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第九章　石斑鱼基因组测序及分子遗传基础
第一节　石斑鱼全基因组测序遗传分析
一、斜带石斑鱼基因组
（一）样品的相关信息及测序策略
斜带石斑鱼基因组采用全基因组鸟枪法测序策略，构建插入长度分别为170 bp、500 bp、800 bp的二代测序文库和长度为20 kb的三代测序文库。使用Illumina和Pacbio测序平台分别进行高通量测序，经过滤后得到有效数据总量为120.31 Gb（表9-2）。
表9-2　全基因组测序文库和测序数据统计表
（二）k-mer分析预估基因组大小
k-mer是指一段长度为kb的序列，对于一个长度为L的序列可以得到（L-k+1）个长度为k的kb-mer序列。笔者对测序得到的reads取k-mer，然后统计每个k-mer出现的频数，在数据量一定的情况下，k-mer出现的频数是服从泊松分布的。使用高质量测序数据32.92 Gb，逐碱基取17-mer获得深度频数分布图，其深度峰值大约在20，总k-mer数为22097528231（图9-1）。从而根据公式，可以估算出斜带石斑鱼的基因组大小约为1.05 Gb。
图9-1　斜带石斑鱼17 mer深度频数分布图
（三）基因组从头组装
利用DBG2LOC软件对Illumina和PacBio数据进行联合组装。首先，Illumina数据通过PLATA-NUS以默认参数构建重叠群（Contig）。而后，DBG2OLC使用上述Contig对PacBio reads进行校正；并将所有数据组装成原始的Contig。接下来，利用PacBio公司Genomic Consensus Package软件包将所有PacBio数据用于纠正组装错误。最后，利用Pilon软件基于Illumina数据对组装序列做进一步改进。得到斜带石斑鱼基因组的框架图，基因组大小为1.02 Gb, Contig N50约为2.5 Mb，总的Scaffold数量为1450个（表9-3）。将Scaffold锚定到斜带石斑鱼遗传图谱，构建了24条染色体序列，覆盖97%的基因组序列。
表9-3　斜带石斑鱼基因组组装长度统计表
（四）斜带石斑鱼基因组注释
1.重复序列（repeat）注释
重复序列广泛存在于真核生物基因组中，这些重复序列或集中成簇，或分散在基因之间。根据分布把重复序列分为散在重复序列和串联重复序列。散在重复序列分为4种：LTR、LINE、SINE和DNA转座子。由于斜带石斑鱼基因组比较大（约1 Gb），这里采用RepeatModeler预测软件来代替Piler、RepeatScout和LTR_finder。然后过滤掉冗余以及低质量的预测结果，以构建De novo的repeat库，再用建好的库作为RepeatMasker的library来寻找基因组中的repeat位置等信息。
最后分析得到重复序列总长度为422.16 Mb，占总基因组的37.48%（表9-4），其中，DNA转座子的总长度为174.83 Mb，占基因组的17.13%，LINE的总长度为152.47 Mb，占基因组的14.94%，SINE的总长度为46.23 Mb，占基因组的4.53%，LTR的总长度为33.59 Mb，占基因组的3.29%（表9-5）。
表9-4　斜带石斑鱼基因组重复序列的统计
2.非编码RNA（ncRNA）注释
用软件tRNAscan-SE通过分析启动子元件的保守序列模式，tRNA二级结构的分析，转录控制元件分析和除去绝大多数假阳性的筛选过程，来寻找基因组中编码tRNA的序列。基于rRNA进化的保守性，用已知近缘物种的rRNA（这里用到的rRNA来源是5S来自Xenopus tropicalis，另外三种rRNA来自Xenopus laevis）作为参考序列，通过与参考rRNA的blast比对来寻找编码rRNA序列。通过基因组与RFAM库（含有miRNA、snRNA等ncRNA）比对，然后通过软件Infernal中的cm-search来确定编码miRNA、snRNA的序列位置。
表9-5　斜带石斑鱼基因组转座元件统计
从斜带石斑鱼基因组中分析得到miRNA的拷贝数为280个，tRNA的拷贝数为1251个，snRNA的拷贝数为259个（表9-6）。
表9-6　ncRNA的注释统计结果
3.基因结构预测
蛋白质编码基因由基因组注释流程工具MAKER联合同源预测、基于转录组的预测和从头预测方法进行预测。基于转录组的预测，使用Trinity软件组装多个不同组织的RNA-seq测序数据，并进行转录本结构预测。同源预测选用欧洲鲈（D.labrax）、斑马鱼（D.rerio）、三刺鱼（G.aculeatus）、人（H.sapiens）、尖吻鲈（L.calcarifer）、青鳉（O.latipes）、黑斑河鲀（T.nigroviridis）、红鳍东方鲀（T.rubripes）（Ensembl Gene version 77）蛋白质序列作为参考。使用RepeatMasker屏蔽重复序列，从头预测AUGUSTUS软件完成。使用MAKER来联合预测基因结构，得到26931个基因。与其他7种硬骨鱼类物种相比，最终基因组具有相似的基因长度、CDS长度、外显子长度和内含子长度分布见图9-2。
图9-2　多个硬骨鱼与斜带石斑鱼的基因结构比较
斜带石斑鱼（E.coioides）欧洲鲈（D.labrax）斑马鱼（D.rerio）三刺鱼（G.aculeatus）人（H.sapiens）尖吻鲈（L.calcarifer）青鳉（O.latipes）黑斑河鲀（T.nigroviridis）红鳍东方鲀（T.rubripes）
4.基因功能注释
将斜带石斑鱼基因组蛋白编码基因翻译成蛋白质的氨基酸序列，然后将这些氨基酸序列通过blast比对相关数据库，从而可以找到与这些氨基酸序列同源的其他物种的蛋白序列，然后根据同源的蛋白序列的功能来确定这些蛋白质氨基酸序列对应的基因的功能，进行InterPro和GO功能注释、代谢途径通路KEGG功能注释、SwissProt和TrEMBL功能注释（表9-7）。
从表9-7可以看出，在斜带石斑鱼基因组中预测得到26931个基因，有25345个基因可以被注释，占总基因数的94.11%。
表9-7　斜带石斑鱼基因注释结果统计
5.基因家族扩张和收缩分析
基因家族的扩张收缩是指生物在进化的过程中，发生了基因的复制或缺失而导致物种中基因数的变化。分析结果显示，在石斑鱼基因组中，有109个基因家族发生了扩张，包括479个石斑鱼基因；92个基因家族发生了收缩，包括333个石斑鱼基因（图9-3）。
二、鞍带石斑鱼基因组
（一）基因组测序和组装
鞍带石斑鱼基因组采用二代+三代测序技术，构建平均插入片段为270 bp、500 bp和800 bp短片段文库以及2 kb、5 kb和10 kb长片段文库，提高了测序与组装的准确性和完整度。基于测序数据和k mer法预估基因组大小为1.165 Gb（图9-4），由Platanus软件（1.2.4版本）组装得到基因组大小为1.128 Gb, Contig N50为1.5 Mb（表9-8）。
图9-3　石斑鱼基因家族扩张和收缩分析
图9-4　17mer深度频数分布图
表9-8　鞍带石斑鱼基因组组装长度统计表
（二）基因组注释
1.重复序列注释
基因组重复序列由同源预测和从头预测分别完成。同源预测利用RepeatMasker、ProteinMasker基于RepBase库（RepBase-16.02）搜索基因组中的转座子元件，得到基因组重复序列的注释信息。从头预测先通过RepeatScout和LTR-FINDER建立De novo预测的重复序列库，对库进行去冗余、污染。然后，利用RepeatMasker软件，基于库来寻找基因组中的重复序列区域。根据串联重复序列的结构和分布特征，利用TRF（Tandem repeats finder）预测基因组中的串联重复序列。最后分析得到重复序列总长度为508.63 Mb，占总基因组的45.09%，其中，DNA转座子的总长度为277.63 Mb，占基因组的24.61%；LINE的总长度为178.36 Mb，占基因组的15.81%；SINE的总长度为16.75 Mb，占基因组的1.48%；LTR的总长度为83.43 Mb，占基因组的7.40%（表9-9）。
表9-9　鞍带石斑鱼重复序列分类结果统计
2.基因结构预测和功能注释
由转录组数据注释、同源基因预测和从头预测得到24794个蛋白编码基因（表9-10）。系统地筛选和识别抗菌肽基因1426个，并定位在染色体上。选择InterPro、KEGG、UniProtKB/SwissProt及UniProtKB/TrEMBL作为注释数据库，共有93.37%的基因得到注释（表9-11）。
表9-10　基因预测的基本统计结果
表9-11　基因集注释结果统计
三、棕点石斑鱼基因组
（一）基因组测序和组装
棕点石斑鱼采用雌核发育个体作为测序样本来降低基因组杂合度。按3个不同插入片段大小，构建3个测序文库。其中，paired-end文库2个，插入片段平均长度为400 bp, matepair文库2个，插入片段的平均长度分别约为2 kb和9 kb。由第二代测序平台Illumina Hiseq2000和Illumina Genome Analy-zer IIx测序，总测序量约160 Gb，总的覆盖率约150×。从k-mer频率的分布来看，基因组的杂合率较低，几乎没有次峰（图9-5）。利用k-mer法计算预估棕点石斑鱼基因组大小约为1.21 Gb；使用SoapDenovo和fermi软件进行组装，最终组装得到的基因组为1.13 Gb, Contig N50为0.84 Mb，约为完整基因组的92%，基因组GC含量为41.34%。
（二）棕点石斑鱼基因组注释
1.重复序列注释
利用RepeatModeler软件进行重复序列从头预测，其结果与RepBase及DFAM数据库结合，采用RepeatMasker软件分析得到总的重复序列长度为411.59 Mb，占总基因组的36.32%。其中，SINE总长度为3.98 Mb，占基因组0.35%；LINE总长度为41.66 Mb，占比3.68%；LTR总长度为11.76 Mb，占基因组1.04%；DNA转座子序列总长度为158.34 Mb，占基因组的13.97%；另有195.83 Mb尚未能分类的重复序列，约占基因组总长度的17.28%（表9-12）。
图9-5　棕点石斑鱼k-mer频率分布（k=17）
表9-12　棕点石斑鱼重复序列基本统计表
2.基因结构注释
基因预测使用Fish-training过的Fgenesh软件进行预测，并且用斜带石斑鱼和斑马鱼的基因模型，以及转录组数据进行筛选检查。最后共预测出蛋白编码（Protein coding）的基因23963个。
3.基因功能注释
将棕点石斑鱼蛋白编码基因序列翻译成氨基酸序列用于基因功能注释。使用Interproscan工具（version 5.35，db version 74.0）进行InterPro蛋白功能信息、GO功能和reactome通路进行注释。利用Kegg Automatic Annotation Server Ver.2.1进行KEGG代谢通路注释。利用blastp程序对Swis-sProt和Nr数据库进行基因功能注释（表9-13）。
表9-13　基因集注释结果统计
表9-13　基因集注释结果统计（续）-1
4.非编码RNA注释
通过基因组与Rfam库（含有miRNA、snRNA等ncRNA）比对，然后通过软件Infernal中的cmsearch来确定编码miRNA、snRNA的序列位置。用软件tRNAscan SE来寻找基因组中编码tRNA的序列，利用软件barrnap预测rRNA（表9-14）。
表9-14　棕点石斑鱼重复序列分类结果统计
四、展望
斜带石斑鱼、鞍带石斑鱼和棕点石斑鱼基因组测序和图谱构建的完成，为石斑鱼类功能基因的发掘与利用提供了基因资源，有利于从基因组水平揭示石斑鱼繁殖、生长、发育、营养、代谢、免疫等重要生命现象的分子调控机制，为筛选鉴定石斑鱼类重要的功能基因、建立石斑鱼功能基因开发与应用平台奠定基础；同时，基因组图谱的完成，将提供大量的重要性状相关分子标记，为建立石斑鱼基因组辅助育种技术，快速培育抗病、抗逆、优质、高产的优良品种奠定重要基础，具有里程碑的意义。
第二节　石斑鱼线粒体基因组
一、石斑鱼线粒体基因组序列（以鞍带石斑鱼为例）
提取鞍带石斑鱼总DNA，构建高通量测序文库，再利用Illumina Hiseq2500平台对其进行测序分析。结果表明鞍带石斑鱼mtDNA全长16743 bp，包含了2个rRNA、22个tRNA、13个蛋白质编码基因以及D-loop区域。13个编码基因为ND1（975 bp）、ND2（1045 bp）、COXⅠ（1551 bp）、COXⅡ（691 bp）、ATP 8（168 bp）、ATP 6（683 bp）、COXⅢ（785 bp）、ND 3（349 bp）、ND 4（1381 bp）、ND4 L（297 bp）、ND 5（1839 bp）、ND6（522 bp）和Cytb（1141 bp）。2个rRNA分别为12S（953 bp）和16S（1706 bp）。22个tRNA长度为69～74 bp。
鞍带石斑鱼mtDNA轻链是由26.55%A、15.02%C、29.67%T以及28.76%G所组成（表9-15）。其中除ND6以及8个tRNA处于轻链上，其他编码基因rRNA以及tRNA均在重链上。13个编码基因除COXⅠ起始密码子为GTG以及为CTG外，其他ATP6编码基因起始密码子均为ATG。而且终止密码子分为三种，与平常终止密码有不同之处，分别为TAA、TA和T。相对应的编码基因分别为TAA（COXⅠ、ATP8、ND4L、ND5、ND1、ND6）、TA（COXⅢ、ATP6）和T（ND2、COXⅡ、ND3、ND4、CYTB）。
表9-15　鞍带石斑鱼线粒体基因组基因结构信息
表9-15　鞍带石斑鱼线粒体基因组基因结构信息（续）-1
二、石斑鱼线粒体基因组序列比较
14种石斑鱼包含8个亲本和6个杂交石斑鱼。亲本为鞍带石斑鱼、斜带石斑鱼、赤点石斑鱼、棕点石斑鱼、云纹石斑鱼、三斑石斑鱼、青石斑鱼和驼背鲈；杂交石斑鱼为红龙石斑鱼[赤点石斑鱼（♀）×鞍带石斑鱼（♂）]、云龙石斑鱼[云纹石斑鱼（♀）×鞍带石斑鱼（♂）]、虎龙石斑鱼[褐点石斑鱼（♀）×鞍带石斑鱼（♂）]、青龙石斑鱼[斜带石斑鱼（♀）×鞍带石斑鱼（♂）]、鼠龙石斑鱼[驼背鲈（♀）×鞍带石斑鱼（♂）]和青红石斑鱼[斜带石斑鱼（♀）×赤点石斑鱼（♂）]。14种石斑鱼线粒体基因组序列号见表9-16。
表9-16　石斑鱼物种线粒体基因组Genebank序列号
表9-16　石斑鱼物种线粒体基因组Genebank序列号（续）-1
图9-6　鞍带石斑鱼线粒体基因组基因结构图
8个亲本线粒体基因组全长相差碱基90～340 bp，其中青石斑鱼线粒体最长，为16798 bp；斜带石斑鱼最短，为16458 bp。6个杂交石斑鱼中红龙石斑鱼、青红石斑鱼和云龙石斑鱼与其对应的母本线粒体基因组全长一样，但是青龙石斑鱼与其母本斜带石斑鱼相差40 bp，而鼠龙石斑鱼比其母本多6 bp。D-loop全长比较发现，相差碱基与基因组全长相差碱基保持一致。
8个亲本线粒体基因组轻链碱基含量相差无几，碱基A上下幅度最大的只有1.12%，碱基T只有1.23%；而碱基G最大相差却有13.21%，相对应的碱基C也有14%。对应的D-loop区域其碱基组成比例波动不大。6个杂交石斑鱼分别与其母本相比较，轻链和D-loop均有小幅度变动，变动范围在0.01%～0.87%，其中青红石斑鱼与其母本斜带石斑鱼变化最大。
14种石斑鱼线粒体基因组各个基因位置顺序不变，但是基因长度以及基因间的间隔有所不同。基因间隔碱基差异最大的在赤点石斑鱼ATP 8与ATP 6两个基因之间，具有11 bp间隔差异，其他各基因间隔差异在1～3 bp。部分编码基因以及tRNA除D-loop区长度具有1～10 bp的差异，差异最大的为赤点石斑鱼ATP 6基因，与其他石斑鱼具有10 bp的差异。6个子代基因长度以及基因间隔均分别与其对应的母本相同。
14种石斑鱼线粒体基因组AT偏移率/GC偏移率相差不大，而且杂交石斑鱼与其相对应的母本也相差无几。鞍带石斑鱼与赤点石斑鱼、杉斑石斑鱼、青石斑鱼和红龙石斑鱼比较计算所得Ks值位于0.8～0.9，Ka值位于0.3～0.4；而与其他的石斑鱼比较计算所得Ks值保持在0.6上下，Ka值在0.25左右。Ka/Ks值均在0.04左右，小于1，即有纯化选择作用。
三、石斑鱼与鲈形目物种比较以及系统发育关系
（一）CCT制图分析
以鞍带石斑鱼mtDNA全长为目标物种，与其他61种鲈形目物种mtDNA全长绘制CCT图。COG功能基因分类显示mtDNA各个蛋白编码基因均分类于G COG（碳水化合物的运输以及代谢活动），其中ND5还归类于U COG（细胞内合成、分泌和膜泡运输）。鞍带石斑鱼mtDNA的A-T偏移率结果表明0～5 kb, A-T skew+多于A-T skew-，而5～15 kb, A-T skew-多于A-T skew+。从图9-7可知，根据由外向里的顺序，其物种的mtDNA长度呈现一个缩短的趋势，而且序列同源性也在下降。物种越靠外（离鞍带石斑鱼越近），在一定程度上表示其与鞍带石斑鱼亲缘关系越近（图9-7）。
图9-7　鲈形目线粒体基因组全长可视化比较
以鞍带石斑鱼mtDNA CDS区域为目标物种，与其他61种鲈形目物种mtDNA CDS区域绘制CCT图。各个物种的各个基因序列同源性也不尽相同，由外向里各物种各基因的同源性越来越低（图9-8）。
（二）系统发育关系分析
采用62种鲈形目物种mtDNA CDS区域构建进化树，对14种石斑鱼系统发育进行分析。云斑虾虎鱼（Yongeichthys criniger）作为外群，整个进化树分成两大支，鮨科为第一大支，而真鲈科、鳜科、太阳鱼科和蝴蝶鱼科汇成第二大支。第一大支中石斑鱼属、光腭鲈属和驼背鲈属汇成一支。棕点石斑鱼、虎龙石斑鱼与白线光腭鲈亲缘关系近；云纹石斑鱼、云龙石斑鱼与褐石斑鱼亲缘关系近；斜带石斑鱼、青龙石斑鱼、青红石斑鱼和点带石斑鱼汇成一小支，再与鞍带石斑鱼汇聚；驼背鲈、鼠龙石斑鱼与棕斑石斑鱼亲缘关系近，而后上述石斑鱼再汇成一支。杉斑石斑鱼与玳瑁石斑鱼为一小支，再与点列石斑鱼、宝石石斑鱼、布氏石斑鱼以及蜂巢石斑鱼汇成一支；青石斑鱼与斑带石斑鱼距离很近，赤点石斑鱼与红龙斑为一小支，而后和青石斑鱼、斑带石斑鱼汇聚，再与六带石斑鱼、南海石斑鱼汇聚。最后所有鮨科汇聚成为第一大支（图9-9）。
采用62种鲈形目物种mtDNA D-loop区域构建进化树，对14种石斑鱼的系统发育进行分析。云斑虾虎鱼作为外群，整个进化树分成很多支，其中鮨科中石斑鱼属、光腭鲈属、九棘鲈属、驼背鲈属和烟鲈属汇聚成为一支。棕点石斑鱼、虎龙石斑鱼先与宽带石斑鱼，后与鞍带石斑鱼汇聚成一小支；云纹石斑鱼、云龙石斑鱼、褐石斑鱼、白线光腭鲈以及横纹九刺鮨汇聚成一小支；斜带石斑鱼、青龙石斑鱼、青红石斑鱼、点带石斑鱼和黑斑石斑鱼相距较近，上述物种汇聚成一支，而后与驼背鲈、鼠龙石斑鱼以及棕斑石斑鱼汇聚成一支。赤点石斑鱼、红龙石斑鱼、六带石斑鱼、青石斑鱼、斑带石斑鱼和南海石斑鱼关系较近，而后与杉斑石斑鱼所在的小支汇聚成一支（图9-10）。
图9-8　鲈形目线粒体基因组蛋白编码区可视化比较
四、石斑鱼分化时间估算
使用鲈形目物种的mtDNA CDS序列，以五个已知进化时间的近缘物种条纹豆娘鱼、眼斑双锯鱼、横带瘤头丽鱼、狮王高地丽鱼、多鳞球丽鱼（Takada et al，2010）作为参考。用MEGA7软件的Rel-Time ML方法计算分化时间构建时间树。参考物种进化时间见表9-17。结果显示，斜带石斑鱼分化估算时间大约在24万年前，鞍带石斑鱼大约在3748万年前，云纹石斑鱼大约在23万年前，棕点石斑鱼大约在245万年前，驼背鲈大约在29万年前，赤点石斑鱼大约在69万年前，青石斑鱼大约在1733万年前，三斑石斑鱼大约在2019万年前。六个杂交子代进化时间的估算：青红石斑鱼和青龙石斑鱼都大约在19万年前，云龙石斑鱼大约在18万年前，虎龙石斑鱼大约在245万年前，鼠龙石斑鱼大约在29万年前，红龙石斑鱼大约在69万年前（图9-11）。
图9-9　鲈形目线粒体基因组蛋白编码区进化树
图9-10　鲈形目线粒体基因组控制区域进化树
图9-11　分子钟时间图
表9-17　参考物种分化时间表
利用五个已知进化时间的近缘物种作为参考序列，Abudefduf vaigiensis和Amphiprion ocellaris分化时间在9500万～8500万年前，地质年代处于古近纪；Ptychochromoides katria、H ypselecara temporalis和Tylochromis polylepis分化时间在144500万～10000万年前，为白垩纪时代。使用鲈形目物种的mtDNA编码基因的核苷酸序列进行构建时间树。14种石斑鱼中云纹石斑鱼分化估算时间最晚，大约在23万年前；斜带石斑鱼与云纹石斑鱼分化估算时间差不多，大约在24万年前，其次是驼背鲈和赤点石斑鱼，分化估算时间分别为大约29万年前和69万年前；青石斑鱼要早于云纹石斑鱼进化估算时间，大约在1733万年前；三斑石斑鱼进化估算时间要更早一些大约为2019万年前，最早的为鞍带石斑鱼，为3748万年前。八种亲本分化估算时间都处于新近纪年代。6个杂交子代为近年通过8个亲本所杂交出来的，由于其mtDNA序列表现为严格的母系遗传，所以在时间树上显示其为对应的母本的分化估算时间。
五、展望
对14种石斑鱼的mtDNA进行对比分析，包括8个亲本（鞍带石斑鱼、斜带石斑鱼、赤点石斑鱼、棕点石斑鱼、云纹石斑鱼、三斑石斑鱼、青石斑鱼以及驼背鲈）、6个杂交石斑鱼（红龙石斑鱼、云龙石斑鱼、虎龙石斑鱼、青龙石斑鱼、鼠龙石斑鱼以及青红石斑鱼）。8个亲本线粒体基因组全长相差碱基90～150 bp，其中青石斑鱼的线粒体最长，为16798 bp，斜带石斑鱼的最短，为16458 bp。而6个子代中，杂交石斑鱼与其相对应的母本相比较，红龙石斑鱼、青红石斑鱼和云龙石斑鱼与其对应的母本线粒体基因组全长一样，虎龙石斑鱼与其母本相差4 bp，碱基在编码基因范围内，属于正常范围内的碱基突变；而青龙石斑鱼与斜带石斑鱼相比少40 bp，鼠龙石斑鱼比其母本多6 bp。而且这些长度差异均来自其对应的D-loop区序列，主体各个基因长度和序列只有少量的突变，大体未变，表现为严格的母系遗传。青龙石斑鱼为品质高的杂交品种，但是在养殖过程中会出现浮头现象，因此猜测是否与线粒体基因组D-loop区域少了40 bp有关，可进一步通过实验论证。鼠龙石斑鱼多出的6个碱基与其父本鞍带石斑鱼相比，只有2个碱基相同，其余4个碱基不同，因此无法确定是否存在父系遗传的证据，可以进一步设计实验探讨是否存在父系遗传。
14种石斑鱼基因组AT偏移率/GC偏移率相差不大，而且子代与其相对应的母本也相差无几。Ka/Ks分析中发现，鞍带石斑鱼与赤点石斑鱼、杉斑石斑鱼、青石斑鱼和红龙石斑鱼比较计算所得Ks值位于0.8～0.9，Ka值位于0.3～0.4；而与其他石斑鱼比较计算所得Ks值保持在0.6上下，Ka值在0.25左右。Ka/Ks值均在0.04左右，小于1。
以14种石斑鱼线粒体基因组为目标物种，与其他已有线粒体基因组的鲈形目物种进行结构比较分析以及系统发育关系分析。利用62个物种的线粒体基因组全长以及CDS区构建CCT图，物种由外向里其mtDNA的长度呈现缩短的趋势，而且序列同源性也在下降。各个物种长度差异基本是由其D-loop区长度不一所引起的，证实了D-loop区确实为高度变异区域。全长以及CDS区分别构建的CCT图中，各个科的位置基本没变，其中的物种位置有不大的调整。而身为外群的云斑虾虎鱼在全长CCT图中位置合理，在最内端，显示其与鞍带石斑鱼差异最大；而在CDS CCT图中位置却在57号，里面还有4个物种。造成这一结果的原因可能是云斑虾虎鱼CDS区域变异程度要低于其D-loop，进一步证实了D-loop的高度变异性。
采用62种鲈形目物种mtDNA CDS区域以及D-loop分别构建进化树，对14种石斑鱼的系统发育进行分析。关于8种石斑鱼亲本的系统发育关系，鞍带石斑鱼与斜带石斑鱼亲缘关系最近，其次与云纹石斑鱼汇聚成一支；赤点石斑鱼与青石斑鱼最近，与三斑石斑鱼汇聚，再与棕点石斑鱼汇聚成为一支；进而两支汇合，其中驼背鲈亲缘关系最远。而6种杂交子代石斑鱼与其母本最近，表现为严格的母系遗传。白线光腭鲈与石斑鱼亲缘关系很近，可以进行属间杂交实验开发新品种。
第三节　石斑鱼遗传连锁图谱及分子标记开发
一、斜带石斑鱼高密度遗传连锁图谱
采用RAD测序技术，以斜带石斑鱼F1全同胞家系为作图群体（包括2个亲本及142个F1个体），构建石斑鱼遗传连锁图谱。RAD测序共产生99.8 Gb的数据量，平均每个样品693 Mb，基因组覆盖率0.63×。过滤后的数据量为93.1 Gb，共筛选到18256个SNP标记，其中父本杂合的标记7108个，母本杂合的标记8100个，双亲杂合的标记3048个，所有标记覆盖的scaffold的总长为984212kb，占所组装的基因组总长的95.3%。利用Joinmap 4.1软件构建所有标记的整合遗传图谱和性别特异连锁图谱，分群LOD阈值为15，采用回归法（Regression mapping）进行分群和排序。所有图谱均可分为24个连锁群，与斜带石斑鱼的染色体对数一致。在整合图谱中，24个连锁群作图标记总数为4608个，总图距为1581.67 cM，覆盖的物理长度为919.12 Mb，覆盖所组装基因组的89%，两个标记平均图距为0.34 cM，平均物理距离为199.4 kb。在雌性图谱中，标记总数为2516个，图谱总长度为1370.9 cM，覆盖的物理长度为704.8 Mb。在雄性图谱中，标记总数为2939个，图谱总长度为1335.5 cM，覆盖的物理长度为800.4 Mb（表9-18）。
表9-18　斜带石斑鱼遗传连锁图谱标记和图距情况
用RAD测序技术，获得覆盖斜带石斑鱼全基因组的SNP位点，对石斑鱼群体的每个个体进行基因分型，同时进行群体结构分析，选择合适的模型[一般线性模型（GLM）或混合线性模型（MLM）及其他模型]，开展位点与生长性状关联分析，确定相关的SNP位点。共筛选到75077个SNP标记，标记的平均密度为每100 kb 7.3个SNP位点，标记在整个基因组的分布比较平均，基于筛选出来的SNPs，结合体重、体高、尾柄高、全长、体长、头长、吻长、尾柄长、眼径、眼间距、体厚11个性状的表型数据进行关联分析，结果表明，有562个SNPs与11个表型性状存在显著关联（P＜0.05），其中有116个SNPs为极显著关联（P＜0.01）（表9-19）。有多个SNPs同时与多个性状存在关联。比如，有16个SNPs与体重性状显著关联（图9-12），其中有14个SNPs与其他性状也存在显著关联。
表9-19　每个性状与其他性状共关联的SNP个数
表9-19　每个性状与其他性状共关联的SNP个数（续）-1
图9-12　与体重显著关联的SNPs
结合基因组注释信息，对与体重相关的95个SNPs所在的序列（侧翼各500 bp）进行注释，有91个SNPs处在非基因区，有4个SNPs位于基因区的非外显子区，其中各有2个SNPs位于同一个基因区域。这4个SNPs的注释信息如表9-20所示。
表9-20　位于基因区的4个SNPs
对95个SNPs所在的序列进行飞行时间质谱引物设计，其中有4个点未能成功设计出引物，有91个点能成功设计出引物。
验证群体为在大亚湾渔业试验中心于2013年4月在同一时间孵化，并在同一水体环境下养殖至2013年8月的斜带石斑鱼。总共300尾，体重平均值71.1 g，最大值108.5 g，最小值13.2 g。
飞行时间质谱基因分型结果显示，有11个SNPs出现PCR反应失败、分型全杂合或假阳性，未能获得分型结果，有80个SNPs成功分型。
对这80个SNPs基因分型数据进行过滤，过滤标准如下：最小等位基因频率小于1%、缺失率大于50%、杂合率大于80%，以上三个条件满足一个即把该位点过滤掉。因此，有43个SNPs用于关联分析，关联分析结果如图9-13所示，这些位点的-log10P值均小于3（有1个点为2.7，其余的均小于2），关联不显著。
控制生长性状的因素较复杂，从个别群体识别到的关联SNPs可能会由于群体结构、人为因素引起的表型数据差异等因素存在一定的假阳性。还需要更加严格地培育具有丰富表型变异的自然群体和家系群体，同时，采用基因组重测序的方法，这样可以最大限度地覆盖整个基因组水平，避免漏掉真正的关联位点。
图9-13　43个SNPs在斜带石斑鱼群体关联分析结果
二、赤点石斑鱼高密度遗传连锁图谱
赤点石斑鱼图谱与赤点石斑鱼单倍体染色体数目一样，分为了24个连锁群（LG1～LG24）。图谱总共包含了3435个标记，总图距为2300.12 cM，平均图距为0.67 cM。每个连锁群上标记个数范围在20（LG22）～251（LG8），图距范围在17.79（LG13）～157.18 cM（LG8）。3151个标记位于雌性图谱，总图距为2464.56 cM，平均图距为0.78 cM。而雄性图谱上只有1220个标记，其总图距为1671.97 cM，平均图距是1.37 cM。雌性图谱每个连锁群上图距范围在45.69（LG22）～177.05 cM（LG11），而雄性图谱图距范围在21.32（LG24）～126.50 cM（LG1），详情见表9-21。
表9-21　赤点石斑鱼遗传连锁图谱信息表
表9-21　赤点石斑鱼遗传连锁图谱信息表（续）-1
三、赤点石斑鱼QTL定位
对赤点石斑鱼家系父母本以及其F1共144个子代进行测序分析后，鉴定出6个与全长性状相关的QTL位点（表9-22），分别位于LG6、LG8、LG10、LG11、LG14和LG18，总共包括10个标记，可解释表型变异范围在10.3%～11.8%；7个与体长性状相关的QTL位点，位于LG1、LG6、LG10、LG16、LG18和LG19，总共包括12个标记，可解释表型变异范围在10.6%～12.9%；4个与体重性状相关的QTL位点，分别位于LG8、LG10、LG11和LG19，总共包括了6个标记，可解释表型变异范围在10.7%～12.6%，LOD值均大于3.5（图9-14）。
表9-22　赤点石斑鱼QTL定位分析
表9-22　赤点石斑鱼QTL定位分析（续）-1
对赤点石斑鱼三个生长相关性状（全长、体长和体重）进行QTL定位分析，鉴定出9个与全长性状相关的标记，位于LG6、LG8、LG10、LG11和LG18；12个与体长性状相关的标记，位于LG1、LG6、LG10、LG16、LG18和LG19；6个与体重性状相关标记，位于LG8、LG10、LG11和LG19。
图9-14　LOD值
四、展望
生长相关性状是非常重要的经济以及生态性状，是通过多个基因来调节的。在分子遗传育种中，生长相关性状的QTL定位分析是非常重要的研究方法。关于生长相关性状的QTL定位分析在多个鱼类中也取得了很多成果，本研究获得的石斑鱼基因连锁图谱为后期比较基因组学以及QTL定位提供了基础，而生长性状相关QTL分析结果为后期筛选具优良生长性状的石斑鱼提供了基础。
第四节　石斑鱼抗病相关基因挖掘及功能分析
一、Toll样受体家族
Toll样受体（Toll-like receptor, TLR）是模式识别受体的重要组成成员，在石斑鱼中已经克隆获得了TLR 1（HM357229.1）、TLR2（HM357230.1）、TLR3（HQ880667.1）、TLR5 M（mem-brane TLR5）（KM282522.1）、TLR5 S（soluble TLR5）（KR005612.1）、TLR7（KM282523.1）、TLR8（KM282524.1）、TLR 9（GQ202585.1）、TLR 13（MG017497.1）、TLR21（GU198366.2）、TLR22（JQ965995.1）以及TLR信号通路中重要信号分子MyD 88（JF271883.1）、IKKα（KM669149.1）、IKKβ（KM669150.1）基因序列，并进行了功能初探，重点展开了TLR 1、TLR2、TLR5 M、TLR5 S、TLR 13、TLR21及TLR22调控机制的深入研究。
斜带石斑鱼TLR1和TLR2蛋白胞外区分别存在9个和10个富含亮氨酸的重复基序（LRR），胞内区各有1个TIR结构域，主要在脾脏、头肾和胸腺中表达，共同参与了溶藻弧菌感染的免疫应答。
斜带石斑鱼TLR5 M具有典型的TLR结构，由10个用于识别配体的富含亮氨酸重复序列的LRR结构域，1个跨膜结构域以及1个用于传递信号的典型TIR结构域组成，在头肾和肾脏中高表达，能特异性地识别副溶血弧菌鞭毛蛋白，并活化下游核因子κB（nuclear factor kappa-B, NF-κB）信号通路。TLR5 S是鱼类所特有的TLR 5亚家族成员，斜带石斑鱼的TLR5 S具有特殊的氨基酸结构，由17个富含亮氨酸重复序列的LRR结构域构成，不具备跨膜结构域及TIR结构域，广泛分布在多种免疫组织中，其中在脾脏和肾脏中有较高的表达。利用siRNA干扰技术在斜带石斑鱼脾脏细胞（Grouper spleen cell, GS细胞）中双敲降TLR5 M和TLR 5 S，发现TLR5 M和TLR 5 S双敲降后显著下调了鞭毛蛋白所诱导的细胞因子干扰素-γ2（Interferon-γ，IFN-γ）、白细胞介素-6（Interleukin, IL）及肿瘤坏死因子-α（Tumor Necrosis Factor, TNF）基因表达，即说明斜带石斑鱼TLR5 M和TLR 5 S参与调控细菌鞭毛蛋白所诱导的细胞因子表达，从而发挥抵御细菌入侵的作用。
斜带石斑鱼TLR 13同样具有典型的TLR结构域，由1个信号肽，14个LRR结构域，1个跨膜结构域和1个TIR结构域构成，在胸腺、脾脏等免疫器官中广泛分布。利用免疫荧光技术发现在HEK 293T细胞及GS细胞中，TLR 13大部分与内质网共定位，部分与早期内体共定位，暗示着TLR13蛋白在内质网合成后会被运输到早期内体去发挥功能。在表达模式分析中发现细菌RNA以及23S rRNA保守片段（ORN sa 19）均能促进斜带石斑鱼TLR 13的表达，在双荧光素酶报告基因检测中发现HEK 293T细胞过表达TLR 13介导了ORN Sa 19所引发的IFN-β启动子活性，从而推测斜带石斑鱼TLR13能够识别细菌23S rRNA保守片段来发挥清除病原的免疫作用。
斜带石斑鱼TLR21由1个N端富含半胱氨酸的CAP，27个LRR结构域，1个C端富含半胱氨酸的CAP和1个胞内的TIR结构域构成，在脾脏和肾脏中高表达，参与了刺激隐核虫早期感染过程。在双荧光素酶报告基因检测中发现HEK 293T细胞过表达TLR21-TIR结构域能够抑制NF-κB活性。
斜带石斑鱼TLR22也具有典型的TLR结构，由17个LRR结构域、1个跨膜结构域以及1个TIR结构域构成，主要在免疫相关组织中广泛分布，在肾和头肾中有较高水平的表达。利用免疫荧光技术发现，在HEK 293T细胞及GS细胞中，TLR22主要定位于内体上，且功能受到内体酸化的影响。在dsRNA类似物HMW刺激下，斜带石斑鱼TLR22能抑制下游NF-κB通路活化，而选择性地促进下游MAPKs通路中ERK的磷酸化，随后验证了TLR22的LRR区域是识别配体的关键结构域，还参与调控下游信号通路的传递方向。
二、Nod样受体家族
Nod样受体（NOD-like receptors, NLRs）是一类胞内受体，能够识别入侵的外源病原微生物，引起下游的免疫和炎症反应，最终起到消灭病原的作用，其中NOD1和NOD2受体是两个典型代表。目前已经在斜带石斑鱼中对NOD 1（JX220894）、NOD 2（JX220895）以及NLRX 1基因进行了克隆，并分别对其功能进行了初步探索。
斜带石斑鱼NOD1蛋白具有典型的CARD-NOD-LRR结构域，在进化上十分保守，与斑点叉尾鮰亲缘关系较近；NOD2蛋白具有典型的CARD-CARD-NOD-LRR结构域，在进化上十分保守，与红鳍东方鲀及虹鳟亲缘关系较近。斜带石斑鱼NOD 1和NOD 2在多个免疫相关组织中广泛表达，其中NOD 1基因在皮肤和肝中高表达，而NOD 2基因在中肾和头肾中高表达，说明NOD 1和NOD 2在石斑鱼的免疫相关组织中发挥重要作用。在对斜带石斑鱼注射半致死量的溶藻弧菌后发现，NOD 1基因在细菌入侵24h时表达量显著上调，随后开始恢复，而NDO2在细菌入侵24h及48h时均发现表达量显著上调。在用细菌类似物脂多糖LPS和病毒类似物Poly I：C孵育斜带石斑鱼外周血、脾脏及头肾白细胞后，发现NOD 1、NOD 2受体基因及其下游信号通路分子RICK及IL-8的表达明显上调，NOD 1在LPS刺激后表达量上调显著，而NOD 2在Poly I：C刺激后上调显著，推测其可能分别在对细菌或病毒识别并清除中发挥重要作用。在细菌及病毒的不同结构组成刺激HEK293T细胞的双荧光实验中，发现NOD2蛋白能够通过识别多种病原组分在抗菌及抗病毒防御中发挥作用，而NOD1蛋白只在细菌细胞壁组分DAP刺激后上调NF-κB-luc活性，即推测NOD1可能通过识别DAP来活化下游信号通路达到消除病原的目的。
斜带石斑鱼NLRX 1由1个NACHT结构域和位于C端的5个LRR结构域构成，在外周组织中广泛分布，高表达于免疫器官，多表达于富含线粒体的组织以及富含肌细胞的部位，并参与溶藻弧菌的早期感染过程。
三、C型凝集素受体
凝集素受体能够识别病原体微生物，参与细胞间相互作用，其同源物具有抗冻效果。在斜带石斑鱼体内成功的克隆一种类C型凝集素（CTLP）基因，编码174个氨基酸，其中包含一个19个氨基酸残基的信号肽序列，一个CLECT结构域和一个WND功能位点，与其他鱼类C型凝集素氨基酸序列的同源性在38%～70%，该基因在肝脏中高表达，暗示CTLP可能具有免疫相关功能。利用免疫荧光技术发现，斜带石斑鱼CTLP主要分布在细胞质中。在不同温度刺激细胞实验中发现低温会引发CTLP基因表达量上调，在石斑鱼CTLP重组蛋白对细菌保护实验中发现细菌的存活率与CTLP蛋白浓度呈正相关关系，暗示着石斑鱼CTLP具有抗冻功能。
四、白细胞介素受体
白细胞介素（Interleukin, IL）是体内免疫细胞因子的重要成员，调节细胞活化、增殖和分化，通过IL与细胞间连续的相互作用，扩大免疫应答反应。在已获得有活性的斜带石斑鱼IL-1β重组蛋白的基础上，开展了针对IL-1受体（IL-1R）的相关研究。IL-1R是IL-1R/Toll like受体超家族的重要成员，在免疫过程中发挥着重要作用。IL-1R通过结合特异性配体IL-1β，激活下游多个信号通路，促进部分免疫细胞增殖与成熟，调控相关细胞因子表达。目前克隆得到斜带石斑鱼IL-1受体样蛋白（IL-1RLR）基因，该基因编码了一个由347个氨基酸残基组成的前体肽，在结构上与Ⅱ型IL-1R相似，具有1个信号肽、2个胞外的免疫球蛋白样（Ig like）结构域以及一个很短的胞内部分（未发现TIR结构域存在）。IL-1 RLR基因主要在免疫相关组织中表达，其中在肝脏和脾脏中表达量最高，并参与了刺激隐核虫感染的免疫过程。斜带石斑鱼IL-1β重组蛋白孵育能显著上调斜带石斑鱼头肾白细胞中IL-1RLR和IL-1β基因的表达。
五、补体
鱼类补体（Complement）系统是由蛋白质裂解酶、酶抑制因子和受体构成的限制性蛋白溶解系统，是先天免疫系统中重要的组成成员，能直接参与机体防御，其生物学活性能够影响机体抵御病原的能力、免疫复合物形成和持续时间。在鞍带石斑鱼感染溶藻弧菌的模型中，溶藻弧菌通过NF-κB途径诱导了IL-1β和IL-6的表达，另外感染还诱导了补体系统中C3、C6、C7、C8及C9基因的表达，从而推测补体系统可能通过形成膜攻击复合体来裂解细菌膜结构，在细菌早期感染中发挥消除细菌的免疫作用。
六、干扰素
干扰素（Interferon,IFN）是一类诱导性多基因家族细胞因子，通过结合细胞膜上相应的受体、引发信号转导，启动其相应的抗病毒免疫、细胞凋亡及机体和细胞的免疫反应等生物学效应，在鱼类抗病毒防御中起重要作用。鱼类中包含Ⅰ型和Ⅱ型两类IFN，其中的IFN-γ作为Ⅱ型干扰素的成员，主要通过增加细胞表面分子主要组织相容性复合物Ⅱ类分子的表达，使细胞产生抗病毒活性，增强细胞活力，从而促进免疫应答，由于其具广谱抗病毒活性，对鱼类病毒和非鱼类病毒（RNA和DNA病毒）都有相应的抑制作用。
通过同源克隆和RACE的方法克隆得到斜带石斑鱼IFNγ1和IFNγ2基因序列，同时也发现斜带石斑鱼IFNγ1和IFNγ2广泛分布在免疫组织中，其中，IFNγ1在胸腺和肠中表达量最高，IFNγ2在鳃和脾中有高水平表达。斜带石斑鱼IFNγ1和IFNγ2重组蛋白可以促进血淋巴细胞中一氧化氮的释放和呼吸暴发，促进头肾细胞STAT1的磷酸化，调节TRAF6蛋白的表达。在细菌类似物LPS和病毒类似物Poly I：C分别刺激斜带石斑鱼头肾白细胞和脾白细胞实验中发现，Poly I：C对IFNγ1和IFNγ2基因都有一定的刺激表达作用，两者的表达模式却有所不同，但IFNγ1和IFNγ2的表达都对LPS的刺激作用不敏感，说明斜带石斑鱼IFNγ1和IFNγ2重组蛋白在机体中发挥着不同效果的抵御病毒感染功能。
七、天然抗体
天然抗体是指未经过抗原主动免疫而天然存在于机体内的各种免疫球蛋白，由遗传基因编码，在首次遇到病原刺激时能够快速有效地产生抗体反应。同高等脊椎动物一样，鱼类的黏膜能够产生一定数量的分泌型抗体，在抵御病原体的黏附、入侵过程起着相当重要的作用。免疫球蛋白IgM需要通过pIgR介导的转胞吞作用，来确保其在黏膜保护中发挥免疫作用。
在证实硬骨鱼的pIgR参与抗体IgM的转运的基础上，已克隆获得了斜带石斑鱼pI gR基因，在分析斜带石斑鱼与哺乳动物pIgR的结构特征中发现，斜带石斑鱼pIgR与哺乳类pIgR相似，均为一次跨膜受体，其N端带有一个由20个氨基酸组成的信号肽，pIgR成熟肽则由胞外区域、跨膜区域和胞内区域三部分构成，且在ILD1含有四个高度保守的关键氨基酸残基C22、W37、D86和C92，推测其对维持鱼类免疫球蛋白折叠结构的稳定性具有重要作用。斜带石斑鱼pIgR基因在除嗅球、垂体、脂肪组织以外的组织中分布广泛，它在后肠、中肠、皮肤和胃等黏膜组织中表达量较高，并在胸腺、头肾等淋巴器官中也有一定量的表达，推测其可能参与黏膜以及中枢淋巴器官的免疫反应。在COS-7细胞中成功表达了重组的斜带石斑鱼pIgR蛋白，并利用流式细胞仪和间接免疫荧光法检测到了重组蛋白定位于细胞膜上，并证明此跨膜蛋白能与纯化的IgM结合。
八、抗菌肽
抗菌肽是鱼体天然免疫的重要组成部分，其结构和组成复杂多样。鱼类抗菌肽多以前肽原的形式合成，通过酶解切除信号肽和羧基端酸性片段后形成有活性的成熟肽，成熟肽具有很强的抑菌活性。在石斑鱼中已克隆获得了抗菌肽Epinecidin-1基因，该基因有22个氨基酸的信号肽、25个氨基酸的成熟肽和20个氨基酸的C末端。合成该肽发现具有较强的抑制细菌生长的功能。随后又对石斑鱼抗菌肽Hepcidin基因进行克隆表达和抗菌活性研究，发现该基因编码87个氨基酸，包括24个氨基酸的信号肽、40个氨基酸的优势域和23个氨基酸的成熟肽，能够选择性抑制部分革兰氏阳性菌（如金黄色葡萄球菌、溶壁微球菌）和革兰氏阴性菌（如大肠杆菌）的生长，还具有很好的热稳定性。
九、展望
石斑鱼作为我国沿海地区的主要海水养殖品种，频发的鱼病在威胁渔业健康发展的同时，促使人们开展对疾病防治的相关研究，为开发高效环保的免疫防病技术提供理论基础。
在石斑鱼抗病相关基因调控机制的研究中，挖掘了一批与石斑鱼免疫相关的功能基因，建立了研究石斑鱼抗病原相关组分感染的细胞模型，在石斑鱼先天免疫模式识别受体调控机制研究上取得突破。对石斑鱼先天免疫系统中Toll样受体、Nod样受体、C型凝集素受体、白细胞介素1受体、补体、干扰素、抗菌肽的研究表明，在识别和抵御病原感染时，针对不同病原相关组分，鱼类可以通过不同机制单独或协同识别并清除病原，激活相应的胞内信号通路，产生免疫效应因子抵御病原侵袭，达到抗病效果。这些研究为提高鱼类疫苗技术、控制石斑鱼发病机制提供了理论基础，并可能产生巨大的应用价值。
（张勇，卢丹琪，王翔，王登东，何良格）
参考文献
闫鸿斌，高闪电，贾万忠，等，2008.细胞内模式识别受体研究进展[J].免疫学杂志，24（3）：359-362.
邓尚龙，2008.石斑鱼抗菌肽Hepcidin基因的克隆、表达与抗菌活性研究[D].吉林：吉林农业大学.
丁旭，2015.斜带石斑鱼模式识别受体TLR22和NLRX1的功能研究[D].广州：中山大学.
冯丽娜，2009.斜带石斑鱼多聚免疫球蛋白受体基因的克隆和功能分析[D].广州：中山大学.
郭新红，刘少军，刘巧，2004.鱼类线粒体DNA研究新进展[J].遗传学报，31（9）：983-1000.
韩蔚伟，卢静，王大兵，2009.天然自身抗体的研究进展[J].青岛大学医学院学报，45（4）：403-404.
候庆华，2013.斜带石斑鱼NOD 1及NOD 2基因的克隆和功能研究[D].广州：中山大学.
李莉，李春梅，2012.鱼类非特异性免疫研究进展[J].河南农业科学，41（2）：26-32.
李淑英，陈新华，2007.鱼类干扰素系统基因研究进展[J].生物技术通报，5：53-57.
李言伟，2012.石斑鱼TLRs功能及刺激隐核虫感染后免疫相关基因表达分析[D].广州：中山大学.
孙艳，2013.斜带石斑鱼两种干扰素γ的克隆、表达及功能初步研究[D].广州：中山大学.
万建业，陈小桥，汪银焰，2011.我国水产品质量安全存在的问题与对策[J].现代农业科技（10）：357-359.
王翔，2017.石斑鱼遗传特性分析及杂交育种[D].广州：中山大学.
魏京广，2010.石斑鱼C型凝集素和两个凋亡相关基因的克隆与功能研究[D].广州：中山大学.
韦友传，2011.斜带石斑鱼TLR1、TLR2和MyD 88基因的克隆与免疫应答研究[D].南宁：广西大学.
姚谧，2011.斜带石斑鱼白细胞介素1受体基因的cDNA克隆及其表达模式分析[D].广州：中山大学.
周庆军，邵健忠，项黎新，2002.鱼类抗菌肽的研究进展[J].生物化学与生物物理进展，5：81-84.
Austin C M, Tan M H, Lee Y P, et al，2016. The complete mitogenome of the Murray Cod，Maccullochella peelii（Mitchell，1838）（Teleostei：Percichthyidae）[J].Mitochondrial DNA，27（1）：729-30.
Bhandari R K, Higa M, Nakamura S, et al，2003. Aromatase inhibitor induces complete sex change in the protogynous honeycomb grouper（Epinephelus merra）[J].Fish Physiology and Biochemistry，67（1）：303-307.
Bi Y H, Chen X W，2012. Mitochondrial genome of the Japanese seabass Lateolabrax japonicus（Teleostei, Perci-formes, and Moronidae）[J].Mitochondrial DNA，23（5）：371-372.
Cantarel B L, Korf I, Robb S M, et al，2008. MAKER：an easy-to-use annotation pipeline designed for emerging model organism genomes[J].Genome Res.，18：188-196.
Ding X, Liang Y, Peng W, et al，2018. Intracellular TLR22 acts as an inflammation equalizer via suppression of NFκB and selective activation of MAPK pathway in fish[J].Fish Shellfish Immunol，72：646-657.
Du F Y, Ye L and Wang X H，2015. Complete mitochondrial genome of the sixbar grouper Epinephelus sexfasciatus（Perciformes：Epinephelidae）[J].Mitochondrial DNA，26（3）：461-462.
Gaither M R, Bowen B W, Bordenave T R, et al，2011. Phylogeography of the reef fish Cephalopholis argus（Epi-nephelidae）indicates Pleistocene isolation across the indo-pacific barrier with contemporary overlap in the coral trian-gle[J].BMC Evolutionary Biology，11（1）：189.
Gan H M, Tan M H, Austin C M，2016. The complete mitogenome of the Macquarie perch，Macquaria australasica Cuvier，1830（Teleostei：Percichthyidae）[J].Mitochondrial DNA，27（1）：383-384.
Gregory T R，2019. Animal Genome Size Database. http：//www. genomesize. com.
He B, Lai T, Peng Z, et al，2013. Complete mitogenome of the Areolate grouper Epinephelus areolatu s（Serranidae, Epinephelinae）[J].Mitochondrial DNA，24（5）：498-500.
He L, Liang Y, Yu X, et al，2019. Vibrio parahaemolyticus flagellin induces cytokines expression via toll-like recep-tor 5 pathway in Orange-spotted grouper，Epinephelus coioides[J].Fish Shellfish Immunol，87：573-581.
Hsiao S T, Chen K S, Tseng C T, et al，2016. Complete mitochondrial genome of the sixblotch hind Cephalopholis sexmaculata（Pisces：Perciformes）[J].Mitochondrial DNA，（2）：1018-1019.
Hsiao S T, Chen K S, Tseng C T, et al，2017. Complete mitochondrial genome of the palemargin grouper Epinephelus bontoides（Pisces：Perciformes）[J].Mitochondrial Dna，28（2）：178-179.
Huang M, Chen H M, Wang D D, et al，2015. The complete mitochondrial genome of Epinephelus awoara（Perci-formes：Epinephelus）with phylogenetic consideration[J].Mitochondrial DNA，27（6）：4286-4287.
Hu Y, Bao B, Gong X，2017. The complete mitochondrial genome sequence of Yongeichthys criniger and phylogenetic studies of Gobiidae[J].Mitochondrial DNA，28（2）：281-282.
Jurka J, Kapitonov V V, Pavlicek A, et al，2005. Repbase Update, a database of eukaryotic repetitive elements[J].Cytogenet. Genome Res.，110：462-467.
Kitagawa T, Okita T, Banno Y，2000. Mitochondrial DNA of the Florida subspecies of largemouth bass Micropterus salmoides floridanus detected in Ikehara Reservoir, Nara Prefecture, Japan[J].Nihon suisan gakkaishi，66（5）：805-811.
Lai T, He B, Peng Z, et al，2013. Complete mitochondrial genome of the striped grouper Epinephelus latifasciatus（Serranidae, Epinephelinae）[J].Mitochondrial DNA，24（5）：510-512.
Liang Y, Ding X, Yu X, et al，2018. Identification and functional characterization of Toll-like receptor 13 from or-ange-spotted grouper（Epinephelus coioides）[J].Fish Shellfish Immunol，74：309-317.
Li J L, Liu M, Wang Y Y，2013. Complete mitochondrial genome of the rock grouper Epinephelus fasciatomaculosus（Pisces：Perciformes）[J].Mitochondrial DNA，24（6）：625-626.
Li J L, Liu M, Wang Y Y，2014. Complete mitochondrial genome of the chocolate hind Cephalopholis boenak（Pisces：Perciformes）[J].Mitochondrial DNA，25（3）：167-168.
Li S J, Bai J J, Cai L, et al，2012. The complete mitochondrial genomes of largemouth bass of the northern subspecies（Micropterus salmoides salmoides）and Florida subspecies（Micropterus salmoides floridanus）and their applica-tions in the identification of largemouth bass species[J].Mitochondrial DNA，23（2）：92-99.
Li S J, Cai L, Bai J J，2011. Mitochondrial genome sequence of the bluegill sunfish（Lepomis macrochirus）[J].Mi-tochondrial DNA，22（5-6）：194-196.
Li S J, Jing Y J, Song H M, et al，2014. Complete mitochondrial genome of the green sunfish（Lepomis cyanellus）[J].Mitochondrial DNA，25（1）：42-43.
Liu K, Duan J, Xu D, et al，2016. Complete mitochondrial genome of Lateolabrax maculatus[J].Mitochondrial DNA，27（4）：2510-2511.
Lowe T M, Eddy S R，1997. tRNAscan-SE：a program for improved detection of transfer RNA genes in genomic se-quence[J].Nucleic Acids Research，25（5）：955-964.
Lv L, Tian C, Liang X, et al，2016. The complete mitochondrial genome sequence of Coreoperca whiteheadi（Perci-formes：Serranidae）[J].Mitochondrial DNA，27（1）：301-303.
Moriya Y, Itoh M, Okuda S, et al，2007. KAAS：an automatic genome annotation and pathway reconstruction server[J].Nucleic Acids Research，35（Web Server issue）：182-185.
Mukai T, Sato C，2009. Complete mitochondrial DNA sequences of two haplotypes of the smallmouth bass，Micropterus dolomieu，collected from nonindigenous populations in Japan[J].Ichthyological Research，56（2）：204-207.
Mu X, Wang X, Liu Y, et al，2015. An unusual mitochondrial genome structure of the tonguefish，Cynoglossus trigrammus：Control region translocation and a long additional non-coding region inversion[J].Gene，573（2）：216-224.
Oh B S, Oh D J, Jung M M, et al，2012. Complete mitochondrial genome of the longtooth grouper Epinephelus bruneus（Perciformes, Serranidae）[J].Mitochondrial DNA，23（2）：137-138.
Park C E, Park G S, Kwak Y, et al，2016. Complete mitochondrial genome of the endemic species Korean aucha perch Coreoperca herzi（Teleostei, Centrarchiformes, Sinipercidae）[J].Mitochondrial DNA，（5）：3493-3495.
Peng C, Wang D D, He J N, et al，2016. The complete mitochondrial genome of the Epinephelus fuscoguttatus（Per-ciformes：Serranidae）[J].Mitochondrial DNA A DNA Mapp. Seq. Anal.，27（6）：4110-4111.
Peng W, Sun Y, Li G, et al，2018. Two distinct interferon-γin the orange-spotted grouper（Epinephelus coioides）：Molecular cloning, functional characterization, and regulation in Toll-like receptor pathway by induction of miR-146a[J].Frontiers in Endocrinology，9：41.
Peng Z, Chen J, Lai T, et al，2014. Complete mitochondrial genome of the longfin grouper Epinephelus quoyanus（Serranidae：Epinephelinae）[J].Mitochondrial DNA，25（3）：175-176.
Peng Z, Huang Y, Chen J, et al，2014. Complete mitochondrial genome of dotted grouper Epinephelus epistictus（Serranidae：Epinephelinae）[J].Mitochondrial DNA，25（3）：190-191.
Qin J, Hu D J, Yang W D, et al，2014. Complete mitochondrial genome of the humpback grouper Cromileptes altivelis[J].Mitochondrial DNA，25（3）：200-201.
Sanger F, Air G M, Barrell B G, et al，1977. Nucleotide sequence of bacteriophageφX174 DNA[J].Nature，265：687-695.
Sanger F, Coulson A R, Friedmann T, et al，1977. Nucleotide sequence of bacteriophageφX174 DNA[J].Nature，265：687-695.
Shen M, Shi X, Qu M, et al，2013. Complete mitochondrial genome of squaretail coralgrouper Plectropomus areolatus（Perciformes, Epinephelidae）[J].Mitochondrial DNA，24（4）：365-367.
Sun Y, Wei T, Su X, et al，2016. The complete mitochondrial genome of Grammistes sexlineatus（Perciformes, Ser-ranidae）[J].Mitochondrial DNA，27（2）：821-823.
Takada M, Tachihara K, Kon T, et al，2010. Biogeography and evolution of the Carassius auratus-complex in East Asia[J].BMC Evol. Biol.，10：7.
Tang L, Tang Z J, Chen X, et al，2016. The complete mitochondrial genome of the hybrid grouper Epinehelus moara♀×Epinephelus_lanceolatus♂with phylogenetic consideration[J].Mitochondrial DNA Part B，1（1）：584-585.
Tang Z J, Chen J X, Tang L, et al，2017. The complete mitochondrial genome of the hybrid grouper Epinephelus coioides♀×Epinephelus akaara♂with phylogenetic consideration[J].Mitochondrial DNA Part B，2（1）：31-32.
Tian C, Lv L, Cai W, et al，2016. The complete mitochondrial genome sequence of Siniperca undulate（Perciformes：Percichthyidae）[J].Mitochondrial DNA，27（1）：18-19.
Walker B J, Abeel T, Shea T, et al，2014. Pilon：an integrated tool for comprehensive microbial variant detection and genome assembly improvement[J].PLoS ONE，9：e112963.
Wang D, Chen X, Zhang X, et al，2019. Whole genome sequencing of the giant grouper（Epinephelus lanceolatus）and high-throughput screening of putative antimicrobial peptide genes[J].Marine Drugs，17（9）：503.
Wang H, Guo L, Ding S X，2016. The complete mitochondrial genome of Diploprion bifasciatum（Perciformes, Ser-ranidae）[J].Mitochondrial DNA，25（5）：3137-3138.
Wang L J, You F, Wu Z H，2016. Complete mitochondrial genome of copperband butterflyfish Chelmon rostratus（Te-leostei, Perciformes, Chaetodontidae）[J].Mitochondrial DNA，27（3）：2141-2142.
Wang Q, Chen H, Xu W, et al，2016. The complete mitochondrial genome of the hybrid grouper Epinephelus coioides♀×Epinephelus lanceolatus♂[J].Mitochondrial DNA A DNA Mapp Seq Anal，27（6）：4181-4182.
Wang X, Wang Q, Xie Z Z, et al，2016. The complete mitochondrial genome of the Epinephelus lanceolatus（Perci-formes：Serranidae）[J].Mitochondrial DNA，27（3）：1738-1739.
Wang Y, Wang Y, Hui C, et al，2016. Transcriptome analysis of the effect of Vibrio alginolyticus infection on the in-nate immunity-related TLR5-mediated induction of cytokines in Epinephelus lanceolatus[J].Fish Shellfish Immu-nol，52：31-43.
Wheeler T J, Clements J, Eddy S R, et al，2013. Dfam：a database of repetitive DNA based on profile hidden Markov models[J].Nucleic Acids Research，41（Database issue）：D70.
Wu X, Xie Z, Yang L, et al，2015. The complete mitochondrial genome of the duskytail grouper Epinephelus bleekeri（Serranidae：Epinephelinae）[J].Mitochondrial DNA，26（5）：722-723.
Xiao L, Yang X K, Xie Z Z, et al，2016. The complete mitochondrial genome of the Epinephelus moara（Osteich-thyes：Ephippidae）[J].Mitochondrial DNA A DNA Mapp. Seq. Anal.，27（3）：2174-2175.
Yang H R, Xie Z Z, Li S S，2016. The complete mitochondrial genome of the Orange-spotted grouper Epinephelus coioides（Perciformes, Serranidae）[J].Mitochondrial DNA，27（3）：1674-1676.
Yang Y, Xie Z, Peng C, et al，2016. The complete mitochondrial genome of the Epinephelus tukula（Perciformes, Serranidae）[J].Mitochondrial DNA，27（1）：520-522.
Ye C, Hill C M, Wu S, et al，2016. DBG2OLC：Efficient assembly of large genomes using long erroneous reads of the third generation sequencing technologies[J].Sci. Rep.，6：31900.
Ye L, Du F Y, Wang X H, et al，2014. Complete mitochondrial genome of the black-dotted grouper Epinephelus stictus[J].Mitochondrial DNA，25（4）：87-88.
Ye L, Wang X H and Du F Y，2014. Complete mitochondrial genome of the threespot grouper Epinephelus trimaculatus[J].Mitochondrial DNA，25（4）：293-294.
Yin X, He W, Chen W, et al，2006. Cloning expression and antimicrobial activity of an antimucrobial peptide, epine-cidin-1，from the orange-spoteed grouper，Epinephelus coioides[J].Aquaculture，253：204-211.
Zhao Z, Yuan S，2016. Complete mitochondrial genome of Siniperca roulei（Perciformes：Sinipercidae）[J].Mito-chondrial DNA，27（6）：4201-4202.
Zheng L, Xie J, Xie Z, et al，2016. The complete mitochondrial genome of the Epinephelus corallicola（Perciformes：Serranidae）[J].Mitochondrial DNA，27（6）：3971-3972.
Zhu K, Huang G, Zhang D, et al，2016. The complete nucleotide sequence of Malabar grouper（Epinephelus malabaricus）mitochondrial genome[J].Mitochondrial DNA，27（3）：2087-2088.
Zhu K, Zhang D, Wei J, et al，2014. The complete mitochondrial genome of the hybrid grouper Epinephelus fuscoguttatus（♀）×Epinephelus lanceolatus（♂）[J].Mitochondrial DNA A DNA Mapp. Seq. Anal.，27（3）：1968-1969.
Zhu Z Y, Yue G H，2008. The complete mitochondrial genome of red grouper Plectropomus leopardus and its applica-tions in identification of grouper species[J].Aquaculture，276（1-4）：44-49.