH的降低，或在pH即将降低时迅速冷冻，是使鱼肉保持良好鲜度的有效方法。
二、多聚磷酸盐在罗非鱼片中的扩散规律
1．罗非鱼片中多聚磷酸盐含量与浸泡时间的关系
由图3-71可见，浸泡前的肉样（0min）磷酸盐含量为3.72g/kg。浸泡于2%、4%、6% STP溶液中的肉样，其磷酸盐含量先降低，再升高，最后趋于平衡；蒸馏水和0.5%浸泡的肉样一直下降，最后趋于平衡。鱼片中磷酸盐含量下降到最低时，6%浸泡的鱼片为3.50g/kg、4%的为3.31g/kg、2%的为2.99g/kg；60min后，鱼片中磷酸盐含量基本达到平衡，此时在0%、0.5%、2%、4%和6%溶液中浸泡的鱼片，其磷酸盐含量分别为：1.79g/kg、2.37g/kg、4.51g/kg、4.99g/kg和6.20g/kg。
图3-71　肉中磷酸盐含量与浸泡时间的关系
扩散作用是多聚磷酸盐进入产品的基本机理。富含蛋白的食品如肉、家禽和水产品中，存在以核苷酸、磷脂等形式的天然磷。此外，这些肉类组织中也存在天然产生的正磷酸盐。因此，当产品浸泡于STP溶液时，STP开始向肉中扩散，肉中的正磷酸盐也同时向溶液中扩散，这种双向扩散可能是由于肉与溶液之间的磷酸盐浓度梯度所引起。在浸泡过程中，STP与鱼肉中的蛋白质和水作用，在肉的表面会逐渐形成水-蛋白质-STP的凝胶蛋白复合物薄膜，从而影响磷酸盐的扩散作用。从图3-71可见，2%、4%和6%浸泡的肉样，在初始阶段磷酸盐含量不断下降，这是因为肉自身含有大量的磷酸盐（3.72g/kg）而与溶液之间形成浓度梯度，其次，正磷酸盐相对分子质量（136.09）约为STP相对分子质量（367.86）的1/3，因此，肉中的正磷酸盐向溶液中扩散的速率也大于STP向肉中的扩散速率。在鱼肉表面凝胶复合物薄膜完全形成时（6%约为5min，4%约为10min，2%约为15min），肉中的磷酸盐含量达到最低值。随后肉中的磷酸盐向溶液中扩散的速率小于STP向肉中的扩散速率，肉中的磷酸盐含量开始增加，最后达到平衡。0.5%和蒸馏水浸泡的肉样，其磷酸盐含量一直下降，这可能是由于STP浓度梯度太低或无STP浓度梯度，肉的表面难以形成凝胶蛋白薄膜，鱼肉相对于浸泡液一直呈负向（向溶液中扩散）扩散。
2．浸泡初始阶段和最后阶段肉中磷酸盐扩散速率的变化
鱼片中磷酸盐的扩散速率可以用磷酸盐含量对浸泡时间的变化率（斜率k）来表示，鱼片表面凝胶蛋白膜形成前后的磷酸盐扩散速率变化关系见图3-72和图3-73。
图3-72　浸泡初始阶段肉中磷酸盐的扩散速率
图3-73　阶段肉中磷酸盐扩散速率
由图3-72和图3-73可见，鱼片中磷酸盐在膜形成之前的下降阶段，其扩散速率高于形成之后的增长阶段。并且浸泡浓度不同，在浸泡的初始和最后阶段磷酸盐的扩散速率也不同（表3-49）。在初始阶段（凝胶蛋白膜形成之前）肉中的磷酸盐向溶液中的扩散速率大于STP向肉中的扩散速率，表现为肉中磷酸盐下降，但随着STP与水溶性蛋白和水发生作用，在鱼片表面形成凝胶蛋白膜之后，它就会像墙一样阻碍肉中正磷酸盐向溶液中的扩散。因此，在浸泡的最后阶段STP从溶液向鱼片中的扩散比较明显，并且浓度越高，扩散也越快（表3-49）。因而随浸泡时间的延长、凝胶蛋白膜厚度的增加、STP从溶液向鱼片的不断扩散，肉样中磷酸盐含量便开始增长，这很大程度是由于肉中正磷酸盐扩散率下降和鱼片与溶液之间磷酸盐浓度差所引起的。
表3-49　浸泡初始和最后阶段鱼肉中磷酸盐扩散速率值（k）
三、几种添加剂对冷冻罗非鱼片持水性的影响
1．单一品种添加剂对冷冻罗非鱼片持水性的影响
（1）NaCl对冷冻罗非鱼片
分别以不同浓度的NaCl溶液浸渍待测样，称量浸渍前后及解冻后样品的重量，计算样品的浸渍吸水率及解冻后持水能力的变化比例，结果见表3-50。
表3-50　NaCl对冷冻罗非鱼片持水性的影响（%）
从浸渍增重的角度来讲，加NaCl的样品浸渍增重率均小于空白样，且随NaCl浓度的增加，鱼片的浸渍吸水率下降；浓度高于6%，样品解冻后持水力高于对照样。
（2）焦磷酸钠对冷冻罗非鱼片持水性的影响
分别以不同浓度的焦磷酸钠溶液浸渍待测样，称量浸渍前后及解冻后样品的重量，计算样品的浸渍吸水率及解冻后持水能力的变化比例。试验重复3次，取平均值，结果见表3-51。
表3-51　焦磷酸钠对冷冻罗非鱼片持水性的影响（%）
由表3-53可知，焦磷酸钠基本不会影响样品的浸渍吸水率，但可以明显提高样品解冻后的持水能力。随焦磷酸钠增加，解冻后持水力值不断增加，但当浓度高于0.4%后，其持水力增长幅度平缓，有的甚至存在下降的趋势。试验结果显示，焦磷酸钠浓度为0.4%时，罗非鱼片样品的指标均处于较好的水平，鱼片冻后的持水力增加量为1.41%。
（3）三聚磷酸钠对冷冻罗非鱼片持水性的影响
以不同浓度的三聚磷酸钠溶液浸渍待测样，称量浸渍前后及解冻后样品的重量，计算样品的浸渍吸水率及解冻后持水能力的变化比例，结果见表3-52。
表3-52　三聚磷酸钠对冷冻罗非鱼片持水性的影响（%）
三聚磷酸钠的变化趋势与焦磷酸钠相似，随着浸渍液浓度的增加，样品的浸渍吸水率变化不大，持水力上升。当添加量超过0.4%时，持水力值上升幅度趋于平缓，甚至略有下降。
2．复合添加剂对冷冻罗非鱼片持水性的影响
（1）不同浓度复合添加剂溶液对罗非鱼片持水性的影响
将复合添加剂配成不同质量百分比浓度的溶液，再将新鲜原料与溶液按1∶10的比例投入浸泡，称量浸渍前及解冻后样品的重量，计算样品解冻后持水能力的变化情况，结果见图3-74。
图3-74　混合盐浓度对样品持水力的影响
从图3-74可以看出，复合添加剂溶液的浓度越大，持水力越高，也就是对鱼片保水性的正面作用越大，其最佳作用浓度为1.6%，浓度继续增加，持水力值的上升势态趋缓。同时考虑到磷酸盐含量过多会影响肉的味道，且不利于人体健康，因此，复合添加剂溶液的浓度不宜过高。
（2）浸渍时间对鱼片保水性的影响
鱼片在其最佳浓度下进行浸泡，确定合理的浸泡时间，结果见图3-75。
图3-75　浸渍时间对鱼片持水性的影响
从图3-75可以看出，随浸渍时间的延长，鱼片的持水力值不断上升，其最高值为2.28%。浸渍约20min后，趋于平缓。
综合上述盐类对冷冻罗非鱼片持水效果来看，盐的加入可以提高冷冻罗非鱼片的持水性，减少解冻过程水分损失。但各种盐的作用效果却不尽相同，其中磷酸盐在较低的浓度下即可达到较好的提高肌肉持水效果，而NaCl的浓度则要提高到数倍以上才具有保水效果。这是因为3种盐提供的离子强度不尽相同，焦磷酸钠或三聚磷酸钠均具有高价阴离子，在一定浓度范围内带电荷数较多，离子强度也相应增大，因此，可以在极小的浓度下，形成较高的离子强度，促进肌肉组织持水能力增加。
四、无磷品质改良剂在罗非鱼加工中的应用
1．海藻糖对罗非鱼片保水效果
（1）海藻糖对冻罗非鱼片水分的影响
由表3-53可见，经过海藻糖溶液处理后的冷冻罗非鱼片解冻后鱼片的水分损失明显低于空白对照组，持水能力得到大的改善。比较了不同浓度的海藻糖处理后的效果，结果表明，海藻糖浓度越大越好。海藻糖作为一种对水产品的低温保护剂特别有效，当海藻糖在蛋白质、水界面绝对抑制水的官能度时使水产品的硬度、伸缩性及凝胶力增加；另外，海藻糖的微甜性质也提高了水产品的口感质量。
表3-53　冻罗非鱼片的水分损失率（%）
（2）海藻糖对蒸煮鱼片水分的影响
由表3-54可见，经过海藻糖溶液处理后的冷冻罗非鱼片经过蒸煮，鱼片水分损失明显低于空白对照组，说明海藻糖能很好地改善鱼片的持水能力。通过比较不同浓度的海藻糖处理后的效果，结果表明，海藻糖浓度在1%～2%效果最好。由此可见，海藻糖能有效地减少冷冻罗非鱼片冻藏过程中的液滴损失，在减少自由液滴上的效果优于加热液滴损失。鱼片冻藏过程中的液滴损失，一方面由于形成的冰晶体对鱼体的肌肉组织产生机械损伤引起的，另一方面是由于蛋白质分子与结合水的结合状态被破坏引起。因此，可以认为液滴损失也是蛋白质变性的一个指标。
表3-54　罗非鱼片蒸煮后的水分损失率（%）
（3）海藻糖对冷冻罗非鱼片肌原纤维蛋白的影响
在罗非鱼片肌原纤维蛋白溶液中加入2%（W/V）海藻糖，分装，-18 ℃冻藏30 d，在冻藏的不同阶段取样测定各项指标。
①海藻糖对冷冻罗非鱼片肌原纤维蛋白盐溶性变化的影响。罗非鱼片肌原纤维蛋白在冻藏过程中盐溶性变化情况如图3-76所示。随着冻藏时间的延长，样品中盐溶性蛋白含量逐渐下降。对照组在冻藏开始阶段迅速下降，冻藏3 d后，盐溶性蛋白含量下降到66.1%，之后下降速度减缓，直到冻藏30 d（50.4%），表现为较明显的两段变性模式。海藻糖有效抑制了蛋白溶解度的迅速下降，冻藏3 d后，添加海藻糖样品中的盐溶性蛋白含量为93%。
图3-76　冻藏过程中盐溶性蛋白含量变化曲线
②海藻糖对冷冻罗非鱼片肌原纤维蛋白Ca-ATP酶活性的影响。图3-77所示为冻藏过程中蛋白Ca-ATP酶活性的变化。冻藏开始时，对照组酶活快速下降，冻藏2 d后，酶活由0.31 μmol（mg·min）下降到0.21 μmol（mg·min），下降了约30%，在第3～15天的冻藏中，酶活降低速度也较快，冻藏15 d时，降低到初始值的50%。添加海藻糖样品的Ca-ATP酶活性降低速度受到抑制，酶活性比同期对照组高，第10天时，海藻糖样品的酶活为初始值的82%。
图3-77　冻藏过程中肌原纤维蛋白ATP酶活性的变化
③海藻糖对冷冻罗非鱼片肌原纤维蛋白巯基含量变化的影响。对照组肌原纤维蛋白活性巯基和总巯基含量变化和抗冻剂组有很大差异（图3-78）。冻藏7 d时，各样品总巯基含量变化很小，在随后7～15 d的冻藏期间，对照组总巯基含量明显下降，从8.94mol/105g降低到7.4mol/105g，而含有抗冻剂的样品下降不明显，在冻藏30d时空白和海藻糖样品的总巯基含量分别为7.2mol/105g、8.3mol/105g。
图3-78　冻藏过程中肌原纤维蛋白巯基含量变化
贮藏过程中蛋白活性巯基含量的变化趋势和总巯基相似，在30 d的冻藏期内，含抗冻剂样品的活性巯基含量缓慢下降，海藻糖样品活性巯基含量分别从5.8mol/105g降低到5.5mol/105g。对照组样品在冻藏10 d时，活性巯基含量和海藻糖相似，变化不显著，随后出现较快下降，冻藏30 d时，活性巯基含量下降为4.1mol/105g。这些结果表明，海藻糖的加入抑制了冻藏过程中蛋白质中巯基的氧化和二硫键的形成。
④海藻糖对冷冻罗非鱼片肌原纤维蛋白表面疏水性变化的影响。罗非鱼肌原纤维蛋白表面疏水性在冻藏过程变化如图3-79所示。对照组蛋白表面疏水性在冻藏过程中呈不断上升趋势，从冻藏前的135上升到冻藏结束时的226。含有抗冻剂的样品在冻藏过程也呈上升趋势，但蔗糖山梨醇样品上升较快，冻藏30 d时表面疏水性值为189。而海藻糖比蔗糖山梨醇有更显著的抑制效果，在整个冻藏期内表面疏水性上升不明显，冻藏30 d时，表面疏水性值为149，说明海藻糖能有效的延缓了冻藏过程中蛋白构型变化从而起到保水作用。
图3-79　冻藏过程中肌原纤维蛋白表面疏水性的变化
2．罗非鱼鱼排酶解物（小分子肽）的抗冻效果
（1）罗非鱼鱼排酶解物制备
1000克鱼排切碎，加入1∶2（W/V）蒸馏水，90 ℃加热30min，使用1mol/L的NaOH调节pH至pH8.0（碱性蛋白酶）或pH7.0（木瓜蛋白酶），加入0.2%（W/W）蛋白酶，30 ℃（碱性蛋白酶）或50 ℃（木瓜蛋白酶）水浴中水解5h，水解结束后于90 ℃加热30min。水解液4000g离心15min，去除不溶物。上清液用纱布过滤，90 ℃加热10min，去除漂浮的油脂，使用1mol/L HCl调节pH7.0。水解液通过截留相对分子质量为30000的微孔滤膜过滤，钠滤装置脱盐，冷冻干燥，得到粉末状的木瓜蛋白酶酶解物（PPH）和碱性蛋白酶酶解物（APH）。
（2）鱼排酶解物基本化学成分
罗非鱼鱼排水解物基本化学成分分析结果如表3-55所示，两种罗非鱼鱼排酶解物的基本化学成分相似，主要成分是含氮化合物，含量分别为81.30%和82.49%。灰分含量也较高，分别为8.21%和8.75%。粗脂肪含量低，含量在0.36%～0.28%之间。
表3-55　罗非鱼鱼排酶解物的化学成分（g/100g）
（3）小分子肽对罗非鱼肌原纤维蛋白Ca2+-ATP酶活性的影响
添加不同小分子肽的鱼肉在-20 ℃冻藏过程中肌原纤维蛋白Ca2+-ATP酶活性变化情况如图3-80所示。在冻藏2周以后，所有样品中肌原纤维蛋白Ca2+-ATP酶活性显著降低，添加不同抗冻剂样品的Ca2+-ATP酶活性无显著差异（P>0.05）。但在随后的2～12周的冻藏过程中，小分子肽都在一定程度上抑制了样品的冷冻变性，添加PPH的样品具有最高的Ca2+-ATP酶活性，然后是添加APH的样品。在冻藏12周时，添加了PPH和APH的样品Ca2+-ATP酶活性与蔗糖/山梨醇样品相近。说明小分子肽具有很好的抗冻效果。
图3-80　小分子肽对罗非鱼鱼肉肌原纤维蛋白Ca-ATP酶活性的影响
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第四章　冰温气调保鲜罗非片加工技术
第一节　鲜罗非鱼片冰温气调包装工艺
一、包装材料的选择与鱼片前处理
1．包装材料的选择
CO2是最主要的实验气体，因此主要通过包装材料对CO2的阻隔性来选择适合的包装材料，从表4-1可知，C、D包装材料对CO2的透过率较低，即对CO2的阻隔性较好，同时考虑成本，最终选择C包装材料。
表4-1　检测结果
表4-1　检测结果（续）-1
2．鱼片的前处理
鲜罗非鱼片减菌化方法采用臭氧水处理，即采用浓度为5mg/kg的O3水处理5min（详见本书第三章第四节）。
二、冰温贮藏条件
从图4-1中可以看到罗非鱼片的冻结曲线分三个阶段：第一阶段冻结曲线较陡，样品放出显热，温度迅速下降到刚好低于0℃；第二阶段鱼片样品中大部分水分开始结晶，冰晶形成时放出大量潜热，温度下降速度极其缓慢，曲线平缓，此时温度即为鱼片的冰点；最后阶段罗非鱼片温度从-5 ℃左右继续下降至终温，温度下降显著，冻结曲线也比较陡。
图4-1　罗非鱼片冻结曲线
根据图4-1所示冻结曲线，知罗非鱼的冰点在-0.7～0.6 ℃，因此将冰温贮藏温度控制在-0.7～0 ℃范围内。
三、气调包装中气体组成成分与比例的选择
1．肉汁渗出率的变化
肌肉中的水分，一部分与蛋白质、糖类的羧基、羟基、氨基等紧密结合而存在，称为结合水，另一部分存在于肌原纤维与结缔组织间的网络结构中，称为自由水。罗非鱼片在冰温气调贮藏过程中，肉汁渗出率随着肌肉中蛋白质的降解而增加。它也是一项重要的肉质性状，可直接影响到肉的滋味、香气、多汁性、营养成分等食用品质，具有重要的经济意义。
将鲜罗非鱼片用臭氧水预处理后，气调包装，各组的充气体积与样品重量比为3∶1，气体组成见表4-2，然后置于（-0.7～0 ℃）贮藏。
表4-2　试验设计与分组（%）
由图4-2可看出，第Ⅰ组和第Ⅱ组、第Ⅲ组和第Ⅳ组间肉汁渗透率无明显差异，而第Ⅰ组、第Ⅲ组、第Ⅴ组和第Ⅵ组的结果的差异显著（P<0.05）。贮藏期间各组的肉汁渗出率都有所升高，这一变化主要是由于鱼体死后的pH变化直接影响肌肉的持水力。一方面鱼体失活后，血液停止循环，肌肉组织细胞供氧中断，有氧呼吸转为缺氧呼吸，即肌糖原沿糖酵解途径（EMP）最终变为乳酸，使肌肉pH降低，从而使肌肉蛋白质静电荷的相互作用减弱，肌球蛋白纤丝和肌动蛋白纤丝之间的间隙缩小，导致肌肉的持水性能降低。发生僵硬时，肌球蛋白和肌动蛋白形成肌动球蛋白复合体而使肌肉持水力变得最低。另一方面对于富含水分的水产品而言，高浓度CO2的使用会带来不理想的效果，这是由于CO2溶于鲜鱼肌肉表面使pH下降，从而降低了蛋白质的持水能力，因而在贮藏后期，包装内会有大量的渗出液出现。从图4-2中还可以看出，CO2浓度越高，肉汁渗出率的增长越快，6组的平均斜率依次为：0.92、0.74、0.61、0.60、0.50、0.46，在第19天气调第Ⅰ、第Ⅱ、第Ⅲ、第Ⅳ、第Ⅴ和第Ⅵ组的肉汁渗出率分别为6.81%、5.1%、4.85%、4.88%、3.35%、3.2%，由此可见，CO2浓度和肌肉的持水性有十分明显的关系，高浓度CO2的气调包装不利于罗非鱼片肌肉持水性的保持，尤其当CO2含量高于70%。研究结果表明，最佳气体比例为60%CO2，这与英国Torry研究所对海水鱼MAP的研究结果一致，他们认为混合气体中CO2浓度应不超过70%。
图4-2　不同气体组成及比例包装的罗非鱼片肉汁渗出率的变化
2．色泽的变化
试验中6组样品的L*值在整个贮藏过程中均呈现不同程度的上升趋势，彼此之间存在明显差异（P＜0.05）（表4-3）。6组样品的H*值均有所增加，其中第Ⅰ组肉色变黄的速度最快，与其他5组差异最大（P＜0.05），第10天以后依次为第Ⅰ组＞第Ⅲ组＞第Ⅱ组＞第Ⅳ组≈第Ⅴ组＞第Ⅵ组，可见CO2含量小于70%在贮藏后期对罗非鱼片红肉褐变的影响程度较小；第Ⅲ组在10d前比其他5组的红色变化缓慢，而10d后肉色褐变速率加快，这表明在贮藏初期肌肉中肌红蛋白与氧分子结合后形成氧和肌红蛋白而呈现鲜红色，说明O2有助于保持肉色鲜红，但在贮藏后期会加速脂肪氧化，使肉色加速褐变。随着贮藏时间的延长，6组样品的C*值均降低。由于肌红蛋白是水溶性，随着肉汁渗出液的增加，肌红蛋白也随之流出，使得肉色变淡，第Ⅲ组在10d前肉色明显红于其他5组（P＜0.05），之后肉色淡化迅速，与第Ⅰ组相似，整个贮藏期间，第Ⅳ组、第Ⅴ组、第Ⅵ组3组无明显差异。
表4-3　不同气体组成及比例包装的罗非鱼片色差的变化
3.pH的变化
pH测定的是溶液中氢离子（H+）的浓度，反映的是已离解酸的浓度。生鲜水产品在贮藏过程中，由于自身所含水解酶和细菌的作用，在导致水产品鲜度下降的同时，还会引起水产品组织pH的变化。表4-4是不同气体组成及比例的气调包装对罗非鱼片冰温贮藏期间pH的影响的试验结果。由表4-4可以看出，在整个贮藏期间，pH的变化趋势为先下降再上升，但到贮藏末期pH仍小于初始值。在贮藏的第10天各组的pH都达到最低，说明该组试验的罗非鱼片冰温贮藏到第10天达到僵直高峰。从第10天开始，pH开始缓慢上升，因为僵硬期过后，蛋白质及其他含氮物质在组织蛋白酶类和微生物的作用下逐渐分解产生氨基酸、氨及胺类等碱性物质，使pH升高。但气调包装中CO2比例越高，其pH在贮藏后期上升越慢，原因是CO2可以抑制微生物的生长繁殖，鱼体肌肉蛋白质没有被大量分解。数据分析表明，第Ⅲ组、第Ⅳ组和第Ⅴ组差异不显著，第Ⅰ组、第Ⅵ组与其他4组比较，差异显著（P＜0.05）。
表4-4　不同气体组成及比例包装的罗非鱼片在贮藏过程中pH的变化
4.TVB-N值的变化
TVB-N一般作为鱼类初期腐败的评定指标，我国和欧洲委员会都对不同水产品设定了严格的TVB-N安全限量。参照国标《鲜、冻动物性水产品卫生标准》（GB 2733－2005），将20mg/100g设为TVB-N的安全限量。鱼体死后初期，TVB-N的增加主要是由腺苷酸（AMP）的脱氨反应产生的氨引起的结果，由于各处理组的鲜罗非鱼片中AMP的浓度几乎相似，因此各组间TVB-N变化不大。在贮藏后期，鱼肉在细菌作用下会产生的三甲胺（TMA）和二甲胺（DMA）等低级胺类化合物，磷脂中的胆碱也会转变为三甲胺。氨基酸等含氮化合物会分解产生氨和各种胺类化合物，使得TVB-N逐渐积累增多。
由图4-3可知，在贮藏前期各组之间TVB-N值相差不大，但第Ⅵ组略高于其他组，原因是在高CO2气调环境下，脱氨进程缓慢。在贮藏后期，各处理组的TVB-N值都加快增加。样品的初始TVB-N值为11.20mg/100g，前8d的增长较缓慢，说明开始阶段鱼样的鲜度变化很小，这也是贮藏初期推荐以K值为鲜度指标的原因，只有在贮藏中后期用TVB-N值来衡量鲜度才有意义。低浓度CO2第Ⅵ组贮藏7 d后上升的趋势明显加快，至第16天时已增为18.59mg/100g，第19天已经达20.18mg/100g，超出了可接受限值20.00mg/100g。CO2含量大于60%的各组间无明显差异，第16天后与50% CO2组相比有明显差异（P＜0.05），而第13天后与第Ⅵ组有极其显著的差异（P＜0.01）。从图4-3中也可看出，CO2含量大于50%组的增长速率与低浓度对照组有着明显的区别。气调第Ⅰ～Ⅴ组，在贮藏19天时TVB-N在19～20mg/100g，小于20.00mg/100g，鲜度仍可以接受，到第22天时CO2含量大于60%的前4组和第5组的TVB-N值分别为20.10mg/100g左右和20.43mg/100g，略微超过了可接受限值。对第22天的TVB-N值进行方差分析，前5组与第Ⅵ组差异十分显著（P＜0.01），说明CO2含量对于TVB-N值的变化影响十分显著，且当CO2≥50%时TVB-N值增加缓慢，鲜度保持的时间较长。另外，还可以看出当CO2为60%时，有无氧气对于TVB-N值几乎不产生影响，上述结果与细菌总数的变化趋势相似。Banks等报道，在4℃下贮藏5 d，气调包装鲑的TVB-N值约为15mg/100g，他们认为气调包装样品在贮藏期间较低的TVB-值是由于细菌生长受到抑制，或者由于细菌的非蛋白氮物质氧化脱氨能力下降的结果。试验的结果与上述研究结果相似，CO2气调包装能有效抑制TVB-N值的增加。
图4-3　不同气体组成及比例包装的罗非鱼片TVB-N的变化
5．细菌总数的变化
水产品腐败主要表现在某些微生物生长和代谢生成氨、硫化物、醇、醛、酮和有机酸等，产生不良气味和异味，使产品变得在感官上不可接受，而气调包装可延缓微生物的生长繁殖，延长食品的货架期。图4-4为不同气体配比下细菌总数的变化，冰温和CO2气调包装可明显抑制鱼肉中细菌的生长。在整个贮藏过程中，6组鱼样细菌总数的变化趋势大致都是先略有降低然后一直增长。贮藏的前4 d，细菌总数从初始的4.7×103CFU/g降低到（2.1～2.5）×103CFU/g，原因可能是某些微生物在从常温环境突然转到-0.5℃左右的冰温环境中，生长繁殖受到了一定程度的抑制，从而使细菌总数减少。贮藏4 d以后，各组都逐渐增加，是由于蛋白质、糖类、脂类逐渐降解为小分子物质，加上鱼体液变为碱性，一部分已适应不良环境的微生物利用小分子物质作为营养来源，不断繁殖，最后导致鱼腐败变质。低CO2浓度第Ⅵ组增加幅度较为明显，在第25天时达5.4×105CFU/g，比初始增加了约114倍，仍没有超过可接受限值（106CFU/g）。高CO2浓度第Ⅰ组的细菌总数增长最缓慢，第25天时才达2.1×105CFU/g，表明高浓度CO2对细菌的生长繁殖起到了明显抑制作用，是由于引起鱼类腐败的革兰氏阴性菌对CO2具有高度敏感性。由图4-4也可看出随着CO2浓度的增加，细菌总数的增长越缓慢，对第25天的数据进行方差分析，CO2浓度大于50%的5组细菌总数增长无明显差异。原因可能是高浓度CO2有利于革兰氏阳性菌的生长，主要有乳酸菌等，它们通常与腐败菌竞争性的生长，从而CO2浓度与抑制细菌的能力并不是一直呈正比。
图4-4　不同气体组成及比例包装的罗非鱼片细菌总数的变化
四、气调包装中的充气比率
1．肉汁渗出率的变化
由图4-5可知，在冰温贮藏过程中，5组样品的肉汁渗出率随贮藏时间的延长均有不同程度升高，对照组的肉汁渗出率从第4天开始一直低于气调包装样品的，而且从第10天开始显著低于其余4组样品的肉汁渗出率（P＜0.05）。冰温贮藏至第25天，对照组样品肉汁渗出率为3.76%，而A组、B组、C组和D组样品均超过4.4%。在贮藏期间A组、B组和C组3组的肉汁渗出率差异不明显，但与D组样品的肉汁渗出率相比差异显著，且在第13天以后，D组的肉汁渗出率极显著于A组、B组和C组（P＜0.05）。这表明充气比率在2∶1～4∶1时，对罗非鱼片的肉汁渗出率的影响不显著。国内外研究报道显示，在冷藏或微冻贮藏过程中气调包装鲜鱼类肉汁渗出率与在空气中相比会增加。因为水产品的肉汁渗出率与CO2含量和浓度有关，溶解于鱼肉中的CO2能减弱肌肉的持水力，因而在贮藏过程中，气调包装产品的肉汁渗出率高于空气包装组。而且随着充气比率的增大肉汁渗出率也增多，当充气比率为5∶1时，肉汁渗出率明显高于其他4组。
图4-5　不同充气比率下罗非鱼片肉汁渗出率的变化
2．色泽的变化
由表4-5可知，该试验5组样品的L*值在整个贮藏过程中均呈现不同程度的上升趋势，彼此之间存在明显差异（P＜0.05）。5组样品的H*值贮藏期间呈现不同程度的增加，4组不同充气比率的气调包装都与对照组存在明显差异（P＜0.05），第16天以后，依次为对照组＞D组＞A组＞B组≈C组，可见B和C组在贮藏后期对罗非鱼片红肉褐变的影响程度最小，试验发现在第22天以后，对照（空气）组的肉出现绿色，原因是腐败肉中的细菌代谢产生的硫化氢与肌红但白结合生成绿色的硫代肌红蛋白，使肉色变绿，这种肉已不可食用。随着贮藏时间的延长，5组样品的C*值均降低，说明随着肉汁渗出液的增加，肌红蛋白也随之流失，使得肉色变淡。此研究过程中观察发现贮藏约12 d以后，充气比率在（3～4）∶1时的气调包装虽能明显延长鲜罗非鱼片的鲜度品质，但是红肉色泽开始褐变，而且肉汁渗出率也比普通的空气包装高。虽然气调包装能明显延长罗非鱼片的鲜度品质，但色泽改变和肉汁渗出率增多都将影响产品的商品价。
表4-5　不同充气比率下罗非鱼片色泽测定结果
3.pH的变化
5种不同包装处理的罗非鱼片在冰温贮藏过程中pH的变化结果见表4-6。5种处理的样品在整个贮藏期间pH均在6.25～6.60，因此包装方式对产品pH的影响并不明显，但是5组的pH随着贮藏时间的延长基本呈先下降而后上升的趋势。该试验结论与Rosnes研究结论相似，但与吕凯波等冰温气调贮藏黄鳝片的pH的变化有区别。
表4-6　不同充气比率下罗非鱼片pH的变化
该研究中5组样品的pH呈下降趋势，是因为：①包装中CO2在样品表面的溶解；②细菌分解糖类产生的有机酸类物质后又因分解蛋白质产生的胺类等碱性物质又有所上升。总的来说，4组不同充气比率的气调包装产品在贮藏期间的pH差异不明显。
4.TBA值的变化
脂肪氧化降解产物丙二醛（MAD）与TBA反应生成稳定的红色复合物，在国际上已被广泛用于测定含脂类食品，特别是肉类制品的氧化酸败程度。据Alasalvar的研究，TBA值可以评价所有鱼类在贮藏过程中的质量变化情况。TBA值以样品中不饱和脂肪酸氧化产生的丙二醛的含量表示。由于鱼肉组织中含有多不饱和脂肪酸和大量的促氧化剂，所以既可作为鱼片的脂肪氧化指标，也可以反映鱼片鲜度变化。但不同样品因脂肪含量及脂肪中不饱和脂肪酸含量不同，其反映鲜度水平的标准也不同。
如图4-6显示，可能是由于罗非鱼属于低脂鱼，5种处理的鲜罗非鱼片的初始TBA值都非常小，从第5天开始，对照组与其余4组差异显著（P＜0.05），在整个贮藏过程中4组不同充气比率的样品之间差异不明显，在第19天之前冰温气调贮藏过程中TBA值变化较缓慢，这表明鲜罗非鱼片在第19天之前脂肪几乎没有氧化酸败，在第25天时对照组的TBA值达到0.57mg/kg，其余4组约为0.45mg/kg，说明不同充气比率的气调包装均对脂肪氧化酸败有减缓作用，但没有显著差异。
图4-6　不同充气比率下罗非鱼片冰温贮藏期间TBA值的变化
5.TVB-N值的变化
由图4-7可以看出，在冰温贮藏期间，5组样品的TVB-N值均有不同程度上升。贮藏期间对照组样品的TVB-N值一直高于A组、B组、C组和D组，贮藏至第4天时，对照组与B组、C组和D组3组气调包装样品的TVB-N值差异比较明显（P＜0.05），在贮藏19 d后TVB-N值已达到20.23mg/100g；A组在贮藏期间，TVB-N值一直略高于其他3种气调包装样品，到第19天时TVB-N值达到20.47mg/100g，而充气比率≥3∶1的3组气调包装的TVB-N值增长缓慢，第19天时均大约为19.30mg/100g。根据GB 2733－2055中的规定（TVB-N≤20mg/100g），得出对照空气包装样品的货架期约为16 d，充气比率≥3∶1的3种气调包装样品的货架期可达19～22 d。
图4-7　不同充气比率下罗非鱼片TVB-N值的变化
6．菌落总数和嗜冷菌数的变化
观察菌落总数和嗜冷菌的变化来评价不同充气比率对冰温贮藏的罗非鱼片中微生物生长的抑制效果。由图4-8和图4-9可看出，在冰温条件下不同充气比率的气调包装的保鲜优势在贮藏中后期越来越明显，能明显抑制微生物的生长繁殖。贮藏第1天时，5组处理样品的细菌菌落总数和嗜冷菌数均没有显著差异。4组气调包装样品在整个贮藏期间的嗜冷菌随贮藏时间的延长而增加，与菌落总数变化有所差异。A组在前7 d的细菌总数减少，之后开始增加，到第22天时细菌菌落总数和嗜冷菌数分别为4.7×106和9.4×105 CFU/g。B组、C组和D组气调包装处理的细菌总数第13天前有所减少，之后开始缓慢增加，并且从第7天开始，这3组处理菌落总数和嗜冷菌与对照相比差异显著（P＜0.05）。在整个贮藏期间，对照产品中的菌落总数和嗜冷菌数都随着贮藏时间的延长而增长，至第16天菌落总数和嗜冷菌数分别达到2.1×106 CFU/g和1.9×106 CFU/g；而B组、C组和D组气调包装样品在整个贮藏期间细菌菌落总数和嗜冷菌数均未超过高品质水产品可接受的限106 CFU/g，表明当充气比率≥3∶1时抑菌效果无显著差异。
图4-8　不同充气比率下罗非鱼片细菌总数的变化
图4-9　不同充气比率下罗非鱼片嗜冷菌的变化
试验中不同充气比率的气调包装样品中的细菌总数在开始时有所减少之后又增加，是因为冰温可有效抑制微生物的生长，冰温条件下，水分子呈有序状态排布，可供微生物利用的自由水含量大大降低。同时CO2通过延长腐败细菌生长阶段中的滞后期和传代时间来抑制水产品中需氧菌的活性，从而降低生长速度，达到延缓腐败的效果，使得在罗非鱼养殖环境中优势菌的生长繁殖在冰温以及高浓度的CO2（≥50%）贮藏环境下得到抑制。在贮藏过程中，气调包装袋内的CO2气体可抑制在空气中生长的腐败细菌如假单胞菌（Pseudomonas）和希瓦式菌（Shewanella putrefaciens）的生长，而CO2耐受菌如乳杆菌（Lactobacillus spp.）、明亮发光杆菌（PHotobacterium phosphoreum）、热杀索丝菌（Brochothrix thermosphacta）以及嗜冷菌如李斯特菌、变形杆菌等则成为优势腐败菌。国外学者研究指出，细菌数达到107 CFU/g或更高时有难闻的气味和味道产生，即鱼类已腐败变质。以细菌菌落总数106 CFU/g作为人们消费高品质鱼类可接受的限制指标，对照产品的货架期约为16 d，充气比率≥3∶1的气调包装产品则远超过25 d。研究结果与Sivertsvik等研究大西洋鲑鱼片气调保鲜技术中的微生物数量变化的结果相似。
五、气调包装的顶隙气体CO2的变化
1．不同温度下不同CO2比例的包装中CO2浓度与鱼肉pH的动态变化
测定3种不同气体配比的罗非鱼片气调包装在4 ℃和（-0.5±0.2）℃贮藏期间，袋内顶隙气体和鱼肉pH的动态变化（试验设计与分组见表4-7）。测定结果见图4-10和图4-11。由图4-10看出，冷藏对照组1的CO2浓度到第9天时由0升到了15.8%，说明微生物生长活跃，冰温的对照组2到第12天时才升至14.07%，说明冰温比冷藏更好抑制微生物的生长。6组气调包装的CO2在贮藏的最初6～9 d都快速下降，到第9天时，ⅰ组和Ⅰ组比初始下降了约28.52%，ⅱ组和Ⅱ组下降了约26.67%，ⅲ组和Ⅲ组下降约25.98%，随后下降开始缓慢，达到相对平稳。这是由于罗非鱼肌肉中含有80%的水分，CO2在水中有较大的溶解度，贮藏初期CO2被鱼体表面迅速吸收，导致袋中CO2浓度快速下降。而后，鱼体表面对CO2的吸收减少并趋于饱和，使袋中CO2的浓度下降缓慢，趋于平稳。这也说明浓度越大下降速率稍快。从图4-10也可以看出，在冰温下初始CO2为60%的包装袋内第20天时浓度降至37.43%，而冷藏的才降至41.38%，冰温下初始浓度为50%到第20天降至31.52%，冷藏的降至34.34%，同一浓度的包装在冰温中CO2下降的要比冷藏的稍快，因为随着温度的降低CO2溶解度会增大，所以在冰温下CO2下降得更快。Parkin等的试验表明，过高含量的CO2溶于鲜鱼肌肉表面，会降低蛋白质的持水能力，导致较多的液汁流失，因此冰温下罗非鱼片的肉汁渗出率要略高于冷藏的。
表4-7　试验设计与分组
图4-10　不同包装方式及温度下罗非鱼贮藏期间袋内CO2的变化
Pedrosa-Menadrito和Regenstein认为，40%～60% CO2气体能有效地保持鱼的新鲜度。Stammen和Gerdes研究表明，CO2浓度至少保持在25%以上，才能有效抑制水产品中微生物的活动。试验也发现，CO2浓度为70%的贮藏罗非鱼片无论从外观色泽，还是从液汁损失来看，都不及60%和50%的理想。CO2浓度为50%或60%时，在贮藏期间始终保持在25%以上，有较好的抑菌效果。因此，罗非鱼片宜采用50%～60% CO2作为气调包装的CO2比例，验证了前述关于气调包装中的充气比率的结论的可行性。
从图4-11中看出，同一浓度CO2包装的鱼片在冰温下贮藏的pH要比冷藏增长缓慢，CO2浓度越高pH增长也越慢，除了对照1组，其他7组在贮藏最初的2d内，肌肉pH有不同程度下降，到第2天时，冷藏气调包装的3组鱼肉pH从最初的6.56下降为6.45左右，随后pH开始增加。而冰温气调包装的3组鱼肉在第6天时才降到最低值6.39左右，然后缓慢上升。试验所得出的CO2气体的动态变化结果也显示了CO2气体组分比例在贮藏的最初4～6 d迅速下降，与pH在贮藏的最初几天显示迅速下降的趋势一致。一方面是因为鱼死后，肌肉糖原开始无氧酵解，随着糖原酵解，肌肉pH下降，因为糖原酵解反应所产生的是乳酸离子和ATP, ATP在ATP酶的作用下分解产生的H+使pH下降。另一方面说明了CO2在贮藏的最初2d内被鱼体迅速吸收，而且鱼体肌肉表面吸收得更多。CO2被鱼体表面吸收后，水解生成碳酸，酸化肌肉，导致pH下降。2d后pH开始逐渐有所上升，这是由于蛋白质分解及细菌逐渐开始活动，产生了碱性物质。由于CO2在鱼体中的溶解是一个由表面向体内逐步渗透的过程，鱼体表面吸收了更多的CO2，抑制了微生物的生长和某些革兰氏阴性需氧菌的繁殖，减少了由于腐败而产生的碱性物质。因此，在整个贮藏期间，冰温比冷藏更有利于抑制微生物的生长，同一温度下不同CO2浓度的组别pH差异不明显。
图4-11　不同包装方式及温度下罗非鱼贮藏期间pH的变化
2．不同温度下不同充气比率的包装中CO2浓度与鱼肉pH的动态变化
采用气体体积∶鱼片重量（V∶W）为2∶1、3∶1、4∶1的比例，贮藏温度为4 ℃和（-0.5±0.2） ℃，试验设计与分组见表4-8。鱼体对CO2的吸收量与鱼体的表面积有关，而吸收量的大小对气调包装内样品的贮藏效果有直接的影响。Laura等建议气调包装鱼肉时，V∶W以（2～3）∶1为宜，至少为2∶1。试验测定了罗非鱼片气调包装（60% CO2+40% N2）在贮藏期间CO2的动态变化，并以空气包装样品为对照。测定结果如图4-12、图4-13所示。
表4-8　试验设计与分组
图4-12　不同充气比率和温度下罗非鱼在贮藏期间袋内CO2的变化
图4-13　不同充气比率及温度下罗非鱼贮藏期间pH的变化
由图4-12看出，冷藏气调包装袋内的CO2在贮藏的最初2d内快速下降至50%左右，随后下降变缓，达到相对平稳，在贮藏期间始终保持在40%以上；冰温气调包装袋内的CO2在贮藏的最初6 d内快速下降至44%左右，随后下降开始缓慢，达到相对平稳，在贮藏期间始终保持在35%以上。有人认为CO2气体在40%～60%能有效地保持鱼的新鲜度。也有研究表明，CO2浓度在贮藏期间至少应保持在25%以上，才能有效抑制水产品中微生物的活动。试验中CO2浓度在贮藏期间始终在35%以上，说明当CO2浓度为60%时气体比率在2∶1以上可抑制某些微生物的生长，有较好的贮藏效果。而空气对照组在冰温贮藏期间，CO2浓度从最初期的0上升至15%左右，说明微生物生长活跃。
从图4-13看出，冷藏对照组1的pH基本没有下降，冰温对照组前2d有所下降随后上升，这是由于蛋白质分解及细菌逐渐开始活动，产生了碱性物质，说明冰温能有效抑制微生物繁殖。同一温度下，不同气体比率之间的鱼肉pH无明显差异，但同一充气比率下，冰温组与冷藏组存在明显差异（P<0.05），气体比率V/W为（2～4）∶1时在贮藏期间都能保证CO2浓度在25%以上，这与上一个试验中结论相似，即冰温比冷藏更有利于抑制微生物的生长，同一温度下不同CO2浓度组的鱼肉pH差异不明显。
六、护色处理技术
1.pH
如图4-14所示，在贮藏的前4 d，各组样品的pH都下降，这可能由于鱼体死后，肌糖原开始无氧酵解形成乳酸以及其他生化途径产生酸类物质，使pH逐步下降。从第4天开始，所有包装组样品的pH逐步回升，这是由于细菌活动产生碱性物质的结果。从图中也可看出Ⅰ组、Ⅱ组的pH与对照组在整个贮藏期间无明显差异（P＞0.05），说明充入CO或O2对pH影响不大。Ⅳ组的pH比其他5组略高，可能是因为异VC钠偏碱性，使得鱼片浸泡后pH升高。Ⅲ组、Ⅴ组的鱼肉pH比其他3组低，这可能是因为植酸是强酸性的，与异VC钠混合后仍偏酸性，使得鱼肉pH降低，因此，Ⅰ组、Ⅱ组对鱼肉pH影响相对较少。
图4-14　不同处理下罗非鱼pH的变化
2．色差值
由表4-10可知，对照组的a*值和C*值在前7 d下降较缓慢，但随后迅速下降，H*值在前7d上升较缓慢，之后迅速增加，可能是有一部分CO2溶解于鱼肉中形成碳酸，使pH下降造成肉表面的一些肌原纤维变性，汁液损失增大所致；Ⅰ组的色泽整个贮藏期内均保持鲜红，a*值和C*值始终保持在较高水平，在后期还有所上升，H*值保持较低水平，在后期略有下降，因为CO与肌红蛋白（Mb）结合形成非常稳定的樱桃红色的一氧化碳肌红蛋白（COMb），不易再被氧化，所以整个贮藏期间鱼片可保持鲜红色。Ⅱ组的罗非鱼片在前7 d色泽红润，因为Mb被氧化为氧合肌红蛋白（MbO2）。MbO2有较好的亮红色，但随着贮藏时间的延长，特别是到了第19天，其a*值、H*值和C*值急剧劣变，这是由于肌红蛋白中Fe2+向Fe3+转化，Fe3+会催化肉组织中脂肪的氧化，使肌红蛋白几乎全部被氧化成MetMb，而MetMb是暗红或者浅红色的；第Ⅲ组、第Ⅳ组、第Ⅴ组在整个贮藏期内a*值、H*值和C*值无明显差异，说明这3组的护色效果相似，在前9d与对照组无明显差异，第10天以后a*值略高于对照组。在初期第Ⅰ组、第Ⅱ组护色效果都可以，但在贮藏中后期，第Ⅰ组明显好于第Ⅱ组，因CO与Mb具有强结合能力，其结合产物COMb较MbO2更难氧化，故低浓度的CO即可赋予肉制品鲜亮的红色，通常空气中含有CO浓度为1%～5%即可明显减少肉制品中MetMb的含量。在贮藏期结束时，6组罗非鱼片的a*值和C*值从大到小依次为第Ⅰ组＞第Ⅲ组、第Ⅳ组、第Ⅴ组＞对照组＞第Ⅱ组；H*值从小到大依次为第Ⅰ组＜第Ⅲ组、第Ⅳ组、第Ⅴ组＜对照组＜第Ⅱ组。因此，5种处理方法中，气调包装时充入1% CO的护色效果最好。
表4-10　不同处理对罗非鱼肉色泽测定结果
3．感官评定
从表4-11中可知，色泽的评分基本与色差值的规律一致，第Ⅰ组、第Ⅱ组在前10 d色泽鲜红，无明显差异，之后第Ⅰ组仍色泽鲜亮，但第Ⅱ组肉色迅速褐变与其他4组无差异；6组的弹性在整个贮藏期间无明显差异（P＞0.05），但是第Ⅲ组、第Ⅴ组的鱼肉在13 d后略差于其他4组，可能是pH低于其他组，使得肌肉纤维结构发生变化；在前4 d，第Ⅲ～Ⅴ组的气味与其他3组差异明显（P＜0.05），可能是因为异Vc钠、植酸特殊的气味造成，之后，对照组与第Ⅰ组、第Ⅲ组、第Ⅳ组、第Ⅴ组无明显差异；而第Ⅱ组自第13天后与其他5组有明显差异（P＜0.05），可能是贮藏后期包装中的O2加速了鱼肉发生氧化酸败。根据pH、色差值、感官评定的综合比较，充入1% CO的护色效果最稳定，并且操作方便。
表4-11　不同处理的罗非鱼片在贮藏过程中的感官评分
第二节　鲜罗非鱼片在冰温气调保鲜过程中优势腐败菌菌相分析
一、腐败样品生化指标
将样品装入气调包装袋中充气包装后置于冰温（-0.7～0 ℃）下贮藏。每隔数天取样观察，通过感官（气味、色泽、弹性）、菌落总数及TVB-N值判定样品腐败终点。接近或达到腐败终点后，3组样品每组各取2个重复进行后续试验，编号为：A1、A2、B1、B2、C1、C2。
虽然试验各组样品为不同批次产品，由于来自相同的养殖场所与加工步骤，初始菌落及TVB-N值差别不大。根据相关标准与研究文献，淡水鱼菌落总数及TVB-N值的可接受限值分别为106CFU/g、20mg/100g，从表4-12中可知，第30天时各样品菌落总数与TVB-N值均超过规定限值，可认定已达到腐败终点。
表4-12　初始样品与腐败终点样品部分理化指标对比
二、细菌16S rDNA V6-V8区PCR扩增结果
冰温气调贮藏罗非鱼片腐败末期表层肌肉细菌总DNA经通用引物GC968F/1401R扩增后，产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，获得450bp左右的特异性扩增片段（图4-15），各组样品均有较亮的条带，扩增产量大，且无明显副带或拖带，说明各样品总DNA提取成功且PCR扩增条件是合适的，产物可用于后续的DGGE电泳分析。
图4-15　样品总细菌16S rDNA的V6～V8可变区PCR扩增结果
三、DGGE指纹图谱分析
各组样品PCR产物经DGGE后的指纹图谱及电泳模式图见图4-16。图谱中不同位置的条带代表序列可能存在差异的微生物，条带越亮代表该种微生物在样品中所占的比例越大。由图4-16中可以看出，该试验PCR产物经DGGE后共分离出37条清晰、可切割的条带（A1-1～C2-8）。从电泳模式图看到，各样品微生物群落总体上差别大不，但还是存在一些不同。条带1、2、3在C1样品中基本未见，在C2样品中含量很少；条带4在A1和C2中未见；条带5和6在C2样品中基本未见，而条带7则除了在B2、C1样品中存在，其余各样品都不是很清晰；条带8在各样品中均存在，且在图谱中的亮度远大于其他条带，为优势条带。
图4-16　不同批次样品PCR产物DGGE电泳图谱（a）和电泳模式图（b）
条带数据经MVSP软件分析后，得出UPGMA聚类图（图4-17）。可以看到，样品C1单独聚为一簇，与其他5组样品相似性仅为58%左右；
图4-17　各组样品微生物群落组成的UPGMA聚类分析
样品C2与B2、B1、A2、A1聚为一簇，相似性为72%左右；A1与B2、B1、A2相似性接近90%，说明这4组样品微生物组成较为相似，而B2、B1、A2三组样品又聚为一类，相似性达到94%，其中A2与B1相似性高达100%，说明这两组样品在微生物组成上基本相同。因此，第一、第二批次样品A与B罗非鱼片在冰温气调贮藏条件下腐败终点的腐败菌相组成相似性较高，第三批次样品C则与前两组样品存在较大差异，可能是由于贮藏条件变化等试验误差所致，但不同批次样品均分离得到亮带8，进一步说明条带8所对应的微生物在贮藏过程中具有较强的低温及CO2的耐受性，生长繁殖速率远大于其他不同种属微生物，在贮藏过程中累积成为腐败终点时优势度最大的腐败菌。
四、DGGE主要条带切割克隆及酶切PCR鉴定结果
选取共9条清晰可见的条带进行切割回收，切割的条带编号如下：B2-1、B2-2、A1-3、A2-4、B1-4、 C1-5、C1-6，C1-7、C1-8。
回收片段经扩增、连接及克隆后，克隆产物在含有X-Gal和IPTG的氨苄青霉素（AMP）LB平板生长情况见图4-18（图示为条带C1-8的克隆产物）。根据蓝白斑筛选原理，图中蓝色菌落表示目的片段连接未成功的细菌，而白色菌落则表示包含有目的片段质粒的细菌。
图4-18　目的条带经pMD-18载体转化至大肠杆菌后的生长情况
克隆产物所提质粒经E. coli Ⅰ外切酶单酶切后，使用968F/1401R重扩增的PCR鉴定结果见图4-19。所切割的9条条带均有亮带产生，且大小为450 bp左右，与初始片段大小一致，因此判定9条条带所对应的克隆产物均为阳性克隆。
图4-19　质粒单酶切后的PCR鉴定结果
五、测序及序列比对结果分析
将上述含有目的片段的质粒递交测序，最终有7条条带测序成功（A2-4、B1-4测序未成功，原因是测序出现双峰，可能是混合克隆所致）。表4-13为上述7条DGGE条带测序结果。
表4-13　细菌DGGE指纹图谱上条带的序列
表4-13　细菌DGGE指纹图谱上条带的序列（续）-1
7条测序成功的条带经Blast比对后，在Genbank中的共挑选出15种相似的菌种（表4-14），其相似度达到97%～100%。将这22条序列用ClustalX进行同源性比对后，经Mega软件构建的NJ发育树见图4-20。可以看到条带1～8所代表的微生物主要来自于厚壁菌门（Firmicutes），其次是变形菌门（Proteobacteria），其中厚壁菌门（Firmicutes）细菌占到85%以上。与7个序列最为相似的序列分别来自以下几个属：梭菌属（Clostridium）、链球菌属（Streptococcus）、乳杆菌属（Lactobacillus）、乳球菌属（Lactococcus）、假单胞菌属（Pseudomonas）以及肉食杆菌属（Carnobacterium）。
表4-14　冰温气调贮藏罗非鱼片细菌DGGE指纹图谱上条带的序列分析
乳酸菌（lactic acid bacteria LAB）是一类能从可发酵碳水化合物（主要指葡萄糖）产生大量乳酸的细菌的统称，目前已发现的这一类菌在细菌分类学上至少包括18个属，主要有：乳酸杆菌属、肉食杆菌属、双歧杆菌属（Bifidobacterium）、链球菌属、明串珠球菌属、肠球菌属（Enterococcus）、乳球菌属、奇异菌属（Atopobium）、片球菌属（Pediococcus）、气球菌属（Aerococcus）、漫游球菌属（Vagococcus）、李斯特菌属（Listeria）、芽孢乳杆菌属（Sporolactobacilus）、芽孢杆菌属（Bacillus）中的少数种、环丝菌属（Brochothrix）、丹毒丝菌属（Erysipelothrix）、孪生菌属（Gemella）和糖球菌属（Saccharococcus）。可以看到，冰温气调贮藏罗非鱼片腐败终点的微生物群落比较单一，绝大部分为乳酸菌群，仅B2与C1两组样品出现假单胞菌，假单胞菌作为一种严格好氧微生物，可能是部分样品在包装过程中混入空气所致。通过图4-20发育树可以看到，冰温气调贮藏罗非鱼片腐败终点的最主要的微生物是乳酸菌，而肉食杆菌（Carnobacterium）是腐败菌群中优势度最大的种属。
图4-20　7条主要序列与一些相似序列以Neibor-Joining方法构建的系统发育树
Collins等于1987年按生理生化性状的分类标准，将某些非典型的乳杆菌——歧异乳杆菌（L. divergens）和鱼乳杆菌（L. piscicola）（它们是已知的食品腐败因子和鱼的致病菌），连同另外2个新种——鸡肉食杆菌（C. gallinarum）和游动肉食杆菌（C. mobile）建立了一个新属，即肉食杆菌属（Carnobacterium）。这些肉食杆菌在表型上相似，形成一类群，与乳杆菌属可鉴别开，然而它们在系统发育上与乳杆菌属的关系在建立新属时尚不明确。肉食杆菌属的主要特征：革兰氏阳性无芽孢的杆菌，运动或不运动。接触酶阴性，从葡萄糖中主要产L（+）乳酸。大多数菌株可在0 ℃生长，不在乙酸盐的琼脂或培养液以及8%NaCl浓度的培养基中生长，在pH 9.0的改良MRS培养液中生长。DNA的G+C含量摩尔分数为33.0%～37.2%。
第三节　冰温气调保鲜对罗非鱼片品质的影响
一、理化指标的变化
1．肉汁渗出率的变化
冰温贮藏过程中鱼肉汁液流失率变化如图4-21所示。在贮藏的第1周，B、C两组的肉汁渗出率与A组差不多，而D组高于A、B、C 3个组，可能是抽真空时对鱼肉有物理挤压，使得鱼肉初始的肉汁渗出量较多。从图4-21中还可以发现，随着贮藏时间的推移，B组、C组样品在贮藏前期肉汁渗出率增幅较大，第19天后变化幅度减小并趋于稳定，达到腐败期后其汁液流失变化较小。经多重比较分析，第10天以后B组、C组样品的肉汁渗出率明显高于其他两组（P＞0.05），说明气调组对肌肉持水性影响十分显著。
图4-21　不同包装方式下罗非鱼肉汁渗出率的变化
2．色泽的变化
从表4-15中知，在整个贮藏期间，A、B、C、D 4个组的白L*值均有所增加，肉色发白，可能是因为肌红蛋白的随汁液流失，使得肉色发白。A组在第1周色泽鲜红，但随着贮藏时间的延长，特别是10 d以后，其色泽急剧劣变（表现为H*值增长迅速，C*值下降加快）；根据多重比较分析B组H*值的增加，C*值的减少都比其他3组显著（P＜0.05），说明B组肉色变化较快；而C组在整个储存期间，色泽一直保持鲜亮红色，色泽相当稳定，而且到贮藏后期H*还有所下降，说明肉色越来越红，这和感官评分的结果一致，说明1%CO具有非常好的护色效果；D组在前7 d色泽劣变程度和B组无明显差异，但之后一直呈暗红，变化不明显，这与肉汁渗出率的变化一致。在A组贮藏期结束时，第16天4个组罗非鱼肉的色泽（以H*值表示）有显著差异（P＜0.05），H*值从小到大依次为C组＜D组＜B组＜A组。
表4-15　不同包装方式下的鱼肉色差测定结果
3.pH的变化
如图4-22所示，随着贮藏时间的延长，罗非鱼片pH总体变化呈现先降低后上升的趋势。A组和D组的pH在前两天略微下降后第4天开始上升，而B组和C组的pH在第7天后才开始缓慢上升，保藏初期，pH的变化主要与ATP降解、糖原分解产生乳酸和蛋白质的变化以及CO2溶解在肉汁中有关，而保藏后期pH的变化主要与细菌的生长，产生碱性物质的多少有关。从图4-22中可以看出，B、C两组的差异不明显，在后期pH虽有所升高但增幅较小，说明冰温气调能有效抑制细菌的生长，细菌生长产生的碱性物质使pH上升，但涨幅不大。
图4-22　不同包装方式下罗非鱼pH的变化
4.TBA值的变化
TBA值的变化如图4-23所示，A组的TBA值随时间的变化增长较快，到第7天时，由初始的0.094mg/kg增加了95.74%，之后增长更快，到第16天时增长了123.91%达到0.412mg/kg，根据方差分析，A组与其他3组自第4天开始有明显差异（P＜0.05），可能是因为空气包装中的O2加速了鱼肉的酸败。D组在前16 d与B组、C气调组无明显差异，之后增长加快。B组、C组在第19天前TBA值缓慢上升，从0.095mg/kg上升至0.275～0.281mg/kg，而到第25天时TBA值达到0.435～0.446mg/kg，19d后鱼肉的脂肪氧化速度才加快，说明冰温气调的协同作用可以有效延长TBA值达到最大值的时间。
图4-23　不同包装方式下罗非鱼TBA值的变化
5.TVB-N值的变化
从图4-24可知，TVB-N值随贮藏时间延长而逐渐增大。在冰温条件下贮藏时，A组的TVB-N值较其他组增长快速（P＜0.05），第16天时已达到20.43mg/100g，超过了20mg/100g，D组比B组和C组的TVB-N值增长稍快，在第19天时超过20mg/100g，而B、C两组随贮藏期的延长均呈缓慢上升趋势，这说明气调包装可显著抑制蛋白质分解和细菌生长。到第22天时B、C两组的TVB-N值才超过20mg/100g，两组无明显差异，可见冰温保藏和CO2气调包装均能有效抑制TVB-N的产生。
图4-24　不同包装方式下罗非鱼TVB-N值变化
CO2气调包装可抑制细菌的生长，从而抑制TVB-N值的增加。Banks等也认为气调包装样品在贮藏期间较低的TVB-N值是由于细菌生长受到抑制，或是由于细菌的非蛋白氮氧化脱氨能力下降的结果，另一方面，在贮藏的过程中，蛋白质分解产物低分子含氮物（碱性）与后期微生物发酵产酸相中和也是CO2气调保鲜过程中TVB-N值较低的一个原因。
6．感官品质的变化
如表4-16所示，罗非鱼在贮藏过程中，感官评分均随时间的延长而下降。初始样品具有特殊的鱼鲜味，白肉、红肉对比明显，体表有透明黏液，肌肉组织质地紧密、弹性好。鱼类在贮藏过程中不良气味的产生主要与细菌的代谢作用和鱼肉自身的分解密切相关，其体表产生的浑浊、污秽的黏状物，是微生物繁殖后形成的菌落。B组和C组的气味和弹性的变化相似，到第25天时，鱼肉的气味仍可接受，无哈喇味和腥味，这可能是因为较高浓度CO2可以较好抑制微生物的生长繁殖；A组从第7天以后气味变化较其他3组显著（P＜0.05），有明显鱼腥味，到第16天时有较明显的哈喇味；D组第13天以后开始有轻微鱼腥味，第16天时各组气味的评分由好到差依次为B≈C＞D＞A；肌肉弹性指标方面，B、C两组的鱼肉从第16天开始变得松软、无弹性，第25天时体表覆盖一薄层黏液，这可能是由于气调包装中高浓度CO2使肌肉酸化所致，A组的鱼肉弹性略微好于B、C两组，D组的鱼肉弹性变化最小，明显好于其他3组（P＜0.05）；从色泽方面看，A组只在贮藏前几天色泽鲜红，从第7天以后迅速变差，主要是由于肌肉组织被氧化以及微生物活动所引起，D组在最初的4 d色泽会变暗，之后变化不明显，一直呈暗紫色，B组在第16天后开始发黄，肉色变淡，而C组在混合气体中添加低浓度1.0% CO，明显延长鱼肉色泽稳定的时间，使鱼肉在整个贮存期中都保持鲜艳的红色，但在22 d后整个肉色会越来越红，色泽不自然。这是因为CO与肌红蛋白结合生成一氧化碳肌红蛋白COMb, COMb对光线的反射特性非常接近鲜红色的氧合肌红蛋白MbO2，而且CO与Mb血红素辅基上的呋啉环结合能力很强，通常其亲和力高出O2近240倍，且与肌红蛋白结合的稳定性极高，从而达到长时间保持肉质良好色泽的目的。
表4-16　不同包装方式下罗非鱼片的感官评分
7．质构的变化
（1）硬度
硬度表现为人体的触觉为柔软或坚硬，即使食品达到一定变形所需要的力，食品保持形状的内部结合力。由图4-25可知，A、B、C、D 4组随着贮藏时间的增加，鱼肉的硬度有不同程度的减小，结合微生物、pH以及肉汁渗出率等考虑，A组硬度的降低主要可能是由于肌肉组织蛋白质受微生物的分解作用导致腐败，因为大多数微生物都是在蛋白质分解产物上才能迅速生长。D组的硬度变化最小，可能是因为在冰温真空状态下，其pH及肉汁渗出率变化较小，所以鱼肉硬度劣变不明显。B、C两组硬度变化显著，主要原因可能是鱼肉在贮藏过程中pH的变化以及水分流失导致干耗，使得鱼肉的保水性发生变化，影响了肉的硬度。有研究指出，当含水率小于21.5%时硬度和肉的含水率之间有一定的正相关性，硬度随着含水率的下降而下降。到第19天时，B、C两组鱼肉的硬度下降至最低，之后又有所上升，这个结果与Maria等得出的结论相近，指出可能是与蛋白质变性有关，由于气调贮藏中CO2溶于肉汁中，使鱼肉间隙的体积膨胀，产生的内压会使肌肉纤维变形甚至局部断裂，内侧的一些疏水基团暴露在外侧，相对降低了蛋白质表面的有效电荷，也就是降低了蛋白质的亲水性与盐溶性，肌肉纤维的变形与蛋白质的凝聚促使肌肉蛋白丝从Z线与M线上脱离，从而造成肌肉硬度的下降。
图4-25　不同包装方式下罗非鱼硬度的变化
（2）黏着性
黏着性是下压一次后将探头从试样中拔出所需能量的大小，反映了在咀嚼鱼肉时，食品表面与其物体（舌、齿、腭）粘在一起的力。黏着性参数能够反映鱼肉细胞间结合力大小，细胞间结合力减小，则黏着性值增大。从图4-26看出，随着贮藏时间的增加，黏着性没有明显的规律，总体比较持平，可能是因为随着贮藏时间的增加，微生物分解蛋白质形成的多肽与水形成黏液，附在肉的表面。在试验过程中，探头上提时，黏液对探头下拉的作用影响了肉本身的黏着力。所以鱼肉在贮藏过程中，黏着力没有显著变化的趋势。Mohammad等对肉的研究表明，黏着力在贮藏过程中，随肉的含水率的降低没有显著的变化。该试验结果与上述文献的结论相近。
图4-26　不同包装方式下罗非鱼黏着性的变化
（3）弹性
弹性反映了外力作用时变形及去力后的恢复程度。如图4-27所示，在贮藏第1～19天时，随着贮藏时间的增加，鱼肉的弹性下降较快，之后变化开始变缓。可能是鱼肉在贮藏过程中肉汁渗出导致干耗，使得鱼肉的保水性发生变化，影响肉的弹性。图4-27显示，到第19天时，弹性下降至最低，之后弹性又有所上升，这个变化趋势和硬度的变化规律一致，可能也是由于蛋白质变性，ATP酶活性的降低引起。由图4-27也可看出，第10天后，C组的弹性比B组稍好，可能是因为C组的鱼肉的含水率比B组高，这个与肉汁渗出率的规律基本一致；D组的弹性明显好于A、B、C 3个组（P<0.05）。
图4-27　不同包装方式下罗非鱼弹性的变化
（4）凝聚性
凝聚性反映了咀嚼鱼肉时，肉纤维抵抗受损并紧密连接使肉保持完整的性质，它同样反映了细胞间合力的大小，但与黏着性反映的鱼肉性质恰好相反。如图4-28所示，4个组的罗非鱼肉在贮藏时间内凝聚性都在变小，A、B、C 3个组的凝聚性无明显差异（P>0.05），但都比A组凝聚性低，可以推断，A、B、C 3个组细胞间结合力随贮藏时间的延长下降，以致肌肉组织变的疏松。另一方面可能是蛋白质发生了变性，暴露出较多的非极性疏水基团，从而导致凝聚性的下降。贮藏中D组的凝聚性始终比其他3组好。
图4-28　不同包装方式下罗非鱼凝聚性的变化
（5）胶性
胶性反映了将鱼肉嚼碎到可吞咽时需做的功，用于描述半固态的测试样品的黏性特性，数值上用硬度和凝聚性的乘积表示。由图4-29可知，D组的胶性减小的较缓慢，而A、B、C 3个组的胶性随着贮藏时间的增加而迅速减少。屠康等以干酪为对象进行了研究，结果表明，干酪的胶性随着含水率的降低而降低，试验结果与屠康等的研究结果接近。也可能是由于随着贮藏时间的增加鱼肉中的肌原纤维蛋白发生了降解，微生物对蛋白分解，通常是先形成蛋白质的水解初步产物——多肤，再水解成氨基酸。因此，鱼肉嚼碎到可吞咽时需做的功也将减少，胶性随时间的增加逐渐减小。
图4-29　不同包装方式下罗非鱼胶性的变化
（6）咀嚼性
咀嚼性就是所说的咬劲，是一项质地综合评价参数，它是肌肉硬度降低，细胞间凝聚力降低，弹性减小等综合作用的结果。如图4-30所示，在贮藏第1～19天时，随着贮藏时间的增加，4组鱼肉的咀嚼性均不同程度的减小，A组和B组无明显差异。Mohammad等指出当含水率小于21.5%时硬度和肉的含水之间的有一定的正相关性，咀嚼性随着含水率的下降而下降。Maria等对猪肉的研究表明，酶解肌球蛋白、肌钙蛋白以及原肌球蛋白水解，酶水解蛋白导致非蛋白氮的堆积，并且在对肌肉微观结构的观察验证了其化学的变化，因此，咀嚼性可能是由生化变化所引起的。到第19天时，A、B两组的咀嚼性下降至最低，之后又有所上升，这可能与蛋白质变性有关。咀嚼性的变化趋势与硬度的变化趋势相近。在该试验的冰温条件下，第19天时蛋白质发生变化足以引起鱼肉的质地参数的变化。
图4-30　包装方式下罗非鱼咀嚼性的变化
二、细菌总数的变化
由图4-31可知，随贮藏时间延长，细菌总数的变化规律总体是缓慢上升的。在细菌总数变化曲线上可观察到两个明显的阶段。开始阶段（1～10 d），细菌总数有所下降。这是因为新的贮藏环境如冰温（-0.7～0℃）状态，较高浓度的CO2，抑制了鱼肉自身所带微生物的生长繁殖，这些微生物自身不断进行自我调整以适应新的环境，有的微生物则直接被淘汰掉，细菌生长和繁殖缓慢或停止，表现为细菌总数的缓慢减小。第二阶段（10～25 d），细菌总数增加较快。这是因为经过一段时间的自我调整，微生物已经适应新的环境，不断利用肉制品的各种营养物质，进行自我生长和繁殖。B组和C组在整个贮藏过程中细菌总数先减少后有缓慢增长，但都维持在较低水平，即使到第25天，细菌总数对数值仍未超过6 lg（CFU/g），而A、D两个冰温组细菌总数均有较大增长，在第19天时，A组细菌总数对数值为6.04 lg（CFU/g），第22天时D组为6.11 lg（CFU/g），可见较高浓度的CO2对细菌有较好的抑制效果，有利于罗非鱼片的保鲜。如果以水产品高品质指标106CFU/g为评定腐败的标准，则A、D两组的货架期分别为18～19 d和21～22 d（这与感官评定的结果相一致），而气调B组和C组到第25天仍未达到此水平，通过试验发现，B、C两组到第30天时其细菌总数才刚刚达到106CFU/g。但是，到第19天时，B组感官上变得难以接受，主要是因为鱼肉感官上的变化不仅是细菌的作用，还有其自溶分解作用以及高浓度CO2的影响。B、C两组的细菌总数虽无明显差异（P>0.05），但C组的细菌总数要略低于B组，这可能是因为当气调包装袋中混有少量的CO时影响某些微生物的生长繁殖。有研究表明，气调包装中混入0.5%～10%CO可以减慢嗜热微生物的生长速度，在0～10℃下存放可以延长产品的保质期。如牛肉于5℃存放，在1%CO+99%N2环境下变味时限为24 d，在100%N2变味时限为18 d，在空气中仅为5 d。
图4-31　不同包装方式下罗非鱼片细菌总数变化
三、营养成分的影响
1．粗蛋白质的变化
从图4-32可看出，A、B、C、D 4个组的蛋白质含量均有略微下降，蛋白质含量由初始19.40%到各组的贮藏结束期平均下降约0.61%，组间没有明显差异（P＞0.05），说明不同的包装方式对罗非鱼的蛋白含量无显著影响。
图4-32　不同包装方式下蛋白质含量的变化
2．粗脂肪的变化
如图4-33所示，在整个贮藏期间B、C、D 3个组的粗脂肪含量基本没变，对各组贮藏结束期的数值进行多重比较分析，A组与其他3组存在明显差异（P＜0.05），由初始的2.52%下降到2.44%，原因可能是空气中的O2使鱼肉发生了部分脂肪氧化。
图4-33　不同包装方式下粗脂肪含量的变化
3．水分的变化
从图4-34中看出，A、B、C、D 4个组在贮藏期间水分均有所下降，在各组贮藏期的最后一天，A组下降了0.92%，B组下降了2.84%，C组下降了1.88%，D组下降了1.63%，这个结果与肉汁渗出率的规律一致，气调组的鱼肉液汁流失相对较多。
图4-34　不同包装方式下水分含量的变化
4．灰分的变化
如图4-35所示，贮藏期间各组灰分有不同程度的上升，但无明显差异，这可能是因为鱼肉体液损失增加，从而使无机物与相对重量之比增大。
图4-35　不同包装方式下灰分含量的变化
5．游离脂肪酸组成与含量的变化
表4-17是不同包装下罗非鱼贮藏过程中游离脂肪酸组成变化，从表4-17中可以看出，鲜鱼肉中游离脂肪酸主要有棕榈酸（16∶0）、硬脂酸（18∶0）、油酸（18∶1）、棕榈油酸（16∶1）、亚油酸（18∶2）、亚麻酸（18∶3），其中油酸含量最高约占总量的29.25%，其次是棕榈酸、亚油酸、棕榈油酸和硬脂酸，分别为24.99%、12.31%、6.97%、5.48%，这些游离脂肪酸的产生主要是罗非鱼宰杀之前和宰杀时产生应激导致肾上腺素的释放影响脂肪水解酶的释放，最终影响脂肪的水解和游离脂肪酸的含量。
表4-17　不同包装方式下罗非鱼游离脂肪酸组成及含量的变化
各组在贮藏结束时，不饱和脂肪酸的含量略微增加，而饱和脂肪酸、多不饱和脂肪酸含量有所减少，但是在不饱和脂肪酸中主要是油酸和亚油酸含量的增加，大多数不饱和脂肪酸含量是降低的，说明在冰温贮藏过程中大多数不饱和脂肪酸氧化产生了挥发性物质，由于不饱和脂肪酸易氧化，而多不饱和脂肪酸比单不饱和脂肪酸更易受到自由基的攻击，因此，多不饱和脂肪酸更容易氧化，其含量减少较明显。饱和脂肪酸中除了硬脂酸、花生酸、二十二酸有所增加，其他饱和脂肪酸含量均减少，可能是脂质的分解速度大于氧化速度。鲜肉中游离脂肪酸含量比较高，在贮藏一段时间后，由于肉汁流失，各组的游离脂肪酸随着水分的流失而散失。其中空气包装A组的饱和脂肪酸含量减少量最小，多不饱和脂肪酸减少量最大，也可能是因为包装中的氧气使得鱼肉不饱和脂肪酸的氧化加剧，故其饱和脂肪酸含量相对较高。B、C两组在第15天时其游离脂肪酸的变化比较缓慢，到第26天时才有明显变化，可能是因为贮藏后期细菌的生长繁殖加快了脂质的分解，同时后期的肉汁渗出率迅速上升。
6．水解氨基酸的变化
由表4-18可知，鲜罗非鱼肌肉氨基酸总量（TAA）为16.71g/100g；必需氨基酸（EAA）含量为7.04g/100g，占氨基酸总量的42.09%；对TAA、EAA2个值分别进行多重比较分析，发现第15天时B组和C组这两个值都有所下降但与鲜鱼肉的差异没有A组明显，说明气调包装对鱼肉有一定的保鲜效果，但到第26天时，B、C两个组的TAA和EAA值有明显降低（P＜0.05），C组比B组更显著，可能是CO引起的，具体还有待研究。
表4-18　不同包装方式下罗非鱼的水解氨基酸组成及含量的变化
表4-18　不同包装方式下罗非鱼的水解氨基酸组成及含量的变化（续）-1
根据FAO/WHO理想模式，质量较好的蛋白质，必需氨基酸（EAA）占氨基酸总量（TAA）的40%左右，但该贮藏试验不能以此判断罗非鱼蛋白质品质是否变化，因为EAA、TAA都在贮藏中同时减少，所以其比值没有明显变化。食物蛋白质营养价值的高低主要取决于所含必需氨基酸的种类、数量和组成比例。将罗非鱼中氨基酸组成情况与FAO/WHO制订的蛋白质评价的氨基酸标准模式和鸡蛋蛋白标准模式进行比较，计算出它们的氨基酸评分（AAS）、化学评分（CS），结果见表4-19。由表4-19可知，根据氨基酸评分（AAS），鲜罗非鱼各种氨基酸评分除苏氨酸、缬氨酸、蛋氨酸+半胱氨酸外，均大于1，化学评分（CS）除蛋氨酸+半胱氨酸均在0.6以上，这说明鲜罗非鱼肌肉必需氨基酸含量较为丰富。第15天时，各组7种AAS值和CS值都有不同程度降低，A组降低的最显著（P<0.05），D组次之，整个贮藏过程中，各组的苏氨酸、异亮氨酸和赖氨酸的AAS/CS减少的较明显，其他4种没有明显变化。
表4-19　不同包装下罗非鱼在贮藏过程中肌肉必需氨基酸组成评价
表4-19　不同包装下罗非鱼在贮藏过程中肌肉必需氨基酸组成评价（续）-1
7．游离氨基酸的变化
由表4-20可知，各组的游离氨基酸总量有不同程度的降低，对其进行多重比较分析，第15天时，B、C、D3个组与A组存在明显差异（P＜0.05），B、C两组的游离氨基酸总量略大于D组，但不显著。鱼肉的风味主要取决于鱼肉中鲜味氨基酸的含量，鱼肉鲜味氨基酸包括谷氨酸（Glu）、天冬氨酸（Asp）、甘氨酸（Gly）和丙氨酸（Ala）。其中谷氨酸、天冬氨酸为呈鲜味的氨基酸，甘氨酸和丙氨酸为呈甘味的氨基酸。在B组和C组整个贮藏期间，减少最明显的是谷氨酸、甘氨酸、天冬氨酸、苏氨酸、脯氨酸。第15天时，A、B、C、D 4个组的DAA值由初始的0.2253g/100g分别降低到0.1953g/100g、0.2064g/100g、0.2187g/100g、0.2044g/100g，说明随着贮藏时间延长，罗非鱼的鲜味有所降低。
表4-20　不同包装方式下罗非鱼的游离氨基酸组成及含量的变化
表4-20　不同包装方式下罗非鱼的游离氨基酸组成及含量的变化（续）-1
参考文献
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第五章　液熏罗非鱼片的加工技术
第一节　罗非鱼片液熏工艺技术
一、液熏方法
1．淋洒法、喷雾法
将烟熏液以一定的流量通过离子雾化系统喷出雾化成小液滴，在气流和重力的作用下，均匀地淋洒或喷雾在鱼片，鱼块表面积，当把烟熏液喷洒完成后，再按工艺制成成品。
2．浸渍法
将定量的烟熏液与其他香料配成香料浸渍液，然后将处理好的鱼片、鱼块等浸入其中。经过一定时间浸渍后即可，然后再按工艺制成成品。浸渍过程中要经常观察鱼体，熟练掌握浸渍程度。对个体较大的鲹、鲐等，需经腹开或背开之后再浸渍，对金枪鱼、大马哈鱼等大型鱼类，要预先切块，再用浓熏液短时间浸渍。
3．注射法
对于大块的鱼片，其质地较硬，因而烟熏液不易在短时间内浸入食品，所以用注射法为好。具体方法是将定量的烟熏液，用注射器注入大块肉中，并要求各个部位都要注射到，还要求边注射边滚揉，使烟熏液分布均匀，当把烟熏液注射完以后，再按工艺制成成品。
4．置入法
将定量的烟熏液注入已装罐的罐内，然后按工艺封口杀菌，通过热杀菌能使烟熏液自行分布均匀，此法对于罐头食品烟熏风味是最适宜的，但对于罐头内固形物的色泽、质地等，仍要按原工艺保证。适用于烟熏罐头食品品种，如油浸烟熏秋刀鱼、油浸烟熏长鳍金枪鱼、油浸液熏鳕、油浸液熏章鱼、油浸液熏沙丁鱼等，也可以油浸液熏牡蛎、五香烟熏牡蛎等。
二、罗非鱼片喷雾烟熏工艺
1．感官评价方法
感官评价时按0～7分对液熏罗非鱼片的色泽、烟熏味、咸味、酸味、组织及后味6项评分指标进行评价。其中7分为最好，0分为最差。感官等级评价标准见表5-1。
表5-1　熏制罗非鱼片的感官评价标准
2．正交试验确定液熏工艺条件
以盐水浓度（A）、腌渍时间（B）、喷雾熏制时间（C）、干燥时间（D）4个因素选取3个水平，采用L9（34）进行正交试验。确定烟熏液烟熏液L-SMOKE1流量为6 L/h。正交表设计9组试验如表5-2所示，正交试验结果见表5-3。
表5-2　正交试验因素水平表
表5-3　正交试验分析表
表5-3　正交试验分析表（续）-1
由表5-3可知，根据感官评价，4个因素的重要性关系依次为：C（喷雾熏制时间）>B（腌渍时间）>D（干燥时间）>A（盐水浓度）。因此，确定选取的最佳条件为：A3B2C2D3，即盐水浓度15%，腌渍时间60min，喷雾熏制时间20min，干燥时间60min。
三、罗非鱼片喷雾烟熏工艺的优化
1．产品色泽的优化
烟熏产品独特的烟熏色泽是引起消费者食欲的重要特征，根据表5-4色泽评分指标分析结果，产品色泽尚不能令人满意。在后续试验中，采用以着色为主的L-SMOKE2烟熏液来进行优化。将腌渍后的罗非鱼片在L-SMOKE2烟熏中进行浸渍烟熏，然后再进行喷雾烟熏。选择烟熏液浓度（A）和浸渍时间（B）为试验因素确定3个水平，烟熏罗非鱼片产品以色泽作为评价指标。其他条件采用喷雾烟熏确定的条件。按L9（32）正交表进行试验，色泽优化因素与水平如表5-4所示，各因素对色泽影响效果如表5-5。
表5-4　色泽优化试验正交试验因素水平表
表5-5　正交试验分析表
表5-5　正交试验分析表（续）-1
从表5-5可见，根据色泽评分结果，两个因素的重要性关系为：A＞B。因此，最优组合为A2B2，即烟熏液浓度为25%，浸渍时间5min。
2．产品风味的优化
烟熏液L-SMOKE1主要成分为木醋液，pH为2.2～3.2，产品酸味较为明显，烟熏液L-SMOKE1以赋予产品烟熏味为主，烟熏液L-SMOKE2以着色为主。在后续研究中，通过调节烟熏液的流量来优化产品的风味。烟熏液L-SMOKE1按2 L/h、4 L/h和6 L/h 3个流量进行单因素试验。感官评价结果见表5-6。
表5-6　烟熏液喷雾流量对产品品质的影响
从表5-6可见，流量为2 L/h时，产品烟熏味较淡，色泽较好；流量为4 L/h时，产品色泽、烟熏味及酸味等评分均较高；流量为6 L/h时，产品烟熏味浓郁，但色泽偏暗，酸味较重。因此，确定喷雾烟熏时熏液流量为4 L/h。
第二节　熏制罗非鱼片生化特性变化
一、常规理化指标分析
对原料及产品的水分含量、粗蛋白质、粗脂肪、盐分、有效酸碱度（pH）、TVB-N值及TBA值进行测定，结果见表5-7。
表5-7　理化指标测定结果
由表5-7可以看出，除盐分和pH外，产品的蛋白质含量、水分含量和脂肪含量与原料基本保持一致，TVB-N值变化不大，仍在我国水产品标准GB 2733－2005规定的20mg/100g以下。由最佳工艺生产的产品盐分为2.34%，pH为5.72，与传统的冷熏即食三文鱼相近，其盐分含量在2%～4%，pH为5.8～6.3。产品的水分含量为72.10%，属于高水分半干食品，正好满足现代消费者对于保持原料原有特性的要求。
与脂肪氧化酸败有关的指标TBA值变化从原料的0.58mg/kg增加至成品的0.70mg/kg，变化比较小，但POV值测定时溶液没有颜色变化，表明液熏罗非鱼片表现出良好的油脂稳定性，对于原料和产品，可以忽略脂肪氧化酸败引起的变质。其原因在于罗非鱼片本身脂肪含量低，原料为2.65%，液熏罗非鱼片为3.25%；此外，烟熏液成分中存在防止氧化作用的愈创木酚等酚类物质起到了阻止脂肪氧化的作用。
二、风味成分分析
烟熏味是利用木材不完全燃烧产生的烟气或烟熏液熏制食品而产生的一种混合风味。食品在获得烟熏味的同时，可以去除或掩盖其他异味，同时烟熏成分起到杀菌和抗氧化作用，延长产品的保质期。经GC-MS检测得到的风味成分离子流色谱图如图5-1和图5-2所示，通过将挥发性成分的质谱数据与气质联用仪的质谱数据进行分析，所得到的液熏罗非鱼片产品和传统木粒烟熏罗非鱼片产品的风味物质分析结果如表5-8所示。
图5-1　液熏罗非鱼片挥发性成分总离子流色谱图
图5-2　传统烟熏罗非鱼片挥发性成分总离子流色谱图
表5-8　液熏罗非鱼片和传统木粒烟熏罗非鱼片的挥发性风味物质分析结果
从表5-8可见，液熏罗非鱼片检出风味成分分别为33种，传统烟熏罗非鱼片检出风味成分30种，在这些呈味成分中有26种是共有的，所占比例分别为91.53%和92.27%。其中，液熏罗非鱼片检测到10个酚类化合物，总相对含量为12.84%；4个酯类化合物，总相对含量为42.79%，二者总和达到55.63%；7个脂肪族酮类，总相对含量为14.59%；4个酸类化合物，总相对含量为19.25%。传统烟熏罗非鱼片检测到12个酚类化合物，总相对含量为30.50%；4个酯类化合物，总相对含量为26.59%，二者总和达到57.09%；4个酸类化合物，总相对含量为18.81%。其余化合物为醛和呋喃类。通过比较，在风味成分的种类和含量方面，液熏罗非鱼片与传统烟熏罗非鱼片相近。
在熏烤鲣的风味成分分析研究中，共检测到17种酚类、13种酸类、2种内酯类、11种烃类、16种羰基化合物、8种含氮化合物、15种醇类、2种硫化物、5种酚醚类及呋喃类等化合物。其中2，6-二甲氧基苯酚、4-甲（乙）基-2，6-二甲氧基苯酚、2-甲基庚醇、3，4二甲氧基甲苯、全顺式-1，5，8-十一碳三烯-3-醇、2，5-辛二烯-3-醇、3-甲基2-环戊烯酮、2，3-二甲基-2-十一酮、2-（或3-）甲基巴豆酸-γ-内酯等都是熏烤鲣的重要香气成分。
在烟熏中起主要作用的熏烟成分是酚类、醇类、酸类、烃类及羰基化合物类，是烟熏味的主要呈味成分，其中酚类物质及其衍生物主要有愈创木酚、4-甲基愈创木酚、4-己基愈创木酚、2，6-二甲氧基苯酚等，熏烟中的羰基化合物如酮类、醛类等不仅提供烟熏风味，而且与烟熏制品的氨基起褐变反应形成熏制品的色泽。
三、质构指标分析
采用质构仪检测了原料及产品的质构特性，以研究液熏罗非鱼片产品的质构变化情况，有关特性见表5-9。
表5-9　质构指标测定结果
罗非鱼片原料和烟熏产品的质构指标结果如表5-9所示，烟熏产品的硬度、弹性、粘牙性、咀嚼性指标值均高于原料，与液熏三文鱼质构变化表现出相同的趋势。在烟熏加工过程中，盐腌后食盐向鱼体内渗透，使得鱼体脱水，在烟熏阶段，烟熏液也会逐渐向鱼肉组织渗透，蛋白质结构发生变化，鱼肉组织变得紧密，产品更有嚼劲。
四、色泽指标分析
肉类食品色泽的评价目前主要有三种方法：①采用标准比色板法，主要用于调查；②色差计测定法，测定结果用L*值、a*值和b*值表示，色差计因其具有方便和客观的特点而被广泛应用；③计算机数值图像处理技术，主要用于在线分级。研究采用色差计来测定液熏产品的色泽，结果如表5-10所示。
表5-10　色泽指标测定结果
由表5-10可知，由于罗非鱼是白肉鱼种，其原料的L*值很高，为55.94，a*值和b*值分别为0.86和8.03，产品的L*值、a*值和b*值分别为48.49、9.77和26.43，这是因为液熏后，随着烟熏色泽的产生，L*值下降，而a*值和b*值显著增加，呈现出产品的烟熏色泽。
五、微生物指标分析
罗非鱼片原料和液熏罗非鱼片产品的细菌总数、金黄色葡萄球菌和单核细胞增生李斯特菌的存在情况如表5-11所示。
表5-11　微生物指标测定结果
由表5-11可知，原料的细菌总数为2.15×104CFU/g，产品的细菌总数1.67×103CFU/g；原料金黄色葡萄球菌＜100 CFU/g，产品中未检出；单核细胞增生李斯特菌在原料和产品中均未检出。液熏加工过程中，原料鱼中的微生物随着清洗、腌渍、液熏、干燥等加工过程的进行，微生物呈现出逐渐减少的趋势。烟熏液中各种有机酸、酚类、醛类及其衍生物等具有杀菌能力，起到杀菌防腐作用。
六、苯并（α）芘含量的分析
为了进行对比，测定了两种液体烟熏液L-SMOKE1和L-SMOKE2，液熏罗非鱼片产品和传统木粒烟熏罗非鱼片产品中苯并（α）芘的含量，结果见表5-12。
表5-12　苯并（α）芘含量的测定结果
由表5-12可知，烟熏液L-SMOKE1、L-SMOKE2和液熏罗非鱼片产品的苯并（α）芘含量分别为0.41 μg/kg、0.52 μg/kg和0.39 μg/kg，传统木粒烟熏罗非鱼片苯并（α）芘含量为3.67 μg/kg。研究结果表明，烟熏液L-SMOKE1、L-SMOKE2和液熏罗非鱼片产品及传统木粒烟熏罗非鱼片的苯并（α）芘含量低于我国国家标准限量。但传统木粒烟熏产品因加工工艺过程复杂，难以实现精确控制而存在质量不稳定的问题；而液熏产品和烟熏液中苯并（α）芘含量低，生产的产品质量稳定，易于实现机械化控制和工业化生产。
七、液熏罗非鱼片产品品质评价方法
按液熏工艺通过调整工艺参数生产得到的液熏罗非鱼片产品，测定产品的水分含量（WC）、脂肪含量（FC）、灰分（AC）、蛋白质含量（PC）、盐度（NC）和pH等主要成分含量和理化指标，并对色泽（CL）、烟熏味（SK）、酸味（SR）、咸味（ST）、组织（TT）和总分（TS）进行感官评价，结果见表5-13。
表5-13　液熏罗非鱼片产品主要成分含量和感官品质评分
将主观感官评价结果与客观理化指标结果相结合，通过对数据采用SPSS进行分析，确定了感官评价指标与理化指标的相关性，如表5-14所示。
表5-14　熏罗非鱼片主要成分含量与感官品质的相关性（r/p）
液熏罗非鱼片的主要成分与感官评分回归分析如表5-15所示。由表5-15可以看出，色泽、烟熏味、组织和总分的回归方程达到显著相关水平，表明方程能较好地反映与液熏罗非鱼片产品相关的色泽、烟熏味、组织方面的感官评价；酸味和咸味是理化指标的函数，但没有表现出相关性。
表5-15　熏罗非鱼片主要成分含量与感官品质的回归分析
第三节　液熏罗非鱼片在不同贮藏条件下的品质变化
一、感官的变化
液熏罗非鱼片在贮藏期间的感官会随保存时间的延长而变化，主要在色泽、气味、质地、外观等方面，这是由于微生物及化学变化引起的。按照感官评定标准表，等级在4分及4分以上为感官评定终点，即产品变质。评定结果见表5-16。
表5-16　液熏罗非鱼片在不同贮藏条件下的保质期
由表5-16所示结果可知，液熏罗非鱼片腐败的发生受贮藏温度的影响较大，5 ℃下贮藏较25 ℃明显变慢。包装方式对腐败的发生也有一定的影响，如真空包装可推迟腐败，其产品的货架期为普通包装产品的1.5～3.0倍，这与Gram等的研究结果一致。液熏罗非鱼片在15 ℃及25 ℃贮藏下，普通包装达到感官评定终点时间分别为20 d和4 d，真空包装达到感官评定终点时间分别32 d和11 d，其中普通包装产品在贮藏后期易长霉菌，如25 ℃普通包装产品放置3 d表面出现白斑，15 ℃普通包装产品12 d后表面长有小白点，这是因为空气中的霉菌孢子无处不在，特别是阴暗潮湿的地方，因此，生产车间的杀菌消毒对产品质量的影响是很大的。液熏罗非鱼片在5 ℃贮藏时变质速度缓慢，真空包装产品存放5个月除色泽加深外未见有任何变质迹象，而普通包装产品存放5个月也只略有腐败味。这不仅与鲜罗非鱼在0℃、5℃、10℃、15 ℃贮藏货架期分别为20d、9.5d、5d和2.5 d相比，液熏罗非鱼片的货架期延长了7～60倍，而且与已见报道的热熏、液熏或冷熏真空包装三文鱼冷藏货架期不超过50 d相比，液熏罗非鱼片的货架期也延长了3倍，这一方面与腌制、冷藏及真空包装有效地抑制了大部分微生物的生长，从而降低了产品的腐败速度有关，另一方面熏制过程本身对鱼体油脂水解影响很小，可减缓油脂的氧化有关，但考虑到5 ℃时真空包装液熏罗非鱼片在贮藏过程中色泽、光泽及质地的变化，建议其保存期定为60 d。
二、TVB-N值的变化
TVB-N指标是鉴定鱼鲜度的经典指标。液熏罗非鱼片在25 ℃、15 ℃及5 ℃贮藏条件下TVB-N值的变化如图5-3所示。
图5-3　液熏罗非鱼片在不同贮藏条件下TVB-N值的变化
由图可见，在25 ℃贮藏下，无论是普通包装还是真空包装，TVB-N值的变化均较快，几乎成直线上升。而15 ℃贮藏的产品，TVB-N值的变化相对较慢，在8 d以内，无论何种包装TVB-N值均保持在15mg/100g左右的较低水平，8 d后普通包装产品才开始明显上升，而真空包装产品20 d后才迅速增长。在5 ℃贮藏条件下，5个月的保藏过程中，普通包装与真空包装产品的TVB-N值变化均缓慢，其中普通包装产品在贮藏4个月后TVB-N值才变化较快，5个月时TVB-N值已接近初期腐败点30mg/100g，而真空包装产品TVB-N值在整个试验过程中变化不大，试验结束时TVB-N值为15.7mg/100g，仅比贮藏0 d时的13.19mg/100g上升2.51mg/100g。在25 ℃、15 ℃及5 ℃贮藏条件下，无论何种包装，TVB-N值达到初期腐败值的天数与感官评定所得的天数基本一致。鱼片贮藏过程中，TVB-N值增大是因为鱼肉中酶和微生物共同作用分解蛋白质，不断产生氨及胺类等碱性含氮物质所致。
三、细菌总数的变化
食品在贮藏过程中，微生物是造成食品腐败变质的最主要因素，其次是食品中的内源酶引起的腐败变质。液体烟熏液的主要成分是有机酸、酚、醛和酮等有机化合物，可有效地抑制腐败微生物的增长及有关的酶促反应。图5-4是液熏罗非鱼片在25 ℃、15 ℃及5 ℃贮藏条件下细菌总数的变化趋势。
图5-4　液熏罗非鱼片在不同贮藏条件下细菌总数的变化
由图5-4可知，产品在贮藏期间细菌总数随保藏时间的延长总体呈上升趋势，温度越高，细菌总数的增加越迅速。包装方式对细菌总数的变化也有一定影响，真空包装产品比普通包装产品上升慢，温度越低，这种作用越明显。
产品存放初期，细菌总数增长较缓慢，这是因为液体烟熏液的主要成分是有机酸、酚、醛和酮等有机化合物，具有抑制微生物生长、增强制品贮藏性的作用，产品在放置过程中，随着液体烟熏液的缓慢渗透，鱼肉表面及肌肉内部的微生物逐渐被抑制，甚至被杀灭，但产品烟熏时间短，所吸收的烟熏液量较少，温度越高，抑菌效果越差，所以随着时间的推移，细菌总数仍会继续增长。由图5-4也可得出，25 ℃和15 ℃普通包装、真空包装及5 ℃普通包装产品到达初期腐败时得到的菌落总数基本一致，均达到106～107CFU/g，而5 ℃真空包装产品在整个试验过程中细菌总数没有太大的变化，基本维持在104～105CFU/g，但这与Sernapesca及Truelstrup等的研究结果有所不同，Sernapesca的研究表明细菌总数在1×105～5×105CFU/g时产品质量不可接受，而Truelstrup等发现冷熏三文鱼的细菌总数高达108CFU/g时仍没有腐败。不过Gibson及Rorvik等发现，细菌总数作为考查产品品质的一个指标，却与产品感官质量和货架期没有相关性（P>0.05）。另外，由于鱼肉中所含的液体烟熏液浓度低，不足以长时间抑制霉菌的生长，也导致了25 ℃和15 ℃普通包装产品腐败的加速。
四、pH的变化
一般活鱼肌肉的pH为7.2～7.4，鱼死后随着酵解反应的进行，pH逐渐下降，白肉鱼pH最低可降到6.0，罗非鱼片属于白肉鱼，试验测得罗非鱼片原料pH为6.5，而产品在贮藏过程中pH的变化如图5-5所示。
图5-5　液熏罗非鱼片在不同贮藏条件下pH的变化
图5-5显示了液熏罗非鱼片在不同贮藏条件下pH的变化。罗非鱼片经过加工后测定，pH为5.6，与原料相比下降了0.9。这是因为盐腌后鱼片细胞内部溶液电离强度增强，并且试验所选用的液体烟熏液pH为2～3，才导致产品的pH急剧下降。贮藏过程中，由图5-5可以看出，在25 ℃、15 ℃及5 ℃3种贮藏温度下，普通包装和真空包装产品的pH变化趋势相似，先高后低再上升，然后变化趋于平缓的过程。这是由于在贮藏初期，肉的腐败变质主要是因为肉表面的腐败性细菌将蛋白质分解为氨、三甲胺等挥发性物质，从而引起pH的增长。大多数微生物的最适生长pH在5.5～8.5，而随着贮藏时间的延长，乳酸菌开始缓慢增长并产生乳酸使pH降低，从而抑制了其他微生物的繁殖，乳酸菌也逐渐成为贮藏过程中的优势菌，并使产品的pH基本维持稳定。
五、色泽的变化
1.L*值的变化趋势及其与贮藏时间（T）的关系
由图5-6可以看出，在5 ℃、15 ℃和25 ℃贮藏条件下，普通包装产品L*值的变化趋势均为先上升，稳定一段时间后再下降，然后又趋于平缓，其达到最佳色泽的时间分别为30 d、4 d和2 d，色泽稳定时间分别为90 d、12 d和4 d，最佳色泽L*值范围为46～49；而真空包装产品L*值的变化趋势为先平缓下降，贮藏一段时间后迅速下降，之后变化不明显，其中平缓下降时间段分别为60 d、12 d和6 d。在同一贮藏时间及贮藏温度下，真空包装比普通包装L*值下降快，且L*值变化显著相关（P<0.05）；在相同贮藏温度和相同包装条件但不同贮藏时间下L*值的变化也显著相关（P<0.05）。随着贮藏时间的延长，氧化反应达到饱和，其对色泽的影响将小于产品因脱水而引起的色泽加深，因此，在试验终点时，25 ℃普通及真空包装产品的L*值高于5 ℃及15 ℃，15 ℃普通及真空包装产品的L*值高于5 ℃。5 ℃真空包装产品的L*值在贮藏5个月后降到36.08，色泽为深棕褐色，因此，单纯从色泽来看，会大大降低消费者的购买需求。
图5-6　液熏罗非鱼片在不同贮藏条件下L*值的变化
对L*值与产品贮藏时间（T）进行逐步回归分析，采用Stepwise变量筛选方法：进入概率小于0.05，移出概率大于0.1。按照此标准，分析5 ℃、15 ℃和25 ℃贮藏条件下L*值与产品贮藏时间（T）之间的关系（图5-7）。回归分析结果表明，虽然相关分析中3种贮藏温度下普通及真空包装L*值变化都呈显著相关，但只有真空包装产品的L*值符合上述条件，可进入线性模型。5 ℃、15 ℃和25 ℃贮藏条件下真空包装产品L*值与贮藏时间（T）之间的线性关系分别为：L*5=-2.234T+47.086，P＜0.01；L*15=-0.257T+46.181，P＜0.01；L*25=-0.442T+46.775，P＜0.01。因此认为，只有在真空包装条件下产品的L*值与贮藏时间（T）有较好的线性拟合度，能较好地反映产品的L*值随时间的变化趋势。
图5-7　L*-T散点图与回归直线
2.a*值的变化趋势及其与其贮藏时间（T）的关系
由图5-8可知，从总体上来看，液熏罗非鱼片在贮藏期间，不同贮藏温度及不同包装方式下，其a*值的变化虽无规律但基本维持在一定的范围内（a*=8～11）。罗非鱼属于白肉鱼，鱼片自身的a*值很低，接近0，因此，对产品的a*值影响很小，产品的a*值大小完全由烟熏液在鱼片表面的着色情况来决定，鱼片表面着色均匀且烟熏液吸收较多者，a*值较高，相反则较低。试验表明，对于同一批次产品来说，a*值相差不大，而且在贮藏过程中，由于氧化反应和脱水作用，L*值和b*值均明显下降，但a*值下降不明显；另外，统计分析结果也表明，同一贮藏温度下，普通包装与真空包装无相关性（P>0.05）。
图5-8　液熏罗非鱼片在不同贮藏条件下a*值的变化
对a*值与产品贮藏时间（T）进行逐步回归分析，采用Stepwise变量筛选方法。回归分析结果表明，a*值与产品贮藏时间（T）无相关性关系。
3.b*值的变化趋势及与贮藏时间（T）的关系
由图5-9可知，不同贮藏温度及不同包装方式下，液熏罗非鱼片在贮藏期间其b*值的变化规律与L*值基本一致，也是先上升，稳定一段时间后再下降，然后又趋于平缓。在同一贮藏时间及贮藏温度下，真空包装比普通包装b*值下降快，且b*值显著相关（P<0.05）；而在相同贮藏温度及相同包装条件下，b*值的变化也显著相关（P<0.05）。
图5-9　液熏罗非鱼片在不同贮藏条件下b*值的变化
对b*值与产品贮藏时间（T）进行逐步回归分析，采用Stepwise变量筛选方法。回归分析结果表明，与L*值的结果一样，也只有真空包装产品的b*值与产品贮藏时间（T）有较好的线性拟合度（图5-10）。5 ℃、15 ℃和25 ℃贮藏条件下真空包装产品b*值与贮藏时间（T）之间的线性关系分别为：b*5=-2.589T+24.592，P＜0.01；b*15=-0.338T+25.145，P＜0.01；b*25=-0.770T+26.264，P＜0.01。
图5-10　b*-T散点图与回归直线
六、质构的变化
质构与食品的外观、风味、营养，一起构成食品的四大品质要素，是决定食品总体可接受性的一个重要因素。以下从硬度、粘牙性、咀嚼性、黏聚性、弹性五个方面来描述液熏罗非鱼片在不同贮藏条件下质构的变化。表5-17至表5-19显示了液熏罗非鱼片在5 ℃、15 ℃和25 ℃贮藏条件下质构的变化。
由表5-17可知，在5℃贮藏时，普通包装产品的硬度、粘牙性、咀嚼性的变化趋势表现为前2个月迅速上升（P<0.05），维持一段时间后（第3个月）开始缓慢下降（P>0.05）；弹性总体趋势上升，但变化不明显（P>0.05）；黏聚性在试验后期才变化显著（P<0.05）。真空包装产品在前2个月时硬度、粘牙性、咀嚼性、黏聚性的变化趋势与普通包装一致，也是迅速上升（P<0.05），之后3个月各参数数值稍有下降，但基本维持稳定（P>0.05），弹性则先下降再上升，但变化均不明显（P>0.05）。在贮藏试验结束后期，普通包装与真空包装产品的咀嚼、黏聚性显著相关（P<0.05），而粘牙性、硬度和弹性没有相关性（P>0.05）。
表5-17　液熏罗非鱼片在5℃贮藏条件下质构的变化
由表5-18可知，在15 ℃贮藏时，普通包装与真空包装产品的硬度、粘牙性、咀嚼性、黏聚性变化趋势均先上升后下降，变化较显著（P<0.05），弹性总体趋势上升，变化不明显（P>0.05）。其中普通包装产品的硬度、粘牙性、咀嚼性、黏聚性在贮藏后期与相同贮藏时间真空包装产品显著相关（P<0.05），而弹性没有相关性（P>0.05）。
表5-18　液熏罗非鱼片在15 ℃贮藏条件下质构的变化
由表5-19可知，在25 ℃贮藏时，普通包装产品只有咀嚼性、黏聚性在腐败初期时显著下降（P<0.05），弹性缓慢上升（P>0.05），而硬度、粘牙性几乎无变化。真空包装产品的硬度、粘牙性、咀嚼性先上升再下降，变化显著（P<0.05），黏聚性在贮藏6 d后开始显著下降（P<0.05），弹性总体趋势缓慢上升（P>0.05）。其中普通包装产品的硬度、粘牙性、咀嚼性、黏聚性在贮藏3 d后与相同贮藏时间真空包装产品显著相关（P<0.05），而弹性没有相关性（P>0.05）。
表5-19　液熏罗非鱼片在25 ℃贮藏条件下质构的变化
液熏罗非鱼片在相同温度下贮藏时，真空包装产品的质构指标优于普通包装产品，这与真空包装产品的出水率高、腐败变质慢有关。在相同包装方式下贮藏时，温度越低，产品变质速度越慢，贮藏时间越长，烟熏液在鱼片肌肉内渗透越充分、均匀，其低酸性可抑制鱼肉中破坏结缔组织自溶酶的活性，使得产品的质构维持在可接受范围内的时间越长。
对质构参数（硬度、粘牙性、咀嚼性、黏聚性）与产品贮藏时间（T）进行逐步回归分析，采用Stepwise变量筛选方法。回归分析结果表明，虽然差异显著相关性分析中3种贮藏温度下普通（25 ℃普通包装除外）及真空包装的硬度、粘牙性、咀嚼性、黏聚性等变化都呈显著相关，但没有哪一项质构参数与贮藏时间的拟合度好，其P值均大于0.05，均不可建立模型。由此可见，没有某一个质构参数能够单独反应产品质量的变化，所有的质构参数均有贡献。
第四节　液熏罗非鱼片加工过程微生物群落的PCR-DGGE分析
一、熏制加工主要环节的鱼片pH、TVB-N值及细菌总数变化
如表5-20所示，pH在着色后和熏制后都突然下降，细菌总数也在着色后骤减，因为着色液和烟熏液都呈强酸性，对细菌的生长影响很大。进一步的分析也表明着色不仅影响微生物的数量，还影响其多样性。TVB-N值在整个过程并没有太大的变化。TVB-N是指示鱼类鲜度的指标，由此看来液熏加工不会使鱼的鲜度发生太大的改变。
表5-20　液熏加工主要环节罗非鱼片的pH、TVB-N值以及细菌总数的变化
表5-20　液熏加工主要环节罗非鱼片的pH、TVB-N值以及细菌总数的变化（续）-1
二、DGGE图谱的分析
1．细菌16S rDNA的V6-V8可变区的PCR结果
提取样品（Ⅰ～Ⅵ）的细菌总DNA，经1%琼脂糖凝胶电泳检测后见图5-11（a），用16S rDNA的V6～V8可变区引物（带GC夹子）进行PCR扩增，扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，获得约430 bp左右的特异性扩增条带［图5-11（b）］，由图5-11（a）可看出，样品Ⅰ和Ⅱ得到的细菌的总DNA能聚集成带，其他样品不能，说明Ⅰ和Ⅱ的菌量明显比其他样品多，这与上述结果符合，但从图中可看出所有样品的DNA的提取都是成功的，细菌总DNA片段在15kb以上。从图5-11（b）可看出，该试验的PCR扩增条件是合适的，可用于后续的DGGE电泳分析。
图5-11　样品中细菌总DNA提取电泳图（a）和16SrDNA的V6-V8可变区PCR扩增产物电泳图（b）
2．液熏各环节样品DGGE图谱的条带分析
各样品PCR产物经DGGE后的指纹图谱见图5-12。样品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ分别在DGGE图谱上产生8条、7条、5条、6条、4条、6条可以鉴别的条带，条带的位置如图5-12所示。DGGE图谱上不同条带代表不同的微生物种类；条带的亮度代表微生物的数量，条带越亮则微生物的数量越多。由图5-12可知，原料样品Ⅰ形成的条带最多，腌渍后样品Ⅱ形成的条带和Ⅰ的条带种类和亮度都基本一致，而着色以后，大部分条带都明显暗淡甚至消失，只有一些以优势条带的形式出现，说明着色对微生物的抑制作用强于腌渍。从前面的结果还可看出，着色和熏制使样品的细菌总数骤减，与pH的降低有很大的关系。着色液和烟熏液都为强酸性物质，大多数细菌生长的最适pH范围在7.0左右，pH向7两端偏移时，微生物生长和繁殖能力减弱，种类减少。另外，由于着色液和烟熏液含有的杀（抑）菌成分，包括多酚类化合物，有机酸、羰基化合物等也影响微生物的生长。
图5-12　液熏罗非鱼片在生产各环节细菌的DGGE图谱
DGGE图谱显示一些条带如3和8存在于液熏罗非鱼片从原料到成品的整个加工过程。而一些条带只存在于加工过程的前几个环节，却随着加工的进行而彻底消失，说明该加工环节对这些菌种有强烈的抑制作用，如腌渍使条带2代表的菌种消失、而着色使条带7代表的菌种消失。还有条带1、4、5、8、9、10呈间断性出现，这可能是这些条带代表的菌种更耐受加工，作为非优势种其实在出现之前也存在，只是浓度达不到DGGE的检测范围，所以不能形成可观察条带。在某个加工环节使一些优势菌种消失以后，整个微生物群落的菌种间的比例发生改变，优势菌种发生了更迭，于是这些菌种能在后续加工环节的条带上显示出来，甚至形成了亮度较亮的优势条带，充分说明液熏加工使微生物群落产生了动态的变化。成品所形成的条带有1、3、4、5、8、9，这些菌种是能耐受整个加工过程而存活下来的，它们中有些菌种将可能形成特定腐败菌（SSO）而对产品的货架期造成影响。
3．液熏各环节罗非鱼片DGGE图谱的条带半定量分析
通过LabImage软件对16S rDNA-DGGE指纹图谱各条带光密度进行分析，液熏各环节罗非鱼片泳道优势条带相对丰度见表5-21。由表5-21可知，各泳道中均不存在明显的主带与次带之分，条带5为大部分样品的优势条带。
表5-21　PCR-DGGE指纹图谱中液熏各环节罗非鱼片细菌优势条带相对丰度
表5-21　PCR-DGGE指纹图谱中液熏各环节罗非鱼片细菌优势条带相对丰度（续）-1
4．液熏各环节罗非鱼片菌群16S rDNA-DGGE指纹图谱的聚类分析
细菌16S rDNA的V6～V8区片段的DGGE指纹图谱数据经MVSP软件分析后，得出的UPMGA聚类分析图见图5-13。由图5-13可知，所有样品的细菌群落总体结构相似性仅为64%。Ⅰ和Ⅱ，Ⅲ和Ⅳ，Ⅴ和Ⅵ分别聚成一簇，显示这些样品的微生物群落较为相似，但其中相似度最高也仅达到80%，说明相邻加工环节中的微生物种类有一定的相似性但并不完全一致，然而随着进一步加工的进行，细菌群落结构产生了更大的差异。
图5-13　液熏加工各环节罗非鱼片细菌16S rDNA的PCR-DGGE指纹图谱UPMGA聚类分析图
三、DGGE主要条带的克隆测序及序列比对结果分析
从DGGE凝胶上切下10个主要条带，经过克隆后测序，得到10个条带的主要序列经Genbank比对后的结果列于表5-22，10个序列及相关序列构建的种系发生树见图5-14。从种系发生树上可知，所获得的序列及相关序列分属于4个门，分别是变形菌门（Proteobacteria）、硬壁菌门（Firmicutes）、疣微菌门（Verrucomicrobia），放线菌门（Actinobacteria），其中变形菌门细菌占70%，是液熏罗非鱼片中最主要的细菌种类。与10个序列最为相似的序列的科属如下：其中变形菌门的细菌主要包括肠杆菌目细菌（Enterobacteriales）和其下的若干属：肠道细菌属（Enterobacter）布特菌属（Buttiauxella）和Aranicola sp.，此外，还有假单胞菌属（Pseudomonas）、弧菌属（Vibrio）。硬壁菌门的细菌主要包括巨型球菌属（Macrococus），还包括放线菌门的微球菌属（Micrococcu）和疣微菌门的突柄杆菌属（Prosthecobacter）。根据比对和构建发生树的结果显示，属肠杆菌科的有条带1，4，5，6，9代表的菌种，其中条带1只能确定为肠杆菌科细菌，5为布特菌属，6和9为肠道细菌属，而4为Aranicola sp.。此外，7为弧菌属细菌，8为假单胞菌属细菌，2则为疣微菌门的突柄杆菌属，3可能为巨型球菌属，而10可能为微球菌属，据此可知，液熏罗非鱼片中存在着丰富的微生物多样性。
表5-22　DGGE图谱优势条带的序列比对结果
图5-14　10个主序列与一些相似序列与Neiborjoining方法构建的种系发生树
第五节　液熏罗非鱼片在贮藏过程中菌相变化分析
一、液熏罗非鱼片在贮藏过程中微生物生长情况
1．液熏罗非鱼片贮藏与微生物培养
罗非鱼片进行液熏加工，抽真空包装后，在25℃条件下进行贮藏试验，取样时间为第0～7天及第9天，样品分别记为D0、D1、D2、D3、D4、D6、D7、D9。
按《食品卫生微生物学检验标准》（GB/T 4789－2003）操作方法进行。各种培养基的培养条件见表5-23。
表5-23　各种菌培养条件
2．液熏罗非鱼片在贮藏过程中微生物生长情况分析
液熏罗非鱼片经真空包装在25 ℃贮藏下，在选择性培养基上的生长变化情况如图5-15所示。产品经过液熏加工处理及真空包装后，仍有部分的微生物存活下来，产品的初始细菌总数为102～103CFU/g，初始时，乳酸菌的数量很少，肠杆菌的数量与细菌总数相当，还有少部分的假单胞菌。0～1 d，各种菌的增长都很缓慢，贮藏期的第二阶段（2～6 d），细菌总数开始急剧增加，各种菌都渐渐进入对数增长期，但各种菌的生长情况开始表现出差异。乳酸菌的增长速度最快，到第4天就达到了2.40×107CFU/g，甚至超过了总菌落数，这是因为培养条件的差异，有些菌在其适合生长的选择性培养基上比在普通营养琼脂培养基上生长得更好，而且可看出乳酸菌为整个贮藏期的优势菌，因为其增长情况和数量都与细菌总数接近。从细菌总数，乳酸菌总数的变化表明，乳酸球菌适合在液熏罗非鱼片中生长，是其中的优势菌。
图5-15　25 ℃贮藏过程中各种菌群在选择性培养基的数量变化
肠杆菌在1d以后也有所增长，到第2天达到了最大值，但最大值也只有104CFU/g左右，随后就处于下降状态。肠杆菌科的细菌优先利用肉中葡萄糖、糖元等化合物，待碳水化合物被消耗殆尽的时候，才利用蛋白质等含氮化合物。液熏罗非鱼片中微生物之间相互抑制和竞争，影响了肠杆菌科细菌的生长。假单胞菌的增长和肠杆菌类似，但数量却一直很少，因为假单胞菌本身是好氧菌，在缺氧情况下很难生长，且生长也受到了其他细菌的抑制。到了第三阶段（6～9 d），细菌总数和乳酸菌总数都开始趋于平稳甚至缓慢下降，这是因为微生物的大量生长和繁殖，营养物质也被快速地消耗，一部分不适宜环境的微生物开始衰亡。而这个阶段，肠杆菌和假单胞菌数量反而会有所上升，可能是由于乳酸菌的数量开始下降，对它们的抑制能力减弱，这些菌群又重新获得了生长的空间。
二、液熏罗非鱼片变性凝胶电泳图谱分析
1．细菌16S rDNA的V6～V8可变区PCR扩增结果
各样品的细菌总DNA经PCR后的琼脂糖电泳图见图5-16。通用引物对968F/1401R对各样品中的微生物16S rRNA基因均产生了较好的扩增。由图5-16可见，各组样品均有较亮的带，扩增产量大，且无明显副带或拖带，说明各样品总DNA提取成功且PCR扩增条件是合适的。
图5-16　样品中细菌16S rDNA的V6～V8可变区的PCR扩增产物电泳图
2．液熏罗非鱼片变性凝胶电泳图谱分析
（1）贮藏过程中样品DGGE图谱的条带分析
PCR产物经DGGE后形成的指纹图谱见图5-17，共产生13个条带，8个样品在DGGE图谱上分别产生9条、10条、7条、5条、7条、6条、8条和7条可鉴别的条带。从图5-17可以看出，条带1～3只在贮藏的早期和末期出现，而在中期几乎不出现，条带4和5也呈现了类似的变化，只不过在末期也几乎观察不到，只在早期呈现了比较清晰地条带，而这5条条带除了在早期比较明显外，其他时期都比较微弱甚至观察不到，可见这5条条带代表的菌种在贮藏期间逐渐被抑制。条带6～8出现在贮藏的任何时期，其中条带7和8在早期的亮度很弱，其余时期都处于较亮的状态，说明了这2条带代表的菌种可能是贮藏过程中的优势菌，也可能是导致鱼片腐败变质的SSO。优势腐败菌初始可能只占总群落很少部分，但后期却能以极快的速度生长繁殖而导致产品的腐败。而条带6则一直处于较亮的状态，也可能是优势菌之一。而条带6和8在末期时，有时会出现条带间断性减弱的现象，这个原因可能是末期那些没完全被抑制住的菌种又重新获得生长空间，使菌群的比例发生了改变而导致。条带10也一直存在于贮藏期的所有时期，只不过亮度很暗而且亮度变化不明显，表明它是一种非优势菌但它的生长不受其他优势菌的影响。条带11只在贮藏的末期出现，条带13只出现在早期，而条带12则呈间断性出现，可能是由于贮藏期的菌相变化是个复杂的过程，菌群间的种类和比例随着贮藏时间的延长不断发生变化。
图5-17　液熏罗非鱼片在25℃下贮藏细菌的DGGE图谱
（2）各加工工序DGGE指纹图谱的聚类分析
根据PCR产物经DGGE后形成的指纹图谱见图5-18，以“1”和“0”记录条带的有无。得到用于指纹图谱聚类图分析的电泳模式见表5-24。
表5-24　贮藏过程中细菌DGGE电泳模式图
条带数据经MVSP软件分析后，得到的UPMGA聚类分析见图5-8所示。由图5-18可知，样品按相似性分类主要聚成两簇，代表贮藏前期的D0和D1以及末期的D6、D7和D9聚成了一簇，而中期的D2、D3、D4聚成一簇，由条带的数目可以知道，整个贮藏期微生物的多样性呈现由多到少再到多的变化过程，这与细菌总数的趋势恰好相反，中期的菌相变得单一，这是因为微生物在特定环境中生长存在相互拮抗的过程，一些能耐受环境的变化而逐渐发展壮大的细菌会抑制住其他细菌，这些菌往往能导致食品的腐败，有些成为食品的特定腐败菌SSO，但到了贮藏末期，由于优势菌的逐渐衰退，那些被抑制住的菌群又重新获得了生长空间，从而使末期的菌相又重新变得复杂起来。Leroi于1998年研究冷熏三文鱼菌相变化表明，在贮藏早期为革兰氏阴性杆菌，如肠杆菌，贮藏中期以肉食杆菌为主，而贮藏末期菌相复杂，为多种乳酸菌的混合。
图5-18　液熏罗非鱼片在25 ℃下贮藏细菌16S rDNA的PCR-DGGE指纹图谱UPMGA聚类分析图
（3）DGGE主要条带的克隆测序及鉴定结果分析
从DGGE图谱上选取13条清晰可见条带进行切割回收，回收片段经扩增、连接及克隆后测序，得到13个条带的主要序列，条带序列如表5-25所示，经Blast比对后，在Genbank中共挑取25种相似的菌种（表5-26）。
表5-25　细菌DGGE指纹图谱上优势条带的序列
表5-25　细菌DGGE指纹图谱上优势条带的序列（续）-1
表5-25　细菌DGGE指纹图谱上优势条带的序列（续）-2
表5-26　细菌DGGE指纹图谱上优势条带的序列分析
表5-26　细菌DGGE指纹图谱上优势条带的序列分析（续）-1
由于条带3、9和11在Blast上比对得到的相应序列的最大相似性较低（<90%），结果不可靠，最后选取除这3个序列以外的10个序列及相关序列构建种系进化树，用ClustalX进行同源性比对后，经Mega软件构建的种系进化树如图5-19所示。
图5-19　10个主序列与一些相似序列与Neibor-joining方法构建的种系进化树
由图5-19可以看出，条带6和12聚合在一起，它们又同时和戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）相似，条带10与明串珠菌（Leuconostoc）相聚，而条带8则与乳球菌属下的两个种：乳酸乳球菌乳酸亚种（Lactococcus lactis subsp.lactis）和格氏乳球菌（Lactococcus garvieae）都相似，故只能确定为乳酸球菌属。上述几种条带代表的菌种都与厚壁菌门下的乳酸杆菌目的细菌相似，戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）属于乳杆菌科，乳酸乳球菌乳酸亚种（Lactococcus lactis subsp.lactis）和格氏乳球菌（Lactococcus garvieae）属于链球菌科，而Leuconostoc则属于明串珠菌属，这些菌通常统称为乳酸菌（LAB），但其实是很多种菌的综合，LAB常常出现于各种真空包装的食品中。条带4和条带7皆与梭菌（Clostridium）相似，梭菌也是厚壁菌门（Firmicutes）的细菌。所以这些条带所代表的菌种在进化树都聚属厚壁菌门（Firmicutes）的细菌。
条带1与肠杆菌属细菌（Enterobacter sp.）聚成一簇，条带2也与肠杆菌属（Enterobacter sp.）相似。条带13则与假单胞菌属（Pseudomonas）相似，肠杆菌属（Enterobacter）和假单胞菌属（Pseudomonas）都属于变形菌门（Proteobacteria），所以在进化树上聚成一簇。
DGGE法是种比较客观的分析微生物群落的方法，从图谱中可以直观地根据条带的明暗而区分出优势菌和非优势菌，并且菌相的组成变化也可以直接根据图谱看出。从上面的分析可知，优势菌种有条带6代表的戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus），条带7代表的梭菌（Clostridium）以及条带8代表的乳酸球菌（Lactococcus），其中Pediococcus pentosaceus和Lactococcus都属于乳酸菌（LAB）。这些条带在图谱上除了贮藏的早期和末期稍暗外，在中期一直是属于亮条带。条带1和2代表的肠杆菌属在图谱上则表现出了由亮到暗再到稍亮的变化，乳酸菌和肠杆菌在图谱上的变化与其在选择性培养基上的数量呈现的变化相类似。但是梭菌在加工过程中的分析没有出现，此时却一开始就呈现出亮条带，一方面可能是因为梭菌是专性厌氧菌，因为生产过程是充分暴露于空气中，这不利于梭菌的存在，其量未达到DGGE的检测范围，因此无法检测到，乳酸球菌也可能因为同样的原因而在生产过程中没有检测到，生产过程中检测到的菌均是好氧菌如肠杆菌、巨型球菌、假单胞菌等；另一方面，加工过程中未被检出的菌出现在贮藏过程中的DGGE谱带中，可能是由于DGGE的共迁移现象引起的，即不同的DNA条带在DGGE胶中可以迁移到同一位置。因此，单一的DGGE条带可能含有不止一种序列。有些时候，即便是序列差异较大的片段，它们的解链行为和迁移位置也相似，无法在DGGE胶上得到有效分离。
第六节　液熏罗非鱼片优势菌的分离、鉴定及其性质
一、优势菌的分离
从贮藏末期选择性培养基中，选取菌落数为70的营养琼脂平板（一般选取生长有30～100个的平板），观察其菌落形态、革兰氏染色后显微镜下观察细胞形态，分出接近乳酸球菌形态特征的34株，每株菌平板画线接种到MRS固体培养基上纯化3次，挑取纯化好的菌株接种到MRS肉汤中，28℃下培养24h，挑取菌液接种到MRS琼脂斜面培养基上。
二、优势菌16SrDNA的扩增
选择通用引物968F/1401R对编号为A、B、C、D、E、F的6株菌株DNA进行扩增，如图5-20所示，
图5-20　优势菌株DNA的PCR反应结果
各组样品均有较亮的条带，扩增量大，无明显副带或拖带，说明各样品DNA提取和扩增是成功，可以进行克隆和测试。
三、优势菌株的鉴定
优势菌株的DNA测序及Blast部分比对结果列于表5-27和表5-28。从表5-27可看出，6株菌与Lactococcus lactis subsp．的相似度都达到了98%以上，可以确定这6株菌均为乳酸乳球菌亚种（Lactococcus lactis subsp.），鉴定结果表明乳酸乳球菌是真空包装液熏罗非鱼片中的优势菌。
表5-27　优势菌株的序列
表5-27　优势菌株的序列（续）-1
表5-28　优势菌株的Blast比对结果
表5-28　优势菌株的Blast比对结果（续）-1
将这6株菌株型DNA序列与已经鉴定出的乳酸球菌（图5-19中的条带8）序列用Mega软件进行比对并构建聚类图（图5-21），从图5-21中可以看出，在6株菌中，菌株A和菌株D与条带8的关系最近，故选择菌株A和菌株D进一步生理生化鉴定和其他试验，并将菌株A和D命名为Lac A和Lac D。
图5-21　6株菌DNA序列与条带8序列的进化树图
四、优势菌株生理生化反应结果分析
优势菌株Lac A和Lac D的生理生化反应结果列于表5-29，优势菌株为革兰氏阳性球菌，Lac A和Lac D的显微镜下细胞形态为形状呈椭圆形，成对或成链状排列。细胞形态和生理生化鉴定的结果，与文献对乳酸球菌的描述一致，所以可以确定两株菌为乳酸球菌。
表5-29　优势菌株的生理生化反应结果
表5-29　优势菌株的生理生化反应结果（续）-1
五、优势菌的生长盐度与pH
1．最适生长盐度
优势菌在不同盐度的培养基中生长，培养后测定细菌的OD630列于表5-30。由表5-30可看出，两株菌在盐度为0.5%的NaCl中不生长，在4%的NaCl中可生长，符合乳酸球菌的特点，最适生长盐度为1.5%～2.0%。
表5-30　培养基盐度对优势菌生长试验的吸光度值结果
2．最适生长pH
优势菌在不同pH的培养基中生长情况见表5-31，由于pH8.0以后的MRS肉汤颜色改变，所以以目测法来表示优势菌的生长情况，由表5-31可知，优势菌在pH9.0时能生长，符合乳酸球菌的特点，最适生长的pH为6.0～8.0。
表5-31　培养基pH对优势菌生长试验的目测法结果
3．优势菌的生长曲线
两株菌LacA和LacD在28 ℃及37 ℃下由吸光度值OD630表示的生长曲线如图5-22和图5-23所示。由图中可知，两株菌的不同温度下都表现出了典型的生长曲线，即迟缓期—对数生长期—稳定期—衰亡期，两株菌在37 ℃下比在28 ℃下生长更早进入生长的对数期，约提早2h，但也更早地进入衰亡期，说明此菌更适合在37 ℃下生长。
图5-22　Lac A在不同温度下的生长曲线图
图5-23　Lac D在不同温度下的生长曲线图
第七节　液熏罗非鱼片产品的质量控制
一、加工各阶段微生物消长情况分析
1．环境、加工用水
加工人员、环境、车间及设施、生产设备及生产过程的质量管理与产品质量安全控制应符合《食品安全管理体系水产品加工企业要求》（GB/T 27304）和《水产品加工企业卫生管理规范》（GB/T 23871）的规定。加工用水及制冰用水水质应符合《生活饮用水卫生标准》（GB 5749）要求，细菌总数＜100 CFU/mL。
2．原料及各加工阶段中的微生物消长规律
罗非鱼熏制过程中各个操作步骤的细菌总数如表5-32所示。从表中可知，细菌总数总体呈下降趋势，从原料的2.2×104CFU/g减少到工艺结束时的1.7×103CFU/g，减少率为92.3%，其中腌渍、烟熏液浸渍、干燥和喷雾烟熏对细菌总数影响比较大，减少率分别为：50.7%，13.3%，23.9%和19.9%。由此可看出，腌渍及烟熏加工具有很强的杀菌作用，其中烟熏液的抑菌作用主要在干燥过程中体现，因为干燥过程也是烟熏液的渗透过程。
表5-32　罗非鱼熏制过程中各个操作步骤的细菌总数变化
二、烟熏罗非鱼片HACCP体系的建立
1．烟熏罗非鱼片生产过程危害分析和预防措施
通过对烟熏罗非鱼片加工过程的各工艺步骤进行危害分析，并结合现行的法规性文件《水产食品加工企业良好操作规范》（GB/T 20941）、《食品安全管理体系水产品加工企业要求》（GB/T 27304）及《水产品加工企业卫生管理规范》（GB/T 23871），列出潜在危害，并提出预防措施，确定关键控制点。
通过对烟熏罗非鱼片加工过程的危害分析，确定了原料接收、辅料接收、腌渍、烟熏和成品保存5个工序为关键控制点。烟熏罗非鱼片生产过程危害分析和预防措施见表5-33。
表5-33　烟熏罗非鱼片生产过程危害分析和预防措施
表5-33　烟熏罗非鱼片生产过程危害分析和预防措施（续）-1
表5-33　烟熏罗非鱼片生产过程危害分析和预防措施（续）-2
2．烟熏罗非鱼片产品HACCP计划表
通过对表5-33危害分析中所确定的关键控制点进行重点监控，列出控制对象和关键限值，并提出相应的监控方法、频度、纠偏措施、记录及验证，得到烟熏罗非片产品HACCP计划表（表5-34）。
表5-34　烟熏罗非鱼片HACCP计划表
3．烟熏罗非鱼片HACCP的监控记录
烟熏罗非鱼片生产过程中的监控记录主要有：HACCP规范计划及用于制订计划的支持性文件，如原辅料验收记录、腌制温度和时间记录、烟熏温度和时间记录、成品检验记录以及人员、环境、工器具和设备消毒记录等，通过这些记录来实现对生产的控制与管理。
HACCP体系是国际公认的食品安全中最有效的管理体系，但它不是一个独立的程序，必须以通过建立良好生产规范（GMP）和卫生标准操作程序（SSOP）为基础，通过有效实施这两个程序确保生产环境的卫生控制，然后通过HACCP对可能存在或产生的食品危害和不可接受的危害实施控制。
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第六章　罗非鱼罐头加工技术
第一节　番茄汁罗非鱼硬罐头加工技术
一、罗非鱼块的腌渍方法及最佳腌渍条件
1．腌渍方法的确定
将小规格罗非鱼按大小分类，将个体较大的罗非鱼切成45～55g的鱼块，然后采用干渍法和湿渍法两种方式进行腌渍，结果如表6-1所示。由表6-1可以看出，要达到罗非鱼块含盐量为2.0%的要求，干渍法时间明显长于湿渍法，且干渍法脱水较湿渍法严重；从外观上看，湿渍法使食盐能均匀渗透，更能保护鱼块新鲜的颜色，干渍法影响鱼块外观；鱼块长期与空气接触便会出现“油烧”现象，湿渍法更能避免这种现象的发生。综合来说，湿渍法较干渍法效果好。因此，腌渍方法选择湿渍法（盐水浸渍法）。
表6-1　不同腌渍方法对产品理化和感官影响
2．盐水浸渍法最佳腌渍条件的确定
以水分含量、盐含量及成品得率为指标，试验对盐水浓度和腌渍时间进行了确定。试验结果如图6-1、图6-2和表6-2所示。由图6-1可见，盐水浓度对水分含量的影响呈现先升高后下降的趋势，而盐含量则随盐水浓度的增加而增加。腌渍工艺要求有初步少量脱水的效果，而腌渍鱼块含盐量在2%比较合适。因此，盐水浓度为12%比较合适，此时腌渍罗非鱼块的水分和盐含量分别为74.8%、2.11%。由6-2图可知，当盐水浓度为12%时，随着腌渍时间延长，鱼块的水分含量不断下降，而盐含量则不断增加。根据腌渍工艺对脱水效果及盐含量的要求，9min为合适的腌渍时间，既能达到初步脱水的要求，盐含量也比较合适，为2.18%。
图6-1　盐水浓度对罗非鱼块水分和盐含量的影响（腌渍时间9min）
图6-2　腌渍时间对罗非鱼块水分和盐含量的影响（盐水浓度12%）
由表6-2可知，腌渍得率随盐水浓度、腌渍时间的增加而减少；而一般腌渍脱水越严重，油炸和成品得率相应也越高。以成品得率为主要考察指标，盐水浓度为12%、腌渍时间为9～10min或盐水浓度为13%、腌渍时间为8～9min都可获得较高的成品得率，但13%盐浓度腌渍8～9min，成品咸味较重。最后确定盐水最佳浓度为12%，腌渍时间为9min，此时成品得率高达60.8%。
表6-2　盐水浓度和腌渍时间对成品得率的影响
二、罗非鱼块油炸工艺条件
罗非鱼块经12%盐水腌渍9min后，以水分含量、盐含量及产品品质和油炸得率为指标，确定罗非鱼块的油炸工艺。结果如图6-3、图6-4和表6-3所示。由图6-3可知，同一油炸温度条件下，随着油炸时间的延长，鱼块水分损失量逐渐增加；同一油炸时间条件下，随着油炸温度的上升，水分损失也不断增加。而图6-4表明，在同一油炸温度条件下，随着油炸时间的延长，含盐量整体呈上升趋势；而在同一油炸时间条件下，随着油炸温度的上升，含盐量也不断增加。实际生产中，产品水分含量为40%～50%、盐含量为2.5%～3.0%较合适。因此，综合油炸对产品水分和盐含量的影响，180℃、5min和200℃、4min的油炸条件较合适，产品对应的水分含量分别为50.6%、46.1%，盐含量分别为2.77%、2.72%。
图6-3　油炸对罗非鱼块水分含量的影响
图6-4　油炸对罗非鱼块盐含量的影响
由表6-3可知，当油炸条件为160℃、6min时，产品的色泽、香味达不到油炸产品应有的效果，而且炸后的鱼肉肉质较软、皮黏、骨酥性差；随着油炸温度和时间的提高，产品色泽逐渐加深，由金黄色到深褐色，口感由软到硬，味感由鱼香味变苦味，骨质变酥。当油炸条件为180℃、5min时，产品品质最好，呈现漂亮的金黄色，鱼香味突出、皮脆、骨酥性较好；其次为200℃、4min，产品各方面的品质也较好。从产品得率看，油炸温度越高、时间越长，得率越低，其中180℃、5min和200℃、4min仍能获得较理想的得率。因此，进一步确定油炸最适温度为180～200℃，油炸时间为4～5min。对应的产品如图6-5所示。
表6-3　油炸温度和时间对产品品质和得率的影响
图6-5　不同油炸条件下的产品外观图
三、罗非鱼块回软工艺条件
罗非鱼块经12%盐水腌渍9min并经180℃、5min油炸后，放入预先调配好并已冷却到室温的香料水（香料水制法为：100mL水加入五香粉1.5g、姜粉1.0g、氯化钠3g，加热搅拌沸腾，冷却待用）中进行回软处理，以水分含量、盐含量及产品的品质为指标，确定回软工艺，结果如图6-6和表6-4所示。图6-6表明，回软对产品的水分和盐含量有影响；随回软时间的延长，水分含量依次增加，40s前增加趋势平缓，40s后增加幅度增大；盐含量则呈现先增加后下降的趋势，并在30s达最高值，为3.07%。回软处理对产品品质也有明显影响，未经回软处理的产品品质明显比回软处理的产品差（表6-4）。
图6-6　回软时间对鱼块水分含量和盐含量的影响
表6-4　回软对产品品质的影响
鱼块经油炸脱水后，肉干易产生带渣的口感，且比较油腻，回软处理能明显改善带渣和油腻现象，使鱼肉恢复紧密、细致、清爽的口感；回软还可增加产品的骨酥性。但回软时间过短，则效果不明显，过长则导致鱼肉吸水过多，造成口感糜烂，味道偏淡。因此，综合考虑产品水分含量、盐含量要求及品质，确定最佳回软时间为30s。
四、调味料配方
在预试验基础上，选取番茄汁、白醋、食盐和辅料组合为影响因素采用L16（45）正交试验确定调味料的最佳配比，试验结果和极差分析见表6-5。由极差分析可知，4个因素对产品品质的影响次序是：A（蕃茄沙司的用量）>C（食盐用量）>B（白醋用量）>D（辅料组合量），最佳组合为A2 B2 C4 D4。由于正交试验所得的最佳组合未在正交表的16个试验中，因此，进行追加试验以确定调味料的最终配方，结果表明，最佳组合试验所得产品的综合评分明显高于正交表中分数最高的第7号试验所得产品的综合评分，因此，正交试验所确定的最佳组合即为调味料的最佳配方，具体为（100mL水中添加的量）：65g番茄沙司、3g食盐、2.0mL白醋、10g白砂糖、0.6g胡椒粉、0.6g味精、10mL黄酒、10mL香料水。
表6-5　调味料正交试验结果及极差分析结果（100mL水）
五、杀菌工艺条件
1．不同杀菌条件商业无菌检验及杀菌条件对产品品质的影响
采用高温高压杀菌方法，在不同温度（118℃、121℃）杀菌处理不同时间（20min、25min、30min、35min、40min）后，将产品置于（36±1）℃恒温培养10d，每天观察，10d后统一开罐，进行感官、镜检和培养检验，结果见表6-6。由表6-6可知，除了杀菌条件118℃、20min，118℃、25min，121℃、20min不符合罐头食品商业无菌要求外，其余杀菌条件都满足罐头食品商业无菌要求，且感官检验正常。
杀菌条件对产品色泽、口感、骨酥性等品质的影响见表6-7。由表6-7可知，杀菌条件会明显影响产品的色泽、口感和骨酥性；产品颜色随杀菌温度、时间的增加而加深；杀菌时间对产品口感影响较大，一般杀菌时间超过30min，则口感较差；骨酥性受杀菌时间影响也很大，一般随杀菌时间的延长更为理想，时间临界点为30min，其后骨质太酥。综合考虑表6-6和表6-7的结果，选择118℃、30min，121℃、25min和121℃、30min的杀菌条件，采用ELLAB杀菌过程评估与检测温度F0值记录系统检测其F值，从节能的角度进一步确定最佳杀菌条件。
表6-6　不同杀菌条件商业无菌检验结果
表6-7　不同杀菌条件对产品品质的影响
2．不同杀菌条件F值的测定
采用ELLAB杀菌过程评估与检测温度F0值记录系统，测定罐头中心温度并计算F值，结果如图6-7至图6-9及表6-8所示。罐头内部中心温度随杀菌温度和杀菌时间的增加而增加；同一杀菌温度条件下，杀菌时间越长，F值越大。鉴于节能的要求，同时考虑商业无菌要求和感官品质，最终选择杀菌条件为118℃、30min。
图6-7　118℃、30min杀菌罐头中心温度变化图
图6-8　121℃、25min杀菌罐头中心温度变化图
图6-9　121℃、30min杀菌罐头中心温度变化图
表6-8　不同杀菌条件最高中心温度和F值
六、罗非鱼硬罐头保质期
产品采用118℃、30min杀菌后冷却取出于常温下保存90d，进行微生物、感官、油脂氧化跟踪试验，结果如表6-9、表6-10和图6-10、图6-11所示。杀菌后经常温保存90d，微生物检验未检出细菌，大肠菌群和致病菌检验合格；感官检验也未出现异常现象；油脂过氧化值前50d呈递增趋势，50d后逐渐缓和，维持在0.20g/100g水平，符合国家相应标准；酸价前70d也呈现递增趋势，前25d递增缓慢，25～65d递增较快，其后保持为0.17mg/g水平，也符合国家相应标准。由此可知产品在常温至少有90d的保质期。
表6-9　罐头90d微生物检验结果
表6-10　罐头90d感官评定结果
图6-10　油脂过氧化值变化图
图6-11　油脂酸价变化图
在上述保质期跟踪试验的基础上，通过作油脂过氧化值和酸价趋势分析，得到回归方程，预测产品保质期，结果如图6-12和图6-13所示。采用对数曲线拟合方法得油脂过氧化值相应的回归方程为y=0.0448ln（x）-0.0155，R2=0.9296，决定系数R2接近1.0，拟合度高可使用，代入数据x（保存时间）=360d，得y（油脂过氧化值）=0.248g/100g，符合国家相应标准；采用多项式曲线拟合方法得到油脂酸价相应的回归方程为y=-5×10-6x2+0.0026x-0.0017，R2=0.981，决定系数R2接近1.0，拟合度高可使用，代入数据x（保存时间）=360d，得y（油脂酸价）=0.2863mg/g，也符合国家相应标准。由此可预测产品保质期可达1年。
图6-12　油脂过氧化值变化趋势图
图6-13　油脂酸价变化趋势图
七、罗非鱼硬罐头加工工艺流程及操作要点
1．工艺流程
在上述试验的基础上，研究出了罗非鱼硬罐头的加工工艺流程，如下所示：
2．工艺操作要点
（1）原料验收
采用新鲜罗非鱼，原料鱼质量必须符合国家农业行业标准（NY 5053－2005）《无公害食品　普通淡水鱼》的要求。
（2）原料处理
鲜鱼以清水洗净，刮净鱼鳞，除去鱼头、尾、鳍和内脏；用流水洗净鱼体表面黏液和杂质，洗净腹腔内血污、内脏和黑膜，按要求切成适当大小（45～55g）的鱼块，沥干表面水分。
（3）腌渍、沥干
采用盐水浸渍法腌渍，盐水浓度为12%，腌制9min。腌渍结束后捞起沥干。
（4）油炸
腌渍罗非鱼块沥干水分后采用180℃、5min或200℃、4min的条件进行油炸，油炸过程中，炸至鱼块上浮时，轻轻翻动，防止鱼块黏结和破皮。
（5）回软
罗非鱼块经油炸后，捞起放置在香料水中回软30s。香料水制法为：100mL水加入五香粉1.5g、姜粉1.0g、氯化钠3g，加热搅拌沸腾，冷却待用。
（6）调味液的制备
按配方称取一定量的蕃茄沙司、食盐、黄酒、白醋、香料水、白糖、胡椒粉、味精，加入100mL水中加热搅拌溶解，冷却备用。调味液的配方为（100mL水中添加的量）：65g番茄沙司、3g食盐、2.0mL白醋、10g白砂糖、0.6g胡椒粉、0.6g味精、10mL黄酒、10mL香料水。
（7）装罐
每罐罐头装300g鱼块，允许10%偏差，鱼块不低于净含量的73%，加入最佳配方调味料40g，允许10%偏差。
（8）封罐
产品罐装后于96～100℃下排气20min，中心温度达95℃，马上封罐。
（9）杀菌
采用高温高压杀菌，将封装好的样品在118℃、30min条件下进行杀菌。
（10）冷却
样品杀菌后冷却至室温取出，擦干，贴标签，保存。
第二节　风干罗非鱼软包装罐头加工技术
一、腌渍工艺条件
将罗非鱼按大小分类，将个体较大的罗非鱼切成45～55g的鱼块，采用湿腌法进行腌渍。试验通过测定鱼体盐渍脱水率、得率、含盐量、水分含量及品质等指标，对盐水浓度和腌渍时间进行了确定，结果如表6-11所示。随着盐渍浓度的增加，鱼体的脱水率增大、得率逐渐减少；水分含量减少，含盐量增大。腌渍工艺要求有初步少量脱水的效果，腌渍鱼块含盐量在2%比较合适。因此，盐水浓度为7%比较合适，此时腌渍罗非鱼块的脱水率适中，得率较理想，水分和盐含量分别为70.2%、2.019%。
表6-11　盐渍浓度对鱼块脱水率、得率、含盐量和水分含量的影响（腌渍时间9min，%）
将鱼块于不同盐水浓度腌渍9min，于70℃热风烘6h，经回软工艺后沥干水分，添加适当调味油后，经121℃、20min杀菌，隔天后进行感官评定，结果见表6-12。随着盐水浓度的增加，产品感官评分先增大后减小，且当盐水浓度为7%时，产品的各项评分都达到最高，综合评分为8.4分。进一步确定最佳盐水浓度为7%。
表6-12　盐渍浓度对罗非鱼块品质的影响（腌渍时间9min）
在浓度7%盐水中，将鱼块腌渍不同时间，其对鱼块各个指标的影响如表6-13所示。在相同盐渍浓度盐渍过程中，随着盐渍时间的增加，鱼体脱水率上升，得率逐渐降低，水分含量下降，盐含量则不断增加。根据腌渍工艺对脱水效果及盐含量的要求，9min为合适的腌渍时间，能达到初步脱水的效果，得率也较高，此时盐含量为2.104%，水分含量为70.2%。
表6-13　盐渍时间对罗非鱼块脱水率、得率、含盐量和水分含量的影响
将鱼块置于7%盐水浓度下腌渍不同时间，在70℃热风烘箱中烘6h，经过回软并添加适当调味油后，121℃、20min灭菌，隔天进行感官评定，结果如表6-14所示。随着盐渍时间的延长，产品的感官评分呈现先增大后减小的趋势，且当腌渍时间为9min时，产品的味感、骨酥性、色泽、组织结构均为最佳，产品的综合评分为最高分8.3分。进一步确定9min为最佳腌渍时间。
表6-14　腌渍时间对产品品质的影响
综上所述，盐水最佳浓度为7%，腌渍时间为9min，此时罗非鱼块的含盐量为2.104%，得率较高，品质最好。
二、脱水工艺条件
1．热风干燥脱水工艺的确定
罗非鱼块经7%盐水腌渍9min后，于不同温度进行热风干燥，通过测定脱水率、得率、水分含量、盐含量并结合其品质来确定最佳干燥条件，结果如图6-14和图6-15所示。随着温度升高，时间延长，脱水率逐渐增加；烘干得率逐渐下降；而由图6-16、图6-17可知，随着温度上升，时间延长，水分含量减小，含盐量上升。适当的干燥能使鱼体脱除部分水分，使鱼肉蛋白凝固，鱼体组织间出现间隙，便于调味液和油充分渗入鱼体；但如果干燥温度太高、时间太长，则鱼体脱水严重，呈现干瘪（严重失水）的状态。图6-18表明，热风干燥温度和时间对罗非鱼块的综合品质（包括味感、骨酥性、口感和组织）影响较大，其中70℃、6h可获得最好感品质。
图6-14　热风干燥对罗非鱼块脱水率的影响
图6-15　热风干燥对罗非鱼块烘干得率的影响
图6-16　热风干燥对罗非鱼块水分含量的影响
图6-17　热风干燥对罗非鱼块盐含量的影响
图6-18　热风干燥对罗非鱼块综合品质的影响
因此，根据感官质量，并结合成品水分含量（50%～57%）的要求，确定热风干燥最佳条件为70℃、6h，此时鱼块脱水率适中，得率较高，鱼体含水量为45.3%，含盐量为3.752%，较适中。图6-19所示为最佳干燥条件下的产品。
图6-19　最佳干燥条件下的产品形态
2．蒸煮脱水工艺的确定
将盐渍好的鱼体沥干，放进已经沸腾的锅内进行蒸煮脱水，设定不同蒸煮脱水时间，考察蒸煮时间对脱水率、得率、水分含量和盐含量的影响。将所有经过蒸煮脱水后的鱼块进行装袋、杀菌等后续工艺后，进一步考察蒸煮时间对产品品质的影响，结果如图6-20、图6-21和表6-15所示。由图6-22可知，在相同蒸煮温度的蒸煮脱水过程中，随着蒸煮时间增加，鱼体的脱水率增大；但是整体的脱水率较热风烘干脱水率小得多。图6-23表明，随着蒸煮时间的增加，鱼体的蒸煮得率则相应地降低，但是整体的得率均很高。综合图6-20至图6-23可知，在蒸煮脱水工艺中，随着蒸煮时间的增加，鱼体的水分含量则相应地降低，但整体的水分含量较高；而盐含量则随蒸煮时间的增加而增大，且在后期变化不太明显。
图6-20　蒸煮时间对鱼体脱水率的影响
图6-21　蒸煮时间对鱼体蒸煮得率的影响
图6-22　蒸煮时间对鱼体水分含量的影响
图6-23　蒸煮时间对鱼体盐含量的影响
表6-15　蒸煮时间对产品品质的影响
表6-15可以看出，在蒸煮脱水工艺中，随着蒸煮时间的增加，产品感官评分呈现先增加后减少的趋势，但是整体的产品中骨酥性均较差，感官评分也不高，其中蒸煮8min的感官评分最高。
对比两种脱水方式可以发现，蒸煮脱水的脱水效果较差，即使经最佳时间8min的脱水，产品的水分含量仍高达72.5%，不能达到含水量50%～57%的要求。另外，通过蒸煮脱水所获得的产品的骨酥性也很差；虽然经过杀菌工艺后其骨酥性有所改善，但同时鱼肉品质都变得很松散，整体品质都不佳，也不如热风干燥脱水的产品。因此，确定最佳脱水方式为热风干燥脱水，且热风干燥脱水的最佳条件为70℃、6h。
三、回软工艺条件
由于热风干燥会使鱼体表面较为僵硬和较为致密，为了成品制成后能够更好地吸收调味油，使得鱼体的感官较为均匀，所以进行回软工艺。鱼块经7%盐水腌渍9min并经70℃、6h热风干燥后进行回软处理，其对鱼块各个指标的影响如表6-16所示，随回软时间的延长，水分含量不断增加，盐含量逐渐下降；得率和吸水率升高。回软对产品品质也有明显影响，经回软工艺可使鱼肉恢复细致、清爽的口感，但鱼体回软时间过长，容易破碎，造成口感糜烂；吸水不足则成品风味不佳。因此，综合考虑产品水分含量、盐含量、得率及产品品质，确定最佳回软时间为30s，此时鱼块吸水适中，得率较高，水分含量为50.9%，含盐量为3.684%，综合评分最高，为7.5分。
表6-16　回软对产品水分含量、盐含量、得率、吸水率及品质的影响
四、调味油配方和配比
在预试验基础上，选取酱油、调和油、花椒油、食盐、黄酒、胡椒粉、姜粉为影响因素，采用L18（37）正交试验确定调味油的最佳配方，试验结果和极差分析见表6-17。由极差分析可知，7个因素对产品品质的影响次序是：B（植物油）>C（花椒油）>A（酱油）>D（黄酒）>G（盐）>E（胡椒粉）>F（姜粉），且最佳调味油配方组合为A2B2C2D1E2F2G2，即：酱油30mL、植物油9mL、花椒油5mL、黄酒4mL、胡椒粉1.5g、姜粉1.5g、盐1g。由于正交试验所得的最佳组合未在正交表的18个试验中，因此进行追加试验以确定调味料的最终配方。结果表明，最佳组合试验所得产品的综合评分明显高于正交表中分数最高的第5号试验所得产品的综合评分。因此，正交试验所确定的最佳组合即为调味料的最佳配方。换算成百分数表示最佳配方即为：酱油62.50%、植物油18.75%、花椒油10.42%、黄酒8.33%、胡椒粉2.88%、姜粉2.88%、盐1.22%
表6-17　调味油正交试验结果及极差分析结果
表6-17　调味油正交试验结果及极差分析结果（续）-1
调味油与罗非鱼块的配比（W/W）对产品品质的影响见表6-18、表6-19，调味油的配比不同，鱼块呈现出不同的感官结果，调味油过多不仅浪费而且会对封袋造成影响；太少则会导致产品感官降低、产生油料与鱼块混合不均匀等问题。对于高温高压杀菌产品，在调味油配比为1∶10时，配料量适中，不影响封袋，同时感官最佳，综合评分达到最高分8.0分。而对于微波杀菌产品，由于微波杀菌的时候失水性较为严重，所以配料需要相应的增加，从表6-19中可见1∶8的配料是最佳的。
表6-18　调味油与罗非鱼块配比对高温高压杀菌产品品质的影响（W/W）
表6-19　调味油与罗非鱼块配比对微波杀菌产品品质的影响（W/W）
五、杀菌工艺条件
1．高温高压杀菌和微波杀菌的品质对比
按上述最佳条件加工好罗非鱼软罐头后，将其放在不同条件下进行高温高压杀菌和微波杀菌，以产品品质为指标确定合适杀菌方法，结果见表6-20和表6-21。由表6-20可知，利用高温高压灭菌工艺，所得产品整体品质较高；产品虽在热风干燥后骨酥性不佳，但经高温高压杀菌后，骨酥性大大得到提高，其中综合品质最高的杀菌工艺是121℃、20min，其次为118℃、30min和121℃、15min。由表6-21可以看出，微波杀菌条件对产品的品质影响也较大，其中品质最好的杀菌条件为60W、2min，其次是480W、3min。对比最佳杀菌条件可以发现，高温高压杀菌所获得的产品的品质比微波杀菌要好一些，尤其在骨酥性方面。鱼罐头的骨酥性是产品品质很重要的一个指标，因此最后确定高温高压杀菌为最适合的杀菌方法。
表6-20　高温高压杀菌条件对产品品质的影响
表6-21　微波杀菌条件对产品品质的影响
表6-21　微波杀菌条件对产品品质的影响（续）-1
2．高温高压杀菌条件的确定
通过感官评定方法已初步确定了高温高压的杀菌条件，为了达到产品商业无菌的要求，还需进一步考察不同杀菌条件所获得的产品的商业无菌情况，结果见表6-22。118℃、30min和121℃、20～30min的杀菌条件可以达到商业无菌的要求，而121℃、15min的杀菌条件不能达到商业无菌要求。因此，结合产品品质和商业无菌要求，最后确定121℃、20min为最佳杀菌条件。
表6-22　软罐头不同杀菌条件商业无菌检验结果
六、产品保质期预测
选择最佳盐渍、热风干燥脱水、回软等工艺加工罗非鱼软罐头，产品采用121℃、20min杀菌后冷却取出于常温下保存90d，进行微生物、油脂氧化跟踪试验，结果见表6-23和图6-24、图6-25。由表6-23可以看出，产品贮存90d后，细菌总数、大肠菌群、致病菌（包括副溶血性弧菌、沙门菌）均未检出。
表6-23　不同杀菌条件微生物检验结果（常温贮存）
图6-24　贮存过程POV值的测定结果及SPSS程序运行结果
图6-25　贮存过程酸价的测定结果及SPSS程序运行结果
由图6-24、图6-25可知，随着贮藏时间的增加，产品的过氧化值和酸值均不断增加，但即使在贮藏的第90天，产品的过氧化值和酸值均在国家标准之内。由微生物和过氧化值及酸值可知，产品经121℃、20min杀菌后，在常温至少有90d的保质期。
在上述保质期跟踪试验的基础上，通过作油脂过氧化值和酸价趋势分析，采用SPSS软件得到回归方程，预测产品保质期，结果如图6-24、图6-25所示。其中过氧化值与时间的关系函数为：Y=0.0164lnX-0.0152，R2=0.815，决定系数R2接近1，拟合度高；P=0.000，满足P<0.05，方程是显著的。用该函数预测产品的过氧化值，当X=270d时，Y=0.076614g/100g，仍在国家标准之内。酸值与时间的关系函数为：Y=0.0261lnX-0.0317，R2=0.864，决定系数R2接近1，拟合度高；P=0.000，满足P<0.05，方程是显著的。用该函数预测产品的酸值，当X=270d时，Y=0.114419mg/g，仍在国家标准之内。由此可预测罗非鱼软罐头产品保质期可达9个月。罗非鱼软罐头产品见图6-26。
图6-26　罗非鱼软罐头产品
七、风干罗非鱼软罐头加工工艺流程及操作要点
1．工艺流程
在上述试验的基础上，研究出了罗非鱼硬罐头的加工工艺流程，如下所示：
2．工艺操作要点
（1）原料验收
同罗非鱼硬罐头原料验收。
（2）原料处理同罗非鱼硬罐头原料处理。

（3）腌渍
采用盐水浸渍法腌渍，其中盐水浓度为7%，腌渍时间为9min。腌渍后将鱼块捞起沥干。
（4）热风干燥脱水
腌渍罗非鱼块沥干水分后采用热风干燥方式进行脱水，干燥条件为70℃、6h。
（5）回软
罗非鱼块经热风干燥脱水后，放置在香料水中回软30s。香料水制法为：1500mL水加入五香粉2g、姜粉1.0g、食盐10g，加热搅拌沸腾，冷却待用。
（6）调味油的制备
按配方称取一定量的胡椒粉、黄酒、酱油、花椒油、姜粉、食盐、加入植物油中加热沸腾，冷却至80～90℃入袋。调味油配方为：酱油30mL、植物油9mL、花椒油5mL、黄酒4mL、胡椒粉1.5g、姜粉1.5g、盐1g；换算成百分数表示为：酱油62.50%、植物油18.75%、花椒油10.42%、黄酒8.33%、胡椒粉2.88%、姜粉2.88%、盐1.22%。
（7）装袋
每袋罐头装入适量鱼块，加入合适配比的最佳配方调味油。调味油温度应不低于70℃，以使汁液更好的渗入鱼体的同时防止油汁分离。
（8）真空封袋
在最佳真空封袋条件（热封时间约28s、真空度约为0.05MPa、充气时间约1.9s）下进行封袋。注意封口处切勿被油污染，以免影响封口质量。
（9）杀菌
将封装好的样品采用高温高压杀菌方法进行杀菌，杀菌条件为121℃、20min。
（10）冷却
样品杀菌后冷却至室温取出，擦干，贴标签，保存。
第三节　特色罗非鱼罐头加工技术
一、盐渍条件的筛选
1．盐水浓度对罗非鱼制品的水分含量和盐含量的影响
由图6-27可知，随着盐渍浓度的增加，其对鱼制品的水分含量呈现出不断下降的趋势，而盐含量却随着盐渍的浓度增加而增加。腌渍工艺要求有初步少量脱水效果，腌渍鱼制品盐含量在2%比较适宜，腌渍过程水分损失越小，产品的得率就越高，测定其水分含量和盐含量分别为70.5%、2.03%，结果表明：确定最佳的盐渍浓度为8%。
图6-27　盐渍时间对产品水分含量和盐含量的影响
2．盐渍时间对罗非鱼制品水分含量和盐含量的影响
在8%盐渍浓度中，将罗非鱼制品浸渍于不同的时间（0min、5min、10min、15min、20min），测定其水分和盐含量指标，结果见图6-28。
图6-28　盐渍时间对产品水分含量和盐含量的影响
由图6-28可知，随着盐渍时间延长，鱼制品的水分含量呈现出不断下降的趋势，而盐含量却随着时间的延长而增加。根据腌渍工艺对脱水效果及盐含量的要求，确定15min为最佳的盐水浸渍时间，其水分能达到脱水效果，此时盐含量为2.15%，其水分和盐含量也符合腌渍工艺对脱水效果的要求。
二、3种风味特色罗非鱼的感官评价
试验研究了3种风味（辣香味、五香味和豆豉味）特色罗非鱼，并通过12位专业人员的评价试验对产品的风味、口感和色泽进行评分。按照好（9～10分），良好（8～9分），一般（7～8分）差（7分以下）四个等级评分，结果见表6-24（平均得分）。
表6-24　3种风味特色罗非鱼感官评价
由表6-24可以看出，通过比较，表明了特色罗非鱼A组感官综合评分为9.8分，即鱼体形态完整，有鱼香味和腊味香味的风味，鱼肉嫩滑，咀嚼性好，弹性好；其次是B组感官综合评分为8.5分，这是因为B组是五香味，使鱼香味稍被冲淡，口感较硬；C组为豆豉味，综合评分为7.7分，因为豆豉掩盖了鱼的香味，感官上不及A组和B组。结果表明A组无论在口感还是在风味方面都是最佳的。
三、热风烘干条件
热风烘干的目的是使鱼体脱除部分水，使鱼肉蛋白质凝固，鱼肉组织紧密，具有一定的硬度，防止鱼体组织碎散。鱼制品经调味液浸渍后于不同温度下热风烘干一定时间后，测定其水分含量，结果见图6-29。
图6-29　热风烘干对鱼制品水分含量的影响
由图6-29可见，温度较低，时间较长，对鱼制品热风烘干效果不显著。随着温度升高，热风时间的延长，水分含量减小，鱼制品的水分含量变化相对较大，根据鱼体水分含量（50%～57%）的要求，从图6-29可知，水分含量符合以上要求的可选择热风烘干条件为125℃、2h，此时鱼制品的脱水率较为适中，其水分含量为52.02%。
四、杀菌温度及时间对产品品质的影响
在保证质量安全的前提下，对于软包装罐头而言，杀菌技术的控制是极为关键的工艺步骤。经以上最佳条件配比好的鱼产品用真空包装好后，在不同的条件下进行杀菌，分别采用高压温度121℃、125℃，时间10min、15min、20min、25min对鱼制品进行灭菌，以确定最佳高压杀菌工艺条件。因此，分别对不同高压杀菌条件进行了研究，结果见图6-30。
图6-30　杀菌温度及时间对产品综合评分的影响
由图6-30可见，随着高压杀菌温度的提高，产品的综合评分呈上升趋势，在125℃、15min时评分达到最大值，而后评分逐渐下降，在相同时间下不同高压杀菌温度，产品的评分也不相同，这是因为高压温度较低对产品未能骨质软化，较硬、难咬断，肉质松软口感不理想，而高压杀菌温度升高到125℃时，在时间15min产品的骨质达到脆软，肉质紧密口感理想的效果，综合评分为8.8分。综合以上因素确定软包装罗非鱼罐头的高压杀菌条件为125℃、15min。
五、产品的保质期
为了保证水产食品的卫生安全，将真空包装后的罗非鱼成品于25℃室内常温下贮存，在7d、30d、60d、90d分别进行了相关微生物检测，按照国家标准方法对产品抽样检测微生物变化情况，结果见表6-25。
表6-25　产品在不同贮存期的微生物的检测结果
由表6-25可知，成品在25℃的环境下保存90d后，其细菌总数、大肠埃希菌、沙门菌、副溶血性弧菌均未检出，即产品合格，因此，产品质量符合国家食品卫生标准的规定。
参考文献
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第七章　罗非鱼干制品和腊制品加工技术
第一节　罗非鱼干制品加工技术
一、罗非鱼的热风干燥技术
热风干燥是以热空气为介质，使水产品中的水分蒸发而达到干燥目的，设备投资较少，易于人为控制条件，适应性强。由于热风干燥是由表及里加热水产品，故热风温度是影响热风干燥速度的主要因素。但热风作用仍然存在局限性，一方面取决于干燥物料的种类、规格等因素的影响；另一方面，过高的温度会导致水产品营养成分遭到破坏，还会引起脂肪氧化和美拉德褐变，降低产品品质。
段振华等研究了罗非鱼鱼片在40℃、50℃和60℃等不同热风温度下的干燥速度变化和热风干燥对鱼片的主要成分含量的影响。结果表明，当比较相同时间段所对应曲线的切线斜率时，3mm厚的鱼片的曲线斜率最大，5mm厚鱼片的曲线斜率次之，而10mm厚鱼片的最小（图7-1～图7-3）。这说明了在一定干燥温度下，鱼片的干燥速度明显受其厚度的影响，鱼片越薄，干燥越快；相反，越厚则干燥越慢。从干燥起始至达到平衡状态所需的时间，可以具体反映厚度的不同对干燥速度的影响程度，如40℃时，3mm、5mm和10mm 3种厚度的鱼片所用的时间分别为20h、27h和37h，互相之间相差几个小时到十几个小时。对于较薄的鱼片，甚至在温度低的条件下得到的速度比温度高条件下得到的速度快，如3mm厚的鱼片在50℃温度干燥达到平衡状态所需的时间（15h），比10mm厚的鱼片在60℃温度干燥达到平衡状态所需的时间（19h）短；又如3mm厚的鱼片在40℃温度下干燥达到平衡状态所需的时间，比10mm厚的鱼片在50℃温度干燥的时间（25h）短。
图7-1　40℃干燥条件下不同厚度鱼片的干燥曲线
图7-2　50℃干燥条件下不同厚度鱼片的干燥曲线
图7-3　60℃干燥条件下不同厚度鱼片的干燥曲线
而当鱼片厚度一定时，温度越高干燥速度越快，例如，3mm厚的鱼片，在50℃温度条件下达到平衡所需的时间与40℃相比缩短了5h左右，而在60℃条件下的干燥时间比50℃缩短了6h；又如，5mm厚的鱼片，在50℃温度条件下达到平衡所需的时间与40℃相比缩短了6h，而在60℃条件下的干燥时间比50℃缩短了5h；同样10mm厚的鱼片在较高温度下的干燥时间要比较低温度下的干燥时间少几个小时到十几个小时。根据Trabert理论，温度升高可以加快水分蒸发，从而提高物料的干燥速率。
对于给定厚度的罗非鱼鱼片，在干燥温度恒定的条件下，鱼片中的粗蛋白质含量随着干燥时间的延长而有所下降，而粗脂肪含量的变化基本不大。
二、罗非鱼片的热泵干燥技术
1．干燥前预处理对罗非鱼片热泵干燥的影响
郑蔓等以罗非鱼为原料，探讨了干燥前预处理对罗非鱼片热泵干燥的影响，筛选出几种糖醇类和盐类预处理添加剂，利用响应面进行优化分析，探讨不同干燥温度下优化出的预处理方法对干制罗非鱼片蛋白质变性、复水性、色泽、质构等干燥品质的影响。首先从预处理对复水率、水分活度和Ca2+-ATP酶活性等重要指标的影响出发，筛选出几种糖醇类和盐类做预处理添加剂，如图7-4～图7-9，表明低盐处理罗非鱼片，干浸和湿浸两种处理方法都能降低干制鱼片复水率和水分活度，提高Ca2+-ATP酶活性，且两种浸渍方法的效果差别不大。
图7-4　NaCl浸渍预处理（干浸）对干燥罗非鱼片复水率的影响
图7-5　NaCl浸渍预处理（湿浸）对干燥罗非鱼片复水率的影响
图7-6　NaCl浸渍预处理（干浸）对干燥罗非鱼片水分活度的影响
图7-7　NaCl浸渍预处理（湿浸）对干燥罗非鱼片水分活度的影响
图7-8　NaCl浸渍预处理（干浸）对干燥罗非鱼片Ca2+-ATP酶活性的影响
图7-9　NaCl浸渍预处理（湿浸）对干燥罗非鱼片Ca2+-ATP酶的影响
如图7-10～图7-12所示，糖醇类处理中，单独添加丙二醇、丙三醇和山梨醇都能提高干制鱼片的复水率，降低水分活度；添加丙二醇、丙三醇和蔗糖能提高干制鱼片Ca2+-ATP酶活性，而添加山梨醇效果不明显。如图7-13～图7-15所示，单独添加焦磷酸钠（SPP）、六偏磷酸钠（SHMP）能提高干制鱼片的复水率，而添加三聚磷酸钠（STP）其复水率稍有降低，其作用效果不显著。单独添加3种磷酸盐均能不同程度的降低干制鱼片的水分活度、提高Ca2+-ATP酶活性。通过对比几种不同配比的复合磷酸盐对复水率、水分活度、Ca2+-ATP酶活性的影响，筛选出最优的复合磷酸盐配比SPP∶STP∶SHMP=5∶5∶4。
图7-10　糖醇浸渍预处理对干燥罗非鱼片复水率的影响
图7-11　糖醇浸渍预处理对干燥罗非鱼片水分活度的影响
图7-12　糖醇浸渍预处理对干燥罗非鱼片Ca2+-ATP酶活性的影响
图7-13　磷酸盐浸渍预处理对干燥罗非鱼片复水率的影响
图7-14　磷酸盐浸渍预处理对干燥罗非鱼片水分活度的影响
图7-15　磷酸盐浸渍预处理对干燥罗非鱼片Ca2+-ATP酶活性的影响
随后在单因素试验和预试验的基础上，以水分活度和Ca2+-ATP酶活性为指标，利用响应面分析优化出两组预处理方案，预处理①（添加量）：丙二醇2%+丙三醇3%+NaCl1%；预处理②（浸渍液浓度）：蔗糖2.1%+山梨醇3.15%+复合磷酸盐1.00%，均能有效降低干制鱼片水分活度，提高Ca2+-ATP酶活性。将优化得到的两组预处理方案和对照组分别在30℃、45℃、60℃3个温度条件下进行干燥，对干制鱼片的Ca2+-ATP酶活性、盐溶性蛋白溶解度、pH和组织切片4个指标进行检测对比，探讨不同干燥温度下预处理对罗非鱼热泵干燥过程蛋白质热变性的影响，表明3个干燥温度下，预处理①和预处理②均能显著提高干制罗非鱼片的Ca2+-ATP酶活性和盐溶性蛋白溶解度，有效防止鱼片蛋白质变性，改善干鱼片品质。在45℃和60℃干燥温度下，预处理②提高Ca2+-ATP酶活性的效果优于预处理①。在45℃和60℃干燥温度下，预处理①和预处理②均能显著提高干制鱼片的pH，且预处理②的作用效果优于预处理①，30℃时，预处理②效果显著，预处理①效果不显著。两种预处理方式均能有效减少肌肉组织的机械损伤，有效保护细胞的完整性和肌纤维排列的有序性，减少鱼片组织结构的变形，改善干制品品质，而两种预处理方法之间，观察不出明显的效果差异。经过相同的预处理，干燥温度对罗非鱼片的Ca2+-ATP酶活性、盐溶性蛋白溶解度及组织结构有显著影响，干燥温度越高，鱼片Ca2+-ATP酶活性和盐溶性蛋白溶解度越小，组织结构破坏程度越严重。
最后从干燥曲线、复水率、水分活度、色泽分析、质构分析、感官评价等方面，探讨不同干燥温度下预处理对罗非鱼热泵干燥过程和干制品品质的影响。结果表明，干燥温度对复水率、水分活度、色泽、硬度和弹性等指标有较大影响。相同预处理条件下，随着干燥温度升高，干制鱼片的复水率、水分活度和弹性都呈减小趋势，硬度则呈增大趋势。较高的干燥温度下，鱼片颜色变深，甚至出现变焦变黄的情况，对于色泽保持不利。如图7-16～图7-18所示，在3个干燥温度下，预处理①和预处理②两种预处理方式均不同程度地提高了罗非鱼片的干燥速率，同时显著提高干制鱼片的复水率，且在45℃和60℃干燥温度下，预处理①的效果明显优于预处理②。两种预处理方法均能显著降低干制鱼片的水分活度，且两者的效果没有显著性差异。两种预处理方法对干制鱼片的色泽影响不大。45℃和60℃干燥温度下，两种预处理均有效降低了干制鱼片的硬度，且预处理①效果更显著。45℃和60℃时预处理①对干制鱼片弹性的影响不显著，预处理②对其影响显著。干燥温度对干制鱼片的感官评分有较大影响，30℃和45℃干燥温度条件下鱼片的口感较好，两种预处理方式对鱼片的感官评价影响不大。干燥温度为60℃时，干制鱼片的口感明显变差变硬，预处理①和预处理②得到的干制鱼片硬度小于对照组，与质构分析的结果一致。
图7-16　30℃干燥温度时罗非鱼热泵干燥曲线
图7-17　45℃干燥温度时罗非鱼热泵干燥曲线
图7-18　60℃干燥温度时罗非鱼热泵干燥曲线
2．罗非鱼片的热泵干燥工艺
刘兰等利用不同干燥条件研究了罗非鱼片的热泵干燥工艺，流程如下：新鲜罗非鱼→预处理（去头、内脏、鱼鳞）→取鱼片→去皮→整形→淡盐水腌渍→沥水→摆网→干制→成品及包装。通过热泵干燥罗非鱼片的试验，如图7-19～图7-24所示，得出了干燥过程的温度条件、吹风速度及鱼片的厚度等单因素对罗非鱼片热泵干燥时间和品质的影响以及罗非鱼片干燥加工曲线和干燥速度曲线。同时研究表明，利用同一台装置的在设定条件下的变温干燥比恒温干燥在相同的时间内可获得更低的含水率，风速越高，干燥时间越短，其品质越好。
图7-19　热泵干燥温度对罗非鱼片干燥曲线的影响
图7-20　热泵干燥对罗非鱼干燥速率的影响
图7-21　热泵干燥对物料温度的影响
图7-22　不同厚度对罗非鱼片干燥曲线的影响
图7-23　不同干燥温度对罗非鱼片干燥曲线的影响
图7-24　不同风速对罗非鱼片干燥曲线的影响
在不同干燥温度条件下干燥的物品其复水率是不一样的，试验表明，罗非鱼片干燥过程中温度太高和太低都不合适，在干燥温度35℃，风速1.6m/s，厚度0.4～0.5cm的工艺条件下，产品的干燥速度较快，在复水时间50min时复水率最高。
三、罗非鱼片的真空冷冻干燥技术
1．不同真空压力对罗非鱼品质的影响
庞文燕等以罗非鱼为材料，分别在700～800Pa、1300～1400Pa和1900～2000Pa的真空压力条件下进行冰温干燥的试验研究，通过干燥速率、复水率、色泽、鲜度指标K值、游离氨基酸等指标的变化情况分析冰温干燥不同真空压力对罗非鱼品质的影响。结果如图7-25～图7-27所示：700～800Pa真空压力下干燥的罗非鱼片干燥速率最快，干燥24h后的残余含水率仅为20.8%，其复水率（43.27%）也最高；1900～2000Pa真空压力下的游离氨基酸总量最高，1300～1400Pa、700～800Pa条件下依次递减；此外，3种不同真空压力测得的罗非鱼干制品K值较为接近，均处于一级鲜度以内，对其影响较小。
图7-25　不同真空压力下罗非鱼的干燥曲线
图7-26　不同真空压力对罗非鱼复水率的影响
图7-27　不同真空压力对罗非鱼片K值的影响
2．真空冷藏干燥主要过程参数对罗非鱼片冻干时间及除水率的影响
叶彪等通过四因数三水平正交试验，研究了真空冷藏干燥主要过程参数——鱼片厚度、预冻温度、加热板温度、真空室压力对罗非鱼片冻干时间及其除水率的影响。结果如图7-28～图7-30所示：单一过程参数对罗非鱼片单位厚度冻干时间的影响为鱼片厚度越厚，冻干时间越长；预冻温度越高，冻干时间越长；加热板温度越低，冻干时间越长；真空冷冻干燥过程参数对罗非鱼片单位厚度升华冻干时间及其除水率影响的主次因数依次为：鱼片厚度>真空室压力>加热板温度>预冻温度；得到了物料厚度为10mm，预冻温度为-18℃，加热板温度为40℃，真空度为160Pa时，单位厚度升华干燥的耗时最小，此时单位厚度耗时约为0.43h；鱼片在经过真空冷冻干燥后，形状变化很小，但鱼片含水量大大减少，干燥程度得以提高，有利于保存和运输。
图7-28　鱼片厚度对冻干时间的影响
图7-29　预冻温度对冻干时间的影响
图7-30　加热板温度对冻干时间的影响
四、罗非鱼片的真空微波干燥技术
微波干燥由于其独特的介电加热特性，能够深入原料内部，具有加热速度快、加热均匀、节能高效、安全无害、易瞬时控制、选择性和穿透性好等特点，在食品工业中越来越受到重视。
杨毅等通过热风、微波、真空微波、冷冻干燥4种不同方式对罗非鱼片进行干燥，比较不同干燥方式对罗非鱼片白度、收缩率、复水率、复原率、气味差异、微观结构等方面的差异，发现真空微波是一种能与冷冻干燥相媲美的干燥方式，明显优于热风和微波干燥。研究了3mm罗非鱼片在真空度0.03MPa、0.06MPa、0.09MPa和微波功率100W、200W、300W下进行了真空微波干燥试验的水分比与时间关系，结果如图7-31～图7-33所示：增大微波功率能提高干燥速率；提高真空度能降低最终的水分含量；在高真空度下，微波功率对干燥速率的影响不明显。
图7-31　0.03MPa下MR-t关系图
图7-32　0.06MPa下MR-t关系图
图7-33　0.09MPa下MR-t关系图
此外，通过试验数据建立罗非鱼真空微波干燥模型，发现Page模型最适合于拟合微波真空干燥薄层罗非鱼片，并用拟合的模型曲线与真实值进行验证，证明Page模型具有良好的效果。进一步对真空微波干燥罗非鱼片品质进行研究，以真空度、微波功率密度和切片大小作为因素，以白度、收缩率、复水率和复原率作为指标，用Box-Behnken响应面法优化加工工艺，得到二次回归方程模型，响应面二次回归分析得出：当功率密度为9.55W/g，真空度为0.09MPa，切片大小为478.26mm2时，罗非鱼片的品质最佳，各指标与方程预测结果相似（图7-34）。
图7-34　试验值与预测值的比较
第二节　罗非鱼腊制品加工技术
一、罗非鱼腌制工艺条件的优化
1．腌制时间对鱼肉含盐量和盐卤中氨基酸态氮含量的影响
将已处理的新鲜罗非鱼，在15%的盐水中15℃下腌制24h。每4h测定鱼肉中氯化钠含量和盐卤中氨基酸态氮含量，鱼肉中含盐量和盐卤中氨基酸态氮含量随时间的变化情况见图7-35。
图7-35　腌制时间对鱼肉含盐量和盐卤氨基酸态氮含量的影响
由图7-35可以看出，随着腌制时间的增加，鱼肉的含盐量逐渐增大，在0～4h内食盐的渗透速率最大，鱼肉的含盐量增加最快，在4h时，含盐量已达到2.67%，之后含盐量增加变缓。同时，随着腌制时间的增加，鱼体肌肉中的可溶性蛋白质和氨基酸等成分逐渐溶出，使盐卤中氨基酸态氮的含量逐渐增大。
2．盐水浓度对鱼肉含盐量和盐卤中氨基酸态氮含量的影响
将已处理的新鲜罗非鱼，在15℃下，食盐浓度分别10%、15%、20%、25%的盐水中腌制4h，测定鱼肉含盐量和盐卤中氨基酸态氮含量，试验结果见图7-36。
图7-36　盐水浓度对鱼肉含盐量和盐卤氨基酸态氮含量的影响
由图7-36可以看出，在15℃下腌制4h，增大盐水浓度，鱼肉中含盐量增加，而盐卤中的氨基酸态氮含量减少。这是由于盐水浓度越大，食盐渗透的速度越快，渗透量越大，同时盐浓度越高，细菌的生长受到抑制，同时也抑制了鱼肉中自溶酶的作用，甚至使酶失活，从而抑制了鱼肉成分的溶出。因此，适当的增加盐水浓度能够有效缩短腌制时间，提高腌制效率，减少营养成分的损失，但盐水浓度过高可能导致腌制过程不易控制，鱼体失水过多，对鱼体的外形和质构等产生负面影响。
3．腌制温度对鱼肉中氯化钠含量和盐卤中氨基酸态氮含量的影响
将已处理的新鲜罗非鱼，分别在5℃、15℃、25℃下用15%的盐水腌制4h，测定鱼肉含盐量和盐卤中氨基酸态氮含量，试验结果见图7-37。
图7-37　腌制温度对鱼肉中含盐量和盐卤中氨基酸态氮含量
由图7-37可以看出，随着腌制温度的升高，腌制温度越高，鱼肉中的含盐量越大，这是由于温度越高，食盐扩散的活化分子数目增加，食盐的渗透速度随着温度的升高而加快。同时，随着温度的升高，微生物的生长和肌肉中自溶酶活性的提高，使得肌肉成分溶出增加，盐卤中氨基酸态氮含量随之增加。
4．均匀试验设计
根据单因素试验结果，以鱼肉中含盐量和盐卤中氨基酸态氮含量为指标，做混合水平的均匀试验。为了考虑试验均匀性因素间的相互作用，试验次数应大于9次，优先选择U12*（12×4×3）混合水平均匀设计表，通过拟水平将混合水平设计表的因素1作为腌制时间，拟为6个水平，试验设计见表7-1。
表7-1　U12*（12×4×3）均匀设计与结果
5．回归分析
通过DPS 7.05软件分别建立鱼肉中含盐量和盐卤中氨基酸态氮含量与腌制时间、盐水浓度、腌制温度3个腌制条件间的多元回归模型，采用二次多项式逐步回归分析，分别获得鱼肉中含盐量和盐卤中氨基酸态氮与各因素间的回归方程。
鱼肉中含盐量与各因素间的回归方程为：
Y1=-3.16998775+0.11388480392X1+0.4467450980X2+0.06654901961X3-0.009133333333X22-0.0017750000000X32+0.0023750000000X1X3　（Ⅰ）
相关系数R=0.9919，F值=113.27>F0.01（6，5），P值=0.0001，剩余标准差S=0.1421，说明该方程回归极显著。
盐卤中氨基酸态氮含量与各因素间的回归方程为：
Y2=6.50477299+4.081322362X1-0.17627824463X2+1.1328141923X3-0.08357142857X12+0.023903571429X32+0.07514285714X1X2-0.025392857143X1X3-0.05565714286X2X3　（Ⅱ）
相关系数R=0.9985，F值=469.64>F0.01（6，5），P值=0.0001，剩余标准差S=0.7974，说明该方程回归极显著。
将试验结果采用DPS7.05软件进行两次多项式逐步回归分析，回归方程（Ⅰ）、（Ⅱ）中各因素的显著性检验分别见表7-2、表7-3。
表7-2　方程（Ⅰ）中各因素显著性分析
表7-3　方程（Ⅱ）中各因素显著性分析
从表7-2各变量显著性检验P值的大小，通过比较可知对鱼肉中含盐量的影响大小为X2>X22>X1>X3>X32>X1X3。X2对鱼肉中含盐影响最大，为极显著影响因素，X1对鱼肉中含盐量影响显著，X3对鱼肉中含盐量影响不显著，各因素间的相互作用较弱，腌制时间和腌制温度间存在交互作用，但影响不显著。腌制过程中应注意控制盐水浓度和腌制时间来控制鱼肉中的含盐量。
从表7-3各变量显著性检验P值的大小，通过比较可知对盐卤中氨基酸态氮含量的影响大小为X1>X3>X2X3>X32>X12>X1X2>X1X3>X2。X1对盐卤中氨基酸态氮含量影响极显著，X3、X2X3和X32对盐卤中氨基酸态氮含量影响显著。交互作用X1X2和X1X3对盐卤中氨基酸态氮含量影响较弱。
6．感官结果分析
由于均匀试验设计的点分布均匀，直接对试验所得到的结果进行对比分析从中挑选出试验指标最好的试验点，这样找到的试验点一般离最佳试验点也不会很远，所以直接分析法是一个非常有效的方法。按照感官评分表对12个试验产品进行感官评分，由表7-1中感官评分结果可知试验4、6和7的腌制罗非鱼感官评分都高于8分，其中4号样品的感官得分最高，为8.18分，同时盐卤中氨基酸态氮含量较低，为33.84mg/L，从控制营养损失的角考虑，4号试验产品的品质优于其他产品。因此，综合考虑，最佳腌制工艺为25%的食盐水5℃腌制6h。
7．结论
①运用DPS 7.05软件设计均匀试验，研究了腌制时间、盐水浓度和腌制温度对鱼肉中氯化钠含量和盐卤中氨基酸态氮含量的影响，建立各腌制因素分别与鱼肉中氯化钠含量（Y1）和盐卤中氨基酸态氮含量（Y2）的二次多项式逐步回归模型：
Y1=-3.16998775+0.11388480392X1+0.4467450980X2+0.06654901961X3-0.009133333333X22-0.0017750000000X32+0.0023750000000X1X3
Y2=6.50477299+4.081322362X1-0.17627824463X2+1.1328141923X3-0.08357142857X12+0.023903571429X32+0.07514285714X1X2-0.025392857143X1X3-0.05565714286X2X3
分析得出，腌制时间对鱼肉中氯化钠含量影响显著、对盐卤中氨基酸态氮含量影响极显著；盐水浓度对鱼肉中氯化钠含量影响极显著、对盐卤中氨基酸态氮含量影响不显著；腌制温度对鱼肉中氯化钠含量影响不显著、对盐卤中氨基酸态氮含量影响显著。交互作用X2X3对盐卤中氨基酸态氮含量影响显著外，其他各因素间交互作用对鱼肉中氯化钠含量和盐卤中氨基酸态氮含量的影响相对较弱。
②由于均匀试验设计的均匀性，直接对均匀试验的结果进行分析，得到理论最佳腌制工艺为：25%的食盐水5℃腌制6h，在此腌制条件下，鱼肉含盐量为3.31%，盐卤中氨基酸态氮含量为33.84mg/L，感官得分为8.18分。
二、腊鱼中优势发酵微生物的分离筛选及鉴定
1．乳酸菌、葡萄球菌和酵母分离纯化
从腊鱼样品中初步分离得到92株具有明显溶钙圈的菌株，再经革兰氏染色和接触酶试验后得到36株革兰氏阳性、接触酶阴性乳酸菌，43株革兰氏阳性、接触酶阳性球菌和8株产香酵母菌。
2．乳酸菌、葡萄球菌和酵母菌的筛选
（1）乳酸菌初筛
将分离得到的乳酸菌经紫色牛乳试验，选择24h内能凝乳且培养基变黄的菌株42，其液体培养发酵产物经乳酸定性试验，共有14株乳酸菌培养液中有组分与乳酸标准液的比移值相同，初步确定该14株菌为乳酸菌。
（2）葡萄球菌初筛
将分离得到的43株革兰氏阳性、接触酶阳性球菌进行呋喃唑酮、溶葡萄球菌素和杆菌肽敏感性试验，呋喃唑酮和溶葡萄球菌素敏感，杆菌肽不敏感的菌株判定为葡萄球菌，共筛选得到32株葡萄球菌。
（3）发酵特性试验
研究初筛得到的14株乳酸菌、32株葡萄球菌和8株产香酵母菌的发酵特性，试验结果见表7-4。
表7-4　各菌株发酵特性试验结果
根据表7-4中各菌株的发酵特性试验结果可看出，大部分菌株都不产黏性物质、不产H2S、不产气、不产氨。分离的乳酸菌中有13株能抑制大肠杆菌，12株能抑制金黄色葡萄球菌。分离的葡萄球菌中只有少部分具有蛋白酶活性和脂肪酶活性，其中有5株有蛋白酶活性，8株有脂肪酶活性。绝大部分的菌株都能耐受4%的盐，所有的葡萄球菌都能耐受6%的盐，但6%的盐抑制了部分乳酸菌和酵母菌的生长。大部分分离的乳酸菌能在pH4.5的酸性环境下生长，只有少数酵母菌能在该酸性环境中生长。大部分分离菌株对亚硝酸盐的耐受性较好。考虑到乳酸菌的产酸能力和产酸速度对保证发酵肉制品的安全性至关重要，根据发酵特性试验结果进一步筛选出一株产酸最快的乳酸菌L3，综合考虑符合筛选条件的各菌株的蛋白酶和脂肪酶活性、耐盐性、耐酸性和亚硝酸盐耐受性，筛选出一株葡萄球菌S12，一株酵母菌Y11。
3．安全性试验
筛选获得葡萄球菌S12，经血平板和耐热核酸酶试验，结果表明，该菌株不溶血且耐热核酸酶检测阴性，初步判断该菌株无毒。
4．拮抗试验
将分离筛选到的乳酸菌L3、葡萄球菌S12和酵母菌Y11进行拮抗性试验，菌株间无明显拮抗作用。
5．乳酸菌、葡萄球菌和酵母菌的鉴定
（1）乳酸菌、葡萄球菌和酵母菌形态观察
将筛选得到的菌株在平板上画线分离得到单菌落，观察菌落形态，乳酸菌和葡萄球菌经革兰氏染色、酵母菌经碘液染色后镜检，各菌株菌落形态和菌体形态见表7-5，同时观察酵母菌的生殖方式及液体培养特征。
表7-5　各菌株形态学观察
（2）乳酸菌、葡萄球菌和酵母菌的生理生化鉴定
①乳酸菌和葡萄球菌的生理生化鉴定。根据表7-5菌落形态特征观察和表7-6中菌株生理生化反应特征，参考《乳酸细菌分类鉴定及实验方法》《常见细菌系统鉴定手册》和《伯杰细菌鉴定手册》，初步判定L3为戊糖乳杆菌、S12为木糖葡萄球菌。
表7-6　乳酸菌和葡萄球菌的生理生化鉴定结果
表7-6　乳酸菌和葡萄球菌的生理生化鉴定结果（续）-1
②酵母菌的生理生化鉴定。根据酵母菌的碳源同化作用，对其进行编码鉴定。将酵母菌Y11接种于14种生化管中，碳源同化试验结果见表7-7。
表7-7　酵母Y11碳源同化试验
根据表7-7中同化试验结果，使用杭州天和微生物试剂有限公司的《酵母样真菌生化鉴定编码册》，进行编码鉴定，同时根据表7-5中酵母Y11形态特征参考《酵母菌的特征与鉴定手册》，初步将酵母Y11鉴定为近平滑假丝酵母。
（3）乳酸菌、葡萄球菌和酵母菌的分子生物学鉴定
对筛选得到的菌株进一步进行分子生物学鉴定，分析菌株L3和S12的16S rDNA进行测序分析及菌株Y11的26S rDNA D1/D2区序列，测序结果经数据库比对结果见表7-8。
表7-8　乳酸菌、葡萄球菌、酵母菌分子生物学鉴定
6．产香酵母发酵液挥发性风味成分分析
产香酵母菌Y11接种于麦芽汁液体培养基28℃摇床培养1d，静置培养2d后，麦芽汁发酵液经固相微萃取和GC-MS分析挥发性成分，其发酵液挥发性成分总离子流色谱见图7-38。
图7-38　酵母Y11麦芽汁发酵液挥发性成分总离子流色谱图
同时以麦芽汁液体培养基做空白试验，各组分质谱经计算机NIST05.LIB谱库检索及相关资料分析，用峰面积归一化法，计算各组分相对百分含量，并分析各组分的气味，将挥发性成分按照保留时间先后顺序统计，见表7-9。
表7-9　产香酵母Y11麦芽汁发酵液挥发性成分相对峰面积及气味
表7-9　产香酵母Y11麦芽汁发酵液挥发性成分相对峰面积及气味（续）-1
由表7-9分析可得，酵母Y11麦芽汁发酵液共分离出17种挥发性成分，主要是醇类和酯类物质，主体风味物质是酯类，产香酵母Y11发酵液中挥发性成分含有大量不同的酯类，且大多数具有令人愉悦的香气，因而赋予该菌株发酵液浓郁的酯香。另外，发酵液中存在大量的高级脂肪酸酯类，包括饱和脂肪酸酯（十二酸乙酯、十四酸乙酯和十六酸乙酯等）和不饱和脂肪酸酯（3，6-十二碳二烯酸甲酯、反式-4-癸烯酸乙酯和9-十六碳烯酸乙酯等），由此可以推测酵母Y11可能是一株产油脂的酵母菌，其细胞裂解后将代谢产生的脂肪酸释放到发酵液中，并与发酵液中的低级醇形成脂肪酸酯，有研究表明酵母是具有很大产油潜力的微生物。
三、复合乳酸菌发酵腊罗非鱼的工艺技术
1．发酵菌种最佳配比筛选试验
嗜酸乳杆菌和植物乳杆菌发酵温度控制在30℃时对生长繁殖都有利，并能抑制腐败菌和致病菌的生长。乳杆菌发酵剂不同菌种的比例组合，腊鱼发酵产酸速度及产品品质不同，组合菌种比单一菌种更能使发酵产品产生独特的风味。La和Lp按照1∶1、1∶2、2∶1三个不同菌种组合配比进行发酵腊鱼试验。工艺条件：发酵温度30℃、发酵时间30h，测定不同时间发酵产品的pH变化及通过感官评定最佳配比组合，结果见表7-10。
表7-10　La和Lp不同比例组合发酵pH变化和感官评价
从表7-10可知，采用La和Lp以1∶1的组合比作为发酵剂发酵腊鱼，样品肉质柔软，色泽鲜，酸味柔和，经30℃条件下发酵24h, pH可达5.20以下；1∶2、2∶1的品质不及1∶1的品质好，酸味较浓，肉质硬，无光泽。因此，筛选出La和Lp以1∶1为最佳的比例组合。
2．发酵菌种接种量与发酵时间的选择
乳酸菌具有很强的产酸能力和丰富的酶系统，使用发酵剂的目的是保证乳酸菌整个发酵和成熟过程中占有绝对优势，抑制有害菌的生长。研究采用La和Lp两种菌为发酵剂，以1∶1组合配比，按鱼体重接入发酵菌种，接种量分别为0%、1%、2%、3%、4%，30℃发酵30h，通过测定不同发酵时间下鱼体酸度，从中筛选出最佳接种量。接种量和发酵时间对鱼体的产酸影响见图7-39。
图7-39　La和Lp不同接种量和发酵时间对腊鱼产酸的影响
由图7-39可知，不同接种量对腊鱼产酸有一定的影响，随着接种量的增大，发酵时间延长，鱼体产酸速度增加，产酸过快造成肌肉纤维收缩，而产酸慢杂菌会大量繁殖，所以选择产酸较为平均，发酵时间相符的接种量，接种量超过3%时，鱼体色泽呈暗灰色，酸味浓，而接种量2%时，发酵时间24h，鱼体酸度适中，综上所述故选择2%接种量为宜。
3．发酵温度的选择
发酵温度对发酵的影响，La和Lp以1∶1的组合发酵剂发酵腊鱼，分别采用3组发酵温度：20℃、30℃、40℃，接种量为鱼重的2%接种，测定其样品的pH，结果见图7-40。
图7-40　不同发酵温度对腊鱼产酸的影响
由图7-40可知，当La和Lp的1∶1组合发酵温度20℃时，在发酵24h时后产酸速度才开始上升，因为在低温下生长缓慢，产酸的性能较低所致；当发酵30℃时，在发酵6h后产酸速度呈上升趋势，24h时后，pH下降比20℃和40℃时快；当发酵40℃时，产酸速度与30℃pH相差不大，但是40℃时，由于发酵温度较高，容易引起其他杂菌生长。因此确定最合理的发酵为30℃。
4．发酵过程乳酸菌数的变化
发酵前后乳酸菌数的变化见图7-41，随着发酵时间的延长，试验组在6h后乳酸菌呈繁殖趋势，在发酵12h时乳酸菌数上升至107CFU/g，18h后增长缓减；对照组乳酸菌数初始为102CFU/g，发酵12h前上升缓慢，30h时乳酸菌数为105CFU/g。结果表明，以La和Lp组合制成发酵剂发酵腊鱼，能改善产品风味，提高产品安全性和质量稳定性。
图7-41　腊鱼发酵过程中乳酸菌数的变化
5．腊鱼TVB-N值的变化
由图7-42可知，试验组在发酵6h时，TVB-N上升速度较快，6h后上升速度减缓。而对照组随着发酵时间的延长而呈上升趋势，24h时已达到7.65mg/100g。根据文献指出，在发酵过程中生成的CO2、有机酸、过氧化氢、细菌素等均对腐败菌有抑制作用。
图7-42　样品TVB-N值的变化
6．腊鱼烘干过程中水分活度的变化
在烘干腊鱼过程中，试验组和对照组经烘干条件35～38℃，不超过40℃，水分活度变化结果见图7-43。试验组和对照组水分活度均呈显著下降趋势，12h前水分活度下降较快，而后期下降速度较为缓慢。从试验组和对照组的水分活度变化没有显著差异，结果表明，乳酸菌发酵过程对烘干速度没有明显的影响。
图7-43　样品发酵过程中水分活度的变化
7．发酵腊鱼的理化分析
对鲜罗非鱼接种复合乳酸菌发酵腊鱼，通过采用混合菌种对腊鱼发酵，在最佳组合比例发酵工艺条件下，得到的腊鱼肉质柔软，色泽鲜艳，口感柔和。腊鱼质量的理化指标见表7-11。
表7-11　发酵腊鱼理化分析结果
四、腊罗非鱼快速发酵生产工艺条件的优化
1．接种比例的确定
人工接种腊鱼加工工艺：
湖北腊鱼样品乳酸菌、葡萄球菌和酵母菌计数结果见表7-12。
表7-12　湖北腊鱼样品中乳酸菌、葡萄球菌和酵母菌含量
由表7-12可知，该湖北腊鱼样品中的乳酸菌、葡萄球菌、酵母菌的比例接近于4∶1∶2，因此，在人工接种过程中模拟该腊鱼样品中的菌种比例接种。
2．发酵温度的确定
将筛选得到的乳酸菌L3，葡萄球菌S12，酵母菌Y11，接种于液体培养基中，于20℃、25℃、30℃、35℃、40℃下160r/min摇床培养24h后，600nm下测定OD值，各菌株的生长状况见图7-44。
图7-44　各菌株在不同温度下的生长情况
由图7-44可知，乳酸菌L3的最适生长温度为35℃，葡萄球菌S12的最适生长温度为30℃，酵母菌Y11的最适生长温度也为30℃，在25～35℃范围内，3种菌的生长状况良好，发酵温度应在30℃附近选择。
3．发酵时间的确定
将添加2%的蔗糖腌制的罗非鱼，按4∶1∶2的比例接种乳酸菌、葡萄球菌和酵母菌，在30℃下发酵，每4h测定鱼肉pH。试验结果见图7-45。
图7-45　鱼肉pH随时间的变化
由图7-45可以看出，接种后，随着发酵时间的增加，鱼肉pH逐渐降低，这是由于发酵初期以乳酸菌利用碳源产酸为主，使鱼肉的pH下降，到16h时鱼肉的pH接近最低，然后逐渐回升，可能是由于内源酶和微生物作用导致的蛋白质分解产生一些碱性氨基酸或氨等。
4．正交试验设计及感官结果分析
根据前期试验，按4∶1∶2的比例接种乳酸菌、葡萄球菌和酵母菌，选择各因素水平，设计L9（34）正交试验（表7-13）。
表7-13　人工接种腊鱼L9（34）正交设计
食品的感官特性如外观、气味、滋味、组织状态等的评价难以用精确的数据来表达，且易受主观因素的影响，并且只能用模糊语言进行描述，从而影响了客观评价食品感官质量的准确性。应用模糊数学评判理论评价食品感官质量的方法可行、方便、快捷且较为准确，能够更加明确地区分食品感官质量间的差别。因此，按照表7-13正交设计做9个试验，并按照表7-14对9个样品评分标准进行模糊感官评定。9个试验样品的评分结果见表7-14。
表7-14　各试验样品感官评定结果
表7-14　各试验样品感官评定结果（续）-1
根据感官评分表可以确定评判因素集U={滋味，气味，组织质地，色泽}，感官评语集V={好，较好，一般，较差，差}，与U各项指标对应的权重向量A=（0.3，0.3，0.3，0.1）。由表7-14感官评分统计结果得到各试验样品感官综合评判模糊矩阵为：
由矩阵的乘法计算各样品对应评定等级的综合隶属度B=A·R，因此，可以得到B1=（0.11，0.61，0.19，0.01，0.00），B2=（0.15，0.74，0.10，0.01，0.00），B3=（0.22，0.50，0.24，0.04，0.00），B4=（0.10，0.71，0.15，0.01，0.00），B5=（0.11，0.69，0.16，0.04，0.00），B6=（0.00，0.58，0.23，0.19，0.00），B7=（0.01，0.72，0.15，0.12，0.00），B8=（0.00，0.49，0.26，0.18，0.07），B9=（0.00，0.07，0.51，0.29，0.13）。
根据综合评分公式H=，H1=5×0.11+4×0.61+3×0.19+2×0.01+1×0.00=3.58，同理可得其他各样品的感官评分，结果见表7-15。
表7-15　正交试验结果
表7-15　正交试验结果（续）-1
由表7-15极差分析可知，发酵温度对感官的影响最大，其次是发酵时间、接种量和糖添加量。感官评分最高的组合为A1B2C3D2，因此，在接种比例为4∶1∶2时，最佳人工接种发酵工艺为添加2%的蔗糖，接种为108，25℃发酵16h。
5．人工接种对游离氨基酸的影响
比较腌制后接种发酵前鱼肉和接种后的鱼肉中游离氨基酸的变化。试验结果见表7-16。
表7-16　接种前和接种后鱼肉游离氨基酸的变化
表7-16　接种前和接种后鱼肉游离氨基酸的变化（续）-1
由表7-16统计分析可以看出，经人工接种，鱼肉中游离氨基酸的总量为1231.62mg/100g，比接种前增加了21.72%。经统计，接种前必需氨基酸的含量为290.20mg/100g，接种后必需氨基酸的含量为313.90mg/100g，接种后必需氨基酸含量提高约7.55%。苏氨酸、半胱氨酸和牛磺酸是接种前后鱼肉中最主要的游离氨基酸。其中，接种后半胱氨酸含量约为接种前的2倍。天冬氨酸是一种呈鲜味的氨基酸，接种后增加了53.12%，为9.79mg/100g鱼肉。
6．人工接种对游离脂肪酸的影响
比较腌制后接种发酵前鱼肉和接种后的鱼肉中游离脂肪酸的变化。试验结果见表7-17。
表7-17　接种前和接种后鱼肉游离脂肪酸的变化
表7-17　接种前和接种后鱼肉游离脂肪酸的变化（续）-1
表7-17统计了接种前和接种后主要游离脂肪酸的种类和含量。由表7-17可以看出接种后，游离脂肪酸的总量增加。接种前和接种后鱼肉中饱和脂肪酸主要有肉豆蔻酸（C14∶0）、十五酸（C15∶0）、棕榈酸（C16∶0）、硬脂酸（C18∶0）；单不饱和脂肪酸主要有棕榈油酸（C16∶1）、油酸（C18∶1）、二十碳一烯酸（C20∶1）；多不饱和脂肪酸主要有油酸（C18∶2）、花生四烯酸（C20∶4）和二十二碳六烯酸（C22∶6）。腌制后鱼肉中含量最高的游离脂肪酸为油酸（C18∶1），其次为棕榈酸（C16∶0），接种后含量最高的两种游离脂肪酸仍然是油酸（C18∶1）和棕榈酸（C16∶0），且含量基本无变化。接种后，二十二碳六烯酸（C22∶6）含量的变化最为明显，较腌制后增加了58.11%。这可能与接种微生物代谢所产脂肪酶的作用有关。
图7-46表示了接种前和接种后饱和脂肪酸（SFA）、单不饱和脂肪酸（MUFA）和多不饱和脂肪酸（PUFA）含量的变化。接种前和接种后鱼肉中的主要游离脂肪酸都是单不饱和脂肪酸。经过人工接种后，饱和脂肪酸和单不饱和脂肪酸的含量变化不明显，多不饱和脂肪酸含量的变化较大，约为接种前的2倍。人工接种的菌株促进了鱼肉多不饱和脂肪酸的释放。
图7-46　腌制和接种后不同种类脂肪酸的比较
7．人工接种腊鱼产品的理化和微生物指标分析
将按照最佳腌制和人工接种发酵制成的腊鱼产品进行理化指标和微生物指标的检测，测定结果见表7-18。
表7-18　人工接种腊鱼理化和微生物指标
人工接种腊鱼产品经理化检测和微生物检测，无致病菌检出，符合相关产品的卫生标准《盐渍鱼卫生标准》（GB 10138－2005）。
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第八章　罗非鱼鱼糜及鱼糜制品加工技术
第一节　罗非鱼鱼糜加工技术
一、罗非鱼鱼糜加工工艺
1．原料验收
①采用新鲜或冰鲜罗非鱼，鱼体完整，眼球平净，角膜明亮，鳃呈红色，鱼鳞坚实附于鱼体上，肌肉富有弹性，骨肉紧密连接，鲜度应符合一级鲜度。
②原料鱼条重250g以上。
2．原料处理
①原料鱼用清水洗净鱼体，除去鱼头、尾、鳍和内脏，刮净鱼鳞。
②用流水洗净鱼体表面黏液和杂质，洗净腹腔内血污、内脏和黑膜，水温不超过15 ℃。
③在处理过程中，应将鲜度差和机械损伤等不符合质量要求的原料剔除。
3．采肉
①原料处理后，进入采肉机采肉，将鱼肉和皮、骨分离。采肉机的种类较多，有滚筒式、履带式和压榨式等几种，目前国内外普遍采用滚筒式采肉机。具体操作通过滚筒孔径选择、橡胶带压力调整及底部刮皮、骨的刀的调整来控制。采肉滚筒的孔径一般在3～6mm。孔径过小，采肉能力差，得率低；孔径过大，则易混入皮、骨、腹膜等，制品质量较差。
②采肉操作中，要调节压力。压力太小，采肉得率低；压力太大，鱼肉中混入的骨和皮较多，影响产品质量。因此，应根据生产的实际情况，适当调节，尽量使鱼肉中少混入骨和皮。同时，要防止操作中肉温上升，以免影响产品质量。操作中鱼肉温升不得超过3 ℃。
③采肉得率应控制在60%左右。
④采肉工序直接影响产品质量和得率，应仔细操作。
4．漂洗
（1）漂洗的目的
除去脂肪、血液和腥味，使鱼肉增白，同时除去影响鱼糜弹性的水溶性蛋白质，提高产品的质量。
（2）漂洗的方法
采肉后的碎鱼肉，放于漂洗槽中，加入5倍量的水，慢速搅拌漂洗。反复漂洗3～5次。根据原料鱼鲜度，确定漂洗次数，一般来说，鲜度高的鱼可少洗。鲜度差的鱼应多洗。漂洗时间为15～20min。
（3）漂洗条件的控制
①漂洗水的温度应控制在5～10 ℃。②漂洗水的pH应控制在6.8～7.0。③漂洗过程中应尽量减少Ca2+及Mg2+等离子的影响。④最后一次漂洗时，可加入0.2%的食盐，以利脱水。
5．脱水
漂洗以后的鱼肉，经过回转筛进行预备脱水，预备脱水筛的孔径是0.5mm，预备脱水后的鱼肉浆，进入螺旋压榨脱水机脱水。脱水与制品的水分含量、得率和弹性都有关。脱水后的鱼肉含水量应控制在80%～85%。
6．精滤
①脱水后的鱼肉，进人精滤机，除去小骨刺、皮、腹膜等，精滤机的孔径为1.5～2.0mm。
②在精滤过程中，应根据质量要求，选择孔径大小和调节进料的快慢。
③在精滤过程中，鱼肉的温度会上升2～3 ℃。在该操作过程中，鱼肉温度应控制在10℃以下，最高不得超过15 ℃。必要时，应在机外冰槽中加冰降温。
7．斩拌
①精滤以后，便在斩拌机中斩拌，斩拌时间为5～10min。
②为防止鱼肉蛋白冷冻变性，在斩拌过程中应加入白砂糖、山梨糖醇、多聚磷酸盐等添加物。
③在斩拌过程中，鱼糜的温度应控制在10 ℃以下，最高不得超过15 ℃，以防温度升高影响产品质量。
④生产调味冷冻鱼糜时，则在斩拌过程中应同时加入食盐和各种辅助调味料。
8．包装
斩拌后的鱼糜，定量装入聚乙烯袋中，每袋10kg，然后装盘。
9．冻结
装盘后，立即送入-35 ℃的平板冻结机中冻结，在-35℃下冻结2～3h，中心温度达-20 ℃以下时，取出，装于纸板箱中。
10．成品贮藏
①成品应贮藏于-25～-20 ℃的冷库中。
②产品贮藏期为8个月。
二、鱼糜质量影响因素
1．鱼的鲜度对鱼糜质量的影响
鱼的鲜度对鱼糜的质量有显著的影响。鲜度不好的鱼，即使采用最好的加工技术，也难以加工出质量好的鱼糜。鱼体在僵直期发生的生物化学和生物物理的变化会对其肌肉蛋白的功能特性产生显著的影响。一般要求鱼体在进入僵鱼期后尽可能快的进行鱼糜加工。在僵直前，鱼体的鱼糜加工特性一般较差。Park等研究发现罗非鱼在僵直前进行加工，则其鱼糜的蛋白质含量要比僵直后高得多，而且鱼糜的产率和凝胶能力都得到提高。为了更好地保持捕获鱼的鲜度，一般鱼在捕获后，必须尽可能快地进行处理。在捕获的鱼未进行加工处理前，必须采用制冷系统保持鱼的鲜度。
2．漂洗条件对鱼糜质量的影响
漂洗是鱼糜加工中的一道重要工序。漂洗是指用水和水溶液对所采得的碎鱼肉进行洗涤。其目的有两个；一是除去血液、尿素、色素、脂肪、水溶性蛋白质、酶和一些含氮化合物，以改良鱼糜的色泽、气味及组织特性，提高制品的耐冻结性能；二是浓缩肌原纤维蛋白，以提高肌原纤维蛋白的浓度，使鱼糜具有较高的凝胶形成能力。漂洗还可洗去肉中Fe3+、Cu2+、Mg2+、Ca2+等离子成分，防止这些离子在冻藏中由于水的冻结使鱼肉的盐浓度升高而促进蛋白质变性。鱼肉蛋白质中含有20%～35%（占肌肉总蛋白质含量）的水溶性蛋白质，它的存在会影响鱼糜凝胶特性。Okada指出通过水洗可以除去大部分水溶性蛋白质，使肌原纤维蛋白浓度相对提高，使鱼肉弹性增加。
鱼糜的质量与漂洗次数、时间、pH、漂洗水量及质量等密切相关（图8-1～图8-4）。此外，漂洗在提高鱼糜的质量及保藏性能的同时，也带来了一些缺陷，如增加成本、浪费水源、对环境易造成污染等。因此，在进行漂洗时应综合其优缺点选择合适的漂洗条件。钱娟等以低盐罗非鱼鱼糜为原料，研究了不同漂洗方式对鱼糜凝胶特性的影响。结果表明：漂洗对低盐罗非鱼鱼糜的品质有较大影响。传统漂洗方式下的鱼糜凝胶具有最大凝胶强度，碱盐水洗和未漂洗鱼糜凝胶的强度分别次之，TCA可溶性肽的含量和鱼糜凝胶的蛋白溶解率则依次增大。
图8-1　不同漂洗方式下低盐罗非鱼鱼糜凝胶的破断强度（a）和凹陷深度（b）
图8-2　不同加热和漂洗方式下低盐罗非鱼鱼糜凝胶的水分持有力
图8-3　漂洗方式对低盐鱼糜凝胶中TCA-可溶性肽的影响
图8-4　漂洗方式对低盐鱼糜凝胶蛋白溶解率的影响
3．冻结温度、速度及解冻条件的影响
冻结温度、速度会影响所形成的冰晶的大小及分布，冻结速度还会影响所浓缩的盐离子的分布，从而影响冷冻鱼糜的质量。冻结时形成大冰晶，易导致蛋白质冷冻变性。研究发现，鱼肉蛋白在-5～-1 ℃停留时间过长易形成大冰晶，而冻结温度越低、速度越快可避免大冰晶的形成，从而提高鱼肉蛋白的低温储存性。解冻条件如解冻方法、冷冻、解冻循环次数是影响鱼糜蛋白冷冻变性的另一重要因素。李德宝等以罗非鱼鱼肠为对象，研究了不同冻结速率（3.40cm/h、2.73cm/h、0.73cm/h、0.23cm/h）对罗非鱼鱼肠冻结曲线及品质的影响（图8-5～图8-7）。结果表明，罗非鱼鱼肠的冻结点为（-1.4±0.1）℃，随着冻结速率的增加，汁液流失率减少，白度下降；与未冻结的鱼肠相比，4种冻结速率下的冻结都会使罗非鱼鱼肠的破断力、破断距离以及凝胶强度下降。
图8-5　不同冻结速率下罗非鱼鱼肠中心部位冻结曲线
图8-6　冻结速率对罗非鱼鱼肠白度的影响
图8-7　冻结速率对罗非鱼鱼肠感官品质的影响
三、鱼糜在冻藏中的变性特点
由于鱼糜的主要成分是肌原纤维蛋白（水分除外），因而鱼糜在冻藏过程中易发生蛋白质变性而导致其物化特性发生改变，从而使加工出的鱼糜制品质量下降。因此，在前期加工中采用最佳工艺获得鱼糜后，必须在后期的鱼糜冻藏过程中采用有效方法来维持鱼糜蛋白的功能特性。为此，国内外对鱼糜蛋白在冻藏过程中的冷冻变性特点及影响因素进行了较多的研究。
鱼肉蛋白质一般由水溶性的肌浆蛋白、盐溶性的肌原纤维蛋白和不溶性的基质蛋白组成。肌原纤维蛋白是冷冻鱼糜的主要成分，因此，冷冻鱼糜蛋白在冻藏中也易变性而影响其加工性能。有关蛋白质冷冻变性的机理主要有三种学说：一是结合水的脱离学说，该学说认为蛋白质的冷冻变性是由于水分予的冻结引起的；二是细胞液浓缩学说，认为冻结导致细胞液的离子浓度上升，pH发生变化而引起蛋白质的盐析变性；三是水和水合水的相互作用引起蛋白质变性的水化作用学说，认为在冻结时，由于冰晶的形成引起结合水和蛋白质分子的结合状态被破坏，使蛋白质分子内部有些键发生变化，有些键又重新结合。这种旧键的断裂和新键的形成必然会涉及蛋白质的内部结构，从而导致蛋白质变性。目前，较为受到认可的是第三种说法。
国外有学者研究认为，由于冰晶的形成，鱼肉蛋白质在冻藏过程中主要会发生两种变性，一是蛋白质分子的聚集（aggregation），二是蛋白质多肽链的展开（unfolding），图8-8和图8-9为相应的变化模型。
图8-8　具有螺旋结构的蛋白质在冻藏中的变性（聚集）模型
图8-9　非螺旋结构（球形结构）蛋白质在冻藏中的变性（开链）模型
鱼糜或鱼肉蛋白质在冻藏过程中的变性会导致自身一些重要的物化特性发生改变（劣化），这些变化与鱼的种类有关；而物化特性的劣化最终导致其形成凝胶的能力下降。因此，通过检测这些物化特性和凝胶特性的变化，可了解某种鱼糜或鱼肉蛋白的冻藏稳定性及其冷冻变性特点。周爱梅等研究了罗非鱼鱼糜和鳙鱼糜蛋白在-18 ℃冻藏过程中的生化变化和凝胶性能的变化（图8-10）。结果表明：随着冻藏时间的延长，2种淡水鱼鱼糜蛋白的盐溶性、Ca2+-ATP酶活性及巯基含量均下降，而二硫键含量及表面疏水性却增加；冻藏还导致2种鱼糜蛋白凝胶性能的下降，冻藏63d后，罗非鱼鱼糜和鳙鱼糜的凝胶强度依次降低了65.1%和62.3%。
图8-10　罗非鱼糜和鳙鱼糜在-18℃冻藏过程中凝胶特性的变化
影响冷冻鱼糜蛋白变性的因素有很多，可将其归为两类：一是物理化学因素，包括鱼的种类、鲜度、pH、漂洗条件及冷冻温度、速度和解冻条件等；二是化学因素，主要指能防止鱼糜蛋白冷冻变性的各种抗冻剂。米顺利等研究了商业抗冻剂（蔗糖/山梨醇）和海藻糖在罗非鱼鱼糜冻藏过程中对蛋白质变性的影响。结果表明：添加8%海藻糖比8%商业抗冻剂更能有效抑制罗非鱼鱼糜在冻藏过程中的蛋白质变性，减缓凝胶强度的降低，提高鱼糜制品的质量（图8-11～图8-13）。
图8-11　抗冻剂对罗非鱼鱼糜凝胶特性的影响
图8-12　抗冻剂对罗非鱼鱼糜盐溶性蛋白含量的影响
图8-13　抗冻剂对罗非鱼鱼糜肌原纤维蛋白Ca2+-ATP酶活性的影响
第二节　罗非鱼鱼糜制品加工技术
一、鱼糜制品的加工工艺
1．解冻
冷冻鱼糜的解冻方法主要有空气解冻（静止空气解冻即自然解冻和流动空气解冻）、水解冻（温水解冻和流水解冻）、高频电磁波加热解冻、蒸汽喷射解冻等。冷冻鱼糜是否解冻及其解冻程度，对鱼糜制品质量尤其是加工工艺有明显影响，如对凝胶形成能来说，解冻后的冷冻鱼糜比未解冻的鱼糜凝胶化容易形成。冷冻鱼糜解冻至半解冻后，可进行加盐擂溃。
2．擂溃
擂溃是鱼糜制品生产中很重要的一个工序，一般分为空擂、盐擂和调味擂三个阶段。空擂是直接将新鲜鱼糜或半解冻的冷冻鱼糜放入擂溃机内擂溃或斩拌机内斩拌，进一步破坏鱼肉组织。空擂几分钟后，再加入鱼肉量1%～3%的食盐继续擂溃15～20min，使鱼肉中的盐溶性蛋白质充分溶出变成黏性很强的溶胶，此过程叫盐擂。然后再加入调味料和辅料等与鱼肉充分搅拌均匀，此过程叫调味擂。擂溃过程中可适当加冰或间歇擂溃以降低鱼肉温度。擂溃所用的设备有擂溃机、斩拌机和真空斩拌机。
3．加热
加热是鱼糜制品加工的一个重要工艺。不同加热温度和时间对鱼糜的凝胶能力影响很大。擂溃成型后的鱼糜一般在0～40 ℃放置一定时间，然后再进行高温加热，比单纯的高温加热更能增加鱼糜制品的弹性和保水性。国外把这个低温放置过程叫“setting”，国内一般叫它凝胶化阶段或静置，同时把这种加热方式叫两段加热。目前采用的静置方法有三种：一是低温静置，即在0～4 ℃保持12h；二是中温静置，即在25 ℃保持3h；三是高温静置，即在40 ℃保持30min。鱼糜制品的加热方法很多，常用的有蒸煮、焙烤、水煮、油炸等，此外，还有远红外照射、高频加热等。
二、鱼糜制品质量影响因素
1．擂溃对鱼糜凝胶能力的影响
擂溃的意义即破坏鱼类的肌肉组织，擂溃的时间和温度会显著影响鱼糜制品的凝胶能力。擂溃不充分，则鱼糜中的肌原纤维蛋白溶解不充分，即鱼糜黏性不足，加热后制品的弹性就差；但是过度的擂溃，会由于鱼糜温度的升高易使蛋白质变性而失去亲水能力，也会引起制品弹性下降。所以在实际生产中，常以鱼糜产生较强的黏性为准，根据原料性质及擂溃条件的不同将擂溃时间控制在20～30min。为了防止擂溃过程中鱼糜蛋白的变性，擂溃温度一般控制在0～10 ℃。在此温度范围内，鱼肉蛋白的热变性很小，否则，温度升高容易造成鱼糜蛋白变性而影响最终制品的弹性。张崟等研究了擂溃时间对罗非鱼鱼糜凝胶强度的影响，结果显示：擂溃6.5min的处理对鱼糜凝胶的强度提高最大（图8-14）。
图8-14　无盐擂溃时间对鱼糜凝胶特性的影响
2．加热条件对鱼糜凝胶能力的影响
不同加热温度和时间对鱼糜的凝胶能力影响很大。通过加热能使很黏稠的鱼糜形成具有弹性的凝胶，即制成鱼糜制品。另外，加热能致死一部分鱼肉中存在的致病菌、腐败菌等以达到安全卫生的目的。加热速度也会影响鱼糜制品的凝胶状况。周爱梅的研究表明，罗非鱼糜经过一定温度和时间的凝胶化过程后，其凝胶特性显著高于直接加热所获得的凝胶特性，综合凝胶硬度、弹性看，40℃是其最佳凝胶温度，而40℃、1h为其最佳凝胶化条件，此时对应的破断强度、凹陷深度和凝胶强度依次为758.7g、13.57mm和1029.5g·cm（图8-15）。
图8-15　不同凝胶化温度和时间对罗非鱼糜凝胶特性的影响
3．添加成分对鱼糜凝胶能力的影响
（1）水分对鱼糜凝胶能力的影响
在鱼糜制品中添加水分主要是维持制品的合适的质构及降低原材料的成本，但水分加入过多会对鱼糜制品的凝胶能力造成不良的影响。
（2）淀粉对鱼糜制品凝胶能力的影响
在鱼糜制品加工中通常要添加一定量的淀粉，以降低产品的成本。适量的淀粉还可在一定程度上提高鱼糜的凝胶能力。周蕊等探讨了不
图8-16　添加不同淀粉对罗非鱼糜凝胶特性的影响
同种类的淀粉（玉米淀粉、糯玉米淀粉、羟丙基淀粉和交联淀粉）对罗非鱼鱼糜制品凝胶性能、弹性、持水力、色泽以及感官的影响。结果发现：在添加量5%时，4种淀粉均可改善罗非鱼鱼糜凝胶性能，但随着添加量的增加则会降低其凝胶性能。较高添加量时（>5%），交联淀粉对罗非鱼鱼糜凝胶性能影响效果最好。4种淀粉都可以不同程度的提高罗非鱼鱼糜的白度和持水力。对添加5%的4种淀粉的罗非鱼鱼糜凝胶进行感官评价，发现添加交联淀粉后的罗非鱼鱼糜的感官得分最高。
（3）盐对鱼糜制品凝胶能力的影响
食盐的加入除了有调味作用外，在擂溃中添加食盐还具有使盐溶性蛋白充分溶出形成溶胶，随之加热后赋予制品弹性的功能。复合磷酸盐加入可提高鱼糜的pH，使pH远离鱼肉蛋白的等电点，向中性或偏碱性方向移动，从而提高鱼糜制品的保水性和弹性。张崟等的研究发现，添加柠檬酸钠显著提高了新鲜或冻藏鱼糜的凝胶强度（P<0.05），但柠檬酸钠对鱼糜凝胶的白度无显著影响（P>0.05）；添加柠檬酸钙显著提高了新鲜或冷冻鱼糜凝胶的白度（P<0.05），但柠檬酸钙对鱼糜凝胶的强度无显著提高（P>0.05）。综合凝胶强度和白度，柠檬酸钠和柠檬酸钙复合添加效果较好。
图8-17　添加柠檬酸盐对罗非鱼糜凝胶破断强度和凹陷深度的影响
三、鱼糜制品品质改良剂
在鱼糜制品加工技术和理论方面，国内外，尤其是国外，做了大量的研究报道。众多研究表明，影响鱼糜制品凝胶能力的因素有很多，不仅与原料鱼的组成与特性有关，还与加工工艺及所添加的成分有关。有些鱼种，其化学组成及特性决定了其鱼糜能力差，即使在最佳加工工艺条件下，所加工的鱼糜制品的质量仍达不到要求，因而在鱼糜制品加工中，往往要加入一些添加剂（品质改良剂），这些添加剂的加入不仅能提高鱼糜制品的凝胶特性，而且也能降低生产成本。因此可以说，通过添加品质改良剂来提高鱼糜制品的凝胶特性是一种简便、经济、有效的方法。
目前研究较多的鱼糜制品品质改良剂主要有以下几类：一是非肌肉蛋白类，如大豆分离蛋白、大豆组织蛋白、乳清浓缩蛋白、鸡蛋清蛋白、猪血浆蛋白和牛血浆蛋白等；二是钙化合物，如乳酸钙、柠檬酸钙等；三是还原剂，如抗坏血酸、半胱氨酸等；四是亲水胶体类，如果胶、黄原胶、刺槐豆胶等；五是转谷氨酰胺酶。这些物质对鱼糜的凝胶作用和机理都不相同。张崟等探讨了干法及湿法添加大豆分离蛋白（SPI）对罗非鱼鱼糜凝胶性能的影响，发现湿法添加2%的SPI提高了鱼糜凝胶的强度，而干法添加SPI降低了鱼糜凝胶的强度，而且随着SPI添加量的增加而降低（图8-18）。
图8-18　干法及湿法添加大豆分离蛋白对罗非鱼糜凝胶特性的影响
赖燕娜等通过检测鱼糜凝胶的质构和感官特性，探讨了咸鸭蛋蛋清对罗非鱼鱼糜凝胶品质的影响。结果表明，在鱼糜制品中添加咸鸭蛋蛋清一方面能有效改善产品的色泽，另一方面却会稍微降低鱼糜凝胶的凝胶强度和保水性，但对罗非鱼鱼糜凝胶品质无明显劣化影响（图8-19）。
图8-19　咸蛋清对罗非鱼鱼糜凝胶特性的影响
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